JP4160954B2 - ニトロソアミンを低減する微生物および該微生物を利用したニトロソアミンを低減する方法 - Google Patents

Description

技術分野
本発明は、収穫した葉タバコの乾燥中および貯蔵中に生成されるニトロソアミンを分解する微生物と、該微生物を利用した葉タバコ乾燥および／または貯蔵中に生成するニトロソアミンの低減方法に関する。
背景技術
葉タバコに含まれるニトロソアミン（Ｔｏｂａｃｃｏ Ｓｐｅｃｉｆｉｃ Ｎｉｔｒｏｓａｍｉｎｅ；以下、ＴＳＮＡと記す）は、収穫直後の葉タバコ（即ち、緑の生葉）には存在しないが、乾燥期間とその後の貯蔵期間中に、葉タバコ中のアルカロイドと亜硝酸態窒素の反応によって生成される。この亜硝酸は、葉タバコ表面に生存する硝酸還元能を有する微生物により生成される。
また、この乾燥およびその後の貯蔵過程において生成されるＴＳＮＡの主成分は、Ｎ’−ニトロソノルニコチン（以下「ＮＮＮ」という）、４−（Ｎ’−ニトロソメチルアミノ）−１−（３−ピリジル）−１−ブタノン）（以下「ＮＮＫ」という）、Ｎ’−ニトロソアナタビン（以下「ＮＡＴ」という）およびＮ’−ニトロソアナバシン（以下「ＮＡＢ」という）等である。
葉タバコ中のＴＳＮＡ含量を低減する方法として従来から知られる方法には（１）ＴＳＮＡの生成を抑制する方法、（２）生成されたＴＳＮＡを除去する方法がある。
ＴＳＮＡの生成を抑制する方法としては、例えば、窒素肥料を低減することによって葉タバコ中のアルカロイド含有量を低くする方法、直熱方式に換えて間熱方式の乾燥機を用いることによって乾燥中に生成するＴＳＮＡを低減する方法（これは主に黄色種に用いられる）、アルカロイド含量の低い品種を開発するなどの育種技術の向上により得られる方法などがある。
また最近では、マイクロ波を照射して葉タバコを乾燥することにより、ＴＳＮＡの生成を抑制する方法も報告されている（特表２００１−５０３２４７）。しかし、マイクロ波処理のような急激な脱水・乾燥を行うと、本来乾燥中に生ずる内容成分の変化が充分に行われないことになり、従来の方法で乾燥したものより、急乾に仕上がり、喫味に問題が残ってしまう。
一方、生成されたＴＳＮＡを葉タバコから除去する方法は、ＴＳＮＡの生成を抑制する方法に比べてその例は少なく、例えば、超臨界抽出によって葉タバコからＴＳＮＡを除去する方法（ＷＯ０１／６５９５４）が知られている。しかしながら、この方法はコストの面から実用化には至っていない。
以上の状況から、葉タバコの乾燥および貯蔵中に生成すると認識されているＴＳＮＡの含量を低減することが望まれている。
併せて、たばこ（シガレット）の原料である葉タバコとして消費に適した喫味を維持したものでＴＳＮＡ含量の少ないものが求められている。
従って、本発明は、現在行われている乾燥および貯蔵形態の中において、乾燥および貯蔵中に生成したＴＳＮＡの含量を低減する方法を提供するものである。
また、従来、ニトロソアミンを分解するものとして、醤油もろみ中から分離した糸状菌であるアスペルギルス属微生物が知られている（特開平１０−２７６６８１号）が、アスペルギルス属微生物は生存に高水分を必要とすること、そして葉タバコの品質、特に香喫味に悪影響を及ぼす恐れがあり、葉たばこの処理に用いることについては問題が指摘されている。
発明の開示
本発明の第１の態様に従うと、葉タバコに対して、スフィンゴモナス・パウシモビリス種およびシュードモナス・フルオレッセンス種に属し、ＴＳＮＡを低減する能力を有する微生物からなる群より選択される微生物を処理することを特徴する葉タバコのＴＳＮＡ含量を低減する方法が提供される。
本発明の第２の態様に従うと、葉タバコに対して、スフィンゴモナス・パウシモビリスＬＧ５菌株およびシュードモナス・フルオレッセンスＬＧ３８菌株からなる群より選択される微生物を処理することを特徴する葉タバコのＴＳＮＡ含量を低減する方法が提供される。
本発明の第３の態様に従うと、スフィンゴモナス・パウシモビリスまたはシュードモナス・フルオレッセンスに属し、葉タバコの乾燥および貯蔵中に生成するＮ’−ニトロソノルニコチン、４−（Ｎ’−ニトロソメチルアミノ）−１−（３−ピリジル）−１−ブタノン）、Ｎ’−ニトロソアナタビンおよびＮ’−ニトロソアナバシンからなる群より選択される少なくとも１成分の葉タバコ中の含量を低減する能力を有する微生物が提供される。
本発明の第４の発明に従うと、葉タバコ中のＴＳＮＡ含量を低減するスフィンゴモナス・パウシモビリスＬＧ５菌株（ＦＥＲＭ ＢＰ−７８３０）が提供される。
本発明の第５の発明に従うと、葉タバコ中のＴＳＮＡ含量を低減するシュードモナス・フルオレッセンスＬＧ３８菌株（ＦＥＲＭ ＢＰ−７８３１）が提供される。
発明を実施するための最良の形態
本発明者らは、鋭意研究の結果、葉タバコ乾燥中および貯蔵中におけるＴＳＮＡの生成過程を解明している中において、葉タバコ表面に存在する微生物にＴＳＮＡを分解する微生物が存在することを見いだし、発明を完成した。
本発明者は、乾燥中の葉タバコにおけるＴＳＮＡの生成過程を解明する過程において、葉タバコ表面に存する微生物から、生成したＴＳＮＡを分解する微生物を分離した。更に、乾燥中の葉タバコおよび／または乾燥が終了し貯蔵に供される葉タバコに対して該微生物を処理することによって、葉たばこ中のＴＳＮＡの含量を低減できることを見い出した。
それらの微生物のうち特に活性の高い２種類の微生物が、その菌学的性質から、それぞれスフィンゴモナス・パウシモビリス（Ｓｐｈｉｎｇｏｍｏｎａｓ ｐａｕｃｉｍｏｂｉｌｉｓ）、およびシュードモナス・フルオレッセンス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ）に属する微生物と同定された。これらの微生物について、本発明者らは、スフィンゴモナス・パウシモビリス菌株をＬＧ５（以下「ＬＧ５」または「ＬＧ５菌株」という）と、シュードモナス・フルオレッセンス菌株をＬＧ３８（以下「ＬＧ３８」または「ＬＧ３８菌株」という）と命名した。ＬＧ５は受託番号ＦＥＲＭ ＢＰ−７８３０として、ＬＧ３８は受託番号ＦＥＲＭ ＢＰ−７８３１として２００１年１２月１８日に独立行政法人産業技術総合研究所 特許生物寄託センター（日本国茨城県つくば市東１丁目１番地１中央第６）に寄託された。
これらの微生物は乾燥および／または貯蔵中の葉タバコ品質に悪影響を及ぼさないものであり、且つＴＳＮＡを低減する効能を有するものである。
さらに、本発明に従う方法は、現在の葉タバコ乾燥法を何ら変更することなく、微生物を処理し達成できるものであることから、現行の葉タバコの品質および喫味を維持できるものである。
これらの菌株の活性は、次の通りである。
ＬＧ５は、ＴＳＮＡの成分うち、ＮＮＫを特異的に分解する活性を有する。また、ＬＧ３８は、主な成分であるＮＮＮ、ＮＮＫ、ＮＡＴおよびＮＡＢを分解する活性を有している。
本発明に従って処理される葉タバコは、通常の乾燥操作を行うものであれば何れの品種であってもよく、具体的には自然乾燥される品種であるバーレー種および在来種、装置乾燥される黄色種をあげることができる。しかしながら、これに限定されるものではない。
本発明に従う微生物を処理する時期は、葉たばこ中にＴＳＮＡが生成される直前からシガレットに加工されるまでの間であればいつでもよいが、葉タバコの乾燥期間および／または貯蔵期間が好ましい。特に乾燥での処理する時期としては、ＴＳＮＡの生成する時期以前である乾燥過程での収穫直後から黄変期および褐変期に処理するのが好ましいが、乾燥過程中であれば何れの時期も可能である。貯蔵期間での処理は、貯蔵期間中であればいつでもよいが、乾燥後の貯蔵開始時に処理するのが好ましい。基本的には、実施者が、乾燥開始時から貯蔵期間中において任意に選択することができる。
また、収穫直前にほ場で処理後、収穫し、乾燥に供することでも可能である。
また、本発明に従って行われる微生物の処理は、１回に限るものではなく、期間中一定期間ごとに連続的に行ってもよい。
なお、本発明の処理は、乾燥および／または貯蔵中の処理に限るものではなく、製品化の過程において処理を行うことも可能である。
本発明に従う処理とは、微生物を懸濁した液の噴霧、微生物の菌体を含む粉末の塗布等、それ自体公知の何れの方法によって行ってもよく、実施者が適宜な方法を選択してよい。また、微生物を含む液体に葉タバコを浸漬してもよい。
上述したとおり、本発明に好ましく使用される微生物は、ＬＧ５菌株およびＬＧ３８菌株である。しかしながら、本発明はこれらの菌株に限定されるものではなく、スフィンゴモナス・パウシモビリス種およびシュードモナス・フルオレッセンス種に属し、ＴＳＮＡを低減する能力を有する微生物であれば本発明の範疇である。
ここで使用される「低減」するとは、葉タバコ中のＴＳＮＡの含量を低減することを意味し、たとえば、葉タバコの乾燥および貯蔵中に生成したＴＳＮＡ各成分を分解するものであればよい。
本発明に使用する微生物を培養する培地としては、微生物培養用としての公知の各種培地を用いることができる。
本発明に使用する微生物を培養する培養条件としては、温度が２５〜３５℃の範囲、ｐＨが６．０〜８．０の範囲にあればよく、好ましくは温度が２８〜３２℃、ｐＨが７．０前後範囲である。
本発明の微生物は、一定期間培養した後で、これを遠心分離することにより集菌する。
集菌した菌体は、緩衝液に懸濁して使用してもよく、凍結乾燥等により粉末状にして使用してもよい。
集菌した菌体を特定の緩衝液に懸濁して菌液を作成する場合には、緩衝液として例えば、滅菌蒸留水およびリン酸緩衝液等を使用できる。
本菌体を緩衝液に懸濁する割合としては、緩衝液１ｍｌ当たり、１０^７〜１０^１２個、好ましくは１０^８〜１０^１０個である。そのような濃度に菌体を懸濁して用いることが好ましい。
本発明に従うと、上記により得た菌体を用いて葉たばこの処理を行えばよい。
必要な菌量を含有した上記菌液に滅菌蒸留水を加えて接種液を作成し、この接種液を葉タバコに均一に噴霧する。この処理は、乾燥から貯蔵の期間であれはどの時期でも可能である。自然乾燥種の場合は、乾燥期間全般および乾燥終了後の貯蔵時期、装置乾燥種の場合は、乾燥初期の黄変期および乾燥終了後の貯蔵時期に処理する。好ましくは、乾燥過程における黄変期さらに自然乾燥の場合には、褐変期に処理するのがよい。
散布量は、上記により作成した液量を葉タバコ１枚あたり、収穫直後および乾燥初期では２〜１０ｍｌ、乾燥中期以降では０．５〜３ｍｌである。
処理回数は、乾燥および／または貯蔵期間中に少なくとも１回であればよく、乾燥および／または貯蔵期間中に間隔をおいて２〜３回処理することが好ましい。
本発明の態様に従うと、当該微生物を処理すること以外、乾燥条件の大きな変化はないので、本来の味に影響を与えることなくＴＳＮＡ含量を低減することが可能である。
実施例
実施例１
例１．葉タバコ表面からの微生物の分離
栃木県小山市のタバコ畑の収穫時から乾燥期間中の葉タバコから微生物を採取した。
菌の採取は、葉タバコの収穫直後、乾燥３日目（即ち、黄変終了）および８日目（即ち、褐変終了）の３回行った。
バーレー種であるみちのく１号の本葉を収穫し、収穫した葉タバコの葉肉部分の一部を切り取りサンプルとした。得られたサンプルを５ｍｍ角に細断し、その約１０ｇを３００ｍｌの三角フラスコに採取した。２００ｍｌの１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ：７．０）を添加し、これをホモジナイザーで粉砕した。得られた懸濁液を、収穫時の葉タバコからの微生物を含む収穫時懸濁液とした。
乾燥期間中（即ち、黄変終了：乾燥３日目、褐変終了：乾燥８日目）の葉タバコからの微生物採取は、前記の収穫した葉タバコの乾燥中の葉タバコを用いて、収穫時葉タバコと同様に行った。即ち、前述の収穫されたみちのく１号の本葉をパイプハウスにつり込み後、３日および８日経過した葉タバコの葉肉部分の一部を切り取りサンプルとした。得られたサンプルを５ｍｍ角に細断し、その約１０ｇを３００ｍｌの三角フラスコに採取した。２００ｍｌの１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ：７．０）を添加し、これをホモジナイザーで粉砕した。得られた懸濁液を乾燥期間中の葉タバコからの微生物を含む乾燥時懸濁液とした。
何れの時期に採取した葉タバコについてのホモジナイザーによる粉砕も、サンプリングから２時間以内に行った。
収穫時懸濁液と乾燥期懸濁液を、それぞれ、微生物が分離できる濃度（即ち、１０^２〜１０^５倍）に上述と同様のリン酸緩衝液を用いて希釈した。得られた希釈液をＹＧ寒天平板培地（組成は、以下の通りである；１．０ｇの酵母エキス、１．０ｇのグルコース、０．３ｇのＫ_２ＨＰＯ_４、０．２ｇのＫＨ_２ＰＯ_４、０．２ｇのＭｇＳＯ_４・７Ｈ_２Ｏ、１５．０ｇの寒天、蒸留水で１０００ｍｌに調製する。ｐＨ６．８）に０．１ｍｌずつ滴下して塗抹し、これを３０℃で７日間培養した。培養後、生育したコロニーを新しいＹＧ寒天平板培地を用いて単一コロニーに分離した。分離された微生物は使用時まで−８０℃で保存した。
このようにして、収穫時葉タバコからは８７菌株、褐変期葉タバコから１７６菌株の微生物を分離した。これらの分離菌株から、コロニー形態の異なる菌株を選択して以後の実験に用いた。
例２．ＴＳＮＡ分解微生物の一次選抜
上記例１で分離した葉面由来の菌株のうち、収穫期の葉タバコから分離した１４菌株と乾燥期葉タバコから分離した３７菌株の合計５１菌株を一次選抜の候補菌株として選抜した。
（１）培地の選択
ＴＳＮＡ分解微生物を選抜するための培地の検討を行った。
前記例１において選抜された菌株を用いて、ＴＳＮＡの各成分（ＮＮＮ、ＮＮＫ、ＮＡＴおよびＮＡＢ）を含む培地について、菌株の増殖に関する検討を行った結果、１／１０ＴＳ液体培地を基礎培地とした場合が最も良好な結果を得られた。従って、以後の培養には、１／１０ＴＳ液体培地を基礎培地として用いた。以下に、まず１／１０ＴＳ液体培地組成を示し、続いて、培養に用いた１／１０ＴＳ液体培地と微生物とを含む培地の組成を記載する。
［１／１０ＴＳ液体培地］
・最終容量 蒸留水で１０００ｍｌにする
・カゼイン １．７ｇ
・Ｄ−グルコース ０．２５ｇ
・ＮａＣｌ ０．５ｇ
・Ｋ_２ＨＰＯ_４ ２．５ｇ
・１／１０ Ｔｒｙｐｔｉｃ Ｓｏｙ（Ｄｉｆｃｏ社製、Ｂａｃｔｏ Ｔｒｙｐｔｉｃ Ｓｏｙ Ｂｒｏｔｈ；Ｓｏｙｂｅａｎ−Ｃａｓｅｉｎ Ｄｉｇｅｓｔ Ｍｅｄｉｕｍ）。
［ＴＳＮＡ分解菌選抜用培地］
・最終容量 ３５ｍｌ
・１／１０ＴＳ液体培地（ＮＮＮ、ＮＡＴ、ＮＡＢおよびＮＮＫを各々５ｐｐｍ含有） ３０ｍｌ
・接種用微生物懸濁液 ５ｍｌ
上記の選抜用培地は次の方法により調製した。各１０００ｐｐｍのＮＮＮ、ＮＡＴ、ＮＡＢ及びＮＮＫを含むジクロロメタン溶解液を１５０μｌずつ三角フラスコに添加し、ジクロロメタンを完全に揮発させた。次に１／１０ＴＳ液体培地を添加して、ＮＮＮ、ＮＡＴ、ＮＡＢおよびＮＮＫの濃度を各々５ｐｐｍ／１０ｍｌとなるように調製した。ＮＮＮ、ＮＡＴ、ＮＡＢおよびＮＮＫを溶解した後、３０ｍｌずつ５０ｍｌの三角フラスコに分注した。次に、接種用微生物懸濁液を５ｍｌ添加して、最終容量が３５ｍｌの選抜用培地を得た。これらを２４時間、３０℃で振とう培養した。
（２）ＴＳＮＡ分解微生物の一次選抜
上記で選抜された培地を用いて、ＴＳＮＡ分解微生物の一次選抜を行った。
一次選抜の候補菌株を、それぞれ１／１０ＴＳ液体培地中で振とう培養し、その後遠心集菌した。各菌体を滅菌蒸留水で２回洗浄した後、再度滅菌蒸留水に懸濁した。次に、菌濃度が１０^８〜１０^１０ｃｆｕ／ｍｌとなるように、滅菌蒸留水を用いて各懸濁液を調製した。
得られた微生物懸濁液を、由来毎に５〜１０菌株ずつ混合して７グループの選抜用懸濁液を調製した。
ＴＳＮＡ分解菌選抜用培地には、上記の１／１０ＴＳ液体培地を用い、前記７グループの微生物懸濁液を用いる以外は、上記例１と同様の方法によって調製した。
コントロールには微生物懸濁液に代えて滅菌蒸留水を５ｍｌ添加した。
これらの７グループの微生物懸濁混合処理区とコントロール区を３０℃で２４時間の振とう培養を行った。
その後、ＴＳＮＡ各成分の含量を定量した。
ＴＳＮＡ各成分の定量は次の方法により行った。即ち、それぞれの培地から得られた試料に含まれるＮＮＮ、ＮＡＴ、ＴＡＢおよびＮＮＫを、改良されたＳｐｉｅｇｅｌｈａｌｄｅｒの方法に準じたガスクロマトグラフィによって定量した（Ｓｐｉｅｇｅｌｈａｌｄｅｒ Ｂ．，Ｋｕｂａｃｋｉ Ｓ．ａｎｄ Ｆｉｓｃｈｅｒ Ｓ．（１９８９）Ｂｅｉｔｒ．Ｔａｂａｋｆｏｒｓｃｈ．Ｉｎｔ．，１４（３），１３５−１４３，Ｆｉｓｈｅｒ Ｓ．ａｎｄ Ｓｐｉｅｇｅｌｈａｌｄｅｒ Ｂ．（１９８９）Ｂｅｉｔｒ．Ｔａｂａｋｆｏｒｓｈ．Ｉｎｔ．，１４（３），１４５−１５３）。
まず、カラムクロマトグラフィを用いて以下のようにそれぞれの培地を精製した。最初に、ろ紙（ＡＤＶＡＮＴＥＣ、Ｎｏ．５Ｃ）を用い全ての培地を濾過した。各濾液の１０ｍｌを、キーゼルグール（粒径６０−１６０ｍｍ、ＭＥＲＣＫ社製）およびアスコルビン酸を充填したカラムに添加した。ジクロロメタンを用いて必要な画分を転溶して分取した。これをガスクロマトグラフィ用の試料とした。得られた試料について、カラムＤＢ−１７（Ｊ＆Ｗ社）、検出器ＴＥＡ−５４３（Ｔｈｅｒｍｅｄｉｃｓ社）を装備したガスクロマトグラフィＨＰ６８９０（Ｈｅｗｌｅｔｔ Ｐａｃｋａｒｄ社製）を用いて分析した。
上記の７グループの処理区とコントロール区のＴＳＮＡ各成分含量の定量結果を表１に示す。

なお、表中のグループ１および２は、収穫直後の葉タバコ表面から採取した菌株の混合懸濁液、グループ３、４および５は、乾燥初期の黄変期（３日目の葉タバコ表面から採取した菌株）、グループ６および７は褐変期（８日目の葉タバコ表面から採取した菌株）からの混合処理区である。表中の％は、コントロール区を１００％とした場合の各処理区におけるＴＳＮＡ各成分の含量％を示すものである。
表１から明かであるように、いずれの微生物混合処理区のＴＳＮＡ含量も、コントロール区のＴＳＮＡ含量と比較して減少した。特に、総ＴＳＮＡ量については、グループ１および２は、それぞれコントロール区に比較してそれぞれ４７．８７％および６４．９５％にまで減少した（表１）。
これらの結果から、葉面微生物から有用なＴＳＮＡ分解微生物が複数分離されたことが明らかになった。
例３．ＴＳＮＡ分解微生物の二次選抜
上述の例２の結果から、ＴＳＮＡ分解能に優れていたグループ１と２について更に二次選抜試験を行った。
グループ１と２に含まれる１４菌株の微生物個々についてのＴＳＮＡ各成分の分解能を調査した。
１／１０ＴＳ液体培地に混合する微生物懸濁液に含まれる微生物の数を上記例１で採取した微生物１菌株とした以外は、上記例２に記載の方法と同様な方法を用いて各菌株のＴＳＮＡ各成分の分解能を調査した。
なお、各定量は２回の反復の平均で行った。
得られた結果を表２に示す。

表２から明らかなようにＬＧ３８菌株、ＬＧ４８菌株、ＬＧ５１菌株およびＬＧ４３菌株はＴＳＮＡの主４成分、即ち、ＮＮＮ、ＮＡＴ、ＮＡＢおよびＮＮＫを分解する能力を有し、特にＬＧ３８菌株は、ＮＮＮ、ＮＡＴ、ＮＡＢおよびＮＮＫ成分をそれぞれ６７．４３％、７５．４０％、６６．６６％および６０．６３％まで低減し、トータルでも６８．００％までＴＳＮＡ含量を低減することができた。
また、ＬＧ２菌株、ＬＧ５菌株およびＬＧ７７菌株はＴＳＮＡ成分のうちＮＮＫを特異的に分解する能力を有し、特にＬＧ５菌株はＮＮＫ含量を３．２４％までに低減する能力を有している菌株であった。
これらの結果から、ＮＮＫを特異的に分解するＬＧ５菌株とＴＳＮＡ各成分を特異的に分解するＬＧ３８菌株を選抜した。
これらの微生物を用いることにより、葉タバコのＴＳＮＡを低減することが可能であると示唆された。また、これらの微生物はたばこの葉から分離されたため、葉タバコに対する定着性に優れており、従って、葉タバコにおけるＴＳＮＡ分解活性が安定して得られると考えられる。
例４．微生物の同定
上記で選抜したＬＧ５およびＬＧ３８菌株についての菌学的性質を表３、表４に示す。

これらの結果から、ＬＧ５菌株はスフィンゴモナス・パウシモビリ（Ｓｐｈｉｎｇｏｍｏｎａｓ ｐａｕｃｉｍｏｂｉｌｉｓ）に属し、ＬＧ３８菌株はシュードモナス・フルオレッセンス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ）に属するものであると同定された。
なお、上記の菌の同定は日本食品分析センターに依頼して行った。
また、ＬＧ５は、特許生物寄託センターに寄託を行い、２００１年１２月１８日受託された（受託番号：ＦＥＲＭ ＢＰ−７８３０号）。同様にＬＧ３８は、特許生物寄託センターに寄託を行い、２００１年１２月１８日に受託された（受託番号：ＦＥＲＭ ＢＰ−７８３１号）。
実施例２：ＬＧ３８菌株による乾燥期間中のＴＳＮＡ含量低減
１／１０ＴＳ液体培地にＬＧ３８菌株を接種し、３０℃で７２時間培養した。
培養後、この菌体を含む培地を５，０００ｒｐｍで遠心し、菌体を分離および集積した。菌体を滅菌蒸留水で２回洗浄した後で、再度滅菌蒸留水に懸濁した。懸濁液の菌体濃度を滅菌蒸留水で希釈し、１０^８〜１０^１０ｃｆｕ／ｍｌに調整した。
所要の菌数に調整した懸濁液を、収穫して乾燥に供したバーレー種（きたかみ１号）の葉タバコに対して処理した。処理時期は、収穫直後、収穫後３日目、および収穫後８日目の３回で、葉タバコ１枚当たり１０ｍｌになるように葉タバコの表裏に噴霧器を使用して噴霧処理した。
葉タバコの乾燥はパイプハウスを使用して行った。乾燥１０日目と、２１日目に処理葉を採取した。採取した葉タバコを葉肉（ラミナ）と中骨（ステム）に分離した後、これらをミキサーを使用して粉砕した。ＴＳＮＡ含量の定量には葉肉を使用した。
ＴＳＮＡ４成分量（ＮＮＮ、ＮＮＫ、ＮＡＴおよびＮＡＢ）の定量は、例２に記載した方法と同様により行った。
なお、総ＴＳＮＡ量は４成分（ＮＮＮ、ＮＮＫ、ＮＡＴおよびＮＡＢ）の合計値で示した。結果を表５に示す。

表５の水処理区とは、処理に際し、菌体を含有しない緩衝液のみで処理したものである。
表５から、ＴＳＮＡ含量は各区とも日数の経過と共に増加し、特に水処理区の増加が著しいことが分かった。ＬＧ３８菌株区は無処理区と比較して、２１日目には無処理区よりもＴＳＮＡ含量が低下していた。
これらの結果から、ＬＧ３８菌株はＴＳＮＡ含量を低減させる能力を有することが示唆された。
また．亜硝酸態窒素含量におけるＬＧ３８の影響を調べた。
前述のように処理した葉タバコでの亜硝酸態窒素含量の定量を行った。定量の方法は次に示す。
まず、各区の葉タバコの葉肉０．５ｇを５０ｍｌ溶遠沈管に採取した。次に、下記に示す抽出液２５ｍｌを添加し、３０分間振とうして、亜硝酸態窒素を抽出した。抽出液をろ紙（ＡＤＶＡＮＴＥＣ、Ｎｏ．１）を用いて濾過した後、濾液１０ｍｌを採取し、そこに活性炭０．５ｇを添加して１５分間振とうした。その後、ろ紙（ＡＤＶＡＮＴＥＣ、Ｎｏ．５Ｃ）を用いて濾過し、活性炭を除去した。得られた濾液を亜硝酸態窒素定量用試料として用いた。
抽出液：
ＫＣｌ （１％ＫＣｌ）
スルファニルアミド （０．５％スルファニルアミド）
トリトンＸ−１００ （０．１％トリトンＸ−１００）
抽出液中の亜硝酸態窒素の定量には、オートアナライザー（ＢＲＡＮ＋ＬＵＥＢＢＥ社製、ＡＡＣＳＩＩ）を使用し、５５０ｎｍのフィルターの透過率から亜硝酸態窒素の含量を換算した。尚、亜硝酸態窒素の発色には、１％のスルファニルアミドと０．１％のＮ−ナフチルエチレンジアミン二塩酸塩を使用した。結果を表６に示す。

表６から明らかであるように、ＴＳＮＡ生成の原因物質である亜硝酸態窒素の含量は、乾燥１０日目において、水処理区では著しく増加しているが、それに比較して、ＬＧ３８菌株区では無処理区よりも僅かではあるが亜硝酸態窒素の含量が低下していた。
ＬＧ３８菌株は、菌学的性質からは硝酸還元能を有する菌株であると同定されたが、上記の結果から、無処理区よりは、硝酸態窒素から亜硝酸態窒素への還元を抑制していることが示唆された。
実施例３：ＬＧ５菌株によるＮＮＫ低減効果
実施例２の５の方法において使用した微生物をＬＧ５に代えた以外は、実施例２に記載の方法と同様にしてＮＮＫ含量を定量した。
結果を表７に示す。

表７より明らかであるように、ＮＮＫ含量は、無処理区では２１日までは増加していたが、３２日目（乾燥終了時）には、２１日目よりも低下していた。水処理区、ＬＧ５菌株区ともに２１日目までは高い含量を示していたが、無処理区と同様に３２日目には２１日目の含量よりも低下していた。ＬＧ５菌株区の３２日目含量は、無処理区の含量より僅かではあるが低下していた。これらの結果から、ＬＧ５菌株はＮＮＫ含量を低減する能力を有していることが示唆された。
ここで引用される文献は、引用によりその全体が本明細書に組み込まれる。
更なる利益および変更が当業者によって容易に想到されるであろう。従って、そのようなより広い範囲を有する本発明は、ここに示し且つ記載された詳細且つ代表的な態様によって限定されるものではない。従って、添付された請求の範囲およびそれらの等価物によって限定されるような全般的な発明の思想の精神および範囲から逸脱することなく種々の変更が可能である。
実施例４：ＴＳＮＡ分解菌処理による葉タバコ粉末中のＴＳＮＡ含量への影響
１／１０ＴＳ液体培地に、ＬＧ５菌株およびＬＧ３８菌株を各々接種し、３０℃で７２時間培養した培養後、これら菌体を含む培地を５，０００ｒｐｍで遠心し、菌体を集めた。菌体を減菌蒸留水で２回洗浄後、再度、滅菌蒸留水に懸濁した。菌体濃度を１０^８〜１０^９ｃｆｕ／ｍｌに調整した微生物懸濁液を接種源とした。
ＬＧ５菌株の実験には、栃木県小山市日本たばこ産業（株）葉たばこ研究所で栽培した乾燥タバコ（品種：きたかみ１号）の合葉着位の凍結乾燥粉末を、ＬＧ３８菌株の実験には本葉着位の凍結乾燥粉末を供試した。
各々のタバコ粉末を乳鉢に量り取り、所定の水分含量になるように微生物懸濁液を添加した。乳棒で粉末中の水分含量が均一になるように混合した。接種粉末を三角フラスコに量り入れ、所定の温度で静置した。
分析は、処理前に採取した試料と静置後４週間後に採取した試料について分析した。各々の試料の５ｇを２００ｍｌ容三角フラスコに量り取り、０．０１ＭＮａＯＨ溶液（Ｔｈｉｍｅｒｏｓａｌ：１００μｇ／ｍｌ含有）を１００ｍｌ加え、振とう機により室温で２時間抽出した。その後、ろ紙（ＡＤＶＡＮＴＥＣ社、Ｎｏ．５Ｃ）を用いて抽出液をろ過した。
ついでＴＳＮＡの４成分量（ＮＮＮ、ＮＮＫ、ＮＡＴ及びＮＡＢ）を実施例１に記載の方法で分析した。
処理前と静置後４週間後のＴＳＮＡ含量を表８および表９に示す。

上記の実験より、ＬＧ５菌株はＴＳＮＡの４成分の中でＮＮＫを特異的に分解し、ＬＧ３８菌株は、ＴＳＮＡの４成分全てを分解した。
ＬＧ５菌株を処理した合葉粉末の４週間後のＮＮＫ含量は、処理前より減少していた。ＬＧ３８菌株を処理した本葉の４週間後のＮＮＮおよびＮＡＴ含量を処理前と比較すると、２成分ともいずれの処理区でも減少していた。タバコ粉末を供試した実験においても、前述の実験と同様にＬＧ５菌株はＮＮＫを分解し、ＬＧ３８菌株はＮＮＮおよびＮＡＴを分解した。
実施例５：ＴＳＮＡ分解菌処理による貯蔵葉たばこ中のＴＳＮＡ含量への影響
ＬＧ３８菌株を１／１０ＴＳ液体培地に接種し、３０℃で７２時間培養した。培養後、菌体を含む培地を５，０００ｒｐｍで遠心し、菌体を集めた。菌体を滅菌蒸留水で２回洗浄後、再度滅菌蒸留水に懸濁した。菌体濃度を１０^８〜１０^９ｃｆｕ／ｍｌに調整した微生物懸濁液を接種源とした。
微生物懸濁液を、パイプハウスで乾燥中のバーレー種の葉タバコ（中骨乾乾燥末期、乾燥２９日目、品種：きたかみ１号）の表裏に１枚当たり１０ｍｌずつ、噴霧器を使用して処理した。処理した葉タバコを３日間パイプハウスで乾燥した後、貯蔵試験に供試した。
分析試料の採取：貯蔵を開始する前に、パイプハウスから取降ろした葉タバコ乾棄の半葉葉肉を採取し、処理前サンプルとした。残りの中骨が付いた半葉葉肉について貯蔵した。貯蔵は、一定の条件に設定した恒温恒湿を使用した。貯蔵の条件として、温度２０℃湿度７０％、温度２０℃湿度８０％、温度３０℃湿度８０％の三区を設定した。貯蔵後一ヶ月、三ヶ月後にサンプリングした。微生物を処理せずに上記と同様の条件で貯蔵した乾葉を対照区とした。採取した葉タバコを、葉肉と中骨に分離した後、凍結乾燥した葉肉のサンプルを、ミキサーを使用して粉砕した。ＴＳＮＡ含量の定量には葉肉のサンプルのみを使用した。
前述の処理をした各区の葉肉サンプル約５ｇを２００ｍｌ容三角フラスコにはかり取り、０．０１ＭＮａＯＨ溶液（Ｔｈｉｍｅｒｏｓａｌ：１００μｇ／ｍｌ含有）を１００ｍｌ加え、振とう機により室温で２時間抽出した。その後、ろ紙（ＡＤＶＡＮＴＥＣ社、Ｎｏ．５Ｃ）を用いて抽出液をろ過した。
ＴＳＮＡの４成分量（ＮＮＮ、ＮＮＫ、ＮＡＴ及びＮＡＢ）の定量は、実施例１に記載の方法により分析した。
結果を、表１０に示す。

無処理区の貯蔵１ヶ月後では、２０℃、７０％区および３０℃、７０％区で増加した。特に、３ヵ月後で３０℃、７０％および３０℃、８０％区で大きく増加した。ＬＧ３８菌株処理区では、１ヶ月、３ヶ月後に減少する傾向が見られた。特に、貯蔵１ヶ月後では大きく減少していた。

Claims (15)

1. 葉タバコに対して、スフィンゴモナス・パウシモビリス種およびシュードモナス・フルオレッセンス種に属し、ＴＳＮＡを低減する能力を有する微生物からなる群より選択される微生物を処理することを特徴する葉タバコのＴＳＮＡ含量を低減する方法。
2. 前記ＴＳＮＡを低減する微生物を処理することが、葉タバコの収穫直前および／または乾燥期の開始時から貯蔵期の終了時までの間に行われることを特徴とする請求項１に記載の方法。
3. 前記ＴＳＮＡを低減する微生物を処理することが、懸濁液または乾燥菌体の何れかの状態にある前記微生物の菌体を、散布または塗布の何れかの方法によって行われることを特徴とする請求項１に記載の方法。
4. 前記ＴＳＮＡを低減する微生物を処理することが、懸濁液または乾燥菌体の何れかの状態にある前記微生物の菌体を、散布または塗布の何れかの方法によって行われることを特徴とする請求項２に記載の方法。
5. 前記ＴＳＮＡが、Ｎ’−ニトロソノルニコチン、４−（Ｎ’−ニトロソメチルアミノ）−１−（３−ピリジル）−１−ブタノン）、Ｎ’−ニトロソアナタビンおよびＮ’−ニトロソアナバシンからなる群より選択される少なくとも１つであることを特徴とする請求項１に記載の方法。
6. 前記葉タバコが、在来種およびバーレー種からなる群より選択されることを特徴とする請求項１に記載の葉タバコのＴＳＮＡ含量を低減する方法。
7. 葉タバコに対して、スフィンゴモナス・パウシモビリスＬＧ５菌株およびシュードモナス・フルオレッセンスＬＧ３８菌株からなる群より選択されるＴＳＮＡを低減する微生物を処理することを特徴する葉タバコのＴＳＮＡ含量を低減する方法。
8. 前記ＴＳＮＡを低減する微生物を処理することが、葉タバコの収穫直前および／または乾燥期の開始時から貯蔵期の終了時までの間に行われることを特徴とする請求項７に記載の方法。
9. 前記ＴＳＮＡを低減する微生物を処理することが、懸濁液または乾燥菌体の何れかの状態にある前記微生物の菌体を、散布または塗布の何れかの方法によって行われることを特徴とする請求項７に記載の方法。
10. 前記ＴＳＮＡが、Ｎ’−ニトロソノルニコチン、４−（Ｎ’−ニトロソメチルアミノ）−１−（３−ピリジル）−１−ブタノン）、Ｎ’−ニトロソアナタビンおよびＮ’−ニトロソアナバシンからなる群より選択される少なくとも１つであることを特徴とする請求項７に記載の方法。
11. 前記葉タバコが、在来種およびバーレー種からなる群より選択されることを特徴とする請求項７に記載の葉タバコのＴＳＮＡ含量を低減する方法。
12. スフィンゴモナス・パウシモビリスまたはシュードモナス・フルオレッセンスに属し、葉タバコの乾燥および貯蔵中に生成するＮ’−ニトロソノルニコチン、４−（Ｎ’−ニトロソメチルアミノ）−１−（３−ピリジル）−１−ブタノン）、Ｎ’−ニトロソアナタビンおよびＮ’−ニトロソアナバシンからなる群より選択される少なくとも１成分の葉タバコ中の含量を低減する能力を有する微生物。
13. 葉タバコ中のＴＳＮＡ含量を低減するスフィンゴモナス・パウシモビリスＬＧ５菌株（ＦＥＲＭ ＢＰ−７８３０）。
14. 葉タバコ中のＴＳＮＡ含量を低減するシュードモナス・フルオレッセンスＬＧ３８菌株（ＦＥＲＭ ＢＰ−７８３１）。
15. 葉タバコに対して、スフィンゴモナス・パウシモビリス種およびシュードモナス・フルオレッセンス種に属し、ＴＳＮＡを分解する能力を有する微生物からなる群より選択される微生物を処理することを特徴する葉タバコのＴＳＮＡ含量を低減する方法。