CN110731223A - 一种盐胁迫下促进金丝柳生长的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种盐胁迫下促进金丝柳生长的方法，属于植物盐胁迫生长研究技术领域。本发明提供的盐胁迫下促进金丝柳生长方法，首先通过在液体培养基中培养耐盐根际促生菌JYZ‑SD2，得到促进植物耐盐生长的微生物菌剂，再将其浇灌金丝柳，可促进金丝柳在盐胁迫下生长。对金丝柳扦插苗进行含耐盐根际促生菌JYZ‑SD2的微生物菌剂处理，随后进行盐胁迫，试验结果表明，其苗高、地径以及叶绿素含量均要高于对照，最高分别可达10.7％、13.15％和37.99％，表明本发明所提供的方法具有非常显著的在盐胁迫下促进金丝柳生长的作用，在开发利用盐碱地植树造林等领域具有良好的应用前景。

Description

一种盐胁迫下促进金丝柳生长的方法
技术领域
本发明属于植物盐胁迫生长研究技术领域，更具体地，涉及一种盐胁迫下促进金丝柳生长的方法。
背景技术
土壤盐渍化影响着世界33％的潜在耕地面积，在干旱和半干旱地区则有9.5亿公顷受盐害影响的土地。盐分的增加会减少土壤有机质、造成土壤退化，使得植物出现生理干旱、甚至死亡。中国土地资源紧缺，海岸带较长，土壤盐渍化问题尤为突出。因此合理开发利用盐碱地植树造林对我国生态环境建设具有重要的意义。
植物根际促生细菌(plant growth promoting rhizobacteria，PGPR)具有提高植物对生物和非生物胁迫的抗性、促进植物生长、提高产量、改善土壤生态环境等特点。目前世界上许多国家通过筛选优良的菌株采用工业发酵制备微生物菌剂、肥料，应用于农林业生产。当前，人们致力于通过施用根际促生细菌来提高植物的耐盐性，促进盐渍土中植物的生长与存活，达到开发利用盐碱地的目的。金丝柳是一种较适于用作开发利用盐碱地植树造林的树种，耐水性和抗寒性强，较耐盐碱，生长快，易于繁殖。若利用植物根际促生细菌开发一种能促进金丝柳在盐胁迫下生长的方法，将有助于利用该树种开发利用盐碱地植树造林，改良盐碱地土壤环境，意义重大。
发明内容
针对现有技术存在的上述问题，本发明所要解决的技术问题在于提供一种盐胁迫下促进金丝柳生长的方法，可以促进金丝柳在盐胁迫下生长或应用于盐碱地植树造林中。
为了解决上述问题，本发明所采用的技术方案如下：
一种盐胁迫下促进金丝柳生长的方法，使用含耐盐根际促生菌JYZ-SD2的微生物菌剂浇灌金丝柳，所述耐盐根际促生菌JYZ-SD2是蜡样芽孢杆菌JYZ-SD2，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO：M2018468，保藏日期为2018年07月13日。
优选地，所述的盐胁迫下促进金丝柳生长的方法，使用含耐盐根际促生菌JYZ-SD2的微生物菌剂浇灌金丝柳，然后对金丝柳进行盐胁迫处理。
优选地，所述的盐胁迫下促进金丝柳生长的方法，使用含耐盐根际促生菌JYZ-SD2的微生物菌剂浇灌金丝柳，接菌生长45d后对金丝柳进行盐胁迫处理。
优选地，所述盐胁迫处理的具体方法为：每隔3天对金丝柳浇一次盐溶液，持续30d，每盆浇灌50mL，所述盐溶液的盐浓度为0～100mmol/L。
优选地，所述的含耐盐根际促生菌JYZ-SD2的微生物菌剂中含耐盐根际促生菌JYZ-SD2的量为1×1010CFU。
优选地，所述含耐盐根际促生菌JYZ-SD2的微生物菌剂的制备方法为：
1)将耐盐根际促生菌JYZ-SD2接种到平板培养基上活化，所述的平板培养基为LB固体培养基，成分包括蛋白胨、酵母粉、NaCl和琼脂，pH值为7.0；
2)将步骤1)中活化的耐盐根际促生菌JYZ-SD2接种到液体培养基中培养，得到的菌液，即为含耐盐根际促生菌JYZ-SD2的微生物菌剂，所述的液体培养基为LB液体培养基，成分包括蛋白胨、酵母粉和NaCl，pH值为7.0。
有益效果：相比于现有技术，本发明的优点为：
本发明提供的盐胁迫下促进金丝柳生长的方法简便，效果优异，采用的耐盐根际促生菌JYZ-SD2具有较高的耐盐性和促进金丝柳生长的特点。在促进金丝柳耐盐生长的应用中，各施菌处理柳树扦插苗苗高，地径以及叶绿素含量均要高于对照，非盐胁迫时，接种微生物菌剂的处理比对照高10.41％、11.42％、32.7％。当盐浓度为50mmol/L时，耐盐根际促生菌JYZ-SD2处理比对照高出8.5％、4.95％、37.99％，叶绿素含量明显提高。当盐浓度达到100mmol/L时，耐盐根际促生菌JYZ-SD2处理的叶绿素含量、苗高和地径比对照高出26.63％、10.7％、13.15％，表明盐胁迫下，耐盐根际促生菌JYZ-SD2对金丝柳有非常显著的促进植物生长的作用。
综上，本申请所提供的盐胁迫下促进金丝柳生长的方法对金丝柳有非常显著的促进其生长的作用，在促进金丝柳在盐胁迫下生长和开发利用盐碱地植树造林等领域有良好的应用前景。
附图说明
图1为菌株JYZ-SD2的16S rDNA的PCR产物电泳结果图；
图2为菌株JYZ-SD2基于16S rDNA的系统发育树图；
图3为菌株JYZ-SD2不同盐浓度下的生长曲线图；
图4为菌株JYZ-SD2不同盐浓度下的菌体干重图。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明进一步进行描述。
菌株来源：供试菌株JYZ-SD2是从山东临沂4年生杨树根际土壤中分离得到的一株根际促生菌，已保藏于中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，保藏编号为CCTCC NO：M2018468，保藏日期为2018年07月13日。
基础培养基：LB固体培养基(蛋白胨10g，酵母粉5g，NaCl 10g，琼脂15g，蒸馏水1000mL，pH值7.0)；LB液体培养基(蛋白胨10g，酵母粉5g，NaCl 10g，蒸馏水1000mL，pH值7.0)。
微生物菌剂制备：将在LB固体培养基上活化两次的供试菌株接入LB液体培养基中，在28℃、200r/min的条件下摇培48h。
数据处理：利用SPSS13.0、Prism 6.01和Excel 2016进行数据统计分析和制图。
实施例1：根际促生菌JYZ-SD2的菌种鉴定
1)根际促生菌JYZ-SD2的形态及生理生化特征
参照伯杰氏细菌鉴定手册分别进行菌落形态、革兰氏染色(Gram stain)、伴孢晶体染色(parasporal crystal)、淀粉水解检测(Starch)、明胶水解(Gelatin)、伏普(V-P)、酪素水解(Casein)、酪氨酸水解(Tyrosine)、卵磷脂酶(Lecithin)、葡萄糖发酵(Glucose)、D-木糖(D-xylose)、D-甘露糖检测(D-mannitol)、苯丙氨酸脱氢(Phenylalanine)、吲哚(Indole)等十四项形态及生理生化指标的测定。
菌株JYZ-SD2在NA固体培养基上培养48h，菌落形态呈圆形，稍微隆起，颜色为淡乳白色，表面无光泽不透明，表面较为粗糙，油蜡状，边缘不规则呈细波状。细胞为杆状，革兰氏染色为阳性，不产生伴孢晶体，大小为(1.0～1.1)μm×(2.6～5.0)μm，芽孢呈圆形，有鞭毛。其余生理生化指标的测定结果如表1所示。
表1菌株JYZ-SD2的生化特征
Figure BDA0002275609270000031
Figure BDA0002275609270000041
+表示阳性反应；-表示阴性反应
2)JYZ-SD2菌株的Biolog系统鉴定
通过Biolog鉴定板，测定菌株对不同碳源的利用情况。将在Biolog培养基上活化培养的待测菌株接种于Biolog鉴定板上，置于培养箱(28℃)，分别于16h、24h、36h、48h后读取相似性指数，以相似性指数最高的度数为测定结果。
根据生理生化及Biolog系统的结果，菌株JYZ-SD2被鉴定为Bacillus cereus/Bacillus thuringiensis，相似性指数SIM为0.674，在Biolog系统进行细菌鉴定时，当相似性指数≥0.5时则鉴定结果可用。由于菌株JYZ-SD2不产伴孢晶体，因此鉴定其为蜡样芽孢杆菌Bacillus cereus。
3)菌株JYZ-SD2 DNA的制备及16S rDNA、cry1/7/9序列测定
根据试剂盒的说明书，使用NANOEAST细菌基因组DNA提取试剂盒(China)提取培养24h的菌株JYZ-SD2的DNA，提取步骤按说明书操作。以提取的细菌DNA为模板，用细菌16SrDNA的一对通用引物(正向引物27F：5’-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’；反向引物1492R：3’-ACGGCTACCTTGTTACGACT-5’)对细菌基因组进行扩增，电泳检测扩增片段，结果如图1所示，在1500bp左右有一条明显的DNA条带。
将扩增后的PCR产物连接含有Amp抗性的pClone007 Simple Vector，转化进入感受态大肠杆菌TreliefTM5α，均匀涂布至含有Amp的培养基上，于37℃静置过夜。挑取长出的转化子送测序，测序表明菌株JYZ-SD2的16S rDNA共有1602bp。将菌株JYZ-SD2的16S rDNA序列与NCBI中的序列进行比对，选取同源性高大于95％的序列，运用MEGA7.0中的Clustal软件进行多重序列同源性分析，并利用MEGA7.0构建系统发育树，结果如图2所示。
利用以上所述方法制备菌株JYZ-SD2基因组DNA，按照Kuo所述的引物cry1/7/9(正向引物：AGGACCAGGATTTACAGGAGG；反向引物：GCTGTGACACCAAGGATATAGCCAC)扩增cry1/7/9基因。将获得的PCR产物于1％琼脂糖凝胶中电泳，经琼脂糖凝胶电泳后未出现DNA条带。
在本实施例中，经形态观察发现该菌株JYZ-SD2符合蜡样芽孢杆菌的描述，通过生理生化特性测定可知该菌不产生伴孢晶体；进一步由系统发育树可知，菌株JYZ-SD2为蜡样芽孢杆菌Bacillus cereus；最后通过PCR扩增cryl、7、9所得的产物，经琼脂糖凝胶电泳后未出现DNA条带，表明菌株JYZ-SD2不属于苏云金芽孢杆菌，确定为蜡样芽孢杆菌Bacilluscereus。
实施例2：根际促生菌JYZ-SD2的耐盐特性测定
分别配制LB液体、固体培养基，培养基的NaCl梯度设为0、1％(0.17mol/L)、3％(0.51mol/L)、6％(1.02mol/L)，即50mL LB培养基中加入0g、0.5g、1.5g、3.0g的NaCl。将菌株接种于不同盐浓度平板中，24-48h后观察平板中菌株的生长情况。将活化后的菌液吸取50μL接种于装有4950μL的不同盐浓度的试管中，振荡摇匀后各吸取200μL加入96孔板中，放入生长曲线自动分析仪(Bioscreen C，FP-110-C，Finland)中测定生长曲线，28℃培养，每两小时自动测一次，连续测至48h。得到结果后，以时间为横坐标、OD值为纵坐标绘制JYZ-SD2的生长曲线。将活化后的菌株以2％的接种量接入不同盐浓度培养基中分别培养，于24h、48h、72h后收集菌体，离心烘干至恒重秤取干重。
生长曲线如图3所示，JYZ-SD2菌株在盐含量为1％时迟缓期最短，进入对数生长期最快；当盐含量为6％时，其迟缓期较长，达到14h。进入对数生长期后，在盐浓度为3％时，JYZ-SD2菌株的生长速度最快；在盐浓度为6％时，JYZ-SD2菌株的生长速度最慢。进入稳定期后，盐浓度为3％时，JYZ-SD2菌株的OD最大可达到1.0以上，且盐浓度为1％和3％时，JYZ-SD2菌株处于生长稳定期的时间较长，而盐浓度为0时，JYZ-SD2菌株稳定期较短且很快进入衰亡期。盐浓度为6％的处理进入稳定期后，OD值最小，其最高时仅为0.666。
如图4所示，从生物量来看，JYZ-SD2菌株在盐浓度为1％时，其菌体干重随着时间的延伸(24h、48h、72h)逐渐下降；在盐浓度为3％时JYZ-SD2菌株的干重在各时段都是最大的，且随时间的延长缓慢降低。当盐浓度为6％时，JYZ-SD2菌株的干重随着时间的延长呈先升高再降低的趋势变化不明显，且在72h时干重略高于其在盐浓度为0和1％时。
根际促生菌JYZ-SD2菌株，在NaCl含量为0-6％的平板以及摇培中均能正常生长。其中在NaCl为6％时，生长缓慢且菌落较小(表2)，说明JYZ-SD2菌株属于中度嗜盐菌。
表2菌株JYZ-SD2的耐盐情况
Figure BDA0002275609270000061
实施例3：利用耐盐根际促生菌JYZ-SD2促进金丝柳盐胁迫下生长的方法
供试柳树扦插条培育：将一年生金丝柳(Salix alba var.tristis)茎条剪成长15cm，直径1cm左右的扦插条，清水浸泡24h后进行扦插，扦插用土来自南京林业大学北大山，每盆扦插3根扦插条。
苗木接种及盐胁迫处理：细菌接种量为每盆1×1010CFU(液体菌剂)。对照CK不接种任何菌剂。共设有2个处理，单接JYZ-SD2，及对照CK。接菌生长45d后进行盐胁迫处理，设0mmol/L、50mmol/L、100mmol/L NaCl三个盐浓度，每隔3天浇一次盐溶液，持续30d，每盆浇灌50mL，并将从底部流到托盘里的溶液再倒回花盆中，对照CK浇灌相同体积的自来水。
柳树生物量的测定：施菌45d后进行盐胁迫处理，每隔3d浇一次盐水，持续30d，之后对柳树株高和地径分别用直尺(cm)和游标卡尺(mm)测定。叶片叶绿素含量用手持叶绿色仪(N-tester，Germany)测定。结果如表3所示。
表3盐胁迫下不同处理对柳树生长的影响(盐胁迫30d)
Figure BDA0002275609270000062
Figure BDA0002275609270000071
注：同列中含不同字母表示差异显著(p＜0.05)
由表3可知，各施菌处理金丝柳树扦插苗苗高，地径以及叶绿素含量均要高于对照，其中非盐胁迫时，施菌处理的金丝柳叶绿素含量、苗高和地径比对照高32.7％、10.41％、11.42％。当盐浓度为50mmol/L时，施菌处理的金丝柳叶绿素含量、苗高和地径比对照高出37.99％、8.5％、4.95％，叶绿素含量明显提高。当盐浓度达到100mmol/L时，施菌处理的金丝柳叶绿素含量、苗高和地径比对照高出26.63％、10.7％、13.15％，表明盐胁迫下，所用的微生物菌剂对金丝柳有非常显著的促进植物生长的作用。

Claims (6)

1.一种盐胁迫下促进金丝柳生长的方法，其特征在于，使用含耐盐根际促生菌JYZ-SD2的微生物菌剂浇灌金丝柳，所述耐盐根际促生菌JYZ-SD2是蜡样芽孢杆菌JYZ-SD2，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO：M2018468，保藏日期为2018年07月13日。
2.根据权利要求1所述的盐胁迫下促进金丝柳生长的方法，其特征在于，使用含耐盐根际促生菌JYZ-SD2的微生物菌剂浇灌金丝柳，然后对金丝柳进行盐胁迫处理。
3.根据权利要求2所述的盐胁迫下促进金丝柳生长的方法，其特征在于，使用含耐盐根际促生菌JYZ-SD2的微生物菌剂浇灌金丝柳，接菌生长45d后对金丝柳进行盐胁迫处理。
4.根据权利要求2或3所述的盐胁迫下促进金丝柳生长的方法，其特征在于，所述盐胁迫处理的具体方法为：每隔3天对金丝柳浇一次盐溶液，持续30d，每盆浇灌50mL，所述盐溶液的盐浓度为0～100mmol/L。
5.根据权利要求1～3任一所述的盐胁迫下促进金丝柳生长的方法，其特征在于，所述的含耐盐根际促生菌JYZ-SD2的微生物菌剂中含耐盐根际促生菌JYZ-SD2的量为1×1010CFU。
6.根据权利要求1～3任一所述的盐胁迫下促进金丝柳生长的方法，其特征在于，所述含耐盐根际促生菌JYZ-SD2的微生物菌剂的制备方法为：
1)将耐盐根际促生菌JYZ-SD2接种到平板培养基上活化，所述的平板培养基为LB固体培养基，成分包括蛋白胨、酵母粉、NaCl和琼脂，pH值为7.0；
2)将步骤1)中活化的耐盐根际促生菌JYZ-SD2接种到液体培养基中培养，得到的菌液，即为含耐盐根际促生菌JYZ-SD2的微生物菌剂，所述的液体培养基为LB液体培养基，成分包括蛋白胨、酵母粉和NaCl，pH值为7.0。
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