CN117645952A - 一株根际假单胞菌及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一株具有促生长作用的根际假单胞菌及其应用，菌株分类命名为Pseudomonas rhizophila，菌株号为Pseudomonas rhizophila PB11，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.27929，保藏日期为2023年7月17日。本发明提供的根际假单胞菌，高产3‑吲哚乙酸以及胞外多糖，具有良好的促生性状；同时在油莎豆根际分泌物存在时趋化性和生物膜形成能力强，能够良好定植油莎豆根际，对油莎豆幼苗具有促进根系生长、促进根系活力、提高抗逆性、提高干旱耐受性的促生长作用。本发明的根际假单胞菌可作为微生物菌肥使用，促进作物幼苗生长提高经济效益。
Description
技术领域
本发明涉及微生物技术领域，尤其涉及一株根际假单胞菌及其在作物幼苗促生长剂中的应用。
背景技术
假单胞菌(Pseudomonas.)为直的或弯的、以极生鞭毛运动、不产生芽孢、有机化能异养型、呼吸代谢、永不发酵的革兰氏阴性杆菌。假单胞菌广泛分布于自然界，如土壤、水、食物和空气中。假单胞菌种类繁多至少包括两百多种，因此功能非常多样化，是潜在的有益微生物资源。
假单胞菌具有重要生态意义，对地球碳氮循环起非常重要的作用。它们具有例如分泌铁载体、增加磷酸盐溶解能力和分泌拮抗化合物拮抗植物病原体、合成生长素、激发植物根际促生细菌活性等益生特点，在植物发育中发挥不同的功能。据报道，假单胞菌可以刺激植物生长，增加植物对生物和非生物胁迫的抵抗力，还具有生物膜形成、抗真菌代谢产物产生、群体感应调节、与植物根系协同附着、趋化调节、吸收和分解代谢等生态学特性。
植物通过多种策略适应和响应环境中的生物和非生物因素，例如将化合物从根部分泌到周围土壤中。这些根系分泌物通过改变根周围的土壤物理化学环境来调节植物性能，促进养分获取并吸引特定的有益微生物群。同时，根际微生物群落可以影响植物的生产能力，其中具有促生长能力的根际微生物会在植物受到非生物胁迫时如干旱，会提供积极效应，发挥有益作用。因此，开发具有促生性状且具有良好定殖能力的假单胞菌菌株，研制高效微生物菌肥，对促进农作物生长，提高经济效益具有重要意义。
油莎豆(Cyperus esculentus L.)，属莎草科莎草属，是多年生草本植物，具有适应性广、生长期短、生物量大和含油量高等优点，含有油脂、淀粉、糖、蛋白质、各种纤维素及其各类生物活性成分。它的地上部分可做青贮饲料，块茎可以榨油，在防风固沙和防止水土流失等方面也有重要作用。油莎豆的原产地为沙漠干旱地带，在长时间的适应中形成耐高温、耐贫瘠、耐盐碱、抗旱、耐涝等特点，虽然油莎豆有较强的生命力，但长期干旱也会使油莎豆降低产量。油莎豆兼具食用价值和药用价值，帮助其增强抗干旱能力尤其是提高幼苗生长能力对其高产高效种植有重要意义。
发明内容
本发明针对上述技术问题，提供一株根际假单胞菌及其在作物幼苗促生长剂中的应用。本发明提供的根际假单胞菌高产3-吲哚乙酸以及胞外多糖，具有良好的促生性状；同时，在油莎豆根际分泌物存在时趋化性和生物膜形成能力强，能够良好定植油莎豆根际，对油莎豆幼苗具有促进根系生长、促进根系活力、提高抗逆性、提高干旱耐受性的促生长作用。可作为微生物菌肥使用，促进作物幼苗生长，提高经济效益。
为了实现上述目的，本发明提供如下技术方案：
第一方面，本发明提供的一株根际假单胞菌，其分类命名为Pseudomonasrhizophila，菌株号为Pseudomonas rhizophila PB11，已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，保藏编号为CGMCC No.27929，保藏日期为2023年7月17日。
第二方面，本发明还提供了上述的根际假单胞菌在作物幼苗促生长剂中的应用。
优选的实施方式中，所述作物幼苗为油莎豆幼苗。
具体地，根际假单胞菌在作物幼苗促生长剂中的应用方法为：将根际假单胞菌在TSB液体培养基中28～32℃培养0.5～1.5d、制备OD600为0.8～1.3的根际假单胞菌菌悬液。
第三方面，本发明还提供了一种作物幼苗促生长剂，包含上述的根际假单胞菌。具体地，所述根际假单胞菌菌悬液的OD600值为0.8～1.3。
第四方面，本发明还提供了一种作物幼苗促生长剂在幼苗种植中的应用，所述的作物幼苗促生长剂在每一根油莎豆植株的根际接种2～3mL，每日喷洒无菌水保持水分，在温度为28℃、960min/16℃、480min，湿度为60％的条件下培育。
与现有技术相比，本发明的有益效果为：
本发明提供的根际假单胞菌，来源于从野外种植的油莎豆根际土壤，筛选出的Pseudomonas rhizophila PB11菌株，属于假单胞菌属，革兰氏染色阴性，杆状，高产3-吲哚乙酸以及胞外多糖，具有良好的促生长性状；同时，在油莎豆根际分泌物存在时趋化性和生物膜形成能力强，能够良好定植油莎豆根际，对油莎豆幼苗具有促进根系生长、促进根系活力、提高抗逆性、提高干旱耐受性的促生长作用。因此，本发明提供的根际假单胞菌，可作为微生物菌肥使用，能够促进作物幼苗生长，提高经济效益。
附图说明
为了更清楚地说明本申请实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明中记载的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为本发明提供的Pseudomonas rhizophila PB11的革兰氏染色镜检照片(TSB，1000×)；
图2为本发明提供的不同假单胞菌菌株的16S rDNA序列比对；
图3为本发明提供的Pseudomonas rhizophila PB11的rpoD基因系统进化树；
图4为本发明提供的四株假单胞菌的3-吲哚乙酸产量；
图5为本发明提供的四株假单胞菌的胞外多糖产量；
图6为本发明提供的不同假单胞菌的生物膜形成能力；
图7为本发明提供的不同假单胞菌处理对油莎豆根长和株高的影响；
图8为本发明提供的不同假单胞菌处理对油莎豆根系活力的影响；
图9为本发明提供的不同假单胞菌处理对油莎豆的抗氧化酶活性的影响；
图10为本发明提供的不同假单胞菌处理下油莎豆的细胞分裂素含量的影响。
具体实施方式
为了使本领域的技术人员更好地理解本发明的技术方案，下面将结合实施例对本发明作进一步的详细介绍。
实施例1Pseudomonas rhizophila PB11的分离鉴定试验
本发明的Pseudomonas rhizophila PB11株根际假单胞菌是从野外种植的油莎豆根际土壤中无菌分离。分离方法为：称取1.5g油莎豆根际土壤溶于25mL磷酸盐缓冲液溶液中，混匀，十倍梯度稀释至10-4，分别取100μL的10-2、10-3、10-4浓度的稀释液涂布于TSA琼脂培养基，重复三次，30℃培养。1d后，观察平板上菌落，挑取单菌落再用TSA琼脂培养基划线培养获得。与PB11株一同分离的还有其他三株，记为P19、PA1和PA2，来源和分离方法相同。
本发明的Pseudomonas rhizophila PB11株根际假单胞菌的革兰氏染色镜检结果为阴性(如图1所示，细胞被染成红色)。
采用通用引物(27F和1492R)进行16S rDNA进行PCR扩增，经测序和序列比对，PB11、P19、PA1和PA2均被判定为假单胞菌属；但PB11的16s rDNA序列与PA1和PA2不同(如图2所示)。
进一步地提取基因组DNA，通过特定引物(见表1)分别扩增rpoD和gyrB序列片段，进行测序和序列比对，确定PB11和P19为Pseudomonas rhizophila；确定PA1和PA2为Pseudomonas thiveralensis(如图3所示)。
表1扩增rpoD和gyrB基因的引物序列
实施例2Pseudomonas rhizophila PB11的促生性状检测
(1)3-吲哚乙酸产量检测
测量PA1、PA2、P19和PB11四株根际假单胞菌分别在第0、3、5和7天的3-吲哚乙酸(IAA)产量，四株根际假单胞菌在这7天中的最高3-吲哚乙酸产量如图4所示。从图中可以看出，3-吲哚乙酸产量最高的菌株是PA1和PB11(16.61μg/mL)，显著高于PA2和P19(P<0.05)。
(2)胞外多糖产量检测
生物膜主要由胞外多糖基质构成，通过检测菌株产生胞外多糖的能力可以间接说明菌株形成生物膜的能力。PA1、PA2、P19和PB11四株假单胞菌的胞外多糖产量如图5所示，PB11的胞外多糖产量显著高于其他菌株(P<0.05)，可达0.67g/L。
(3)对根系分泌物的趋化性测定
细菌与植物根部相互作用时，植物根部通过趋化性吸引细菌进而定殖和生物膜形成。因此，收集干旱胁迫下的油莎豆根系分泌物，测定油莎豆根系分泌物对假单胞菌的趋化性。趋化指数≥2被认为具有良好的趋化性。结果如表2所示，从表中可以看出，油莎豆根系分泌物对PA1、PA2、P19和PB11四株假单胞菌均有良好的趋化性。其中，对PB11、P19和PA1的趋化指数均大于28，显著高于PA2的趋化指数(P<0.01)。表明PB11和P19对油莎豆根际分泌物具有良好的趋化性。
表2干旱胁迫下的油莎豆根系分泌物对假单胞菌的趋化指数
注：数据后面的不同字母表示这些数据具有显著性差异，相同字母表示这些数据没有显著性差异。
(4)生物膜形成能力测定
油莎豆根系分泌物存在时，采用结晶紫染色法检测PA1、PA2、P19和PB11四株假单胞菌的生物膜形成能力。结果如图6所示，PB11和P19生物膜形成能力显著高于PA1和PA2(P<0.001)。
综上，本发明中Pseudomonas rhizophila PB11株的3-吲哚乙酸产量最高可达16.61μg/mL，胞外多糖产量可达0.67g/L，趋化指数大于28，生物膜形成值为0.116，均优于同条件下的其他菌株。
实施例3Pseudomonas rhizophila PB11的油莎豆幼苗的促生长实验
从实施例2的结果可以看出，PB11和P19两株假单胞菌相对PA1和PA2有更好的促生长潜力，因此进一步通过油莎豆幼苗促生长实验来检验PB11和P19的应用方法与效果。
(1)对油莎豆根长和株高的影响
将P19株、PB11株假单胞菌菌悬液分别接种于油莎豆幼苗根际后，对油莎豆根长、株高的影响如图7所示。结果发现，接种P19株的油莎豆的植株高度显著高于只接种无菌水的油莎豆对照组(CK组)，但对根系长度无显著促进作用。接种PB11株的油莎豆根长(P<0.01)和株高(P<0.05)均显著高于只接种无菌水的油莎豆对照组(CK组)，与CK组相比，接种PB11株的油莎豆根长增加23.82％，株高增高28.30％，说明PB11株能显著促进油莎豆根系生长，且相对于接种P19株的油莎豆，促根系生长能力更为显著。
(2)对油莎豆根系活力的影响
根系活力是反应根的生长情况和代谢水平，根的生长情况和活力水平直接影响地上部的营养状况及产量水平。P19株、PB11株假单胞菌处理对油莎豆根系活力的影响如图8所示。从图中可以看出，与无菌水对照组(CK组)相比，接种PB11能显著促进油莎豆的根系活力(增加86％)，根系活力是对照组的1.87倍，且显著高于P19株(P<0.001)。
(3)对油莎豆抗氧化酶活性的影响
超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化物酶(POD)和过氧化氢酶(CAT)是植物抗氧化系统中的主要酶，它们起协同作用，清除植物体内过剩自由基，从而提高植物的抗逆性。它们的活性水平能反应植物受外界逆境影响的程度。
P19株、PB11株假单胞菌对油莎豆过氧化酶活性的影响如图9所示。与无菌水对照组(CK组)相比，接种PB11和P19均能显著促进油莎豆的SOD和POD活性(P<0.001)，PB11组的SOD活性比对照组提高了60％，POD活性提高了48％。与对照组相比，接种PB11的油莎豆CAT活性显著增加(P<0.05)，酶活提高了18％，而接种P19的油莎豆CAT无显著变化。
(4)对油莎豆细胞分裂素含量的影响
细胞分裂素(cytokinin，CTK)是一类促进细胞分裂、诱导芽的形成并促进其生长的植物激素。PB11和P19株对油莎豆细胞分裂素含量的影响如图10所示。与对照组(CK组)相比，接种PB11和P19均能显著增加油莎豆CTK含量(P<0.01)，PB11组的油莎豆CTK含量比对照组提高了8.95％，PB11与P19没有显著差异。
综上，本发明中Pseudomonas rhizophila PB11可增高油莎豆幼苗的根长增加23.82％，株高增高28.30％；使油莎豆根系活力增加86％；提高油莎豆SOD活性60％、POD活性48％、CAT活性18％；提高油莎豆CTK含量8.95％；且在促根系生长能力和促进油莎豆的根系活力显著优于同条件下的其他菌株。
以上实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换，但这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的精神和范围。以上所述仅为本发明的较佳实施例，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所做的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
Claims (7)
1.一株根际假单胞菌，其分类命名为Pseudomonas rhizophila，菌株号为Pseudomonasrhizophila PB11，已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.27929，保藏日期为2023年7月17日。
2.如权利要求1所述的根际假单胞菌在作物幼苗促生长剂中的应用。
3.如权利要求2所述的根际假单胞菌在作物幼苗促生长剂中的应用，其特征在于，所述作物幼苗为油莎豆幼苗。
4.如权利要求3所述的根际假单胞菌在作物幼苗促生长剂中的应用，其特征在于，应用方法为将根际假单胞菌在TSB液体培养基中28～32℃培养0.5～1.5d，制备OD600为0.8～1.3的根际假单胞菌菌悬液。
5.一种作物幼苗促生长剂，其特征在于，包含权利要求1所述的根际假单胞菌。
6.如权利要求5所述的作物幼苗促生长剂，其特征在于，所述根际假单胞菌菌悬液的OD600值为0.8～1.3。
7.如权利要求6所述的作物幼苗促生长剂在幼苗种植中的应用，其特征在于，所述的作物幼苗促生长剂在每一根植株的根际接种2～3mL，每日喷洒无菌水保持水分，在温度为28℃、960min/16℃、480min，湿度为55～65％的条件下培育。
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| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN118638698A (zh) * | 2024-08-15 | 2024-09-13 | 西北农林科技大学深圳研究院 | 一株嗜根假单胞菌及其在猕猴桃细菌性溃疡病防治中的应用 |
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