CN112831440B - 一株耐盐碱解磷海洋菌3-1a、微生物有机肥及制备方法与应用 - Google Patents

一株耐盐碱解磷海洋菌3-1a、微生物有机肥及制备方法与应用 Download PDF

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Abstract

本发明涉及微生物有机肥领域，具体涉及一株耐盐碱解磷海洋菌3‑1a、微生物有机肥及制备方法与应用。本发明从深海热液口沉积物中分离出一种耐盐碱解磷海洋菌3‑1a，所述耐盐碱解磷海洋菌3‑1a能在较宽的盐度、pH和温度范围内生长并保有较高的解磷活性，将该菌株作为活性材料制备得到的微生物有机肥可有效改善土壤板结问题，降低土壤pH，提高土壤有效磷含量，提升土壤肥力，促进植物根际土壤磷素转化和对磷的吸收，提高植物生物量，减少化学磷肥的使用量，降低环境污染；此外该菌株还具有还原Cr(VI)的功能，可在高盐度条件下还原0～150mg/L的Cr(VI)，能广泛应用于含铬土壤和水体的治理。

Description

一株耐盐碱解磷海洋菌3-1a、微生物有机肥及制备方法与 应用
技术领域
本发明涉及微生物有机肥领域，具体涉及一株耐盐碱解磷海洋菌3-1a、微生物有机肥及制备方法与应用。
背景技术
公开该背景技术部分的信息仅仅旨在增加对本发明的总体背景的理解，而不必然被视为承认或以任何形式暗示该信息构成已经成为本领域一般技术人员所公知的现有技术。
磷是植物生长所必需的矿质元素，主要参与植物生长过程中核酸，磷脂和ATP的合成，并通过光合作用，生物氧化、营养物质吸收和细胞分解代谢等途径促进作物生长，决定农作物的产量和品质。土壤中可以被植物吸收利用的磷元素形态称为有效磷，然而，盐渍土中富含钙质，土壤磷素多被钙固定，导致有效磷含量很低，不能满足农作物的生长需要。为解决土壤有效磷缺乏的问题，农业上主要用追加磷肥的方式，但目前我国磷肥利用率仅为10％～25％，磷进入盐渍土壤后易被土壤中的Ca2+固定，形成难溶性磷酸盐而沉积，造成土壤不缺磷但缺乏磷素有效性的状况。且磷是一种不可再生资源，为减少磷肥的施用量，提高土壤磷素的利用率，增加土壤中植物可利用的有效磷含量已成为国内外学者普遍关注的问题。
自然界中具有解磷功能的微生物可以将土壤中被固定的磷素转化为易被植物吸收利用的有效磷，从而促进植物生长。向土壤中施加解磷菌是提高土壤磷素有效性的有效方法。我国的滨海盐渍土面积广阔，农业利用程度低，是重要的后备土地资源，有很大的开发潜力。但处于海陆交界处的滨海盐渍土具有“盐、碱、板、瘦“的特点，土壤盐渍化程度高，板结现象严重，速效养分含量低。长期频繁的水盐运动导致土壤肥力下降，土壤微生物活性降低，常规的解磷菌很难在这种高盐碱环境中存活和发挥作用。
农作物秸秆等废弃物可用作功能微生物的载体来制备固体微生物有机肥，为微生物的定殖提供良好的生境和养分。我国粮食作物产量高，由此也产生了大量的秸秆、玉米芯、稻壳等农业废弃物，此外，我国食用菌种植产业发达，尤其是山东地区，每年都会产生大量食用菌菌渣，这些工农业废弃物结构疏松多孔，有良好的吸水保水性，且含有丰富的有机营养，是良好的解磷菌生长基质，若将工农业废弃物作为载体制备成微生物有机肥，可以减少环境污染并实现生物质的资源化利用。
因此，选育一株在滨海盐渍土这种极端盐碱且贫营养的环境中能存活和发挥作用的耐盐碱解磷菌，并添加工农业废弃物为载体制备成生物有机肥施加到盐渍土中，对改善盐渍土壤质量，提高土壤肥力，推动农业可持续发展具有重要意义。
发明内容
为了解决现有技术的不足，本发明提供一株耐盐碱解磷海洋菌3-1a、微生物有机肥及制备方法与应用。本发明从深海热液口沉积物中分离出一种耐盐碱解磷海洋菌3-1a，所述耐盐碱解磷海洋菌3-1a能在较宽的盐度、pH和温度范围内生长并保有较高的解磷活性，将该菌株作为活性材料制备得到的微生物有机肥可有效改善土壤板结问题，降低土壤pH，提高土壤有效磷含量，提升土壤肥力，促进植物根际土壤磷素转化和对磷的吸收，提高植物生物量，减少化学磷肥的使用量，降低环境污染；此外该菌株还具有还原Cr(VI)的功能，可在高盐度条件下还原0～150mg/L的Cr(VI)，能广泛应用于含铬土壤和水体的治理。
为实现上述目的，本发明涉及以下技术方案：
本发明第一方面提供一株耐盐碱解磷海洋菌3-1a，分类命名为拟蕈状芽孢杆菌(Bacillus paramycoides)，分离自深海热液口沉积物，于2021年1月20日保藏于武汉市武昌区珞珈山的中国典型培养物保藏中心，其菌种保藏编号为：CCTCC M 2021116。
菌体及菌落特征为：菌株为革兰氏阳性细菌，扫描电子显微镜观察细菌为短杆状，菌体大小约为3μm，在LB固体培养基上的菌落呈乳白色，湿润，较光滑平坦。
本发明第二方面提供一种微生物有机肥，该微生物有机肥包括上述耐盐碱解磷海洋菌3-1a和菌株载体，所述菌株载体包括食用菌菌渣和玉米芯粉。
本发明第三方面提供一种上述微生物有机肥的制备方法，具体包括：菌株载体的预处理、耐盐碱解磷海洋菌3-1a的培养与接种以及微生物有机肥的半固态发酵。
本发明第四方面提供上述耐盐碱解磷海洋菌3-1a和/或微生物有机肥在如下任意一种或多种领域中的应用：
(1)盐渍土壤复垦；
(2)高盐碱地农作物养殖；
(3)含重金属铬的污染场地治理；
(4)铬渣堆场、废弃矿山的修复；
(5)水体污染修复。
本发明的一个或多个实施方式至少具有以下有益效果：
(1)本发明提供的耐盐碱解磷海洋菌3-1a能在较宽的盐度范围内有良好的解磷效果，将其与食用菌菌渣和玉米芯混合发酵，可制备成高有效磷含量的微生物有机肥，将微生物有机肥施加到滨海盐渍土中，可有效改善土壤板结问题，降低土壤pH，提高土壤有效磷含量，提升土壤肥力，促进植物根际土壤磷素转化和对磷的吸收，提高植物生物量，可减少化学磷肥的使用量，降低环境污染。本发明丰富了适用于盐渍土改良的耐盐碱解磷菌菌株资源，解决了现有解磷菌耐盐性差、不适用于滨海盐渍土改良的问题。
(2)本发明中制备微生物有机肥的载体采用食用菌种植产生的菌渣和玉米芯，实现了工农业废弃物的资源化利用，有利于降低微生物有机肥的制备成本，载体可以为耐盐碱解磷海洋菌3-1a的生长繁殖提供稳定的环境和营养物质，同时缓解土壤板结问题，改善土壤质量。
(3)耐盐碱解磷海洋菌3-1a还具有还原Cr(VI)的功能，可在高盐度条件下还原0～150mg/L的Cr(VI)，能够用于含Cr土壤和水体的修复治理。
附图说明
构成本发明的一部分的说明书附图用来提供对本发明的进一步理解，本发明的示意性实施例及其说明用于解释本发明，并不构成对本发明的不当限定。
图1为本发明中耐盐碱解磷海洋菌3-1a菌体表面形态的SEM图；
图2为本发明中以磷酸三钙为磷源时6株菌5d内的解磷量及pH变化趋势图；
图3为本发明中耐盐碱解磷海洋菌3-1a在不同盐度、pH和温度下3d后的溶磷量效果；
图4为本发明中耐盐碱解磷海洋菌3-1a在不同碳源、氮源下3d后的解磷量效果；
图5为本发明中各处理组的小白菜移栽三周后的生长情况；
图6为本发明中接种耐盐碱解磷海洋菌3-1a后培养基在72h内的六价铬浓度变化；
图7为本发明中耐盐碱解磷海洋菌3-1a在不同初始浓度、盐度和pH下72h后的Cr(VI)还原率。
具体实施方式
应该指出，以下详细说明都是示例性的，旨在对本发明提供进一步的说明。除非另有指明，本文使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属技术领域的普通技术人员通常理解的相同含义。
需要注意的是，这里所使用的术语仅是为了描述具体实施方式，而非意图限制根据本发明的示例性实施方式。如在这里所使用的，除非上下文另外明确指出，否则单数形式也意图包括复数形式，此外，还应当理解的是，当在本说明书中使用术语“包含”和/或“包括”时，其指明存在特征、步骤、操作、器件、组件和/或它们的组合。
正如背景技术所介绍的，现有技术中，海陆交界处的滨海土壤盐渍化程度高，板结现象严重，速效养分含量低，长期频繁的水盐运动导致土壤肥力下降，土壤微生物活性降低，常规的解磷菌很难在这种高盐碱环境中存活和发挥作用。为了解决如上的技术问题，本发明提供了一株耐盐碱解磷海洋菌3-1a，分类命名为拟蕈状芽孢杆菌(Bacillusparamycoides)，分离自深海热液口沉积物，于2021年1月20日保藏于武汉市武昌区珞珈山的中国典型培养物保藏中心，其菌种保藏编号为：CCTCC M 2021116。
菌体及菌落特征为：菌株为革兰氏阳性细菌，扫描电子显微镜观察细菌为短杆状，菌体大小约为3μm，在LB固体培养基上的菌落呈乳白色，湿润，较光滑平坦。
所述耐盐碱解磷海洋菌3-1a，能在较宽的盐度、pH和温度范围内生长并保有较高的解磷活性。此外该菌株还具有还原Cr(VI)的功能，可在高盐度条件下还原0～150mg/L的Cr(VI)。
本发明第二方面提供一种微生物有机肥，该微生物有机肥包括上述耐盐碱解磷海洋菌3-1a和菌株载体，所述菌株载体包括食用菌菌渣和玉米芯粉。
本发明第三方面提供一种上述微生物有机肥的制备方法，具体包括：菌株载体的预处理、耐盐碱解磷海洋菌3-1a的培养与接种以及微生物有机肥的半固态发酵。
在本发明的一个或多个实施方式中，所述菌株载体的预处理具体为：将食用菌菌渣和玉米芯粉分别风干、粉碎、过筛，于120℃高压蒸汽灭菌2次，每次30min。
在本发明的一个或多个实施方式中，所述过筛为：将食用菌菌渣过18目筛，将玉米芯粉分别过18目筛和过60目筛，并以2:1:1的质量比将过18目筛的食用菌菌渣、过18目筛的玉米芯粉和过60目筛的玉米芯粉混合均匀。
在本发明的一个或多个实施方式中，所述耐盐碱解磷海洋菌3-1a的培养与接种，具体为：先将耐盐碱解磷海洋菌3-1a制备成解磷菌接种剂，再将解磷菌接种剂接种至混合均匀的菌株载体，使菌株载体完全润湿。
在本发明的一个或多个实施方式中，所述解磷菌接种剂的制备方法为：向LB海水培养基中接种菌株3-1a，于20-25℃培养22-26h至对数生长期，取适量的菌液离心，弃去上清后用去离子水洗涤两次，再用无菌水重悬，即为解磷菌接种剂。
优选的，菌液与菌株载体的用量比为1mL：5g。
在本发明的一个或多个实施方式中，所述菌液与无菌水的体积比为1:10。
在本发明的一个或多个实施方式中，所述对数生长期的耐盐碱解磷菌3-1a菌液的OD600值为1.5。
在本发明的一个或多个实施方式中，所述微生物有机肥的半固态发酵，具体为：将接种有解磷菌接种剂的菌株载体置于25℃恒温培养箱半固态发酵7d，期间每天翻动肥料供氧。
本发明第四方面提供上述耐盐碱解磷海洋菌3-1a和/或微生物有机肥在如下任意一种或多种中的应用：
(1)盐渍土壤复垦；
(2)高盐碱地农作物养殖；
(3)含重金属铬的污染场地治理；
(4)铬渣堆场、废弃矿山的修复；
(5)水体污染修复。
为了使得本领域技术人员能够更加清楚地了解本发明的技术方案，以下将结合具体的实施例详细说明本发明的技术方案。
实施例1
耐盐碱解磷海洋菌3-1a在5d内的解磷量及培养基pH变化：
首先，将耐盐碱解磷海洋菌3-1a在海水LB培养基中培养24h(200rpm，25℃)。
然后，将菌液4000rpm离心，去离子水洗涤两次，用无菌水重悬后，以5％接种量(v/v)接种至高盐PVK培养基，每间隔6h，12h或24h取样测定培养基pH，离心取上清液测定上清液中的可溶性磷含量，绘制5d内菌株的解磷量和培养基pH变化曲线。
上述高盐PVK培养基的配方为：葡萄糖10g/L，(NH4)2SO4 0.5g/L，MgSO4 0.5g/L，KCl0.3g/L，NaCl 33.3g/L，酵母粉0.5g/L，FeSO4 0.03g/L，MnSO4 0.03g/L，Ca3(PO4)2 5g/L，去离子水配制，用0.5M HCl和0.5M NaOH调节pH至6.8～7.2，115℃高压蒸汽灭菌20min。菌株在5d内的解磷量和培养基pH变化曲线如图2a，2b所示。
实施例2
耐盐碱解磷海洋菌3-1a在不同盐度、pH、温度下和利用不同碳源、氮源时的解磷能力测定：
所用高盐PVK培养基：葡萄糖10g/L，(NH4)2SO4 0.5g/L，MgSO4 0.5g/L，KCl 0.3g/L，NaCl 33.3g/L，酵母粉0.5g/L，FeSO4 0.03g/L，MnSO4 0.03g/L，Ca3(PO4)2 5g/L，去离子水配制，用0.5M HCl和0.5M NaOH调节pH至6.8～7.2，115℃高压蒸汽灭菌20min。
其中，菌株在不同盐度下的解磷量测定试验采取以下方法，调节上述含盐PVK培养基中氯化钠的含量，配制成氯化钠质量浓度为0.5％，1％，3％，5％，8％，10％六个盐度梯度的含盐PVK培养基。
菌株在不同pH下的解磷量测定试验采取以下方法，用0.5M HCl和0.5M NaOH调节上述PVK培养基的pH，设置pH＝7，8，8.5，9，10五个梯度。
菌株在不同温度下的解磷量测定试验采取以下方法，将恒温摇床设置为18、25、35、45℃四个温度进行实验。
菌株利用不同碳源时的解磷量测定试验采取以下方法，分别以葡萄糖、半乳糖、蔗糖、乳糖和可溶性淀粉作为高盐PVK培养基的碳源进行实验，每种碳源的浓度均为10g/L。
菌株利用不同氮源时的解磷量测定试验采取以下方法，分别以硫酸铵、硝酸铵、氯化铵、硝酸钠、乙酸铵作为高盐PVK培养基的氮源进行实验，其中每种氮源的NH4 +或NO3 -浓度设为0.03mol/L。
每个处理设置3个平行，取50mL培养基装入100mL锥形瓶，115℃，灭菌20min后以5％接种量(v/v)接种解磷海洋菌3-1a，在25℃恒温摇床内200rpm培养72h，离心取上清液，以钼锑抗分光光度法测定解磷海洋菌3-1a在不同盐度下的解磷量。
菌株在不同盐度、pH和温度下3d后的溶磷效果分别如图3a、3b、3c所示，从图中可以看出，本发明所提供的耐盐碱解磷海洋菌3-1a能在较宽的盐度、pH和温度范围内生长并保有较高的解磷活性。
菌株在不同碳源、氮源下3d后的解磷效果如图4a、4b所示。
实施例3
含有耐盐碱解磷海洋菌3-1a的微生物有机肥的制备：
以食用菌菌渣及玉米芯粉为载体，制备包含上述菌株的微生物有机肥及不含上述菌株的有机肥，载体的具体性质如表1：
表1所用玉米芯、食用菌菌渣的理化性质
Figure BDA0002927836170000061
将所述载体分别风干、粉碎、过筛，于120℃高压蒸汽灭菌2次，每次30min，用无菌自封袋装100g过18目筛的食用菌菌渣，50g过18目筛的玉米芯粉，50g过60目筛的玉米芯粉，混合均匀。取40ml培养24h的菌液(OD600＝1.5)，于4000rpm离心8min，弃去上清，用去离子水洗涤2次，将菌体重悬于400ml无菌水中形成均匀的菌悬液，将菌悬液缓慢倒入混合载体，使其完全润湿并混合均匀，置于25℃恒温培养箱半固态发酵7d，期间定期翻动肥料供氧。
不包含所述菌株的有机肥制备：将上述方法中的400mL菌悬液替换为400mL无菌水，其余步骤同。
实施例4
小白菜种植实验：
将待改良土壤风干、磨碎、过2mm筛于室温下保存备用。
小白菜种植实验作4个处理组：
(1)处理A：原土样，不添加任何物质；
(2)处理B：原土样+菌悬液；
(3)处理C：原土样+上述有机肥，二者质量比为6:1，混合均匀；
(4)处理D：原土样+上述微生物有机肥，二者质量比为6:1，混合均匀。
各处理组土壤的部分理化性质如表2所示：
表2四个处理组土壤的部分理化性质
Figure BDA0002927836170000071
所用小白菜种子为速生388小白菜种子，购自山东寿禾种业有限公司。
进行纸杯育苗试验，每个处理做6个平行，挑选长势一致的已长出两片真叶的小白菜移栽至四个处理组的土壤，观察植物的生长情况。
如图5所示，A、B两组在小白菜移栽后两天全部蔫萎，C、D两组中小白菜可存活，生长三周后，D组小白菜长势明显优于C组，表现为D组小白菜已长出五片真叶，C组仅有四片真叶且第三、四片叶子较小。
实施例5
耐盐碱解磷海洋菌3-1a对Cr(VI)的还原能力
所用培养基成分为：蛋白胨10g/L，酵母粉3g/L，氯化钠30g/L，120℃灭菌15min，添加无菌重铬酸钾储备液配制成一定Cr(VI)浓度的溶液。
将菌株在LB海水培养基中活化至对数生长期，以5％(v/v)接种量接种到含Cr(VI)培养基，25℃，200rpm恒温摇床培养72h，定期取样，离心，用二苯碳酰二肼分光光度法测定上清液的Cr(VI)浓度，计算Cr(VI)去除率。如图6所示，当培养时间达到60h时，Cr(VI)的浓度趋于0，几乎实现了Cr(VI)的完全去除。
设置培养基Cr(VI)浓度为20，40，60，80，150mg/L，pH调至7，盐度3％，25℃恒温摇床转速设为200rpm，探究菌株在不同初始浓度下的Cr(VI)还原性能，3d后的Cr(VI)还原结果示于图7a。
设置培养基盐度(用氯化钠调节)为0.5％，1％，2％，3％，4％，5％，Cr(VI)浓度设为60mg/L，pH调至7，25℃恒温摇床转速设为200rpm，探究菌株在不同初始盐度下的Cr(VI)还原性能，3d后的Cr(VI)还原结果示于图7b。
设置培养基pH为5，6，7，8，9，Cr(VI)浓度设为60mg/L，盐度3％，25℃恒温摇床转速设为200rpm，探究菌株在不同初始pH下的Cr(VI)还原性能，3d后的Cr(VI)还原结果示于图7c。
以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (13)

1.一株耐盐碱解磷海洋菌3-1a，分类命名为拟蕈状芽孢杆菌(Bacillusparamycoides)，于2021年1月20日保藏于武汉市武昌区珞珈山的中国典型培养物保藏中心，其菌种保藏编号为：CCTCC M 2021116。
2.一种微生物有机肥，其特征在于：所述微生物有机肥包括权利要求1所述的耐盐碱解磷海洋菌3-1a和菌株载体。
3.权利要求2所述的微生物有机肥，其特征在于：所述菌株载体包括食用菌菌渣和玉米芯粉。
4.权利要求2所述的微生物有机肥的制备方法，具体包括：菌株载体的预处理、耐盐碱解磷海洋菌3-1a的培养与接种以及微生物有机肥的半固态发酵。
5.如权利要求4所述的制备方法，其特征在于：所述菌株载体的预处理具体为：将食用菌菌渣和玉米芯粉分别风干、粉碎、过筛，于120℃高压蒸汽灭菌2次，每次30min。
6.如权利要求5所述的制备方法，其特征在于：所述过筛为：将食用菌菌渣过18目筛，将玉米芯粉分别过18目筛和过60目筛，并以2:1:1的质量比将过18目筛的食用菌菌渣、过18目筛的玉米芯粉和过60目筛的玉米芯粉混合均匀。
7.如权利要求6所述的制备方法，其特征在于：所述耐盐碱解磷海洋菌3-1a的培养与接种，具体为：先将耐盐碱解磷海洋菌3-1a制备成解磷菌接种剂，再将解磷菌接种剂接种至混合均匀的菌株载体，使菌株载体完全润湿。
8.如权利要求7所述的制备方法，其特征在于：所述解磷菌接种剂的制备方法为：向LB海水培养基中接种菌株3-1a，于20-25℃培养22-26h至对数生长期，取适量的菌液离心，弃去上清后用去离子水洗涤两次，再用无菌水重悬，即为解磷菌接种剂。
9.如权利要求8所述的制备方法，其特征在于：菌液与菌株载体的用量比为1mL：5g。
10.如权利要求8所述的制备方法，其特征在于：所述菌液与无菌水的体积比为1:10。
11.如权利要求8所述的制备方法，其特征在于：所述对数生长期的耐盐碱解磷菌3-1a菌液的OD600值为1.5。
12.如权利要求7所述的制备方法，其特征在于：所述微生物有机肥的半固态发酵，具体为：将接种有解磷菌接种剂的菌株载体置于25℃恒温培养箱半固态发酵7d，期间每天翻动肥料供氧。
13.权利要求1所述的耐盐碱解磷海洋菌3-1a和/或权利要求2-3中任一项所述的微生物有机肥在如下任意一种或多种领域中的应用：
(1)盐渍土壤复垦；
(2)高盐碱地农作物养殖；
(3)含重金属铬的污染场地治理；
(4)铬渣堆场、废弃矿山的修复；
(5)水体污染修复。
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