CN105820984B - 芽孢杆菌属菌株Bacillus invictus ECU1101及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明属于微生物应用技术领域，具体涉及一种芽孢杆菌属菌株Bacillus invictus ECU1101及其应用。所述芽孢杆菌属菌株Bacillus invictus ECU1101，其保藏号为：CGMCC NO.12199。所述菌株能够在短期内降解醇化烟叶中的TSNAs、NNN、NNK、NAB、NAT普遍达8.5~30.0%以上。

Description

芽孢杆菌属菌株Bacillus invictus ECU1101及其应用
技术领域
本发明属于微生物应用技术领域，具体涉及一种芽孢杆菌属菌株Bacillusinvictus ECU1101及其应用。
背景技术
烟草特有亚硝胺(tobacco-specific nitrosamines,TSNAs)主要包括NNN(N-亚硝基去甲基烟碱)，NAT(N-亚硝基新烟草碱)，NAB(N-亚硝基假木贼碱)和NNK(4-(N-甲基-亚硝氨)-1-(3-吡啶基)-1-丁酮)，是含氮化合物(烟碱，去甲基烟碱，假木贼碱等)和亚硝酸盐衍生物(NO2，N2O3，N2O4等)在酸性条件下进行亚硝化反应的产物。TSNAs在烟草绿叶中含量很少甚至没有，通常被认为形成于烟叶调制时期，与烟草品种、调制温湿度、氮肥用量、生物碱含量、硝酸盐含量、亚硝酸盐含量、微生物群落等因素相关。
烟草特有亚硝胺(TSNAs)是烟草最主要的一类慢性致癌物，是烟叶中重要的有害成分且影响烟叶的品质。近40年来，降低烟叶TSNAs含量一直是烟草工作者研究的重点，也是全球各大烟草公司的重点研究项目，农业技术、调制技术、物理技术和生物技术被用于TSNAs含量的降低，其中微生物应用技术比其他技术更具实用性与安全性。
目前有关于降低烟叶TSNAs含量的微生物的报道较少，且来源与种类相对局限。雷丽萍从白肋烟TN90品种的主叶脉组织中分离到一株内生芽孢杆菌，通过对白肋烟叶片喷施可使叶片组织中烟草特有亚硝胺含量降低44.6％(雷丽萍.烟草内生芽孢杆菌降低烟叶亚硝胺类物质含量的研究.西南农业学报.2007,20(3),515-520.)。陕西中烟工业有限责任公司和中国烟草总公司青州烟草研究所联合西北农林科技大学，从醇化烤烟表面分离得到一株高效降解烟草特有亚硝胺的荧光假单胞菌，降解率达45.47％(单宏英,陈德鑫,李晶等.一株源于醇化烟叶表面高效降解TSNA菌株AS97的分离筛选、鉴定及应用.微生物学报.2011,51(10),1326-1333.)。但是，尚无来源于可用于生产袋装口含烟的晒红烟的相关作用菌株的报道。因此，筛选该来源的微生物以应用于降解烟草特有亚硝胺含量，对新型烟草制品的制造与烟草有害化学物质的降低都具有重要意义，即为新型烟草制品的减害提供新的方法支撑。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术的缺陷，提供一种芽孢杆菌属菌株Bacillusinvictus ECU1101及其应用。
为实现上述目的及其相关目的，本发明采用如下技术方案：
本发明的第一方面，提供了一种芽孢杆菌属菌株Bacillus invictus ECU1101，其保藏号为：CGMCC NO.12199。
本发明从取自贵州省的一份晒红烟烟叶样品中分离筛选到一种芽孢杆菌属菌株Bacillus invictus ECU1101，该菌株已于2016年03月10日在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)保藏，保藏号为CGMCC NO.12199。
在本发明实施例中筛选培养基上培养时，该菌株细胞呈圆形，直径在0.3cm，呈黄色，有凸起，无光泽，边缘不规则。
经形态学鉴定和16S rRNA分子鉴定，确定该菌株为芽孢杆菌属菌株，命名为芽孢杆菌属菌株Bacillus invictus ECU1101(按照国际命名规则：属名+种名+株名对该菌株进行命名，属名、种名、株名分别为Bacillus invictus和ECU1101，因此该菌株命名为Bacillus invictus ECU1101)。该菌株保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，保藏号为CGMCC NO.12199。
优选地，所述芽孢杆菌属菌株Bacillus invictus ECU1101对烟草特有亚硝胺具有显著的降解效果。更优选地，所述芽孢杆菌属菌株Bacillus invictus ECU1101对晒红烟中的烟草特有亚硝胺具有显著的降解效果。
更优选地，所述晒红烟为贵州晒红烟。
本发明的第二方面，提供了芽孢杆菌属菌株Bacillus invictus ECU1101在降解烟草特有亚硝胺或制备烟草特有亚硝胺降解产品中的用途。
优选地，所述烟草为晒红烟。更优选地，所述烟草为贵州晒红烟。
优选地，所述发酵的温度条件是20～40℃。更优选地，所述发酵的温度条件是28℃。
优选地，所述发酵的时间条件是8～15天。
本发明第三方面公开了一种降解烟草特有亚硝胺的方法，包括如下步骤：
(1)将芽孢杆菌属菌株Bacillus invictus ECU1101活化后，接种于发酵培养基，发酵，收集发酵菌液；
(2)在烟草上接种步骤(1)所得发酵菌液，通气，发酵醇化。
优选地，步骤(2)中，所述烟草为晒红烟。更优选为贵州晒红烟。
与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：
(1)与已报道的烟草特有亚硝胺降解菌株相比，本发明所筛选到的有效降解烟草特有亚硝胺菌株芽孢杆菌属菌株Bacillus invictus ECU1101来源于晒红烟品种，且该芽孢杆菌属菌株此前未有此作用的报道。所述菌株能够在短期内降解醇化烟叶中的TSNAs、NNN、NNK、NAB、NAT普遍达8.5～30.0％以上。
(2)所述芽孢杆菌属菌株大量存在于晒红烟表面，属绝对优势菌属，易于获得，可稳定操作。对人体无害的同时，因其来源于晒红烟本身而更易附着并发挥降解烟草特有亚硝胺的作用，从而为以晒红烟为原料制备袋装口含烟提供烟草减害支持。
(3)本发明中的芽孢杆菌属菌株能良好适应满足感官需求的晒红烟发酵条件，且在其条件下能够有效降解烟草特有亚硝胺，可实现袋装口含烟制备的感官需求与降低有害化学物质的双重目标。
本发明菌株保藏信息如下：
菌株名称：Bacillus invictus ECU1101；
保藏号为：CGMCC NO.12199；
保藏日期：2016年03月10日；
保藏单位名称：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心；
保藏单位简称：CGMCC；
保藏单位地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号。
附图说明
图1：阳性菌株筛选方法示意图。
具体实施方式
在进一步描述本发明具体实施方式之前，应理解，本发明的保护范围不局限于下述特定的具体实施方案；还应当理解，本发明实施例中使用的术语是为了描述特定的具体实施方案，而不是为了限制本发明的保护范围。下列实施例中未注明具体条件的试验方法，通常按照常规条件，或者按照各制造商所建议的条件。
当实施例给出数值范围时，应理解，除非本发明另有说明，每个数值范围的两个端点以及两个端点之间任何一个数值均可选用。除非另外定义，本发明中使用的所有技术和科学术语与本技术领域技术人员通常理解的意义相同。除实施例中使用的具体方法、设备、材料外，根据本技术领域的技术人员对现有技术的掌握及本发明的记载，还可以使用与本发明实施例中所述的方法、设备、材料相似或等同的现有技术的任何方法、设备和材料来实现本发明。
除非另外说明，本发明中所公开的实验方法、检测方法、制备方法均采用本技术领域常规的分子生物学、生物化学、染色质结构和分析、分析化学、细胞培养、重组DNA技术及相关领域的常规技术。这些技术在现有文献中已有完善说明，具体可参见Sambrook等MOLECULAR CLONING：A LABORATORY MANUAL，Second edition，Cold Spring HarborLaboratory Press，1989 and Third edition，2001；Ausubel等，CURRENT PROTOCOLS INMOLECULAR BIOLOGY，John Wiley&Sons，New York，1987and periodic updates；theseries METHODS IN ENZYMOLOGY，Academic Press，San Diego；Wolffe，CHROMATINSTRUCTURE AND FUNCTION，Third edition，Academic Press，San Diego，1998；METHODS INENZYMOLOGY，Vol.304，Chromatin(P.M.Wassarman and A.P.Wolffe，eds.)，AcademicPress，San Diego，1999；和METHODS IN MOLECULAR BIOLOGY，Vol.119，ChromatinProtocols(P.B.Becker，ed.)Humana Press，Totowa，1999等。
实施例1 芽孢杆菌属菌株Bacillus invictus ECU1101的获得及其应用
无菌条件下采集晒红烟烟叶样品7g，加入无菌生理盐水150mL，在室温下振荡1.5h。灭菌纱布过滤后离心得到烟样表面微生物浸出液，用灭菌生理盐水梯度稀释6个梯度后于30℃平板静置培养48h。分离培养基组成为：葡萄糖20.0g/L，NaNO2(KNO3)1.0–3.0g/L，K2HPO4 1.5g/L，KH2PO4 1.0g/L，MgSO4·7H2O 0.1g/L，NaCl 0.5g/L，CaCl2·2H2O 0.01g/L，琼脂15.0g/L，调节pH 7.0。所采集的晒红烟烟叶样品为贵州晒红烟烟叶粉末。
分离到直径1～4mm，白色或淡黄色，结晶紫染色显微观察为杆状或短杆状，光泽和边缘整齐度不一的一批菌株，其可在分离培养基中以硝酸盐或亚硝酸盐为唯一氮源生长。
将分离获得的菌株接种到筛选培养基中，30℃振荡培养1–7d，定时取样，格里斯试剂法显色筛选阳性菌株。筛选培养基组成：葡萄糖20.0g/L，蛋白胨3.0g/L，K2HPO4 1.0g/L，KH2PO4 0.5g/L，MgSO4·7H2O 0.1g/L，NaCl 0.8g/L，CaCl2·2H2O 0.05g/L，MnSO4·H2O0.02g/L，NaNO2(KNO3)0.1–0.3g/L，调节pH 7.0。阳性菌株筛选方法如图1所示。
选出1d内完全降解NaNO2(KNO3)的阳性菌株(记为BA b2)，其为革兰氏阳性菌，其表型鉴定提供在表1中；经16S rRNA分子鉴定所筛选菌株(记为BA b2)的种属类别，相比于相应模式属微生物的一致性提供在表2中。
表1 所述芽孢杆菌属菌株的表型鉴定结果
菌株 形状 直径(cm) 颜色 凸起 光泽 边缘
BA b2 圆形 0.3 黄 有 无 不规则
表2 所述芽孢杆菌属菌株的分子鉴定结果
菌株 模式属微生物 一致性
BA b2 Bacillus invictus Bi.FFUP1<sup>T</sup> 99.79％
以LB培养基30℃振荡活化所筛选的保藏菌种(BA b2)，以3％(v/v)的接种量接种发酵培养基，180rpm、30℃振荡培养48h后收集发酵菌液，此时发酵液中菌种生长旺盛，活菌数达1010CFU/mL。发酵培养基组成：胰蛋白胨8g/L，酵母提取物4g/L，NaCl 9g/L，调节pH7.0。按8％(v/v)的接种量均匀接种未经醇化的保藏贵州晒红烟烟叶粉末，空白对照组为接种等量灭菌生理盐水的晒红烟样品。以28℃，初始水含量50％，相对湿度40％，通气的发酵条件醇化贵州晒红烟烟叶粉末15d。
根据国际烟草研究合作中心推荐方法No.72Determination of tobacco-specific nitrosamines in smokeless tobacco products by LC-MS/MS检测该芽孢杆菌属菌株(BA b2)对烟草特有亚硝胺的作用效果。结果显示，所述该菌株(BA b2)特别在醇化8d时，实现了对晒红烟样品中烟草特有亚硝胺总量及NNN、NNK、NAB、NAT含量的有效降低，结果提供于表3。同时，所述该菌株(BA b2)也可在醇化8d时，有效降解烟草中硝酸盐和亚硝酸盐的含量，结果提供于表4。
表3 所述芽孢杆菌属菌株对烟草特有亚硝胺的降解结果
表4 所述芽孢杆菌属菌株对烟草硝酸盐与亚硝酸盐的降解结果
本申请将菌株(BA b2)命名为芽孢杆菌属菌株Bacillus invictus ECU1101，该菌株已于2016年03月10日在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)保藏，保藏号为CGMCC NO.12199。
以上所述，仅为本发明的较佳实施例，并非对本发明任何形式上和实质上的限制，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员，在不脱离本发明方法的前提下，还将可以做出若干改进和补充，这些改进和补充也应视为本发明的保护范围。凡熟悉本专业的技术人员，在不脱离本发明的精神和范围的情况下，当可利用以上所揭示的技术内容而做出的些许更动、修饰与演变的等同变化，均为本发明的等效实施例；同时，凡依据本发明的实质技术对上述实施例所作的任何等同变化的更动、修饰与演变，均仍属于本发明的技术方案的范围内。

Claims (8)

1.一种芽孢杆菌属菌株Bacillus invictus ECU1101，其保藏号为：CGMCC NO.12199。
2.如权利要求1所述的芽孢杆菌属菌株Bacillus invictus ECU1101在降解晒红烟特有亚硝胺或制备晒红烟特有亚硝胺降解产品中的用途。
3.根据权利要求2所述的用途，其特征在于，所述烟草为贵州晒红烟。
4.一种降解晒红烟特有亚硝胺的方法，包括如下步骤：(1)将如权利要求1或2所述的芽孢杆菌属菌株Bacillus invictus ECU1101活化后，接种于发酵培养基，发酵，收集发酵菌液；(2)在晒红烟上接种步骤(1)所得发酵菌液，通气，发酵醇化。
5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述烟草为贵州晒红烟。
6.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述发酵的温度条件是20～40℃。
7.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述发酵的温度条件是28℃。
8.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述发酵的时间条件是8～15天。
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