CN105154366A - 一株可降解苯酚且具有产电特性的蜡样芽孢杆菌及其应用 - Google Patents

Abstract

一株可降解苯酚且具有产电特性的蜡样芽孢杆菌及其应用，涉及一株蜡样芽孢杆菌及其应用。本发明提供一株蜡样芽孢杆菌，可降解苯酚，且具有产电特性，为利用微生物处理苯酚奠定了基础。本发明可降解苯酚的蜡样芽孢杆菌为蜡样芽孢杆菌WL027，保藏在中国典型培养物保藏中心，保藏日期为2015年7月10日，保藏编号为CCTCC？No：M？2015439。本发明蜡样芽孢杆菌WL027能够降解苯酚，且具有产电特性，对青霉素、氯霉素和四环素有良好的耐受性，具有耐盐性，可利用苯胺为底物。该蜡样芽孢杆菌可应用于微生物燃料电池。

Description

一株可降解苯酚且具有产电特性的蜡样芽孢杆菌及其应用

技术领域

本发明涉及一株蜡样芽孢杆菌及其应用。

背景技术

苯酚是芳香化合物的一种，是染料、造纸、农药、医药等行业的生产原料和中间体。随着我国工业迅速发展，对苯酚需求量越来越大，同时含酚废水的排放量也在不断增加，对环境的污染日趋严重，被我国列为“水中优先控制污染物黑名单”。苯酚属于原生质物质，对于一切生物个体具有毒害作用，且具有“三致效应”。未经处理的苯酚废水，不但会污染环境，还会使蛋白质凝结，从而危害人类健康。

目前，含酚废水的处理方法有物理处理方法(吸附法、溶剂萃取法和液膜法)、化学处理法(氧化法、沉淀法和光催化法)和生物处理法(活性污泥法、酶处理法和固定化微生物技术)。物理处理法和化学处理法虽然苯酚的回收率可达90％以上，但是处理后排出的物质依旧会对环境产生污染。采用微生物处理法不但不会产生二次污染，还具有节约成本和创造经济效益的特点。因此，利用微生物处理苯酚具有重要意义。

发明内容

本发明提供一株蜡样芽孢杆菌(Bacilluscereus)，可降解苯酚，且具有产电特性，为利用微生物处理苯酚奠定了基础。

本发明可降解苯酚的蜡样芽孢杆菌为蜡样芽孢杆菌(Bacilluscereus)WL027，保藏在中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，保藏地址是武汉市武汉大学，保藏日期为2015年7月10日，保藏编号为CCTCCNo：M2015439。

本发明蜡样芽孢杆菌WL027为革兰氏染色阳性，杆状，菌体大小为(1.0μm～1.2μm)×(3.0μm～5.0μm)，产芽孢，有鞭毛，可运动。在MYP培养基上可生长，菌落直径达8～10mm，质地软，挑起呈丝状，培养48h菌落表面呈毛玻璃状，并产生红色色素。

本发明蜡样芽孢杆菌WL027的接触酶试验呈阳性，氧化酶试验呈阳性，淀粉水解试验呈阳性。蜡样芽孢杆菌WL027的生长实验结果如表1所示：

表1

本发明蜡样芽孢杆菌WL027可以氯化铵、碳酸铵、硝酸铵和硝酸钠为氮源，其中最佳氮源为硝酸铵，可以乙酸钠、蔗糖、乳糖、葡萄糖和果糖为碳源，其中最佳碳源为蔗糖。

本发明蜡样芽孢杆菌WL027可在肉汤培养基和无机盐培养基中生长，最适生长pH为6，最适生长温度为30℃，最适装液量为150mL/250mL，最适的接种量为2％。

本发明蜡样芽孢杆菌WL027通过16SrDNA序列比对分析，与芽孢杆菌属(Bacillus)内各种之间有极高的同源性，同源性为95％以上。通过结合菌体形态特征、生长条件、生理生化鉴定结果确定蜡样芽孢杆菌WL027属于芽孢杆菌科(Bacillaceae)芽孢杆菌属(Bacillus)蜡样芽孢杆菌(Bacilluscereus)。

本发明蜡样芽孢杆菌WL027能够降解苯酚，且具有产电特性，可应用于微生物燃料电池。对青霉素、氯霉素和四环素有良好的耐受性，具有耐盐性，可利用苯胺为底物。既可耐受一定浓度的重金属离子，且可在相应重金属以较高浓度存在时保持较高的苯酚降解能力。

本发明蜡样芽孢杆菌(Bacilluscereus)WL027，属于芽孢杆菌属(Bacillus)，保藏在中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，保藏地址是武汉市武汉大学，保藏日期为2015年7月10日，保藏编号为CCTCCNo：M2015439。

附图说明

图1为本发明蜡样芽孢杆菌WL027与GenBank中收录的相近菌株的16SrDNA序列进行同源性比对所构建的系统发育树；图2为本发明蜡样芽孢杆菌WL027的生长曲线；图3为本发明蜡样芽孢杆菌WL027的苯酚降解曲线；图4为本发明蜡样芽孢杆菌WL027的循环伏安曲线；图5为不同盐度条件对菌体生长的影响曲线；图6为不同盐度条件对苯酚降解情况的影响曲线；图7为四种重金属离子Cr²⁺、Co²⁺、Pb²⁺和Cu²⁺对蜡样芽孢杆菌WL027的生长影响曲线；图8为四种重金属离子Cr²⁺、Co²⁺、Pb²⁺和Cu²⁺对蜡样芽孢杆菌WL027的苯酚降解率影响曲线。

具体实施方式

本发明技术方案不局限于以下所列举具体实施方式，还包括各具体实施方式间的任意组合。

具体实施方式一：本实施方式可降解苯酚的蜡样芽孢杆菌为蜡样芽孢杆菌(Bacilluscereus)WL027，保藏在中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，保藏地址是武汉市武汉大学，保藏日期为2015年7月10日，保藏编号为CCTCCNo：M2015439。

本实施方式蜡样芽孢杆菌WL027为革兰氏染色阳性，杆状，菌体大小为(1.0μm～1.2μm)×(3.0μm～5.0μm)，产芽孢，有鞭毛，可运动。在MYP培养基上可生长，菌落直径达8～10mm，质地软，挑起呈丝状，培养48h菌落表面呈毛玻璃状，并产生红色色素。

本实施方式蜡样芽孢杆菌WL027的接触酶试验呈阳性，氧化酶试验呈阳性，淀粉水解试验呈阳性。

本实施方式蜡样芽孢杆菌WL027可以氯化铵、碳酸铵、硝酸铵和硝酸钠为氮源，其中最佳氮源为硝酸铵，可以乙酸钠、蔗糖、乳糖、葡萄糖和果糖为碳源，其中最佳碳源为蔗糖。

本实施方式蜡样芽孢杆菌WL027可在肉汤培养基和无机盐培养基中生长，最适生长pH为6，最适生长温度为30℃，最适装液量为150mL/250mL，最适的接种量为2％。

肉汤培养基配方：由3g/L牛肉膏、10g/L蛋白胨、5g/LNaCl和蒸馏水组成。

无机盐培养基配方：由3g/LKH₂PO₄、6g/LNa₂HPO₄、0.5g/LNaCl、0.2g/L酵母膏、1g/LNH₄Cl、0.011g/LCaCl₂、0.025g/LFeSO₄、0.24g/LMgSO₄、2.75g/LNa₂HPO₄、4.22g/LNaH₂PO₄、200mg/LKMnO₄和蒸馏水组成。

本实施方式蜡样芽孢杆菌WL027是由微生物燃料电池中分离得到的，分离方法按以下步骤进行：

微生物燃料电池(MFC)采用盐桥连接阴阳两极，是双室微生物燃料电池。电池阳极和阴极的有效容积均是550mL，阳极反应器上端中部设有取样口，两端分别设有进水口和出水口。阳极由经氯化铁改性的碳毡(5cm×5cm，有效面积12.56cm²)，阴极的电极采用的是碳刷，导线用铜丝链接，露出的部分用环氧树脂黏住。阴极室和阳极室之间用盐桥连接，接口处均做绝缘处理。电路中设有外接变阻箱(0～9999Ω)，外电路电阻采用1000Ω。实验过程中所产生的电压通过双通道电压采集系统(PISO813)直接记录，电压采集系统通过导线与台式电脑相连，每60s测定一次数据。电池启动前，阳极室通入20minN₂，保证阳极室的厌氧环境。阳极室接种菌源为文昌污水处理厂厌氧段和好氧段污水1：1混合接入到阳极室，同时加入1000mg/L的葡萄糖和500mg/L苯酚。阴极室加入的是含有KMnO₄的阴极缓冲溶液。将整个电池阳极装置放在温度为30℃恒温磁力搅拌器上运行，搅拌以便维持阳极溶液的均匀。待外界电压升高到稳定后，再经过10天的电池运行，测得电压为0.15V。将阳极室中的碳毡取出，放入到无菌生理盐水中，振荡，使粘在上面的菌体进入到生理盐水中。然后采用肉汤培养基于30℃，160r/min对菌种进行富集培养24h。将富集后的菌液用稀释涂布法涂布于苯酚浓度为500mg/L的平板上，30℃的恒温培养箱培养48h后挑取较大的菌落进行逐步划线分离纯化。最后将获得的纯菌接种肉汤斜面培养基上，30℃培养48h后，保存于4℃的冰箱里，即为本实施方式的蜡样芽孢杆菌WL027。

对分离筛选得到的蜡样芽孢杆菌WL027进行分子鉴定，蜡样芽孢杆菌WL027的16SrDNA序列长度为1384bp，其序列如SEQIDNO：1所示，测序结果与GenBank中的16SrDNA序列进行同源性比对，构建的系统发育树如图1所示，以确定菌株的种属关系。同源性分析结果表明，该序列与芽孢杆菌属(Bacillus)内各种之间有极高的同源性，同源性为95％以上。通过结合菌体形态特征、生长条件、生理生化鉴定结果确定蜡样芽孢杆菌WL027属于芽孢杆菌科(Bacillaceae)芽孢杆菌属(Bacillus)蜡样芽孢杆菌(Bacilluscereus)。

为验证本发明蜡样芽孢杆菌WL027的功能，进行以下试验：

(一)细菌生长

将蜡样芽孢杆菌WL027接种于肉汤培养基，在30℃，160r/min的摇床上培养48h。取3mL的培养液于离心管中，离心(8000r/min)。菌体采用无菌水洗涤离心三次后，将菌体悬浮于无菌的50mL生理盐水中，然后以10％的接种量接种到无机盐培养基中，在30℃，160r/min的摇床上培养，每隔2h取培养液测定600nm处的吸光值，共培养48h。吸光值即菌体的生长量。以时间为X轴，吸光度为Y轴，作出一条曲线，即该菌体的生长曲线(如图2)。

(二)苯酚浓度测定及降解率计算

培养液于12000r/min离心15min，上清液的苯酚浓度使用4-氨基安替比林直接光度法测定(国家环保局《水和废水监测分析方法》编委会，《水和废水分析监测分析方法》[M].北京：中国环境科学出版社，1997，408-410)。

(三)苯酚降解实验

将用肉汤培养基扩大培养的蜡样芽孢杆菌WL027分装到离心管中，在8000r/min条件下离心15min，弃去上清液，然后向离心管中加入灭过菌生理盐水，搅匀离心管底部沉淀的菌体，再次离心，如此洗涤菌体三次，以去除菌体表面吸附的培养基。将得到的菌体用无机盐培养基配成菌悬液。以10％(V/V)的接菌量接到pH7.5、苯酚浓度为500mg/L的无机盐培养基中，于160r/min，30℃恒温摇床振荡培养，于不同时间取样测定培养基上清液中的苯酚浓度。苯酚降解率曲线如图3所示。在5h、9h、31h和39h时，蜡样芽孢杆菌WL027的苯酚降解率分别为1.17％、15.88％、86.44％和72.38％。研究结果表明，31h时，苯酚最佳的降解率可达86.44％。

(四)产电活性研究

将蜡样芽孢杆菌WL027接种在无机盐培养基中，于30℃，160r/min的摇床中培养31h形成菌悬液。取每个菌株的菌悬液10mL于三极系统中，以ITO电极为工作电极，铂电极为辅助电极，Ag/AgCl为参比电极，扫描速率为100mV/s，扫描范围为-0.8～0.8V进行扫描并绘制伏安图，根据绘制出的伏安图来判断分离出的菌株是否具有电化学活性。循环伏安曲线如图4所示。图4中虚线表示空白对照(即未接菌的无机盐培养基的循环伏安曲线)，实线表示含有菌株WL027的无机盐培养基的循环伏安曲线。蜡样芽孢杆菌WL027的循环伏安曲线有明显的氧化峰和还原峰。氧化峰位于-0.8mV到-0.4mV，还原峰在0.5mV到-0.76mV附近。说明该菌株具有产电活性。

(五)抗生素耐受性

将蜡样芽孢杆菌WL027分别接种到含有青霉素、氯霉素、庆大霉素、红霉素、四环素、链霉素和卡那霉素的无机盐固体培养基上，30℃培养5-7天，观察菌株的生长情况。结果表明，蜡样芽孢杆菌WL027对青霉素、氯霉素和四环素有良好的耐受性。

(六)耐盐性

将蜡样芽孢杆菌WL027分别接种于NaCI浓度为5g/L、10g/L、15g/L、20g/L和25g/L的无机盐培养基中，于30℃，160r/min的摇床中培养48h后测培养基中菌株的生长量和苯酚浓度。考察不同盐度条件对菌体生长和苯酚降解情况的影响，探讨蜡样芽孢杆菌WL027是否对NaCl有耐受性。

在实际污水中都含有一定程度的盐分，高浓度的盐分会抑制微生物生长。图5为不同盐度条件对菌体生长的影响曲线，图6为不同盐度条件对苯酚降解情况的影响曲线；如图5和图6所示，在NaCl为低浓度20g/L时，细胞多处于游离状态，培养基中盐含量过高时就有可能破坏细胞的运输系统或造成某些酶类的失活，影响它们对营养物质的吸收利用和降解，表现为苯酚降解率的下降。当浓度达到20-30g/L时细胞多处于固定化状态，细胞固定化后，由于有了载体的保护，固定化细胞周围的NaCl浓度要远低于培养基中NaCl的浓度，因而对细胞的运输系统和酶的伤害较小，苯酚降解率升高。当浓度达到50g/L时，蜡样芽孢杆菌WL027直接死亡。由此可以看出，蜡样芽孢杆菌WL027可以耐受高盐(30g/L)并在此盐度条件下保持较高的苯酚降解效率，降解率可达63.46％。

(七)不同底物利用

将菌接种到含有苯胺、邻甲苯胺、对氨基苯、苯甲酸、水杨酸、萘、间甲苯胺和3,5-二硝基水杨酸的无机盐固体培养基上，于30℃恒温培养5-7天，观察生长情况。

结果发现，只有含有苯胺的无机盐固体培养基中可长出菌落，可能是由于苯胺与苯酚在结构上有一定的相似性，都是一个苯环结构连接一个小分子基团。

(八)重金属盐

将蜡样芽孢杆菌WL027分别接种于苯酚浓度为500mg/L，且含有不同浓度梯度的不同重金属离子的无机盐培养基中。重金属离子分别为Cr²⁺、Co²⁺、Pb²⁺和Cu²⁺，每种金属离子的不同浓度分别为0.01、0.05、0.1、0.2和0.3mg/L。于160r/min，30℃恒温摇床中进行培养，48h后测菌株的生长量和苯酚浓度，研究不同浓度的各重金属存在时对菌株生长和苯酚降解率的影响。

图7为四种重金属离子Cr²⁺、Co²⁺、Pb²⁺和Cu²⁺对蜡样芽孢杆菌WL027的生长影响曲线，图8为四种重金属离子Cr²⁺、Co²⁺、Pb²⁺和Cu²⁺对蜡样芽孢杆菌WL027的苯酚降解率影响曲线，图中表示Cr²⁺，表示Co²⁺，表示Pb²⁺，表示Cu²⁺。由图7和图8可以看出，蜡样芽孢杆菌WL027可以耐受一定浓度的重金属离子，并且保持较高的苯酚降解效率。而且该菌株对不同重金属离子的耐受程度不一致。重金属离子浓度较低时(0.01mg/L)，对该菌株的生长基本没有太大影响，可保持较高的生长量，其中对于Pb²⁺的耐受能力最强，而对Cr²⁺的耐受能力相对弱些，在含Pb²⁺0.01mg/L的培养基中培养48h，菌株生长于的生长量可达1.587。当各重金属离子浓度不断增加，会相应抑制菌株的生长，当离子浓度达到较高浓度(0.2mg/L)时，菌株仍可表现较好的生长量，在各重金属离子Cr²⁺、Co²⁺、Pb²⁺和Cu²⁺存在的培养基中生长量分别可达0.728、1.351、1.049和1.189。

而不同浓度重金属离子对菌株降解苯酚的影响却表现为，当培养基中含较高浓度(0.2mg/L)金属离子Cr²⁺、Co²⁺、Pb²⁺和Cu²⁺时，菌株对苯酚的降解效率达到了最高的水平，分别为92.4％、62.2％、64.1％和98.7％。其中Cu²⁺的存在，对苯酚的降解最为有利。而当金属离子浓度达到0.3mg/L时，菌株对苯酚的降解效率虽略有下降，但仍维持较高水平，分别可达85.8％、80.6％、70.6％和78.8％。

由此，可以看出该蜡样芽孢杆菌WL027既可耐受一定浓度的重金属离子，且可在相应重金属以较高浓度存在时保持较高的苯酚降解能力。

Claims (2)

1.一株可降解苯酚且具有产电特性的蜡样芽孢杆菌，其特征在于该菌株为蜡样芽孢杆菌(Bacilluscereus)WL027，保藏在中国典型培养物保藏中心，保藏地址是武汉市武汉大学，保藏日期为2015年7月10日，保藏编号为CCTCCNo：M2015439。

2.权利要求1所述的蜡样芽孢杆菌在微生物燃料电池中的应用。