KR20040104680A

KR20040104680A - 니트로사민을 저감하는 미생물 및 상기 미생물을 이용한 니트로사민의 저감방법

Info

Publication number: KR20040104680A
Application number: KR10-2004-7017511A
Authority: KR
Inventors: 코가카즈하루; 카츠야사토시
Original assignee: 니뽄 다바코 산교 가부시키가이샤
Priority date: 2002-05-10
Filing date: 2003-05-09
Publication date: 2004-12-10
Also published as: JPWO2003094639A1; WO2003094639A1; AU2003235921A1; EP1504679B1; EP1504679A1; BR0309909B1; KR100641723B1; CN100358445C; EP1504679A4; JP4160954B2; BR0309909A; ES2399630T3; CN1652702A

Abstract

본 발명은, 잎담배에 대하여, 스핑고모나스·파우시모비리스종 및 슈도모나스·플루오레센스종에 속하는 미생물로 이루어지는 군으로부터 선택되는, TSNA를 저감하는 미생물을 처리하는 것을 특징으로 하는 잎담배의 TSNA 함량을 저감하는 방법에 관한 것이다.

Description

니트로사민을 저감하는 미생물 및 상기 미생물을 이용한 니트로사민의 저감방법{MICROORGANISM REDUCING THE AMOUNT OF NITROSAMINE AND METHOD OF REDUCING THE AMOUNT OF NITROSAMINE USING THE MICROORGANISM}

잎담배에 함유되는 니트로사민(Tobacco Specific Nitrosamine; 이하, TSNA라 함)은, 수확 직후의 잎담배(즉, 녹생엽(綠生葉))에는 존재하지 않지만, 건조 기간과 그 후의 저장 기간 동안에, 잎담배중의 알칼로이드와 아질산성 질소의 반응에 의해 생성된다. 상기 아질산은 잎담배 표면에 생존하는 질산환원 능력을 갖는 미생물에 의해 생성된다.

또한, 상기 건조 및 그 후의 저장 과정에서 생성되는 TSNA의 주성분은, N'-니트로소노르니코틴(이하, 「NNN」이라 함), 4-(N'-니트로소메틸아미노)-1-(3-피리딜)-1-부타논(이하, 「NNK」라 함), N'-니트로소아나타빈(이하, 「NAT」라 함) 및 N'-니트로소아나바신(이하, 「NAB」라 함) 등이다.

잎담배중의 TSNA 함량을 저감하는 방법으로서 종래부터 알려진 방법에는,(1) TSNA의 생성을 억제하는 방법, (2) 생성된 TSNA를 제거하는 방법이 있다.

TSNA의 생성을 억제하는 방법으로서는, 예컨대, 질소 비료를 저감하므로써 잎담배중의 알칼로이드 함유량을 낮게 하는 방법, 직열(直熱)방식 대신 간열(間熱)방식의 건조기를 사용하는 것에 의해 건조중에 생성하는 TSNA를 저감하는 방법(이것은 주로 황색종에 사용된다), 알칼로이드 함량이 낮은 품종을 개발하는 등의 육종기술의 향상에 의해 얻어지는 방법 등이 있다.

또한, 최근에는, 마이크로파를 조사하여 잎담배를 건조하는 것에 의해, TSNA의 생성을 억제하는 방법도 보고되어 있다(일본 특허공표 2001-503247호). 그러나, 마이크로파 처리와 같은 급격한 탈수·건조를 행하면, 원래 건조중에 생기는 내용성분의 변화가 충분히 행하여지지 않게 되고, 종래의 방법으로 건조한 것보다 급건조로 마무리되어, 끽미(喫味)에 문제가 남게 된다.

한편, 생성된 TSNA를 잎담배로부터 제거하는 방법은, TSNA의 생성을 억제하는 방법에 비해서 그 예는 적고, 예컨대, 초임계 추출(supercritical extraction)에 의해 잎담배로부터 TSNA를 제거하는 방법(WO 01/65954)이 알려져 있다. 그러나, 이 방법은 코스트 측면에서 실용화에는 이르지 못하고 있다.

이상의 상황으로부터, 잎담배의 건조 및 저장중에 생성하는 것으로 인식되어 있는 TSNA의 함량을 저감하는 것이 요망되고 있다.

아울러, 담배(cigarret)의 원료인 잎담배로서 소비에 적합한 끽미를 유지한 것으로, TSNA 함량이 적은 것이 요구되고 있다.

따라서, 본 발명은, 현재 행해지고 있는 건조 및 저장 형태중에 있어서, 건조 및 저장중에 생성한 TSNA의 함량을 저감하는 방법을 제공하는 것이다.

또한, 종래, 니트로사민을 분해하는 것으로서, 미정제의 간장 소스로부터 분리한 사상균인 아스퍼길러스(Aspergillus)속 미생물(특개평 10-276681호)이 알려져 있지만, 아스퍼길러스속 미생물은 생존에 고수분을 필요로 하는 것, 그리고 잎담배의 품질, 특히 향끽미에 악영향을 미칠 우려가 있어, 잎담배의 처리에 사용하는 것에 관해서는 문제가 지적되어 있다.

본 발명은, 수확한 잎담배의 건조중 및 저장중에 생성되는 니트로사민을 분해하는 미생물과, 상기 미생물을 이용한 잎담배 건조 및/또는 저장중에 생성하는 니트로사민의 저감방법에 관한 것이다.

발명의 개시

본 발명의 제1의 태양에 따르면, 잎담배에 대하여, 스핑고모나스·파우시모비리스(Spingomonas paucimobilis)종 및 슈도모나스·플루오레센스(Pseudomonas Fluorescence)종에 속하고, TSNA를 저감하는 능력을 갖는 미생물로 이루어지는 군으로부터 선택되는 미생물을 처리하는 것을 특징으로 하는 잎담배의 TSNA 함량을 저감하는 방법이 제공된다.

본 발명의 제2의 태양에 따르면, 잎담배에 대하여, 스핑고모나스·파우시모비리스 LG5 균주 및 슈도모나스·플루오레센스 LG38 균주로 이루어지는 군으로부터 선택되는 미생물을 처리하는 것을 특징으로 하는 잎담배의 TSNA 함량을 저감하는 방법이 제공된다.

본 발명의 제3의 태양에 따르면, 스핑고모나스·파우시모비리스 또는 슈도모나스·플루오레센스에 속하고, 잎담배의 건조 및 저장중에 생성하는 N'-니트로소노르니코틴, 4-(N'-니트로소메틸아미노)-1-(3-피리딜)-1-부타논, N'-니트로소아나타빈 및 N'-니트로소아나바신으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 적어도 하나의 성분의 잎담배중의 함량을 저감하는 능력을 갖는 미생물이 제공된다.

본 발명의 제4의 태양에 따르면, 잎담배중의 TSNA 함량을 저감하는 스핑고모나스·파우시모비리스 LG5 균주(FERM BP-7830)가 제공된다.

본 발명의 제5의 태양에 따르면, 잎담배중의 TSNA 함량을 저감하는 슈도모나스·플루오레센스 LG38 균주(FERM BP-7831)가 제공된다.

발명을 실시하기 위한 최선의 형태

본 발명자들은, 예의 연구를 한 결과, 잎담배 건조중 및 저장중에서의 TSNA의 생성 과정을 해명하고 있는 중에, 잎담배 표면에 존재하는 미생물에 TSNA를 분해하는 미생물이 존재한다는 것을 발견하고, 본 발명을 완성하였다.

본 발명자는, 건조중의 잎담배에 있어서의 TSNA의 생성 과정을 해명하는 과정에서, 잎담배 표면에 존재하는 미생물로부터, 생성한 TSNA를 분해하는 미생물을 분리했다. 더욱이, 건조중의 잎담배 및/또는 건조가 종료하여 저장에 제공되는 잎담배에 대하여 상기 미생물을 처리하므로써, 잎담배중의 TSNA의 함량을 저감할 수 있다는 것을 발견하였다.

이들 미생물중 특히 활성이 높은 2종류의 미생물이, 그 균학적 성질로부터 각각 스핑고모나스·파우시모비리스 및 슈도모나스·플루오레센스에 속하는 미생물로 동정되었다. 이들 미생물에 대하여, 본 발명자들은 스핑고모나스·파우시모비리스 균주를 LG5(이하, 「LG5」 또는 「LG5 균주」라 한다)라 명명하고, 슈도모나스·플루오레센스 균주를 LG38(이하, 「LG38」또는 「LG38 균주」라 한다)이라고 명명하였다. LG5는 수탁번호 FERM BP-7830으로서, LG38은 수탁번호 FERM BP-7831로서 2001년 12월18일에 독립행정법인 산업기술종합연구소 특허생물기탁센터(일본국 이바라키켄 츠쿠바시, 히가시1가 1번지 1중앙 제6)에 기탁되었다.

이들 미생물은 건조 및/또는 저장중의 잎담배 품질에 악영향을 미치지 않는 것이며, 또한 TSNA를 저감하는 효능을 갖는 것이다.

또한, 본 발명에 따르는 방법은, 현재의 잎담배 건조법을 조금도 변경하는 일 없이 미생물을 처리하여 달성할 수 있는 것이므로, 현행의 잎담배의 품질 및 끽미를 유지할 수 있는 것이다.

이들 균주의 활성은 다음과 같다.

LG5는 TSNA의 성분중 NNK를 특이적으로 분해하는 활성을 갖는다. 또한, LG38은 주성분인 NNN, NNK, NAT 및 NAB를 분해하는 활성을 갖고 있다.

본 발명에 따라 처리되는 잎담배는, 통상의 건조 조작을 행하는 것이면 어느 품종이어도 좋고, 구체적으로는 자연건조되는 품종인 벌리(Burley)종 및 재래종, 장치건조되는 황색종을 들 수 있다. 그렇지만, 이것들에 한정되는 것은 아니다.

본 발명에 따르는 미생물을 처리하는 시기는, 잎담배중에 TSNA가 생성되기 직전부터 궐련으로 가공되기 까지의 사이이면 언제라도 좋지만, 잎담배의 건조 기간 및/또는 저장 기간이 바람직하다. 특히 건조에서 처리하는 시기로서는, TSNA를 생성하는 시기 이전인 건조 과정에서의 수확 직후로부터 황변기 및 갈변기에 처리하는 것이 바람직하지만, 건조 과정중이면 어느 시기도 가능하다. 저장 기간에서의 처리는, 저장 기간중이면 언제라도 좋지만, 건조후의 저장 개시시에 처리하는 것이바람직하다. 기본적으로는, 실시자가 건조 개시시부터 저장 기간 동안에 임의로 선택하는 것이 가능하다.

또한, 수확 직전에 밭에서 처리후 수확하고, 건조에 제공하는 것도 가능하다.

또한, 본 발명에 따라 행하여지는 미생물의 처리는, 1회에 한정하는 것은 아니고, 기간중 일정 기간마다 연속적으로 행하여도 좋다.

또한, 본 발명의 처리는 건조 및/또는 저장중의 처리에 한정하는 것은 아니고, 제품화의 과정에서 처리를 하는 것도 가능하다.

본 발명에 따른 처리로는, 미생물을 현탁한 액의 분무, 미생물 균체를 포함하는 분말의 도포 등, 그 자체가 공지인 어느 방법에 의해도 좋고, 실시자가 적당한 방법을 선택하여도 좋다. 또한, 미생물을 포함하는 액체에 잎담배를 침지해도 좋다.

상술한 바와 같이, 본 발명에 바람직하게 사용되는 미생물은 LG5 균주 및 LG38 균주이다. 그러나, 본 발명은 이들 균주에 한정되는 것은 아니고, 스핑고모나스·파우시모비리스종 및 슈도모나스·플루오레센스종에 속하고, TSNA를 저감하는 능력을 갖는 미생물이면 본 발명의 범주이다.

여기서 사용되는 「저감」한다는 것은, 잎담배중의 TSNA의 함량을 저감하는 것을 의미하고, 예를들면, 잎담배의 건조 및 저장중에 생성한 TSNA 각 성분을 분해하는 것이면 좋다.

본 발명에 사용하는 미생물을 배양하는 배지로서는, 미생물 배양용으로서 공지의 각종 배지를 사용할 수 있다.

본 발명에 사용하는 미생물을 배양하는 배양 조건으로서는, 온도가 25~35℃의 범위, pH가 6.0~8.0의 범위에 있으면 좋고, 바람직하게는 온도가 28~32℃, pH가 7.0 전후 범위이다.

본 발명의 미생물은, 일정기간 배양한 후에, 이것을 원심분리하는 것에 의해 집균(集菌)한다.

집균한 균체는, 완충액에 현탁해서 사용해도 좋고, 동결 건조 등에 의해 분말상으로 해서 사용해도 좋다.

집균한 균체를 특정의 완충액에 현탁해서 균액을 작성할 경우에는, 완충액으로서 예컨대, 멸균 증류수 및 인산 완충액 등을 사용할 수 있다.

본 균체를 완충액에 현탁하는 비율로서는, 완충액 1ml당 10⁷~10¹²개, 바람직하게는 10⁸~10¹⁰개이다. 이러한 농도로 균체를 현탁해서 사용하는 것이 바람직하다.

본 발명에 따르면, 상기에 의해 얻은 균체를 사용하여 잎담배의 처리를 하면 좋다.

필요한 균량을 함유한 상기 균액에 멸균 증류수를 가해서 접종액을 작성하고, 이 접종액을 잎담배에 균일하게 분무한다. 이 처리는, 건조시부터 저장 기간이면 어느 시기라도 가능하다. 자연건조종의 경우는, 건조 기간 전반 및 건조 종료후의 저장 시기, 장치건조종의 경우는, 건조 초기의 황변기 및 건조 종료후의 저장 시기에 처리한다. 바람직하게는, 건조 과정에서의 황변기, 자연건조의 경우에는 갈변기에 처리하는 것이 더 좋다.

산포량은, 상기에 의해 작성한 액량을 잎담배 1장당, 수확 직후 및 건조 초기에서는 2~10ml, 건조 중기 이후에서는 0.5~3ml이다.

처리 회수는, 건조 및/또는 저장 기간중에 적어도 1회이면 좋고, 건조 및/또는 저장 기간중에 간격을 두고 2~3회 처리하는 것이 바람직하다.

본 발명의 태양에 따르면, 상기 미생물을 처리하는 것 이외에, 건조 조건의 큰 변화는 없으므로, 본래의 맛에 영향을 주는 일 없이 TSNA 함량을 저감하는 것이 가능하다.

실시예 1

예 1. 잎담배 표면으로부터의 미생물의 분리

토치기현 오야마시의 담배밭의 수확시부터 건조 기간 동안의 잎담배로부터 미생물을 채취했다.

균의 채취는, 잎담배 수확 직후, 건조 3일째(즉, 황변종료) 및 8일째(즉, 갈변종료)의 3회 행하였다.

벌리종인 미치노쿠(Michinoku) 1호의 본엽(本葉)을 수확하고, 수확한 잎담배의 엽육부분의 일부를 베어내 샘플로 하였다. 얻어진 샘플을 5mm×5mm로 잘게 절단하고, 이것의 약 10g을 300ml의 삼각 플라스크에 채취했다. 200ml의 10mM 인산 완충액(pH:7.0)을 첨가하고, 이것을 호모게나이저(homogenizer)로 분쇄했다. 얻어진 현탁액을, 수확시의 잎담배로부터의 미생물을 포함하는 수확시 현탁액으로 하였다.

건조 기간중(즉, 황변종료:건조 3일째, 갈변종료:건조 8일째)의 잎담배로부터의 미생물채취는, 상기의 수확한 잎담배의 건조중의 잎담배를 사용하고, 수확시 잎담배와 동일하게 행하였다. 즉, 상기의 수확된 미치노쿠 1호의 본엽을 파이프 하우스에 들인후, 3일 및 8일 경과한 잎담배의 엽육부분의 일부를 절취하여 샘플로 하였다. 얻어진 샘플을 5mm×5mm로 잘게 절단하고, 이것의 약 10g을 300ml의 삼각 플라스크에 채취했다. 200ml의 10mM 인산 완충액(pH:7.0)을 첨가하고, 이것을 호모게나이저(homogenizer)로 분쇄했다. 얻어진 현탁액을, 건조 기간중의 잎담배로부터의 미생물을 포함하는 건조시 현탁액으로 하였다.

어느 시기에 채취한 잎담배에 대해서나 호모게나이저에 의한 분쇄는, 샘플링으로부터 2시간이내에 행하였다.

수확시 현탁액과 건조기 현탁액을, 각각 미생물을 분리할 수 있는 농도(즉, 10²~10⁵배)에 상기한 바와 같은 인산 완충액을 사용해서 희석했다. 얻어진 희석액을 YG한천평판배지(조성은 이하와 같음: 1.0g의 효모 엑기스, 1.Og의 글루코스, 0.3g 의 K₂HPO₄, 0.2g의 KH₂PO₄, 0.2g의 MgSO₄·7H₂0, 15.Og의 한천, 증류수에서 1000ml로 조제한다. pH 6.8)에 0.1ml씩 적하하여 도말하고, 이것을 30℃에서 7일간 배양하였다. 배양후, 생육한 콜로니를 새로운 YG한천평판배지를 사용해서 단일 콜로니로 분리했다. 분리된 미생물은 사용시까지 -80℃에서 보존했다.

이렇게 하여, 수확시 잎담배로부터는 87개의 균주, 갈변기 잎담배로부터 176개의 균주의 미생물을 분리했다. 이들 분리 균주로부터, 콜로니 형태의 다른 균주를 선택해서 이후의 실험에 사용했다.

예 2. TSNA 분해 미생물의 1차 선발

상기 예 1에서 분리한 잎면 유래의 균주 중, 수확기의 잎담배로부터 분리한 14개의 균주와 건조기 잎담배로부터 분리한 37개의 균주의 합계 51개의 균주를 1차 선발의 후보 균주로서 선발했다.

(1) 배지의 선택

TSNA 분해 미생물을 선발하기 위한 배지의 검토를 행하였다.

상기 예 1에서 선발된 균주를 사용하여, TSNA의 각 성분(NNN, NNK, NAT 및 NAB)을 포함하는 배지에 대해서, 균주의 증식에 관한 검토를 행한 결과, 1/10 TS 액체 배지를 기초배지로 했을 경우가 가장 양호한 결과를 얻을 수 있었다. 따라서, 이후의 배양에는, 1/10 TS 액체 배지를 기초배지로서 사용했다. 이하에, 우선 1/10 TS 액체 배지 조성을 나타내었고, 이어서, 배양에 사용한 1/10 TS 액체 배지와 미생물을 포함하는 배지의 조성을 기재하였다.

[1/10 TS 액체 배지]

·최종용량 증류수로 1000ml로 한다.

·카제인 1.7g

·D-글루코오스 0.25g

·NaCl 0.5g

·K₂HPO₄2.5g

·1/10 Tryptic Soy(Difco사제, Bacto Tryptic Soy Broth; Soybean-Casein Digest Medium).

[TSNA 분해균 선발용 배지]

·최종용량 35ml

·1/10 TS 액체 배지(NNN, NAT, NAB 및 NNK를 각각 5ppm 함유)

30ml

·접종용 미생물 현탁액 5ml

상기의 선발용 배지는 다음 방법에 의해 조제했다. 각 1000ppm의 NNN, NAT, NAB 및 NNK를 포함하는 디클로로메탄 용해액을 150㎕씩 삼각 플라스크에 첨가하고, 디클로로메탄을 완전히 휘발시켰다. 다음으로, 1/10 TS 액체 배지를 첨가하고, NNN, NAT, NAB 및 NNK의 농도를 각각 5ppm/10ml이 되도록 조제했다. NNN, NAT, NAB 및 NNK를 용해한 후, 30ml씩 50ml의 삼각 플라스크에 분주하였다. 다음으로, 접종용 미생물 현탁액을 5ml 첨가하고, 최종용량이 35ml인 선발용 배지를 얻었다. 이것들을 24시간, 30℃에서 진동 배양하였다.

(2) TSNA 분해 미생물의 1차 선발

상기에서 선발된 배지를 사용하여, TSNA 분해 미생물의 1차 선발을 행하였다.

1차 선발의 후보 균주를 각각 1/10 TS 액체 배지중에서 진동배양하고, 그 후 원심집균하였다. 각 균체를 멸균 증류수로 2회 세정한 후, 다시 멸균 증류수에 현탁했다. 다음으로, 균농도가 10⁸~10¹⁰cfu/ml이 되도록 멸균 증류수를 사용해서 각 현탁액을 조제했다.

얻어진 미생물 현탁액을, 유래마다 5~10 균주씩 혼합해서 7 그룹의 선발용 현탁액을 조제했다.

TSNA 분해균 선발용 배지에는, 상기의 1/10 TS 액체 배지를 사용하고, 상기 7 그룹의 미생물 현탁액을 사용하는 이외는, 상기 예 1과 같은 방법에 의해 조제했다.

대조군에는 미생물 현탁액 대신 멸균 증류수를 5ml 첨가했다.

이들 7 그룹의 미생물 현탁 혼합 처리군과 대조군을 30℃에서 24시간 진동배양을 행하였다.

그 후, TSNA 각 성분의 함량을 정량했다.

TSNA 각 성분의 정량은 다음 방법에 의해 행하였다. 즉, 각각의 배지로부터 얻어진 시료에 포함되는 NNN, NAT, TAB 및 NNK를, 개량된 Spiegelhalder의 방법에 준한 가스크로마토그라피에 의해 정량했다(Spiegelhalder B., Kubacki S. 및 Fischer S. (1989) Beitr. Tabakforsch. Int., 14(3), 135~143, Fisher S. 및 Spiegelhalder B. (1989) Beitr. Tabakforsh. Int., 14(3), 145~153).

우선, 칼럼크로마토그라피를 사용하여 아래와 같이 각각의 배지를 정제했다.우선, 여과지(ADVANTEC, No.5C)를 사용하여 모든 배지를 여과했다. 각 여과액의 10ml를 키젤글(kieselgur)(입경 60~160mm, MERCK사제) 및 아스코르빈산을 충전한칼럼에 첨가했다. 디클로로메탄을 사용해서 필요한 분획을 전용하여 분취하였다. 이것을 가스크로마토그라피용의 시료로 하였다. 얻어진 시료에 대해서, 칼럼 DB-17(J&W사), 검출기 TEA-543(Thermedics사)을 장비한 가스크로마토그라피HP6890(Hewlett Packard사제)을 사용하여 분석했다.

상기의 7 그룹의 처리군과 대조군의 TSNA 각 성분 함량의 정량 결과를 표 1에 나타내었다.

[표 1] 1차 선발 결과

또한, 표중의 그룹 1 및 2는 수확 직후의 잎담배 표면으로부터 채취한 균주의 혼합 현탁액, 그룹 3, 4 및 5는 건조 초기의 황변기(3일째의 잎담배 표면으로부터 채취한 균주), 그룹 6 및 7은 갈변기(8일째의 잎담배 표면으로부터 채취한 균주 ) 유래의 혼합 처리군이다. 표중의 %는, 대조군을 100%라고 했을 경우의 각 처리군에 있어서의 TSNA 각 성분의 함량%를 나타내는 것이다.

표 1로부터 명백해진 바와 같이, 어느 미생물 혼합 처리군의 TSNA 함량도, 대조군의 TSNA 함량과 비교해서 감소했다. 특히, 총 TSNA량에 대해서는, 그룹 1 및 2는, 각각 대조군에 비교해서 각각 47.87% 및 64.95%까지 감소했다(표 1).

이들 결과로부터, 잎면 미생물로부터 유용한 TSNA 분해 미생물이 복수 분리된 것이 밝혀졌다.

예 3. TSNA 분해 미생물의 2차 선발

상기 예 2의 결과로부터, TSNA 분해능력이 우수한 그룹 1과 2에 대해서 2차 선발 시험을 더욱 행하였다.

그룹 1과 2에 포함되는 14 균주의 미생물 각각에 관한 TSNA 각 성분의 분해능력을 조사했다.

1/10 TS 액체 배지에 혼합하는 미생물 현탁액에 포함되는 미생물의 수를 상기 예 1에서 채취한 미생물 1균주로 한 이외는, 상기 예 2에 기재된 방법과 같은 방법을 사용해서 각 균주의 TSNA 각 성분의 분해능력을 조사했다.

또한, 각 정량은 2회 반복의 평균으로 행하였다.

얻어진 결과를 표 2에 나타내었다.

[표 2] 균주별의 TSNA 분해능력

표 2로부터 명백해진 바와 같이, LG38 균주, LG48 균주, LG51 균주 및 LG43 균주는 TSNA의 주4성분, 즉, NNN, NAT, NAB 및 NNK를 분해하는 능력을 갖고, 특히 LG38 균주는 NNN, NAT, NAB 및 NNK 성분을 각각 67.43%, 75.40%, 66.66% 및 60.63%까지 저감하고, 토털로도 68.00%까지 TSNA 함량을 저감할 수 있었다.

또한, LG2 균주, LG5 균주 및 LG77 균주는 TSNA 성분중 NNK를 특이적으로 분해하는 능력을 갖고, 특히 LG5 균주는 NNK 함량을 3.24%까지 저감하는 능력을 갖고 있는 균주였다.

이들 결과로부터, NNK를 특이적으로 분해하는 LG5 균주와, TSNA 각 성분을 특이적으로 분해하는 LG38 균주를 선발했다.

이들 미생물을 사용하는 것에 의해, 잎담배의 TSNA를 저감하는 것이 가능하다고 시사되었다. 또한, 이들 미생물은 담배의 잎으로부터 분리되었기 때문에, 잎담배에 대한 정착성이 뛰어나고, 따라서, 잎담배에 있어서의 TSNA 분해 활성이 안정하게 얻어지는 것으로 생각된다.

예 4. 미생물의 동정

상기에서 선발한 LG5 및 LG38 균주에 관한 균학적 성질을 표 3, 표 4에 나타내었다.

[표 3] LG5 균주의 세균학적 성질

시험항목	성질
형태	간상균
그람 염색성	-
포자	-
운동성	+
효소에 대한 태도	호기성
옥시다제	+
카탈라제	+
OF	-
집락(colony)의 색소	황색계
질산염의 환원	-
인돌의 생성	-
글루코스의 발효성	-
아르기닌 디히드롤라제	-
우레아제	-
에스쿨린의 분해	+
젤라틴의 액화	-
β-갈락토시다제	-
자화성
글루코스	+
L-아라비노스	+
D-만노스	-
D-만니톨	-
N-아세틸-D-글루코사민	+
말토스	+
글루콘산칼륨	+
n-카프린산	-
아디핀산	-
dl-말산	+
구연산나트륨	-
초산페닐	-

[표 4] LG38 균주의 세균학적 성질

시험항목	성질
형태	간상균
그람 염색성	-
포자	-
운동성	+
효소에 대한 태도	호기성
옥시다제	+
카탈라제	+
OF	o
집락(colony)의 색소	황색계
형광색소의 생성	-
질산염의 환원	+
인돌의 생성	-
글루코스의 발효성	-
아르기닌 디히드롤라제	-
우레아제	-
에스쿨린의 분해	-
젤라틴의 액화	-
β-갈락토시다제	-
자화성
글루코스	+
L-아라비노스	+
D-만노스	+
D-만니톨	+
N-아세틸-D-글루코사민	-
말토스	-
글루콘산칼륨	+
n-카프린산	+
아디핀산	-
dl-말산	+
구연산나트륨	+
초산페닐	-

이들 결과로부터, LG5 균주는 스핑고모나스·파우시모비리스(Sphingomonas paucimobilis)에 속하고, LG38 균주는 슈도모나스·플루오레센스(Pseudomonas fluorescens)에 속하는 것으로 동정되었다.

또한, 상기의 균의 동정은 일본 식품분석센터에 의뢰하여 행하였다.

또한, LG5는 특허생물기탁센터에 기탁을 하고, 2001년 12월18일 수탁되었다 (수탁번호:FERM BP-7830호). 동일하게, LG38은 특허생물기탁센터에 기탁을 하고, 2001년 12월18일에 수탁되었다(수탁번호:FERM BP-7831호).

실시예 2: LG38 균주에 의한 건조 기간중의 TSNA 함량 저감

1/10 TS 액체 배지에 LG38 균주를 접종하고, 30℃에서 72시간 배양했다. 배양후, 이 균체를 포함하는 배지를 5,000rpm으로 원심하고, 균체를 분리 및 집적했다. 균체를 멸균 증류수로 2회 세정한 후, 다시 멸균 증류수에 현탁했다. 현탁액의 균체 농도를 멸균 증류수로 희석하고, 10⁸~10¹⁰cfu/ml로 조정했다.

원하는 균수로 조정한 현탁액을, 수확해서 건조에 제공한 벌리종(키타카미(kitakami) 1호)의 잎담배에 대하여 처리했다. 처리 시기는, 수확 직후, 수확후 3일째 및 수확후 8일째의 3회로, 잎담배 1장당 10ml가 되도록 잎담배의 표리에 분무기를 사용해서 분무 처리했다.

잎담배의 건조는 파이프 하우스를 사용하여 행하였다. 건조 10일째와, 21일째에 처리잎을 채취했다. 채취한 잎담배를 엽육(lamina)과 중골(中骨)(stem)로 분리한 후, 이것들을 믹서를 사용해서 분쇄했다. TSNA 함량의 정량에는 엽육을 사용했다.

TSNA 4성분량(NNN, NNK, NAT 및 NAB)의 정량은, 예 2에 기재한 방법과 동일하게 행하였다.

또한, 총 TSNA량은 4성분(NNN, NNK, NAT 및 NAB)의 합계값으로 나타냈다. 결과를 표 5에 나타내었다.

[표 5] TSNA 각 성분의 합계 함량(㎍/g)

	처리후 경과일수
군	0일째	10일째	21일째
무처리군	0.53	0.98	3.01
수처리군	0.53	3.48	3.45
LG38 균주군	0.53	1.09	2.76

표 5의 수처리군이란, 처리에 있어서, 균체를 함유하지 않는 완충액만으로 처리한 것이다.

표 5로부터, TSNA 함량은 각 군 모두 일수의 경과와 함께 증가하고, 특히 수처리군의 증가가 현저한 것을 알았다. LG38 균주군은 무처리군과 비교해 보면, 21일째에는 무처리군보다도 TSNA 함량이 저하되어 있었다.

이들 결과로부터, LG38 균주는 TSNA 함량을 저감시키는 능력을 갖는 것이 시사되었다.

또한, 아질산성 질소 함량에 있어서의 LG38의 영향을 조사했다.

상기한 바와 같이 처리한 잎담배에서의 아질산성 질소 함량의 정량을 행하였다. 정량의 방법은 다음과 같다.

우선, 각 군의 잎담배의 엽육 0.5g을 50ml용량 원심관(遠沈管)(centrifuge tube)에 채취했다. 다음으로, 아래에 나타낸 추출액 25ml를 첨가하고, 30분간 진동하여, 아질산성 질소를 추출했다. 추출액을 여과지(ADVANTEC, No.1)를 사용해서 여과한 후, 여과액 10ml를 채취하고, 여기에 활성탄 0.5g을 첨가해서 15분간 진동하였다. 그 후, 여과지(ADVANTEC, No.5C)를 사용해서 여과하여, 활성탄을 제거했다. 얻어진 여과액을 아질산성 질소 정량용 시료로서 사용했다.

추출액:

KCl (1% KCl)

술파닐아미드 (0.5% 술파닐아미드)

트리톤 X-100 (0.1% 트리톤 X-100)

추출액중의 아질산성 질소의 정량에는, 오토애널라이저(BRAN+LUEBBE사제, AACSII)를 사용하여, 550nm의 필터의 투과율로부터 아질산성 질소의 함량을 환산했다. 또한, 아질산성 질소의 발색에는, 1%의 술파닐아미드와 0.1%의 N-나프틸에틸렌디아민2염산염을 사용했다. 그 결과를 표 6에 나타내었다.

[표 6] 아질산성 질소(NO₂-N) 함량(㎍/g)

	처리후 경과일수
군	0일째	10일째
무처리군	0.71	1.25
수처리군	0.71	3.29
LG38 균주군	0.71	1.20

표 6으로부터 명백해진 바와 같이, TSNA 생성의 원인 물질인 아질산성 질소의 함량은, 건조 10일째에 수처리군에서는 현저하게 증가하고 있지만, 이에 반하여, LG38 균주군에서는 무처리군보다도 약간이기는 하지만 아질산성 질소의 함량이 저하되어 있었다.

LG38 균주는, 균학적 성질로부터는 질산환원 능력을 갖는 균주라고 동정되었지만, 상기의 결과로부터, 무처리군보다는 질산태질소로부터 아질산성 질소로의 환원을 억제하고 있는 것이 시사되었다.

실시예 3: LG5 균주에 의한 NNK 저감 효과

실시예 2의 5의 방법에서 사용한 미생물을 LG5로 대체한 이외는, 실시예 2에 기재된 방법과 동일하게 하여 NNK 함량을 정량했다.

결과를 표 7에 나타내었다.

[표 7] NNK 성분의 함량(㎍/g)

	처리후 경과일수
군	10일째	21일째	32일째
무처리군	0.15	0.52	0.29
수처리군	0.71	0.61	0.32
LG5 균주군	0.59	0.78	0.22

표 7로부터 명백해진 바와 같이, NNK 함량은, 무처리군에서는 21일째까지는 증가하고 있었지만, 32일째(건조 종료시)에는 21일째보다도 저하되어 있었다. 수처리군, LG5 균주군 모두 21일째까지는 높은 함량을 나타내고 있었지만, 무처리군과 동일하게 32일째에는 21일째의 함량보다도 저하되어 있었다. LG5 균주군의 32일째 함량은, 무처리군의 함량보다 약간이기는 하지만 저하되어 있었다. 이들 결과로부터, LG5 균주는 NNK 함량을 저감하는 능력을 갖고 있는 것이 시사되었다.

여기서 인용되는 문헌은, 인용에 의해 그 전체가 본 명세서에 포함된다.

다른 이익 및 변경이 당업자에 의해 용이하게 도출될 것이다. 따라서, 그러한 보다 넓은 범위를 갖는 본 발명은, 여기에 나타내고 또한 기재된 상세한 또한 대표적인 태양에 의해 한정되는 것은 아니다. 따라서, 첨부된 청구의 범위 및 그것들의 등가물에 의해 한정되는 것 같은 전반적인 발명의 사상의 정신 및 범위로부터 일탈하는 일 없이 다양한 변경이 가능하다.

실시예 4: TSNA 분해 균처리에 의한 잎담배 분말중의 TSNA 함량에의 영향

1/10 TS 액체 배지에, LG5 균주 및 LG38 균주를 각각 접종하고, 30℃에서 72시간 배양한 후, 이들 균체를 포함하는 배지를 5,000rpm으로 원심하여 균체를 모았다. 균체를 멸균 증류수로 2회 세정후, 다시 멸균 증류수에 현탁했다. 균체 농도를 10⁸~10⁹cfu/ml로 조정한 미생물 현탁액을 접종원으로 하였다.

LG5 균주의 실험에는, 토치기현 오야마시 니뽄다바코산교(주) 잎담배 연구소에서 재배한 건조 담배(품종:키타카미 1호)의 중엽(cutter)부위의 동결 건조 분말을, LG38 균주의 실험에는 잎줄기부위의 동결 건조 분말을 시험했다.

각각의 담배 분말을 유발에 일정량 넣고, 소정의 수분 함량이 되도록 미생물 현탁액을 첨가했다. 유발에서 분말중의 수분 함량이 균일해지도록 혼합했다. 접종 분말을 삼각 플라스크에 일정량 넣고, 소정의 온도에서 정치했다.

분석은, 처리전에 채취한 시료와 정치후 4주간 후에 채취한 시료에 대해서 분석했다. 각각의 시료 5g을 200ml용량 삼각 플라스크에 넣고, 0.01M NaOH 용액(Thimerosa1:100μg/ml 함유)을 100ml 가하고, 진동기에 의해 실온에서 2시간 추출했다. 그 후, 여과지(ADVANTEC사, No.5C)를 사용하여 추출액을 여과했다.

다음으로, TSNA의 4성분량(NNN, NNK, NAT 및 NAB)을 실시예 1에 기재된 방법으로 분석했다.

처리전과 정치후 4주간후의 TSNA 함량을 표 8 및 표 9에 나타내었다.

[표 8] LG38 균주 처리에 의한 잎담배 분말중의 TSNA 함량의 변화

* NAB, NNK는 검출한계 이하였으므로 나타내지 않음.

[표 9] LG5 균주 처리에 의한 잎담배 분말중의 NNK 함량의 변화

* NAB는 검출한계 이하였으므로 나타내지 않음.

상기의 실험으로부터, LG5 균주는 TSNA의 4성분중에서 NNK를 특이적으로 분해하고, LG38 균주는 TSNA의 4성분 모두를 분해했다.

LG5 균주를 처리한 합엽분말의 4주후의 NNK 함량은, 처리전보다 감소되어 있었다. LG38 균주를 처리한 본엽의 4주후의 NNN 및 NAT 함량을 처리전과 비교하면, 2성분 모두 어느 처리군에서나 감소되어 있었다. 담배 분말을 시험에 제공한 실험에 있어서도, 상기의 실험과 동일하게 LG5 균주는 NNK를 분해하고, LG38 균주는NNN 및 NAT를 분해했다.

실시예 5: TSNA 분해균 처리에 의한 저장 잎담배중의 TSNA 함량에의 영향

LG38 균주를 1/10 TS 액체 배지에 접종하고, 30℃에서 72시간 배양했다. 배양후, 균체를 포함하는 배지를 5,000rpm으로 원심하여 균체를 모았다. 균체를 멸균 증류수로 2회 세정후, 다시 멸균 증류수에 현탁했다. 균체 농도를 10⁸~10⁹cfu/ml로 조정한 미생물 현탁액을 접종원으로 했다.

미생물 현탁액을, 파이프 하우스에서 건조중의 벌리종의 잎담배(중골건(中骨乾) 건조 말기, 건조 29일째, 품종: 키타카미 1호)의 앞뒤면에 1장당 10ml씩, 분무기를 사용해서 처리했다. 처리한 잎담배를 3일간 파이프 하우스에서 건조한 후, 저장 시험에 제공하여 시험했다.

분석 시료의 채취: 저장을 시작하기 전에, 파이프 하우스로부터 가져온 잎담배 건엽의 반엽 엽육을 채취하여, 처리전 샘플로 하였다. 나머지 중골이 붙은 반엽 엽육에 대해서 저장했다. 저장은 일정한 조건으로 설정한 항온항습을 사용했다. 저장의 조건으로서, 온도 20℃ 습도 70%, 온도 20℃ 습도 80%, 온도 30℃ 습도 80%의 3군을 설정했다. 저장후 1개월, 3개월후에 샘플링했다. 미생물을 처리하지 않고 상기와 같은 조건에서 저장한 건엽을 대조군으로 하였다. 채취한 잎담배를 엽육과 중골로 분리한 후, 동결 건조한 엽육의 샘플을 믹서를 사용해서 분쇄했다. TSNA 함량의 정량에는 엽육의 샘플만을 사용했다.

상기한 처리를 한 각 군의 엽육 샘플 약 5g을 200ml용량 삼각 플라스크에 넣고, 0.01M NaOH 용액(Thimerosal:100μg/ml 함유)을 100ml 가하고, 진동기에 의해 실온에서 2시간 추출했다. 그 후, 여과지(ADVANTEC사, No.5C)를 사용해서 추출액을 여과했다.

TSNA의 4성분량(NNN, NNK, NAT 및 NAB)의 정량은, 실시예 1에 기재된 방법에 의해 분석했다.

결과를 표 10에 나타내었다.

[표 10] 미생물 처리에 의한 저장 잎담배중의 TSNA 함량의 변화

무처리군의 저장 1개월 후에는, 20℃, 70% 군 및 30℃, 70% 군에서 증가했다. 특히, 3개월 후에 30℃, 70% 군 및 30℃, 80% 군에서 크게 증가했다. LG38 균주 처리군에서는, 1개월, 3개월 후에 감소하는 경향이 발견되었다.

특히, 저장 1개월 후에는 크게 감소되어 있었다.

Claims

잎담배에 대하여, 스핑고모나스·파우시모비리스종 및 슈도모나스·플루오레센스종에 속하고, TSNA를 저감하는 능력을 갖는 미생물로 이루어지는 군으로부터 선택되는 미생물을 처리하는 것을 특징으로 하는 잎담배의 TSNA 함량의 저감방법.
제 1항에 있어서, 상기 TSNA를 저감하는 미생물을 처리하는 것이, 잎담배의 수확 직전 및/또는 건조기의 개시시부터 저장기의 종료시까지의 사이에 행하여지는 것을 특징으로 하는 잎담배의 TSNA 함량의 저감방법.
제 1항에 있어서, 상기 TSNA를 저감하는 미생물을 처리하는 것이, 현탁액 또는 건조 균체의 어느 상태에 있는 상기 미생물의 균체를, 산포 또는 도포의 어느 방법에 의해 행하여지는 것을 특징으로 하는 잎담배의 TSNA 함량의 저감방법.
제 2항에 있어서, 상기 TSNA를 저감하는 미생물을 처리하는 것이, 현탁액 또는 건조 균체의 어느 상태에 있는 상기 미생물의 균체를, 산포 또는 도포의 어느 방법에 의해 행하여지는 것을 특징으로 하는 잎담배의 TSNA 함량의 저감방법.
제 1항에 있어서, 상기 TSNA가 N'-니트로소노르니코틴, 4-(N'-니트로소메틸아미노)-1-(3-피리딜)-1-부타논, N'-니트로소아나타빈 및 N'-니트로소아나바신으로이루어지는 군으로부터 선택되는 적어도 하나인 것을 특징으로 하는 잎담배의 TSNA 함량의 저감방법.
제 1항에 있어서, 상기 잎담배가 재래종 및 벌리종으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 잎담배의 TSNA 함량의 저감방법.
잎담배에 대하여, 스핑고모나스·파우시모비리스 LG5 균주 및 슈도모나스·플루오레센스 LG38 균주로 이루어지는 군으로부터 선택되는 TSNA를 저감하는 미생물을 처리하는 것을 특징으로 하는 잎담배의 TSNA 함량의 저감방법.
제 7항에 있어서, 상기 TSNA를 저감하는 미생물을 처리하는 것이, 잎담배의 수확 직전 및/또는 건조기의 개시시부터 저장기의 종료시까지의 사이에 행하여지는 것을 특징으로 하는 잎담배의 TSNA 함량의 저감방법.
제 7항에 있어서, 상기 TSNA를 저감하는 미생물을 처리하는 것이, 현탁액 또는 건조 균체의 어느 상태에 있는 상기 미생물의 균체를, 산포 또는 도포의 어느 방법에 의해 행하여지는 것을 특징으로 하는 잎담배의 TSNA 함량의 저감방법.
제 7항에 있어서, 상기 TSNA가 N'-니트로소노르니코틴, 4-(N'-니트로소메틸아미노)-1-(3-피리딜)-1-부타논, N'-니트로소아나타빈 및 N'-니트로소아나바신으로이루어지는 군으로부터 선택되는 적어도 하나인 것을 특징으로 하는 잎담배의 TSNA 함량의 저감방법.
제 7항에 있어서, 상기 잎담배가 재래종 및 벌리종으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 잎담배의 TSNA 함량의 저감방법.
스핑고모나스·파우시모비리스 또는 슈도모나스·플루오레센스에 속하고, 잎담배의 건조 및 저장중에 생성하는 N'-니트로소노르니코틴, 4-(N'-니트로소메틸아미노)-1-(3-피리딜)-1-부타논, N'-니트로소아나타빈 및 N'-니트로소아나바신으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 적어도 하나의 성분의 잎담배중의 함량을 저감하는 능력을 갖는 미생물.
잎담배중의 TSNA 함량을 저감하는 스핑고모나스·파우시모비리스 LG5 균주(FERM BP-7830).
잎담배중의 TSNA 함량을 저감하는 슈도모나스·플루오레센스 LG38 균주(FERM BP-7831).
잎담배에 대하여, 스핑고모나스·파우시모비리스종 및 슈도모나스·플루오레센스종에 속하고, TSNA를 분해하는 능력을 갖는 미생물로 이루어지는 군으로부터선택되는 미생물을 처리하는 것을 특징으로 하는 잎담배의 TSNA 함량의 저감방법.