CN112522117A

CN112522117A - 一株粪壳菌及其应用

Info

Publication number: CN112522117A
Application number: CN202011594060.2A
Authority: CN
Inventors: 李东; 刘金艳
Original assignee: Chengdu Institute of Biology of CAS
Current assignee: Chengdu Institute of Biology of CAS
Priority date: 2020-12-29
Filing date: 2020-12-29
Publication date: 2021-03-19
Anticipated expiration: 2040-12-29
Also published as: CN112522117B

Abstract

本发明属于微生物领域，具体涉及一株粪壳菌及其应用。具体技术方案为：一株粪壳菌，于2020年12月01日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为：CGMCC No.21076。其ITS基因序列如SEQ ID No.1所示。本发明提供了一株新的粪壳菌，该粪壳菌具有独立降解木质素的能力，可广泛应用于各种含木质素的废弃物处理、木质素降解领域。

Description

一株粪壳菌及其应用

技术领域

本发明属于微生物领域，具体涉及一株粪壳菌及其应用。

背景技术

木质素是自然界含量仅次于纤维素和甲壳素的生物质，其存在形式多样且无规则。根据构成木质素前体的不同可将其分为三类：介子醇作为前体，由紫丁香基苯丙烷结构单体聚合而成的丁香基木质素(Syringyl lignin，S-木质素)、松柏醇作为前体，由愈创木基苯丙烷结构单体聚合而成的愈创木基木质素(Guajacyl lignin，G-木质素)、香豆醇作为前体由对羟基苯基苯丙烷结构单体聚合而成的对羟苯基对羟基苯基木质素(Hydroxyphenyl lignin，H-木质素)。

同时，不同植物中，木质素存在的结构单元组合也不一样。复杂的结构使得木质素在自然界中转化率极低。在木质组织中，木质素包围着半纤维素和纤维素，组成植物外层基质，形成一个紧密的网状结构。因此，木质素的低转化率也限制了对纤维素和半纤维素的利用。

现有技术中，几乎没有将木质素利用起来，往往是使用强酸、强碱等将其从植物中脱除，不仅要耗费大量化学试剂，还会污染环境，同时也直接浪费了大量木质素，且可能降低纤维素、半纤维素的品质。如果能利用微生物降解木质素，不仅可解决既往污染环境的问题，而且可以合理利用木质素资源。因此，开发新的木质素降解微生物资源，具有重要的现实意义。

发明内容

本发明的目的是提供一株新的粪壳菌MSDA1(Sordaria sp.)及其在降解木质素上的应用。

为实现上述发明目的，本发明所采用的技术方案是：一株粪壳菌，于2020年12月01日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为：CGMCC No.21076。

相应的，一株粪壳菌，其ITS基因序列如SEQ ID No.1所示。

相应的，所述粪壳菌在降解木质素中的应用。

优选的，所述应用的pH为3.0～9.0。

优选的，所述应用的温度为25℃～45℃。

优选的，所述应用中，需外加氮源。

优选的，所述外加氮源为氯化铵、酒石酸铵、尿素、蛋白胨、硝酸铵中的一种或几种混合。

优选的，所述应用中，需外加Mn²⁺。

优选的，所述Mn²⁺的浓度为0.8mmol/L。

本发明具有以下有益效果：本发明提供了一株新的粪壳菌，该粪壳菌具有独立降解木质素的能力，可广泛应用于各种含木质素的废弃物处理、木质素降解领域。

附图说明

图1为粪壳菌在不同培养基上生长情况示意图；

图2为粪壳菌菌落图；

图3为粪壳菌的电镜扫描图；

图4为粪壳菌降解碱木质素与时间关系示意图；

图5为粪壳菌降解碱木质素与初始pH关系示意图；

图6为粪壳菌降解碱木质素与氮源种类关系示意图；

图7为粪壳菌降解碱木质素与氮的添加比例关系示意图；

图8为粪壳菌降解碱木质素与初始碱木质素浓度关系示意图；

图9为粪壳菌降解碱木质素与转速关系示意图；

图10为粪壳菌降解碱木质素与锰离子浓度关系示意图；

图11为粪壳菌降解碱木质素与铜离子浓度关系示意图；

图12为粪壳菌在木屑中生长情况示意图。

具体实施方式

本发明提供了一株新的粪壳菌MSDA1(Sordaria sp.)，于2020年12月01日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮编：100101，保藏编号为：CGMCC No.21076。

本发明将该粪壳菌用于降解木质素，及含有木质素的各项物质。

下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。

实施例一：木质素降解菌的筛选与鉴定

1、培养基的配置

(1)碱木质素培养基：碱木质素1.0g，NH₄Cl 2.0g，K₂HPO₄ 1.0g，KH₂PO₄ 1.0g,MgSO₄·7H₂O 0.20g，CaCl₂ 0.1g，FeSO₄·7H₂O 0.05g，MnSO₄·7H₂O 0.02g，加入琼脂15.0g，补水至1000mL。121℃灭菌20min。对应的液体培养基不加琼脂即可。

(2)马铃薯培养基(PDA)：去皮马铃薯200g，切块煮沸，用纱布过滤，滤液中再加葡萄糖20.0g，KH₂PO₄ 3.0g，MgSO₄·7H₂O 1.5g，加入琼脂15.0g，补水至1000mL。115℃灭菌30min。对应的液体培养基不加琼脂即可。

2、菌种的分离与纯化

将堆肥厂玉米秸秆样品在无菌条件下接种到碱木质素固体培养基上，30℃培养7天。期间间隔24h进行观察，选择在相同条件下能更快长满碱木质素培养基的微生物并挑取菌丝，接种到新的碱木质素固体培养基上，反复接种纯化直至获得纯菌株。将所得各菌株接种到液体PDA培养基中，在30℃、150r下培养24h，将获得的种子液按10％(v/v)的比例接种到新的液体碱木质素培养基中，计算5天后培养基中碱木质素降解率，选出降解率最高的微生物，命名为MSDA1。

将MSDA1接种到新的PDA平板上，30℃下培养至微生物长满平板。用打孔器从长满微生物的平板上取菌块，将菌块分别倒置接种于PDA平板和碱木质素培养基平板上，定时测定菌落直径，绘制MSDA1在PDA平板和碱木质素平板上的生长曲线。结果如图1所示：MSDA1在PDA平板和碱木质素培养基平板上生长速度相当，且都能在48小时内长满平板。同法测定MSDA1在碱木质素培养基平板上的生长pH和温度。每12h观察1次，结果如表1所示。表1中，“-”表示不生长，“+”表示能在84h内长满平板，“++”表示能在72h内长满平板，“+++”表示能在60h内长满平板，“++++”表示能在48h内长满平板，“+++++”表示能在36h内长满平板。

表1 MSDA1生长性能对照表

结果显示：MSDA1在pH为3.0～9.0范围均能生长，最适生长pH为5.0，在25℃～45℃范围内能够生长，最适生长温度30℃。

将获得的菌种进行测序分析：采用真菌全基因组快速抽提试剂盒，提取纯菌株的全基因组，通过选用真菌ITS通用引物进行PCR扩增，然后测序分析，其ITS基因序列如SEQID No.1所示。测序结果经NCBI数据库中的BLAST比对，菌株MSDA1与粪壳菌属Sordaria sp.的同源性为98.96％，结合该菌菌落形态(如图2所示)和显微形态(如图3所示)，鉴定该菌株为粪壳菌属菌。

将所述粪壳菌属菌命名为：MSDA1(Sordaria sp.)，于2020年12月01日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮编：100101，保藏编号为：CGMCC No.21076。

实施例二：粪壳菌MSDA1降解碱木质素的条件优化

取PDA斜面活化24h的菌种，按2％接种量接种于100mL/250mL三角瓶中，30℃、150r培养24小时，制备成种子液，种子液中，活菌浓度≥10⁸CFU/mL。按照体积比10％的接种比例接种到50mL的液体碱木质素培养基中，采用单因素试验考察不同时间、不同氮源、不同转速、不同碱木质素浓度等对MSDA1降解碱木质素的影响。除考察因素外，培养条件为：pH＝6.5、30℃、150r/min摇床培养5天。具体如下：

1、不同时间对碱木质素降解率的影响。按照10％的接种比将种子液接种到50mL碱木质素培养基中，30℃、150r培养5天，使用分光光度法测定碱木质素浓度，计算碱木质素降解率。结果如图4所示，MSDA1第1天对碱木质素降解速度最快，降解率高达52.78％，而后速度变慢，第5天降解率为71.80％，第6天降解率为71.89％，较前一天仅提高0.09％。故此，后续实验选择测定第1天和第5天的木质素降解率，以判断考察因素对MSDA1降解碱木质素的影响。

2、初始pH对碱木质素降解的影响。将种子液接种到不同初始pH(3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0)的液体碱木质素培养基中(使用盐酸调节pH)，30℃、150r培养5天，测定第一天和第五天木质素浓度变化，结果如图5所示。pH对MSDA1降解碱木质素具有显著影响，初始pH为5.0时，其对碱木质素降解速度最快，降解率为76.31％。

3、不同氮源对木质素降解的影响。分别使用3.4g/L酒石酸铵、1.2g/L尿素、3.6g/L蛋白胨、1.5g/L硝酸铵作为外加氮源，替换所述碱木质素培养基中的氮源(氯化铵2g/L)。外加氮源的总量与碱木质素质量比为1.0％。分别测量各组碱木质素降解率，结果如图6所示。MSDA1降解碱木质素的最佳氮源为酒石酸铵，其次为蛋白胨。酒石酸铵对应的第1天和第5天碱木质素降解率分别为54.78％、75.82％，蛋白胨对应的第1天和第5天碱木质素降解率分别为52.14％、75.07％。

4、不同氮比例对木质素降解的影响。分别配制氯化铵含量为1g/L、2g/L、3g/L、4g/L的碱木质素培养基，外加氮源的氮总量与碱木质素质量比分别为0.5％、1.0％、1.5％、2.0％。分别测量各组碱木质素降解率，结果如图7所示。质量比为1％时，MSDA1降解碱木质素速度最快，第1天和第5天碱木质素降解率分别为47.56％、72.35％。

5、碱木质素浓度对木质素降解的影响。分别配制碱木质素浓含量为0.5g/L、1.0g/L、1.5g/L、2.0g/L、2.5g/L的碱木质素培养基。分别测量各组碱木质素降解率，结果如图8所示。过高浓度的碱木质素不利于MSDA1降解碱木质素，0.5g/L、1.0g/L浓度的碱木质素培养基第5天降解率分别为68.04％、67.59％，而1.5g/L、2.0g/L、2.5g/L浓度的碱木质素培养基第5天降解率分别为51.09％、49.80％、35.80％，呈降低趋势。

6、转速对木质素降解的影响。将接种了的碱木质素液体培养基分别置于100r、120r、150r、180r、200r恒温摇床培养。分别测量各组碱木质素降解率，结果如图9所示。一定范围内提高转速能够提高MSDA1降解碱木质素效率，180r培养5天后降解率为75.23％，较150r提高了6.02％。

7、Mn²⁺浓度对木质素降解的影响。调节MgSO₄·7H₂O的含量，分别配制Mn²⁺浓度为0mmol/L、0.4mmol/L、0.6mmol/L、0.8mmol/L、1.0mmol/L的碱木质素培养基，原培养基中Mn²⁺浓度为0.72mmol/L。分别测量各组碱木质素降解率，结果如图10所示。MSDA1降解碱木质素的最佳Mn²⁺浓度为0.8mmol/L，第五天降解率为74.93％，较原培养基提高了5.52％。

8、Cu²⁺浓度对木质素降解的影响。分别配制0mmol/L、0.05mmol/L、0.1mmol/L、0.25mmol/L、0.5mmol/L、1.0mmol/L Cu²⁺的碱木质素培养基(使用硫酸铜提供铜离子)，原培养基Cu²⁺浓度为0mmol/L。分别测量各组碱木质素降解率，结果如图11所示。Cu²⁺在培养初期对MSDA1降解碱木质素有明显抑制作用，培养5天后，添加Cu²⁺的各培养基种，碱木质素降解率均低于原培养基。

实施例三：粪壳菌MSDA1降解木屑中木质素的效果验证

将木屑105℃干燥后，过40目筛，将粪壳菌MSDA1的PDA种子液(活菌浓度≥10⁸CFU/mL)接种到木屑中，接种量为1mL/g，充分混匀后，培养温度为30℃，静置培养10天。以直接将MSDA1接种到木屑中作为组1；添加3.4g/kg酒石酸铵，其他条件与组1相同，作为组2。测定失重率、木质素和纤维素的降解率(范式法)及其选择性系数。选择性系数＝木质素降解率/纤维素降解率。结果如表2所示。MSDA1在木屑中生长10天后的生长情况如图12所示。

表2 MSDA1处理木屑的性能展示

组别	失重率(％)	木质素降解率(％)	纤维素降解率(％)	选择性系数
					组1	13.16	17.29	6.43	2.69
组2	35.76	48.35	16.24	2.98

根据粪壳菌MSDA1降解木质素的性能，还可应用到木质素含量高的废弃物(如园林废弃物)的处理(如堆肥)上。

以上所述的实施例仅是对本发明的优选方式进行描述，并非对本发明的范围进行限定，在不脱离本发明设计精神的前提下，本领域普通技术人员对本发明的技术方案做出的各种变形、变型、修改、替换，均应落入本发明权利要求书确定的保护范围内。

序列表

<110> 中国科学院成都生物研究所

<120> 一株粪壳菌及其应用

<160> 1

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 481

<212> DNA

<213> 粪壳菌属(Sordaria sp.)

<400> 1

tcctcaggcc ccggaccctc ggttcccccg ctcgcggggg gctgcccgcc ggaatgccga 60

aaccaaactc ttgatatttt atgtctctct gagtaaactt ttaaataagt caaaactttc 120

aacaacggat ctcttggttc tggcatcgat gaagaacgca gcgaaatgcg ataagtaatg 180

tgaattgcag aattcagtga atcatcgaat ctttgaacgc acattgcgct cgccagtatt 240

ctggcgagca tgcctgttcg agcgtcattt caaccatcaa gctctgcttg cgttggggat 300

ccgcggctgc ccgcggtccc tcaaaaacag tggcgggctc gctagtcaca ccgagcgtag 360

taactctaca tcgctatggt cgtgcggcgg gttcttgccg taaaaccccc aatttctaag 420

gttgacctcg gatcaggtag gaatacccgc tgaacttaag catatcaata aagcggagga 480

a 481

Claims

1.一株粪壳菌，其特征在于：于2020年12月01日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为：CGMCC No.21076。

2.一株粪壳菌，其特征在于：其ITS基因序列如SEQ ID No.1所示。

3.权利要求1或2所述粪壳菌在降解木质素中的应用。

4.根据权利要求2所述应用，其特征在于：所述应用的pH为3.0～9.0。

5.根据权利要求3所述应用，其特征在于：所述应用的温度为25℃～45℃。

6.根据权利要求3所述应用，其特征在于：所述应用中，需外加氮源。

7.根据权利要求6所述应用，其特征在于：所述外加氮源为氯化铵、酒石酸铵、尿素、蛋白胨、硝酸铵中的一种或几种混合。

8.根据权利要求3所述应用，其特征在于：所述应用中，需外加Mn²⁺。

9.根据权利要求8所述应用，其特征在于：所述Mn²⁺的浓度为0.8mmol/L。