CN102551192A - 樟树叶烟用香料的制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种樟树叶烟用香料的制备方法，通过筛选烟叶表面的微生物，并分离出能产生香气的产香微生物，然后将其与无菌的樟树叶混合进行固体发酵，其后提取发酵产物中的挥发油，稀释得到樟树叶烟用香料。本发明通过微生物发酵的方法来获得烟用香料，可以有效的保存发酵原料中的活性成分，工艺简单，且为香料制备工业提供了一种新途径。所获得的樟树叶烟用香料可在一定程度上降低香烟对人体的伤害，且烟气细腻，平滑，有润感和轻微的甜感，透发性好，喉部刺激性明显减轻，有酿香和发酵的酸香，舌面无明显残留。
Description
技术领域
本发明涉及一种烟用香料的制备方法，具体地指一种樟树叶烟用香料的制备方法。
背景技术
加香加料是卷烟工艺中的关键环节，是完善产品风格的决定性因素和提高卷烟香气质量的有效手段之一。目前烟用香料按香料生产方法的不同主要分为2种，即采用各种分离手段直接从烟草或其它植物中提取的天然香料和采用化学反应合成的香料。
樟树叶中含量丰富的樟叶黄酮和各种维生素，可以有效地防止烟草中尼古丁、苯并芘、放射性元素及大量的自由基等对人体的危害。樟叶中的多酚类物质(樟多酚)可与香烟中尼古丁化合形成无毒复合物，对烟碱还有良好的过滤作用。在烟丝中加入不同浓度的樟叶提取物，能降低卷烟焦油含量和焦油的致突变性。樟多酚对气相烟引起鼠肺细胞膜损伤具有抑制作用，可抑制气相烟自由基引起的膜脂类分子的过氧化作用，对维护细胞膜的流动性有良好效果，可以有效地清除由GPCS(香烟气雾)处理的大鼠肝线粒体产生的脂质自由基，能抑制烟气中有害物质的生物活性和它对生物体基因的恶变，对“亚硝胺”、“黄曲霉毒素B1”等其它强致癌物的毒性，也有抑制作用。
由于樟树叶具有上述的多项优点，现有技术已有将樟树叶精油用于烟草工业中报道，但是并未详述其工艺过程。
发明内容
本发明的目的在于填补现有技术的空白，提供一种樟树叶烟用香料的制备方法。
为实现上述目的，本发明所提供的樟树叶烟用香料的制备方法，所述方法包括以下步骤：
(1)原料准备：
①选取樟树叶作为原料、灭菌得到无菌樟树叶备用；灭菌条件可选用在115℃下灭菌15～20min，为本领域常用技术手段；灭菌前可将樟树叶粉碎成樟树叶粉，使微生物分解樟树叶时更快速。
②烟叶复合培养基的制备：将烟叶和水按1∶5的比例混合后加热至100℃，并保持1～2小时，过滤得到烟水，将烟水和微生物固体培养基按3∶7～10的比例混合，制成烟叶复合培养基；制作烟叶复合培养基在于为其后的微生物培养提供适宜的生长环境，促进能分解烟草中有机物，产生香气的微生物有更大几率成为优势菌种。
(2)产香微生物的筛选：
①取烟叶5～10g，加入到无菌蒸馏水中，从中取100～1000μl的液体，滴加到由步骤(1)得到的烟叶复合培养基上，以平板划线分离或稀释涂平板法，在有氧或厌氧条件下培养，长出菌落后，将烟叶复合培养基放到体视镜下筛查，挑取10～50个酵母菌和/或芽孢杆菌的单菌落；发明人在大量的试验中得出酵母菌作为能产香微生物的效果更优秀，其次为芽孢杆菌，其他的菌体不适宜作为产香微生物的菌种培养。
②将挑出的单菌落在烟叶复合培养基中分别进行小量扩增培养，将小量扩增培养得到的菌液与无菌樟树叶混合，进行小试量的固体堆积发酵，然后对发酵好的樟树叶进行提取，获得发酵型樟树叶提取物；将得到的单菌落做小试培养，并提取其分泌的挥发油为筛选产香微生物做准备。
③将发酵型樟树叶提取物稀释后添加至香烟中，并通过卷烟加香评吸筛选所需的产香微生物，然后保存筛得的产香微生物的菌种；需要说明的是，卷烟加香评吸一般选取10～15人进行人工的香味评吸，综合评价能够产生增加酱香和柔和细腻烟气作用的微生物作为产香微生物，为本领域常用技术手段，此处不做赘述。保存筛选出的产香微生物菌种可以将其直接作为以后的发酵菌种，而不必每次进行微生物筛选工作，以简化工艺程序。
(3)利用步骤(2)中得到的产香微生物与无菌樟树叶混合，进行固体堆积发酵；
需要说明的是，如果是将保存的产香微生物菌种取出来进行樟树叶的发酵，则需要先将保存的菌种活化，其过程为：将所述产香微生物的菌种接种到斜面培养基上，置于20～37℃的恒温培养箱中培养24～48h使其中的菌种活化，再将活化的菌种接种于添加糖源的液体培养基中，于20～37℃恒温培养24～48h得到的培养液，将所述培养液离心弃除上清液，所得到的沉淀用生理盐水稀释震荡均匀，即得到的活化菌种液；斜面培养基优选为固体PDA培养基。添加糖源的液体培养基优选为PDA液体培养基，更适合酵母菌和芽孢杆菌的生长。
(4)对步骤(3)得到的发酵好的樟树叶进行提取，得到樟树叶烟用香料。
上述方法中，步骤(1)中所述的烟叶优选为自然陈化一年至两年的烟叶，其表面的产香微生物较其他的微生物多，为烟叶表面的优势菌种，使产香微生物的筛选更容易。
步骤(1)中所述的烟叶可选为白肋烟叶。
步骤(2)中和步骤(3)中所述的固体堆积发酵优选为：将产香微生物按照1∶1～10的质量比接种到无菌樟树叶中，放置于28～35℃的培养箱中发酵2～7天，得到发酵好的樟树叶。
步骤(2)中和步骤(4)中对发酵好的樟树叶进行提取的方法优选为水蒸气蒸馏法。水蒸气蒸馏法为本领域业内的常用香料提取方法，制得的香料无其他的残留物，绿色环保，为本发明的优选方法，但并不用以限制本发明。
所述水蒸气蒸馏法为：将上述发酵好的樟树叶，置于水蒸气蒸馏装置中，按发酵固体与纯净水质量比1∶10～15的比例加入的纯净水，加热至100℃，直至发酵固体与水的混合物开始沸腾，连续加热2～10h，收集发酵型樟树叶挥发油，利用95％的乙醇溶液按与挥发油质量比例100～1000∶1稀释挥发油，得到樟树叶烟用香料。
本发明的有益效果：本发明采用微生物发酵的方法来获得烟用香料，可以有效的保存发酵原料中的活性成分，工艺简单，且为香料制备工业提供了一种新途径。本发明所获得樟树叶烟用香料可在一定程度上降低香烟对人体的伤害，且烟气细腻，平滑，有润感和轻微的甜感，透发性好，喉部刺激性明显减轻，有酿香和发酵的酸香，舌面无明显残留。
具体实施方式
以下结合具体实施例对本发明作进一步的详细描述。
实施例1
本发明实施例提供了一种樟树叶烟用香料的备方法，包括以下步骤：
(1)原料准备：
①选取干燥的已粉碎的樟树叶作为原料，在115℃下灭菌15～20min，得到无菌樟树叶粉备用；
②烟叶复合培养基的制备：将自然陈化一年至两年的白肋烟叶和水按1∶5的比例混合后加热至100℃，并保持1小时，过滤得到白肋烟水，将白肋烟水和微生物固体培养基按3∶7的比例混合，制成烟叶复合培养基；
(2)产香微生物的筛选：
①取自然陈化一年至两年的白肋烟叶10g，加入到5ml无菌蒸馏水中，震荡45min，从中取100μl的液体，滴加到由步骤(1)得到的烟叶复合培养基上，以平板划线分离或稀释涂平板法，在有氧或厌氧条件下培养，长出菌落后，将烟叶复合培养基放到体视镜下筛查，挑取10～50个酵母菌和/或芽孢杆菌的单菌落；
②将挑出的单菌落在烟叶复合培养基中分别进行小量扩增培养，将小量扩增培养得到的菌液按照1∶10的质量比分别加入到无菌樟树叶粉中，于28～35℃的培养箱中7天进行小试固体堆积发酵，然后对发酵产物采用水蒸气蒸馏法进行提取，获得发酵型樟树叶提取物；
③将发酵型樟树叶提取物稀释后添加至香烟中，并通过卷烟加香评吸筛选所需的产香微生物，然后保存筛得的产香微生物的菌种；
(3)利用步骤(2)中得到的产香微生物对樟树叶进行固体堆积发酵：
①菌种活化：将所述产香微生物的菌种接种到固体PAD培养基上，置于37℃的恒温培养箱中培养24h使其中的菌种活化，再将活化的菌种接种于PAD液体培养基中，于37℃恒温培养40h得到的培养液，将所述培养液离心弃除上清液，所得到的沉淀用生理盐水稀释震荡均匀，即得到的活化菌种液；
②固体发酵：将活化种子液800ml接种到800g干燥的无菌的樟树叶粉中，搅拌，使其与种子液充分混合均匀，放置于35℃的培养箱中发酵2天，得到发酵好的樟树叶粉；
(4)对步骤(3)得到的发酵好的樟树叶粉进行提取：将上述发酵好的樟树叶粉，置于水蒸气蒸馏装置中，按发酵固体与纯净水质量比1∶12例加入的纯净水，加热至100℃，直至发酵固体与水的混合物开始沸腾，连续加热2h，收集发酵型樟树叶挥发油，利用95％的乙醇溶液按与挥发油质量比例1000∶1稀释挥发油，得到樟树叶烟用香料1。
实施例2
本发明实施例提供了一种樟树叶烟用香料的备方法，包括以下步骤：
(1)原料准备：
①选取干燥的已粉碎的樟树叶作为原料，在115℃下灭菌15～20min，得到无菌樟树叶粉备用；
②烟叶复合培养基的制备：将自然陈化一年至两年的白肋烟叶和水按1∶5的比例混合后加热至100℃，并保持2小时，过滤得到白肋烟水，将白肋烟水和微生物固体培养基按3∶8的比例混合，制成烟叶复合培养基；
(2)产香微生物的筛选：
①取自然陈化一年至两年的白肋烟叶5g，加入到5ml无菌蒸馏水中，震荡30min，从中取1000μl的液体，滴加到由步骤(1)得到的烟叶复合培养基上，以平板划线分离或稀释涂平板法，在有氧或厌氧条件下培养，长出菌落后，将烟叶复合培养基放到体视镜下筛查，挑取10～50个酵母菌和/或芽孢杆菌的单菌落；
②将挑出的单菌落在烟叶复合培养基中分别进行小量扩增培养，将小量扩增培养得到的菌液按照1∶5的质量比分别加入到无菌樟树叶粉中，于28～35℃的培养箱中4天进行小试固体堆积发酵，然后对发酵产物采用水蒸气蒸馏法进行提取，获得发酵型樟树叶提取物；
③将发酵型樟树叶提取物稀释后添加至香烟中，并通过卷烟加香评吸筛选所需的产香微生物，然后保存筛得的产香微生物的菌种；
(3)利用步骤(2)中得到的产香微生物对樟树叶进行固体堆积发酵：
①菌种活化：将所述产香微生物的菌种接种到固体PAD培养基上，置于35℃的恒温培养箱中培养36h使其中的菌种活化，再将活化的菌种接种于PAD液体培养基中，于20℃恒温培养24h得到的培养液，将所述培养液离心弃除上清液，所得到的沉淀用生理盐水稀释震荡均匀，即得到的活化菌种液；
②固体发酵：将活化种子液100ml接种到700g干燥的无菌的樟树叶粉中，搅拌，使其与种子液充分混合均匀，放置于30℃的培养箱中发酵5天，得到发酵好的樟树叶粉；
(4)对步骤(3)得到的发酵好的樟树叶粉进行提取：将上述发酵好的樟树叶粉，置于水蒸气蒸馏装置中，按发酵固体与纯净水质量比1∶15例加入的纯净水，加热至100，直至发酵固体与水的混合物开始沸腾，连续加热5h，收集发酵型樟树叶挥发油，利用95％的乙醇溶液按与挥发油质量比例100∶1稀释挥发油，得到樟树叶烟用香料2。
实施例3
本发明实施例提供了一种樟树叶烟用香料的备方法，包括以下步骤：
(1)原料准备：
①选取干燥的已粉碎的樟树叶作为原料，在115℃下灭菌15～20min，得到无菌樟树叶粉备用；
②烟叶复合培养基的制备：将自然陈化一年至两年的白肋烟叶和水按1∶5的比例混合后加热至100，并保持1.5小时，过滤得到白肋烟水，将白肋烟水和微生物固体培养基按3∶7的比例混合，制成烟叶复合培养基；
(2)产香微生物的筛选：取自然陈化一年至两年的白肋烟叶8g，加入到5ml无菌蒸馏水中，震荡60min，从中取500μl的液体，滴加到由步骤(1)得到的烟叶复合培养基上，以平板划线分离或稀释涂平板法，在有氧或厌氧条件下培养，长出菌落后，将烟叶复合培养基放到体视镜下筛查，挑取10～50个酵母菌和/或芽孢杆菌的单菌落；
②将挑出的单菌落在烟叶复合培养基中分别进行小量扩增培养，将小量扩增培养得到的菌液按照1∶1的质量比分别加入到无菌樟树叶粉中，于28～35℃的培养箱中2天进行小试固体堆积发酵，然后对发酵产物采用水蒸气蒸馏法进行提取，获得发酵型樟树叶提取物；
③将发酵型樟树叶提取物稀释后添加至香烟中，并通过卷烟加香评吸筛选所需的产香微生物，然后保存筛得的产香微生物的菌种；
(3)利用步骤(2)中得到的产香微生物对樟树叶进行固体堆积发酵：
①菌种活化：将所述产香微生物的菌种接种到固体PAD培养基上，置于28℃的恒温培养箱中培养48h使其中的菌种活化，再将活化的菌种接种于PAD液体培养基中，于28℃恒温培养48h得到的培养液，将所述培养液离心弃除上清液，所得到的沉淀用生理盐水稀释震荡均匀，即得到的活化菌种液；
②固体发酵：将活化种子液100ml接种到1000g干燥的无菌的樟树叶粉中，搅拌，使其与种子液充分混合均匀，放置于28℃的培养箱中发酵7天，得到发酵好的樟树叶粉；
(4)对步骤(3)得到的发酵好的樟树叶粉进行提取：将上述发酵好的樟树叶粉，置于水蒸气蒸馏装置中，按发酵固体与纯净水质量比1∶10例加入的纯净水，加热至100℃，直至发酵固体与水的混合物开始沸腾，连续加热10h，收集发酵型樟树叶挥发油，利用95％的乙醇溶液按与挥发油质量比例500∶1稀释挥发油，得到樟树叶烟用香料3。
将上述实施例中制得的烟用香料分别加入到香烟中做评析得到：加入樟树叶香料的香烟，烟气细腻，平滑，有润感和轻微的甜感，透发性好，喉部刺激性明显减轻，有酿香和发酵的酸香，舌面无明显残留。
Claims (6)
1.一种樟树叶烟用香料的制备方法，其特征在于：所述方法包括以下步骤：
(1)原料准备：
①选取樟树叶作为原料、灭菌得到无菌樟树叶备用；
②烟叶复合培养基的制备：将烟叶和水按1∶5的比例混合后加热至100℃，并保持1～2小时，过滤得到烟水，将烟水和微生物固体培养基按3∶7～10的比例混合，制成烟叶复合培养基；
(2)产香微生物的筛选：
①取烟叶5～10g，加入到无菌蒸馏水中，从中取100～1000μl的液体，滴加到由步骤(1)得到的烟叶复合培养基上，以平板划线分离或稀释涂平板法，在有氧或厌氧条件下培养，长出菌落后，将烟叶复合培养基放到体视镜下筛查，挑取10～50个酵母菌和/或芽孢杆菌的单菌落；
②将挑出的单菌落在烟叶复合培养基中分别进行小量扩增培养，将小量扩增培养得到的菌液与无菌樟树叶混合，进行小试量的固体堆积发酵，然后对发酵好的樟树叶进行提取，获得发酵型樟树叶提取物；
③将发酵型樟树叶提取物稀释后添加至香烟中，并通过卷烟加香评吸筛选所需的产香微生物，然后保存筛得的产香微生物的菌种；
(3)利用步骤(2)中得到的产香微生物与无菌樟树叶混合，进行固体堆积发酵；
(4)对步骤(3)得到的发酵好的樟树叶进行提取，得到樟树叶烟用香料。
2.根据权利要求1所述的樟树叶烟用香料的制备方法，其特征在于：步骤(1)中所述的烟叶为自然陈化一年至两年的烟叶。
3.根据权利要求1所述的樟树叶烟用香料的制备方法，其特征在于：步骤(1)中所述的烟叶为白肋烟叶。
4.根据权利要求1所述的樟树叶烟用香料的制备方法，其特征在于：步骤(2)中和步骤(3)中所述的固体堆积发酵为：将产香微生物按照1∶1～10的质量比接种到无菌樟树叶中，放置于28～35℃的培养箱中发酵2～7天，得到发酵好的樟树叶。
5.根据权利要求1所述的樟树叶烟用香料的制备方法，其特征在于：步骤(2)中和步骤(4)中对发酵好的樟树叶进行提取的方法为水蒸气蒸馏法。
6.根据权利要求7所述的樟树叶烟用香料的制备方法，其特征在于：所述水蒸气蒸馏法为：将上述发酵好的樟树叶，置于水蒸气蒸馏装置中，按发酵固体与纯净水质量比1∶10～15的比例加入的纯净水，加热至100℃，直至发酵固体与水的混合物开始沸腾，连续加热2～10h，收集发酵型樟树叶挥发油，利用95％的乙醇溶液按与挥发油质量比例100～1000∶1稀释挥发油，得到樟树叶烟用香料。
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