BR0309909B1 - Processo de redução de teor de TSNA em folha de tabaco - Google Patents

Description

Relatório Descritivo da Patente de Invenção para "PROCESSO DE REDUÇÃO DE TEOR DE TSNA EM FOLHA DE TABACO".

Campo Técnico A presente invenção refere-se a um microorganismo que degra- da nitrosaminas formadas em folhas de tabaco durante os processos de cura e armazenamento das folhas de tabaco, e um processo de redução de nitro- saminas formadas em folhas de tabaco durante seu processo de cura e/ou processo de armazenamento, através do uso de microorganismo.

Fundamentos da Técnica Nitrosaminas contidas em folhas de tabaco (Nitrosaminas Espe- cíficas de Tabaco, que serão referidas como "TSNA" a seguir), não estão presentes em folhas de tabaco imediatamente após colheita (isto é, folhas verdes), mas formadas durante o processo de cura e processo de armaze- namento a seguir através de reação entre alcalóides e nitrito contido nas folhas de tabaco. Este nitrito é formado por um microorganismo que está presente na superfície da folha de tabaco e que tem a capacidade de reduzir nitrato.

As principais TSNA formadas no processo de cura e subse- qüente processo de armazenamento são Ν'-nitroso nornicotina (que será referida como "NNN" daqui por diante), 4-(N-nitroso metil amino)-1-(3- piridil)-1-butanona (que será referida como "NNK" daqui por diante), Ν'- nitroso anatabina (que será referida daqui por diante como "NAT"), Ν'- nitroso anabasina (que será referida como "NAB" daqui por diante), e se- melhantes.

Exemplos do processo que têm sido convencionalmente conhe- cidos como um processo de redução de teor de TSNA em folhas de tabaco incluem: (1) um processo de supressão de formação de TSNA; e (2) um pro- cesso de remoção de TSNA que foi formada.

Exemplos do processo de supressão de formação de TSNA in- cluem: um processo de diminuição de teor de alcalóides em folhas de tabaco através de redução de quantidade de fertilizador nitrogenoso; um processo de redução de TSNA formada durante o processo de cura, através de adoção de um tipo de aquecimento indireto de celeiro de cura em lugar de um tipo de aquecimento - direto de celeiro de cura (este processo é principalmente empregado para tabaco curado em fumeiro); um processo de multiplicação de novas variedades de tabaco tendo teor de alcalóide; cujo processo ba- seia-se no progresso da tecnologia de multiplicação; e semelhantes.

Ainda, um processo foi recentemente reportado no qual forma- ção de TSNA é suprimida por irradiação com microondas (PCT National Pu- blication Ne 2001-503247). Entretanto, tais rápidas secagem e cura como causadas pelo tratamento mencionado anteriormente com microondas re- sultam em insuficiente alteração no tipo de componentes das folhas de taba- co, cuja alteração podia ser efetuada em uma maneira satisfatória no pro- cesso de cura convencional. Pelo que, as resultantes folhas de tabaco que foram curadas mais rapidamente que através do processo convencional exi- bem aroma e sabor pobres quando fumadas.

No caso do processo de remoção de TSNA (assim formada) de folhas de tabaco, o número de seus exemplos reportados é menor que o processo de supressão de formação de TSNA. Como um destes exemplos, um processo é conhecido no qual TSNA é removida de folhas de tabaco por extração supercrítica (WO 01/65954). Entretanto, este processo não foi colo- cado em uso prático em termos de seu custo.

Devido às circunstâncias descritas acima, tem havido uma de- manda por um novo processo de redução de teor de TSNA que é conhecida ser formada durante os processos de cura e armazenamento de folhas de tabaco.

Ainda, tem havido uma demanda por folhas de tabaco, como o material bruto de cigarros, que tenham relativamente menos teor de TSNA e mantenham bom aroma e sabor satisfatório para consumidores.

Da mesma maneira, o objeto da presente invenção é prover um processo que permite redução de teor de TSNA formada durante os conven- cionais processos de cura e armazenamento.

Adicionalmente, já é conhecido que um microorganismo perten- cendo ao gênero Aspergillus que é um fungo filamentoso isolado de fonte de soja não-refinada degrada nitrosaminas (Jpn. Pat. Appln. KOKAI Publication N- 10-276681). Entretanto, foi destacado que microorganismos que perten- cem ao gênero Aspergillus precisam de alto teor de umidade para sobrevi- vência, cujo alto teor de umidade pode causar efeitos adversos sobre a qua- lidade de folhas de tabaco, especialmente sobre seu aroma e sabor. Por isso, uso de um tal microorganismo como descrito acima no tratamento de folhas de tabaco pode causar um problema em qualidade de tabaco.

Descrição da Invenção De acordo com um primeiro aspecto da presente invenção, é provido um processo de redução de teor de TSNA em folhas de tabaco, ca- racterizado por compreender tratamento de folhas de tabaco com um micro- organismo que tem a capacidade de reduzir TSNA e que é selecionado do grupo consistindo em Sphingomonas paucimobilis e Pseudomonas fluores- cens.

De acordo com um segundo aspecto da presente invenção é provido um processo de redução de teor de TSNA em folhas de tabaco, ca- racterizado por compreender tratamento de folhas de tabaco com um micro- organismo selecionado do grupo consistindo em Sphingomonas paucimobilis cepa LG5 e Pseudomonas fluorescens cepa LG38.

De acordo com um terceiro aspecto da presente invenção, é provido um microorganismo que pertence a Sphingomonas paucimobilis ou Pseudomonas fluorescens e que tem a capacidade de reduzir o teor de pelo menos um tipo de TSNA em folhas de tabaco que é selecionada do grupo consistindo em N’-nitroso nornicotina, 4-(N-nitroso metil amino)-1-(3-piridil)- 1-butanona, Ν'-nitroso anatabina e Ν’-nitroso anabasina, onde estas são for- madas durante os processos de cura e armazenamento das folhas de tabaco.

De acordo com um quarto aspecto da presente invenção, é pro- vido um Sphingomonas paucimobilis cepa LG5 (FERM BP-7830) que é ca- paz de reduzir o teor de TSNA em folhas de tabaco.

De acordo com um quinto aspecto da presente invenção, é pro- vido um Pseudomonas fluorescens cepa LG38 (FERM BP-7831) que é ca- paz de reduzir o teor de TSNA em folhas de tabaco.

Melhor Modo de Realização da Invenção Como um resultado de estudo e análise do processo de forma- ção de TSNA durante a cura e armazenamento de folhas de tabaco, os in- ventores da presente invenção descobriram que existe um microorganismo que pode degradar TSNA, entre os microorganismos presentes sobre folha de tabaco, pelo que completando a presente invenção.

Enquanto os invetores da presente invenção estavam analisan- do o processo de formação de TSNA em folhas de tabaco que estavam sen- do curadas, eles isolaram um microorganismo que pode degradar a TSNA formada, a partir dos microorganismos presentes sobre folhas de tabaco.

Ainda, os inventores da presente invenção descobriram que o conteúdo de TSNA em folhas de tabaco pode ser reduzido através de tratamento, com o microorganismo, de folhas de tabaco que estão sendo curadas e/ou as fo- lhas de tabaco que são para serem estocadas após o processo de cura.

Os dois tipos de microorganismos que exibem atividade de de- gradação especialmente alta entre os microorganismos isolados (coletados) foram identificados, nas bases de suas características bacteriológicas, como Sphingomonas paucimobilis e Pseudomonas fluorescens, respectivamente.

Os inventores da presente invenção nomearam a cepa de Sphingomonas paucimobilis "LG5" (que será referida como "LG5" ou "cepa LG5" daqui por diante), e a cepa de Pseudomonas fluorescens "LG38" (que será referida como "LG38" ou "cepa LG38" daqui por diante). LG5 foi depositada com o número de acesso FERM BP-7830 e LG38 foi depositada com número de acesso FERM BP-7831, respectivamente, em 18 de dezembro de 2001, sob International Patent Organism Depositary (IPOD), National Institute of Advan- ced Industrial Science and Technology (AIST Tsukuba Central 6,1-1 Higashi 1-chome, Tsukuba-shi, Ibaraki-ken, Japan).

Estes microorganismos LG5 e Lg38 efetivamente reduzem TSNA em folhas de tabaco sem causar qualquer efeito adverso sobre a qualidade das folhas de tabaco que estão sendo curadas e/ou as folhas de tabaco em armazenamento.

Ainda, de acordo com o processo da presente invenção, redução do teor de TSNA pode ser obtido simplesmente através de tratamento de folhas de tabaco com o microorganismos, sem alteração de processo con- vencional de cura. Assim, a qualidade, aroma e sabor das presentes folhas de tabaco podem ser confiavelmente mantidos. A atividade de cepas LG5 e LG38 é como se segue. LG5 tem a atividade de especificamente degradar NNK. LG38 tem a atividade de degradação de NNN, NNK, NAT e NAB.

Folha de tabaco a ser tratada de acordo com a presente inven- ção pode ser qualquer tabaco, tanto quanto o tabaco permita uma convenci- onal operação de cura. Seus exemplos específicos incluem tabaco Burley e tabaco doméstico Japonês como um tipo curado com ar, e tabaco curado em fumeiro que é curado com um aparelho, sem restrição ao mesmo. O tempo quando folha de tabaco é tratada com o microorganis- mo de acordo com a presente invenção não é particularmente restrito, e o tratamento pode ser realizado em qualquer momento em um período de a partir do momento imediatamente antes de TSNA ser formada em folha de tabaco ao momento quando folha de tabaco é processada em cigarros. O tratamento é preferivelmente realizado em um período durante o qual folha de tabaco é curada e/ou um período durante o qual folha de tabaco é esto- cada. Em um caso no qual o tratamento é realizado no processo de cura, o tratamento é preferivelmente realizado em um período de tempo imediata- mente após colheita, que é o momento antes de TSNA ser formada, ao mo- mento de estágio de amarelecimento e estágio de cor marrom. Entretanto, o tratamento pode ser realizado em qualquer momento no processo de cura.

Em um caso no qual o tratamento é realizado no processo de armazena- mento, o tratamento é preferivelmente realizado quando armazenamento é iniciada após o processo de cura, embora o tratamento possa ser realizado em qualquer momento durante o período de armazenamento. O tempo quando o tratamento é realizado pode ser basicamente selecionado por um operador, como desejado, em um período a partir do momento quando o processo de cura é iniciado ao momento quando o processo de armazena- mento é completado.

Alternativamente, é aceitável que folha de tabaco seja tratada com o microorganismo no campo imediatamente antes de colheita e então colhida e curada. O número de vezes do tratamento com o microorganismo de acordo com a presente invenção não é limitado a uma vez. O tratamento pode ser realizado várias vezes consecutivamente no período de tratamento, com um predeterminado intervalo entre cada tratamento. O tratamento na presente invenção não é limitado ao tratamento durante os processos de cura e/ou armazenamento, e o tratamento pode ser realizado em um processo durante o qual folha de tabaco é processada em cigarros. O tratamento de acordo com a presente invenção pode ser reali- zado através de quaisquer processos conhecidos, seus exemplos incluem pulverização de suspensão na qual o microorganismo está suspenso e re- vestimento de pó contendo células bacteriais do microorganismo. Ou seja, um operador pode selecionar um apropriado processo para o tratamento. É também aceitável imergir a folha de tabaco em um líquido contendo o micro- organismo.

Como descrito acima, o microorganismo que é preferivelmente usado na presente invenção é cepa LG5 e cepa LG38. Entretanto, a pre- sente invenção não é restrita a estas cepas. Quaisquer espécies de microor- ganismos que pertençam a Sphingomonas paucimobilis ou Pseudomonas fluorescens e que tenha a capacidade de reduzir TSNA estão incluídas no escopo da presente invenção.

No presente relatório descritivo, o termo "para reduzir TSNA" representa redução de teor de TSNA em folha de tabaco. Por exemplo, para degradar cada um dos componentes de TSNA em folha de tabaco formado durante seus processos de cura e armazenamento está incluído no termo "para reduzir TSNA".

Como um meio de cultura para cultura de microorganismo usado na presente invenção, vários tipos de meios de cultura conhecidos para cul- tura de microorganismos podem ser usados.

Com relação às condições de cultura sob as quais o microorga- nismo é cultivado, a temperatura pode estar na faixa de 25 a 35°C, preferi- velmente em uma faixa de 28 a 32°C, e pH pode estar em uma faixa de 6,0 a 8,0, preferivelmente 7,0 ou mais.

Na presente invenção, o microorganismo é coletado por centri- fugação, após cultivado por um período predeterminado. As células bacteri- ais coletadas podem ser usadas após serem suspensas em um tampão. Al- ternativamente, as células bacteriais coletadas podem ser usadas em forma pulverizada por secagem - congelamento.

Em um caso onde as células bacteriais coletadas são suspensas em um tampão específico para preparação da suspensão de microorganis- mos, água destilada esterilizada, tampão fosfato ou semelhante pode ser usado como o tampão. A concentração das células bacteriais suspensas em um tampão pode ser 107 a 1012, preferivelmente 108 a 101° células por 1 ml do tampão.É preferível que as células bacteriais sejam suspensas em uma concentração tal como descrito acima quando usadas para o tratamento de folha de taba- co com o microorganismo.

De acordo com a presente invenção, o tratamento de folha de tabaco com o microorganismo pode ser realizado usando as células bacteri- ais obtidas como descrito acima Uma solução de inoculação para o microorganismo para inocu- lação em folha de tabaco é preparada pela adição de água destilada esterili- zada à suspensão bacterial contendo a quantidade necessária das células bacteriais. Solução de inoculação assim preparada é uniformemente espar- gida sobre folha de tabaco. Este tratamento pode ser realizado em qualquer momento dentro do período de processo de cura ao processo de armaze- namento. Em um caso usando tabaco curado ao ar, o tratamento pode ser realizado em qualquer momento durante o processo de cura e o período de armazenamento a seguir. Em um caso de uso de tabaco curado em fumeiro, o tratamento é realizado no estágio inicial do processo de cura (o estágio de amarelecimento) ou no processo de armazenamento após o processo de cura. É preferível que o tratamento seja realizado no estágio de amareleci- mento no processo de cura. No caso de tabaco curado ao ar, é preferível que o tratamento seja realizado no estágio de formação de cor marrom no processo de cura.

Com relação à quantidade da solução de inoculação a ser es- pargida, quando o tratamento é realizado imediatamente após colheita ou no estágio inicial do processo de cura, 2 a 10 ml da solução de inoculação são aplicados sobre uma peça de folha de tabaco. Quando o tratamento é reali- zado em um estágio intermediário do processo de cura ou a seguir, 0,5 a 3 ml da solução de inoculação são aplicados por uma peça de folha de tabaco.

Com relação ao número de vezes do tratamento, é suficiente que o tratamento seja realizado pelo menos uma vez durante os processos de cura e/ou armazenamento. É preferível que o tratamento seja realizado duas ou três vezes durante os processos de cultura e/ou armazenamento, com um intervalo entre cada tratamento.

De acordo com os aspectos da presente invenção, nenhuma significante mudança é efetuada na condição de cura exceto que folha de tabaco é tratada com microorganismo, e por isso é possível reduzir o teor de TSNA sem causar um efeito adverso sobre aroma e sabor naturais da folha de tabaco.

Exemplos Exemplo 1 1) Isolamento de microorganismo de folhas de tabaco Microorganismos foram coletados de folhas de tabaco crescidas em campo de tabaco em Oyama-shi, Tochigi prefecture.

Os microorganismos foram coletados três vezes, isto é, imedia- tamente após a colheita de folhas de tabaco, no dia 3 no período de cura (ou seja, quando a mudança em cor das folhas para amarelo foi completada), e no dia 8 no período de cura (ou seja, quando a mudança em cor das folhas para marrom foi completada). A posição de haste de folha de Michinoku 1, que é tabaco Burley, foi colhida, e porções de lâmina das folhas de tabaco colhidas foram cortadas como amostras. As amostras assim obtidas foram finamente cortadas em quadrados de 5 mm x 5 mm. Aproximadamente 10 g das amostras assim cor- tadas foram colocados em um frasco Erlenmeyer de 300ml. 200 ml de tampão fosfato 10 mM (pH 7,0) foram adicionados, e a mistura foi homogeneizada. A suspensão assim obtida foi usada como "a suspensão tempo - colheita" contendo microorganismos derivados das folhas de tabaco no momento de colheita.

Coleção de microorganismos de folhas de tabaco no período de cura (isto é, coleta no dia 3 no processo de cura quando a mudança para cor amarela foi completada; e coleta no dia 8 no processo de cura quando a mudança para cor marrom foi completada) foi realizada, usando as folhas de tabaco que foram colhidas como descrito acima e então colocadas no pro- cesso de cura, em uma maneira similar àquela na coleta de microorganis- mos no estágio de colheita. Especificamente, a posição de haste de folha de Michinoku 1 colhida como descrito acima pendurada em um fumeiro de aço, que é um celeiro de cura convencional para tabaco curado ao ar. No dia 3 e dia 8 a seguir, porções de lâmina das folhas de tabaco assim sendo curadas foram cortadas como amostras. As amostras assim obtidas foram finamente cortadas em quadrados de 5 mm x 5 mm. Aproximadamente 10 g das amos- tras assim cortadas foram coletados e colocados em um frasco Erlenmeyer de 300 ml. 200 ml de tampão fosfato 10 mM (pH: 7,0) foram adicionados, e a mistura foi homogeneizada. As suspensões assim obtidas foram usadas como "as suspensões tempo de cura" contendo microorganismos derivados das folhas de tabaco no período de cura.

Em cada uma das três coleções de diferente momento, as folhas de tabaco coletadas foram homogeneizadas dentro de 2 horas para amos- tragem. A suspensão tempo de colheita e a suspensão tempo de cura foram diluídas com o tampão fosfato mencionado acima, para uma concen- tração na qual microorganismo pode ser isolado (especificamente, 102 a 105 vezes), respectivamente. Cada uma das suspensões diluídas assim obtida foi aplicada, por gotejamento de 0,1 ml por vez, sobre uma placa YG (a composi- ção do meio de cultura foi como se segue: 1,0 g de extrato de levedura: 1,0 g de glicose: 0,3 g de K2HPO4; 0,2 g de KH2PO4; 0,2 g de MgSC^JhfeO; 15,0 g de ágar; e uma quantidade ajustada de água destilada para fazer 0 volume total do meio de cultura 1000 ml, pH 6,8). O microorganismo assim aplicado foi cultivado a 30°C por 7 dias. Após cultura, a colônia crescida foi separada em uma colônia simples através do uso de uma placa YG nova. O microor- ganismo assim isolado foi estocado a -80°C até usado para experimentos.

Em uma maneira tal como descrito acima, 87 cepas de microor- ganismos foram isoladas a partir das folhas de tabaco de tempo - colheita e 176 cepas de microorganismos foram isoladas das folhas de tabaco que estão no estágio de formação de cor marrom. As cepas tendo diferentes morfologias de colônia foram selecionadas destas cepas coletadas e usadas para os experimentos a seguir.

2) Seleção primária de microorganismo degradando - TSNA

Entre as cepas derivadas de folhas de tabaco assim coletadas em 1), 51 cepas no total incluindo 14 cepas coletadas de folhas de tabaco no estágio de colheita e 37 cepas coletadas de folhas de tabaco no estágio de cura foram selecionadas como as cepas candidatas para seleção primária, a) Seleção de meio de cultura Um meio de cultura para seleção de microorganismo degradando - TSNA foi examinado. Através do uso de cepas selecionadas em 1) menci- onado anteriormente, crescimento de cada cepa sobre um meio de cultura contendo NNN, NNK, NAT e NAB foi examinado. Como um resultado, 0 melhor resultado foi obtido quando caldo TS 1/10 foi usado como o meio ba- sal. Da mesma maneira, caldo TS 1/10 foi usado como o meio basal na sub- seqüente cultura. A composição de próprio caldo TS 1/10 e a composição do meio de cultura contendo caldo TS 1/10 e o microorganismo, que foi usado para cultura, são mostradas abaixo nesta ordem. [Caldo TS 1/10] - Volume final ajustado para 1000 ml através da adição de água destilada - Caseína 1,7 g - D-glicose 0,25 g - NaCI 0,5 g - K2HPO4 2,5 g - Soja triptica 1/10 (fabricada por Difco Co., Ltd., Bacto Tryptic Soy Broth;

Meio de digestão soja - caseína) [meio de cultura para seleção de microor- ganismo degradante em TSNA] - Volume final 35 ml - Caldo TS 1/10 (contendo 5 ppm de NNN, 5 ppm de NAT, 5 ppm de NAB e 5 ppm de NNK) 30 ml - Suspensão de microorganismo para inoculação 5 ml O meio de cultura mencionado anteriormente para seleção de microorganismo degradando em TSNA foi preparado através do seguinte processo. 150 μΙ de diclorometano contendo 1000 ppm de NNN, 150 μΙ de diclorometano contendo 1000 ppm de NAT, 150 μΙ de diclorometano conten- do 1000 ppm de NAB, e 150 μΙ de diclorometano contendo 1000 ppm de NNK, foram colocados em um frasco Erlenmeyer e então diclorometano no frasco foi completamente volatilizado. A seguir, o caldo TS 1/10 foi adiciona- do ao frasco de modo que as concentrações de NNN, NAT, NAB e NNK fo- ram ajustadas para 5 ppm /10 ml, respectivamente. Após NNN, NAT, NAB e NNK serem dissolvidas, 30 ml da mistura foram colocados em cada um dos frascos Erlenmeyer de 50 ml. A seguir, 5 ml da suspensão do microorganis- mo para inoculação foram adicionados ao frasco Erlenmeyer de 50 ml, pelo que um meio de cultura para seleção de microorganismo de degradação em TSNA, que teve um volume final de 35 ml, foi obtido. O meio de cultura foi incubado a 30°C por 24 horas com agitação, b) Seleção primária do microorganismo degradando - TSNA A seleção primária do microorganismo degradando em TSNA foi realizada através do uso de meio de cultura para seleção assim preparado.

As cepas candidatas para seleção primária foram cada uma cul- tivada com agitação no caldo TS 1/10 e então as células bacteriais de cada cepa foram coletadas por centrifugação. As células bacteriais assim coleta- das foram lavadas duas vezes com água destilada esterilizada e suspensas em água destilada esterilizada. A seguir, a concentração do microorganismo em cada suspensão foi ajustada para 108 a 101° cfu/ml com água destilada esterilizada, pelo que uma suspensão de cada cepa candidata foi preparada.

Cinco a 10 cepas do microorganismo candidato em uma forma de suspensões assim obtidas, foram misturadas umas com as outras, onde as 5 a 10 cepas misturadas são derivadas do mesmo estágio de folhas de tabaco. Pelo que 7 grupos de misturas de suspensões dos microorganismos candidatos foram preparados.

Estes 7 grupos de misturas de suspensões dos microorganismos candidatos foram cultivados em uma maneira similar àquela do 1) mencionado anteriormente através do uso de caldo TS 1/10 como o meio de cultura para seleção de microorganismo degradando em TSNA, exceto que os 7 grupos descritos acima de misturas de suspensões dos microorganismos candida- tos foram empregados.

Como um controle, 5 ml de água destilada esterilizada foram adi- cionados no lugar da suspensão dos microorganismos candidatos.

Os 7 grupos de suspensão dos microorganismos candidatos mis- tos e o grupo controle foram incubados a 30°C por 24 horas com agitação. A seguir, os teores das respectivas TSNA foram determinados. A determinação dos teores das respectivas TSNA foram deter- minados pelo seguinte processo. Especificamente, teores de NNN, NAT, NAB e NNK contidos em uma amostra obtida de cada meio de cultura foram cada um determinados através do uso de cromatografia gasosa de acordo com o processo aperfeiçoado de Spiegelhalder (Spiegelhalder B., Kubacki S. e Fis- cher S. (1989) Beitr. Tabakforsch. Int., 14(3), 135-143, Fischer S. and Spie- gelhalder B. (1989) Beitr. Tabakforsch. Int., 14(3), 145-153).

Primeiro, cada meio de cultura foi purificado através do uso de cromatografia de coluna como se segue. Primeiro, todo o meio de cultura foi filtrado através do uso de um papel de filtro (ADVANTEC, N° 5). Então, 10 ml de cada filtrado foi aplicado sobre uma coluna enchida com Kieselgur (diâ- metro de partícula: 60 a 160 mm, fabricado por MERCK Co., Ltd.) e ácido ascórbico. Uma fração necessária para uma amostra foi coletada por disso- lução da fração com diclorometano. A fração assim obtida foi usada como uma amostra para cromatografia gasosa. A amostra assim obtida foi anali- sada através do uso de cromatografia gasosa HP 6890 (fabricado por Hewlett-Packard Co., Ltd.) equipado com coluna DB-17 (fabricada por J & W

Co. Ltd.) e detector TEA-543 (fabricado por Thermedics Co., Ltd.).

Os resultados de determinação dos teores da respectiva TSNA nos 7 grupos descritos acima e o grupo controle são mostrados na tabela 1.

Tabela 1 Resultados da seleção primária Grupo 1 e Grupo 2 na Tabela 1 cada um representa a mistura de suspensões das cepas coletadas de folhas de tabaco imediatamente após colheita. Grupo 3, Grupo 4 e Grupo 5 cada um representa a mistura de sus- pensões das cepas coletadas de folhas de tabaco no estágio de amareleci- mento que é o estágio inicial do processo de cura (no dia 3 do processo de cura). Grupo 6 e Grupo 7 cada um representa a mistura de suspensões das cepas coletadas de folhas de tabaco no estágio de formação de cor marrom (no dia 8 do processo de cura). Na tabela ,"%" representa o teor (%) da res- pectiva TSNA em cada grupo, quando os correspondentes teores no grupo controle são expressos como 100%.

Como é óbvio a partir da Tabela 1, em todos os grupos da mistu- ra de microorganismos, os teores de TSNA foram diminuídos como compa- rados com os teores de TSNA do grupo controle. Com relação à quantidade total de TSNA, em particular, a quantidade total de TSNA de Grupo 1 e aquela de Grupo 2 foram diminuídas para 47,87% e 64,95%, respectiva- mente, como comparada com aquela do grupo controle (Tabela 1). A partir destes resultados, foi provado que tipos plurais de mi- croorganismos úteis que degradam TSNA foram isolados com sucesso de folhas de tabaco.

3) Seleção secundária do microorganismo degradando - TSNA

Nas bases dos resultados de 2) mencionados anteriormente, Grupo 1 e Grupo 2 exibindo excelente capacidade para degradar TSNA foram ainda submetidos a um teste para seleção secundária.

Para cada uma das 14 cepas dos microorganismos contidos em Grupo 1 e Grupo 2, a capacidade para degradar sua respectiva TSNA foi testada. A capacidade para degradar a respectiva TSNA, de cada uma das 14 cepas, foi testada em uma maneira similar àquela descrita em 2) mencionado anteriormente, exceto que o número do tipo do microorganismo contido em cada suspensão de microorganismos (cuja cada suspensão foi misturada com o caldo TS 1/10) foi limitado a uma cepa selecionada das cepas dos microorganismos coletados em 1) mencionado anteriormente.

Cada um dos valores de teor determinados foi a média dos valo- res obtidos por duas determinações repetidas.

Os resultados assim obtidos são mostrados na Tabela 2.

Tabela 2. Capacidade de cada cepa para degradação de TSNA

Como é óbvio a partir da Tabela 2, cepa LG38, cepa LG48, cepa LG51 e cepa LG43 são capazes de degradarem NNN, NAT, NAB e NNK.

Cepa LG38, em particular reduziu NNN, NAT, NAB e NNK para 67,43%, 75,40%, 66,66% e 60,63%, respectivamente. Cepa LG38 reduziu o teor de TSNA total para 68,00%.

Ainda, cepa LG2, cepa LG5 e cepa LG77 são capazes de de- gradarem especificamente NNK. Cepa LG5, em particular, é capaz de redu- zir o teor de NNK para 3,24%.

Nas bases dos resultados descritos acima, cepa LG5 capaz de degradar especificamente NNK e cepa LG38 capaz de degradar especifica- mente a respectiva TSNA foram selecionadas.

Os resultados descritos acima indicam que TSNA em folhas de tabaco pode ser significantemente reduzida através de tratamento de folhas de tabaco com os microorganismos mencionados anteriormente. Os micro- organismos mencionados anteriormente foram isolados de folhas de tabaco, e por isso exibem excelente estabilidade quando colocados sobre folhas de tabaco. É assumido que, devido a sua capacidade de fixação sobre folhas de tabaco, o microorganismo pode exibir atividade de degradação de TSNA sobre folhas de tabaco em uma maneira suficientemente estável. 4) Identificação do microorganismo As características bacteriológicas de cepa LG5 e cepa LG38 as- sim selecionadas são resumidas na Tabela 3 e Tabela 4.

Tabela 3 Características bacteriológicas de cepa LG5 Tabela 3 (continuação) Tabela 4 Características bacteriológicas de cepa LG38 Tabela 4 (continuação) Nas bases dos resultados descritos acima, cepa LG5 foi identifi- cada como microorganismo que pertence a Sphingomonas paucimobilis e LG38 foi identificado como microorganismo que pertence a Pseudomonas fluorescens. A identificação das bactérias mencionadas anteriormente foi rea- lizada com a ajuda de Japan Food Research Laboratories. LG5 foi depositado sob International Patent Organism Depositary descrito acima com 18 de dezembro de 2001 (número de acesso: FERM BP-7830). Similarmente, LG38 foi depositado sob International Patent Orga- nism Depositary em 18 de dezembro de 2001 (número de acesso: FERM BP-7831).

Exemplo 2: Diminuição em teor de TSNA em processo de cura através de tratamento com cepa LG38 Cepa LG38 foi inoculada no caldo TS 1/10 e cultivada a 30°C por 72 horas. Após a cultura, o meio de cultura contendo as células bacteri- ais foi submetido à centrifugação em 5000 rpm, de modo que as células bacteriais foram separadas e coletadas. As células bacteriais assim coleta- das foram lavadas duas vezes com água destilada esterilizada e suspensas em água destilada esterilizada. A concentração do microorganismo na sus- pensão foi ajustada para 108 a 101° cfu/ml através de diluição da suspensão com água destilada esterilizada.

Folhas de tabaco de variedade Burley (Kitakami 1) que foram colhidas e colocadas no processo de cura foram tratadas com a suspensão do microorganismo onde a concentração do microorganismo foi ajustada para uma concentração predeterminada. O tratamento foi realizado três ve- zes, isto é, imediatamente após a colheita, 3 dias após a colheita e 8 dias após a colheita. Em cada tratamento, a suspensão foi pulverizada sobre su- perfícies de frente e de costas de folhas de tabaco através de um spray de modo que 10 ml da mesma foram pulverizados por cada peça de folha de tabaco.

As folhas de tabaco assim tratadas foram curadas através do uso de um fumeiro de aço. As folhas de tabaco foram coletadas no dia 10 e dia 21 no processo de cura. As folhas de tabaco assim coletadas foram cor- tadas de modo a serem separadas para lâminas e hastes. Então as lâminas e as hastes foram homogeneizadas através do uso de um misturador. A por- ção de lâmina foi usada para determinar o teor de TSNA. A determinação dos quatro principais tipos de TSNA (NNN, NNK, NAT e NAB) foi realizada em uma maneira similar àquela descrita em 2) men- cionado anteriormente. O teor de TSNA total foi expresso como o total dos respectivos teores dos quatro principais tipos de TSNA (NNN, NNK, NAT e NAB). Os resultados são mostrados na Tabela 5.

Tabela 5 Teor de TSNA (ua/q) O grupo tratada com água na Tabela 5 representa um grupo que foi tratado com somente água não contendo células bacteriais em cada tra- tamento. A partir da Tabela 5, é conhecido que o teor de TSNA aumentou com o lapso de tempo em todos os grupos e que um aumento no teor de TSNA foi particularmente significante no grupo tratado com água. Quando o grupo tratado com cepa LG38 é comparado com o grupo que não recebeu tratamento, o anterior exibiu menor teor de TSNA no dia 21 que o último.

Estes resultados indicam que cepa LG38 é capaz de reduzir o teor de TSNA.

Ainda, um efeito de teor de nitrito (-nitrogênio) sobre o trata- mento com LG38 também foi investigado.

Determinação do teor de nitrito - nitrogênio de folhas de tabaco tratadas como descrito acima foi realizada. O processo de determinação será descrito a seguir.

Primeiro, 0,5 g de lâminas foram coletados de folhas de tabaco de cada grupo e colocados em um tubo de centrífuga de 50 ml. A seguir, 25 ml de uma solução de extração descrita abaixo foram adicionados. A mistura foi agitada por 30 minutos e então nitrito foi extraído. O extrato foi filtrado através do uso de um papel de filtro (ADVANTEC, No. 1). 10 ml do filtrado foram coletados, 0,5 g de carvão ativo foram adicionados e a mistura foi agitada por 15 minutos. A seguir, o carvão ativo foi removido através do uso de um papel de filtro (ADVANTEC, Ne 5). O filtrado assim obtido foi usado como uma amostra para determinação de teor de nitrogênio - nitrito.

Solução de Extração: KCI (KO11%) Sulfanilamida (sulfanilamida a 0,5%) Triton X-100 (Triton X-100 a 0,1 %) Na determinação do teor de nitrogênio - nitrito no extrato, foi usado um auto-analisador (fabricado por BRAN + LUEBBE Co., Ltd., AACSII) e o teor de nitrogênio - nitrito foi obtido por conversão de transmitância do filtro em 550 nm para o teor de nitrogênio - nitrito. Para coloração de nitrogênio - nitrito, 1% de sulfanilamida e 0,1% de dicloridrato de N-naftil etilenodiamina foram usados. Os resultados são mostrados na Tabela 6.

Tabela 6 Teor de nitrito - nitrogênio (NO?-N) (μο/g) Como é óbvio a partir da Tabela 6, o teor de nitrito - nitrogênio que é um material em formação de TSNA foi significantemente aumentado no grupo tratado com água no dia 10 no processo de cura. Em contraste, quando o grupo tratado com a cepa LG38 é comparado com o grupo que não recebeu tratamento, o teor de nitrito - nitrogênio do anterior foi leve- mente menor que aquele do último no dia 10 no processo de cura.

Cepa LG38 foi identificada, nas bases de suas características biológicas, como uma cepa que é capaz de reduzir nitrato. Entretanto, os resultados descritos acima indicam, como comparado com o grupo que não recebeu tratamento, que cepa LG38 antes suprime redução de nitrato a ni- trito.

Exemplo 3: Efeito do tratamento com cepa LG5 sobre o teor de NNK O teor de NNK foi determinado em uma maneira similar àquela descrita no Exemplo 2, exceto que o microorganismo usado no processo de Exemplo 2 foi substituído com LG5.

Os resultados são mostrados na Tabela 7.

Tabela 7 Teor de NNK (iiq/q) Como é óbvio a partir da Tabela 7, no grupo que não recebeu tratamento, o teor de NNK foi aumentado até o dia 21 mas o teor de NNK no dia 32 (quando o processo de cura foi completado) foi menor que aquele no dia 21. Em ambos os grupos tratados com água e o tratado com cepa LG5, o teor de NNK foi relativamente alto até o dia 21, mas o teor de NNK no dia 32 foi menor que aquele do dia 21 como no caso do grupo que não recebeu tratamento. Quando o grupo tratado com cepa LG5 é comparado com o gru- po que não recebeu tratamento, o teor de NNK no dia 32 do anterior foi le- vemente menor que aquele do último. Estes resultados indicam que cepa LG5 é capaz de reduzir o teor de NNK.

Deve ser notado que os inteiros conteúdos de todos os docu- mentos referidos neste relatório descritivo são aqui incorporados por refe- rência.

Ainda vantagens e modificações da presente invenção serão facilmente visíveis para aqueles versados na técnica. A presente invenção poderá ser facilmente inventada por um versado na técnica. A presente in- venção que pode ser definida através de um tal maior escopo não é restrita pelos aspectos específicos e representativos da invenção mostrada e des- crita acima. Assim, várias modificações serão possíveis para a presente in- venção sem se fugir do escopo e espírito da idéia de invenção compreensiva como definida pelas reivindicações apostas e seus equivalentes.

Exemplo 4: Efeito do tratamento com a bactéria de degradação de TSNA sobre o teor de TSNA em pó de folha de tabaco Cepa LG5 e cepa LG38 foram inoculadas sobre o caldo TS 1/10, respectivamente, e cultivadas a 30°C por 72 horas. Cada um dos meios de cultura contendo as células bacteriais foi submetido à centrifugação em 5000 rpm, de modo que as células bacteriais foram coletadas. As células bacteri- ais foram lavadas duas vezes com água destilada esterilizada e suspensas em água destilada esterilizada. A concentração de células bacteriais de cada suspensão foi ajustada para 108 a 109 cfu/ml, pelo que a suspensão do mi- croorganismo como inoculum foi obtida.

No experimento de cepa LG5, pó secado por congelamento dos cortadores, de plantas de tabaco (variedade: Kitakami 1) crescidas em Leaf Tobacco Research Center (Oyama-shi, Tochigi prefecture) de Japan Tobac- co Inc., foi usado. No experimento de cepa LG38, pó secado por congela- mento da posição de haste de folha das mesmas plantas de tabaco como descrito acima foi usado.

Cada um dos respectivos tipos de pó de tabaco foi colocado, através de uma quantidade medida, em um almofariz, e a suspensão do mi- croorganismo foi adicionada ao mesmo, de modo que o teor de umidade atingiu um valor predeterminado. A mistura foi misturada com um pistilo de modo que o pó exibiu uma distribuição uniforme do teor de umidade. O pó assim obtido foi colocado, através de uma medida conhecida, em um frasco Erlenmeyer, e deixado em repouso até uma temperatura predeterminada.

As análises foram realizadas para uma amostra tomada do pó de tabaco antes de tratamento mencionado anteriormente como o microor- ganismo e uma amostra tomada do pó de tabaco que foi deixado ainda por quatro semanas após o tratamento, respectivamente. 5 g de cada uma das amostras foram colocados em um frasco Erlenmeyer de 200 ml, 100 ml de solução aquosa 0,01 M de NaOH (contendo Thimerosal por 100 pg/ml) fo- ram adicionados, e a extração foi realizada por 2 horas em temperatura am- biente através do uso de um agitador. A seguir, o extrato foi filtrado com um papel de filtro (ADVANTEC Co., Ltd., Ne 5C). A seguir, NNN, NNK, NAT e NAB foram analisadas pelo proces- so descrito no Exemplo 1.

Os teores de TSNA antes de tratamento com o microorganismo e aquelas quatro semanas após o tratamento são mostradas na Tabela 8 e Tabela 9.

Tabela 8 Mudança em teores de TSNA em pó de folhas de tabaCo causada pelo tratamento com Cepa LG38___________________ * Valores de teores de NAB e NNK não são mostrados porque estes valores estavam abaixo do limite de deteção.

Tabela 9 Mudança em teor de NNK em pó de folhas de tabaco causada pelo tratamento com cepa LG5 * Valores de teor de NAB não é mostrado porque ele estava abaixo do limite de deteção. A partir dos experimentos descritos acima, foi provado que cepa LG5 degrada especificamente NNK, e cepa LG38 degrada NNN, NAT, NAB e NNK. O teor de NNK no pó dos cortadores de plantas de tabaco, foi diminuído quatro semanas após o tratamento com cepa LG5, como compa- rado com aquele antes do tratamento. Quando os teores de NNN e NAT no pó da posição de haste de folha de plantas de tabaco, quatro semanas após o tratamento com cepa LG38 foram comparados com aqueles antes de tra- tamento, os teores de NNN e NAT foram ambos diminuídos em todos os grupos tratados. Ou seja, nos experimentos nos quais pó de tabaco foi tes- tado, cepa LG5 degradou NNK e cepa LG38 degradou NNN e NAT em uma maneira similar àquela observada nos experimentos mencionados anterior- mente.

Exemplo 5: Efeito do tratamento com a bactéria degradando - TSNA sobre o teor de TSNA de folhas de tabaco em armazenamento Cepa LG38 foi inoculada em caldo TS 1/10 e cultivada a 30°C por 72 horas. Após a cultura, o meio de cultura contendo as células bacteri- ais foi submetido à centrifugação em 5000 rpm, de modo que as células bacteriais foram coletadas. As células bacteriais assim coletadas foram la- vadas duas vezes com água destilada esterilizada e suspensas em água destilada esterilizada. A concentração de células bacteriais na suspensão foi ajustada para 108 a 109 cfu/ml, pelo que a suspensão do microorganismo como inoculum foi obtida. A suspensão do microorganismo assim preparada como o ino- culum foi pulverizada sobre as superfícies de frente e traseira de folhas de tabaco de tabaco Burley que estavam no processo de cura em um fumeiro de aço (no estágio final de secagem de hastes de folhas, dia 29, variedade: Kitakami 1) de modo que 10 ml da suspensão foram pulverizados por cada peça de folha. As folhas de tabaco assim tratadas foram ainda curadas por 3 dias no fumeiro de aço e então usadas para o teste de armazenamento.

Coleta de amostras a serem analisadas: Antes de início de ar- mazenamento das folhas de tabaco, as lâminas de meia - folha das folhas de tabaco curadas tomadas do fumeiro de aço foram coletadas como a amostra antes do tratamento. As restantes lâminas meia - folha com hastes foram estocadas. A armazenamento foi realizada sob as condições prede- terminadas onde temperatura e umidade foram mantidas constantes. Com relação às condições de armazenamento, três grupos: temperatura de 20°C e umidade de 70%; temperatura de 20°C e umidade de 80%; e temperatura de 30°C e umidade 80%, foram fixados, respectivamente. Amostragem foi realizada um mês e três meses após o início da armazenamento. As folhas de tabaco tratadas foram estocadas nas mesmas condições como descrito acima sem tratamento das folhas de tabaco com o microorganismo, e as folhas de tabaco obtidas foram usadas como a amostra do grupo controle.

As folhas de tabaco assim amostradas foram separadas para lâminas e hastes e então amostra secada - congelada de lâminas foi triturada através do uso de um misturador. Somente a amostra de lâminas foi usada para determinação de teor de TSNA.

Aproximadamente 5 g da amostra de lâminas de cada um dos grupos tratados como descrito acima foram colocados em um frasco Er- lenmeyer de 200 ml, 100 ml de solução aquosa de 0,01 M de NaOH (conten- do Thimerosal por 100 pg/ml) foram adicionados, e a extração foi realizada por 2 horas em temperatura ambiente através do uso de um agitador. A seguir, o extrato foi filtrado com um papel de filtro (ADVANTEC Co., Ltd., N- 5C). NNN, NNK, NAT e NAB foram analisadas através do processo descrito no Exemplo 1.

Os resultados são mostrados na Tabela 10.

Tabela 10 Mudança em teor de TSNA em folhas de tabaco em armazenamento causada pelo tratamento com o microorganismo Nos grupos sem tratamento, um mês após a armazenamento, o teor de TSNA foi aumentado em "grupo 20°C - 70%" e "grupo 30°C - 70%".

Nos grupos sem tratamento, três meses após a armazenamento, o teor de TSNA foi significantemente aumentado no "grupo 30°C - 70%" e "grupo 30°C - 80%", em particular. No grupo tratado com cepa LG38, foi observada uma tendência do teor de TSNA ter diminuído após um mês e após três meses.

Nos grupos tratados com cepa LG38, o teor de TSNA foi significantemente diminuído um mês após a armazenamento, em particular.

Claims (5)

1. Processo de redução de teor de TSNA em folha de tabaco, caracterizado pelo fato de que compreende tratamento de folha de tabaco com um microorganismo que é selecionado do grupo consistindo em Sphin- gomonas paucimobilis cepa LG5 (FERM BP-7830) possuindo a capacidade de reduzir TSNA e Pseudomonas fluorescens cepa LG38 (FERM BP-7831) possuindo a capacidade de reduzir TSNA.

2. Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o tratamento de folha de tabaco com o microorganismo é reali- zado imediatamente antes de colheita de folha de tabaco e/ou em um perío- do a partir do momento quando iniciando um processo de cura ao momento quando terminando um processo de armazenamento.

3. Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o tratamento de folha de tabaco com o microorganismo é reali- zado através de pulverização ou revestimento de células bacteriais do mi- croorganismo sobre a folha de tabaco em um estado de suspensão ou em um estado seco.

4. Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a dita TSNA é pelo menos um tipo de TSNA selecionada do gru- po consistindo em Ν'-nitroso nornicotina, 4-(N-nitroso metil amino)-1-(3- piridil)-1-butanona, Ν'-nitroso anatabina e Ν'-nitroso anabasina.

5. Processo de redução de teor de TSNA em folha de tabaco, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a folha de ta- baco é obtida de uma variedade de tabaco selecionada do grupo consistindo em variedade doméstica Japonesa e variedade Burley.