CN115971226A - 一种超声基因转导强化生物修复污染环境介质的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及污染环境介质修复技术领域，尤其涉及一种超声基因转导强化生物修复污染环境介质的方法。该方法是将含有功能基因的核酸溶液加入到重金属污染或有机污染的目标修复环境介质中，充分混合后引入超声波，以一定作用频率、振幅及时间进行超声作用并将目标修复环境介质置于一定温度下养护一段时间。该方法可以在降低生态安全风险的前提下，在原位增加目标修复环境介质中的功能微生物数量和活性，极大程度上提高对目标修复环境介质的修复效率和修复效果，是一种绿色可持续的污染场地生物强化修复方法。
Description
技术领域
本发明涉及污染环境介质修复技术领域，尤其涉及一种超声基因转导强化生物修复污染环境介质的方法。
背景技术
重污染企业用地、工业废弃地及采矿区等土壤污染点位超标率高。这些污染场地对土壤和地下水的污染正在严重危害人体健康与生态安全。污染场地可根据污染物的不同分为有机物污染场地、重金属污染场地和有机物-重金属复合污染场地。对污染场地的土壤修复主要包括化学修复、物理修复和生物修复技术。化学和物理修复技术往往面临处理费用较高、施工影响较大、对污染场地周围环境具有破坏性等问题。
污染场地生物修复技术指的是利用微生物或植物的生命代谢活动减少污染环境中有毒有害物的浓度或使其无害化，从而使污染了的环境能够部分的或完全的恢复到原初状态的技术。为了提高污染场地生物修复效率，一般采用生物刺激或生物强化方法。
然而，自然环境中的功能微生物的数量较少且活性较低，添加营养物质或外源菌株的生物刺激或生物强化的提升效率有限，而采用基因工程技术存在生物安全隐患。这些问题限制了污染场地生物修复技术的进一步应用。针对这些污染场地生物修复面临的主要技术瓶颈，可以通过强化自然进化的技术手段扩大具有降解功能的微生物数量，降低可能存在的生物安全风险，大幅度提升生物修复效率。为实现这一目标，原位强化自然基因转导技术是一种可行的技术方案。常用的基因转导技术包括真核病毒感染、直接注射、基因枪、脂融合、电转导、DNA-磷酸钙共沉淀以及超声基因转导技术。其中，真核病毒感染、直接注射、基因枪、脂融合、电转导和DNA-磷酸钙共沉淀均属于有创或微创基因工程手段，操作条件要求严苛，难以大规模使用；只有超声基因转导技术属于无创基因转导技术，且操作条件温和，具有现场应用可能。超声基因转导技术是指在超声波的作用下，在微生物细胞表面形成阳离子微气泡，微气泡爆裂形成可逆的小孔通道，从而使外源DNA进入受体细胞的技术。目前，超声基因转导技术主要应用于哺乳动物和植物组织的基因工程中，而在生物修复污染场地中的应用尚不明确。
发明内容
本发明提供了一种超声基因转导强化生物修复污染环境介质的方法，实现功能基因在污染场地的原位转移与复制，达到在原位条件下增加功能微生物数量以及功能基因丰度的目的，提升了污染场地的生物修复效率，解决了现有技术中存在的问题。
本发明所采用的技术方案是：
一种超声基因转导强化生物修复污染环境介质的方法，采用如下任一步骤或其结合：
a向目标修复环境介质中加入外源基因溶液，充分混合，施加超声处理，将超声处理后的环境介质在一定温度下养护一段时间；
b对污染环境介质进行取样，加入外源基因溶液，施加超声处理，将超声处理后的样品混合至污染环境介质中，在一定温度下养护一段时间；
c培养并富集目标修复环境介质中的微生物，并向微生物培养液中加入外源基因溶液，施加超声处理，与目标修复环境介质混合，在一定温度下养护一段时间。
进一步地，所述外源基因溶液为含功能基因的核酸溶液。
进一步地，所述功能基因是表达对目标修复介质具有降解作用的蛋白质的结构基因；或者，所述功能基因是调控目标修复介质含有的微生物中的特定基因的操纵子，所述特定基因能表达对目标修复介质具有降解作用的蛋白质。
进一步地，所述功能基因是对目标修复介质实现重金属氧化、还原或转运的基因；或者，所述功能基因是调控目标修复介质含有的微生物中的特定基因的操纵子，所述特定基因能对目标修复介质实现重金属氧化、还原或转运。
进一步地，含功能基因的核酸溶液包括质粒溶液或细胞核酸提取液；含功能基因的核酸溶液中核酸含量为10-100000ng/kg。
进一步地，所述目标修复环境介质包括有机污染或重金属污染的土壤、地下水或固体废弃物。
进一步地，所述超声波处理为连续或脉冲超声波处理，超声波频率为5-120kHz，处理作用时间为10-300s。
进一步地，超声处理后的环境介质或添加有超声处理后的样品或微生物培养液的环境介质在0-80℃、黑暗好氧条件下养护至少1天。
进一步地，超声处理后的环境介质或添加有超声处理后的样品或微生物培养液的环境介质在0-80℃、黑暗好氧条件下养护5-20天。
上述超声基因转导强化生物修复污染环境介质的方法，在目标修复环境介质污染规模小时，采用如前述a的方式，具体如下操作步骤：
(1)将外源基因溶液以5％-50％的体积/重量比或体积比，加入目标修复环境介质中，充分混合；
(2)引入超声波，作用于混合了含有外源基因溶液的目标修复环境介质；
(3)将超声处理后的环境介质在0-80℃下养护1天以上。
上述超声基因转导强化生物修复污染环境介质的方法，在目标修复环境介质污染规模较大时，采用如前述b或c的方式：
b方式的具体操作步骤如下：
(1)对污染环境介质进行分散取样，在各样品中分别按5％-50％的体积/重量比或体积比，加入外源基因溶液，充分混合；
(2)引入超声波，作用于各混合了含有外源基因溶液的污染环境介质；
(3)将步骤(2)超声处理后的样品按取样位置分散混合至污染环境介质中，在0-80℃下养护1天以上。
进一步地，上述方式a和b的步骤(3)养护过程中，定期添加超纯水将土壤含水率控制在20％。
c方式的具体操作步骤如下：
(1)培养并富集目标修复环境介质中的微生物，并向微生物培养液中加入外源基因溶液；
(2)引入超声波，作用于含有外源基因溶液的微生物培养液；
(3)将步骤(2)超声处理后的微生物培养液均匀混合至目标修复环境介质中，在0-80℃下养护1天以上。
进一步地，上述c方式中的步骤(3)的微生物培养液采用喷施方式均匀混合至目标修复环境介质中。
进一步地，a、b、c方式均针对含有微生物的目标修复环境介质进行。
本发明的有益效果：
1、本发明采用超声基因转导技术，在污染场地中用于修复，实现了在原位条件下较短时间内、通过强化自然基因转导过程、极大的提高了对污染场地修复效率和修复效果，是一种绿色可持续的污染场地生物修复技术。
2、本发明超声基因转导强化生物修复污染环境介质的方法在污染场地中的应用，不受环境条件限制，充分利用土壤中或水体中本身存在的微生物资源，降低了生物修复技术中可能存在的生态安全风险。
3、本发明超声基因转导强化生物修复污染环境介质的方法结合污染介质的规模大小，可采取不同的处理方式，能够实现对目标修复环境介质污染改善的灵活处理。
附图说明
图1为本发明超声基因转导强化生物修复污染环境介质的方法原理图；
图2为本发明可使用的超声波发生设备类型的参考图；
图3为本发明处理污染场地地下水的水样进行修复应用的操作参考图；
图4为本发明实施例1方法处理重金属六价铬污染土壤后不同实验组中六价铬的残留量柱状图；
图5为本发明实施例2方法在处理有机物菲污染土壤后不同实验组中菲的残留量柱状图；
图6为本发明本发明实施例3方法在处理有机物萘污染地下水后不同实验组中萘的残留量柱状图。
具体实施方式
为能清楚说明本方案的技术特点，下面通过具体实施方式，结合附图，对本发明进行详细阐述。
实施例1
该超声基因转导强化生物修复污染环境介质的方法，对应修复的污染环境介质为六价铬污染土壤，污染土壤中六价铬含量为100mg/kg；修复步骤如下：
第一步、将含有360ng铬还原chrA基因的核酸溶液加入到10g六价铬污染土壤中，并充分混合；
第二步、引入脉冲超声波，超声波频率为20kHz，作用时间为20s，作用于步骤(1)混合了含有铬还原chrA基因核酸溶液的六价铬污染土壤；
第三步、将步骤(2)超声后的六价铬污染土壤在28℃、黑暗好氧条件下养护20天，定期添加超纯水将土壤含水率控制在20％。
具体实验过程如下：
(1)用分析天平准确称取10g取自污染场地的六价铬污染土壤；配置2mL浓度为180ng/mL的含铬还原chrA基因的核酸溶液，得到含有360ng铬还原chrA基因的核酸溶液；将该铬还原chrA基因的核酸溶液加入到称取的六价铬污染土壤样品中，并充分混合；
(2)设置仅超声组、仅添加核酸溶液的对照组和同时进行超声和添加核酸溶液的实验组；
仅超声组添加2mL纯水，脉冲超声波频率为20kHz，作用时间为20s；对照组添加2mL含铬还原chrA基因的核酸溶液；实验组添加2mL含铬还原chrA基因的核酸溶液，脉冲超声波频率为20kHz，作用时间为20s；
上述处理后，所有样品置于28℃，黑暗好氧条件下培养20天，定期添加超纯水将土壤含水率控制在20％，设置三组平行实验。
20天后采集土壤样本，测定六价铬残留率，结果如图4所示。实验结果表明，仅超声组和对照组中，六价铬含量无显著变化，去除率低于10.0％；实验组中六价铬含量显著降低，去除率达到56.5％。因此，单独添加核酸溶液或单独超声处理不能提高六价铬还原能力，只有在同时添加核酸并超声处理的条件下才可以提高六价铬还原能力，即本实施例的超声基因转导强化生物修复污染环境介质的方法可以实现污染土壤中六价铬还原能力的显著提升。
实施例2
该超声基因转导强化生物修复污染环境介质的方法，对应修复的污染环境介质为菲污染土壤，污染土壤中菲含量为50mg/kg，修复步骤如下：
第一步、将含有50ng菲降解phn基因簇的核酸溶液加入到10g菲污染土壤中，并充分混合；
第二步、引入脉冲超声波，超声波频率为40kHz，作用时间为100s，作用于步骤(1)混合了含有菲降解phn基因簇核酸溶液的菲污染土壤；
第三步、将步骤(2)超声后的菲污染土壤在10℃、黑暗好氧条件下养护5天，定期添加超纯水将土壤含水率控制在20％。
具体实验过程如下：
(1)用天平准确称取1kg取自污染场地的菲污染土壤；配置200mL浓度为25ng/mL的菲降解phn基因簇的核酸溶液，得到含有50ng菲降解phn基因簇的核酸溶液；将该菲降解phn基因簇的核酸溶液加入到称取的菲污染土壤中，并充分混合；
(2)设置仅超声组、仅添加核酸溶液的对照组和同时进行超声和添加核酸溶液的实验组；
仅超声组添加200mL纯水，脉冲超声波频率为40kHz，作用时间为100s；对照组添加200mL含菲降解phn基因簇的核酸溶液；实验组添加200mL含菲降解phn基因簇的核酸溶液，脉冲超声波频率为40kHz，作用时间为100s；
上述处理后，所有样品置于10℃，黑暗好氧条件下培养5天，定期添加超纯水将土壤含水率控制在20％，设置三组平行实验。
5天后采集土壤样本，测定菲残留率，结果如图5所示。实验结果表明，仅超声组和对照组中，菲含量无显著变化，去除率低于20.0％；实验组中菲含量显著降低，去除率达到78.8％。因此，单独添加核酸溶液或单独超声处理不能提高土壤菲降解能力，只有在同时添加核酸并超声处理的条件下才可以提高土壤菲降解能力，即超声基因转导技术可以实现污染土壤中菲降解能力的显著提升。
实施例3
该超声基因转导强化生物修复污染环境介质的方法，对应修复的污染环境介质为萘污染地下水，污染地下水中萘含量为20mg/L，修复步骤如下：
第一步、将含有1ng萘降解nah基因的核酸溶液加入到10mL萘污染地下水中，并充分混合；
第二步、引入脉冲超声波，超声波频率为80kHz，作用时间为250s，作用于步骤(1)混合了含有萘降解nah基因核酸溶液的萘污染地下水；
第三步、将步骤(2)超声后的萘污染地下水在40℃、黑暗好氧条件下养护12天，定期添加超纯水将土壤含水率控制在20％。
具体实验过程如下：
(1)用量筒准确称取10mL取自污染场地的萘污染地下水；配置2mL浓度为0.5ng/mL的萘降解nah基因的核酸溶液，得到含有1ng萘降解nah基因的核酸溶液；将该萘降解nah基因的核酸溶液加入到量取的萘污染地下水中，并充分混合；
(2)设置仅超声组、仅添加核酸溶液的对照组和同时进行超声和添加核酸溶液的实验组；
仅超声组添加2mL纯水，脉冲超声波频率为80kHz，作用时间为250s。对照组添加2mL含萘降解nah基因的核酸溶液。实验组添加2mL萘降解nah基因的核酸溶液，脉冲超声波频率为80kHz，作用时间为250s。
上述处理后，所有样品置于40℃，黑暗好氧条件下培养12天，设置三组平行实验。
12天后采集地下水样本，测定萘残留率，结果如图6所示。实验结果表明，仅超声组和对照组中，萘含量无显著变化，去除率低于30.0％；实验组中萘含量显著降低，去除率达到95.6％。因此，单独添加核酸溶液或单独超声处理不能提高地下水萘降解能力，只有在同时添加核酸并超声处理的条件下才可以提高地下水萘降解能力，即超声基因转导技术可以实现污染地下水中萘降解能力的显著提升。
上述具体实施方式不能作为对本发明保护范围的限制，对于本技术领域的技术人员来说，对本发明实施方式所做出的任何替代改进或变换均落在本发明的保护范围内。
本发明未详述之处，均为本技术领域技术人员的公知技术。
Claims (9)
1.一种超声基因转导强化生物修复污染环境介质的方法，其特征在于，采用如下任一步骤或其结合：
a向目标修复环境介质中加入外源基因溶液，充分混合，施加超声处理，将超声处理后的环境介质在一定温度下养护一段时间；
b对污染环境介质进行取样，加入外源基因溶液，施加超声处理，将超声处理后的样品分散混合至污染环境介质中，在一定温度下养护一段时间；
c培养并富集目标修复环境介质中的微生物，并向微生物培养液中加入外源基因溶液，施加超声处理，与目标修复环境介质混合，在一定温度下养护一段时间。
2.根据权利要求1所述的一种超声基因转导强化生物修复污染环境介质的方法，其特征在于，所述外源基因溶液为含功能基因的核酸溶液。
3.根据权利要求2所述的一种超声基因转导强化生物修复污染环境介质的方法，其特征在于，所述功能基因是表达对目标修复介质具有降解作用的蛋白质的结构基因；或者，所述功能基因是调控目标修复介质含有的微生物中的特定基因的操纵子，所述特定基因能表达对目标修复介质具有降解作用的蛋白质。
4.根据权利要求2所述的一种超声基因转导强化生物修复污染环境介质的方法，其特征在于，所述功能基因是对目标修复介质实现重金属氧化、还原或转运的基因；或者，所述功能基因是调控目标修复介质含有的微生物中的特定基因的操纵子，所述特定基因能对目标修复介质实现重金属氧化、还原或转运。
5.根据权利要求2所述的一种超声基因转导强化生物修复污染环境介质的方法，其特征在于，含功能基因的核酸溶液包括质粒溶液或细胞核酸提取液；含功能基因的核酸溶液中核酸含量为10-100000ng/kg。
6.根据权利要求1所述的一种超声基因转导强化生物修复污染环境介质的方法，其特征在于，所述目标修复环境介质包括有机污染或重金属污染的土壤、地下水或固体废弃物。
7.根据权利要求1所述的一种超声基因转导强化生物修复污染环境介质的方法，其特征在于，所述超声波处理为连续或脉冲超声波处理，超声波频率为5-120kHz，处理作用时间为10-300s。
8.根据权利要求1所述的一种超声基因转导强化生物修复污染环境介质的方法，其特征在于，超声处理后的环境介质或添加有超声处理后的样品或微生物培养液的环境介质在0-80℃、黑暗好氧条件下养护至少1天。
9.根据权利要求1所述的一种超声基因转导强化生物修复污染环境介质的方法，其特征在于，包括如下操作步骤：
(1)将外源基因溶液以5％-50％的体积/重量比或体积比，加入目标修复环境介质中，充分混合；
(2)引入超声波，作用于混合了含有外源基因溶液的目标修复环境介质；
(3)将超声处理后的环境介质在0-80℃下养护1天以上。
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| CN202310065485.1A CN115971226A (zh) | 2023-02-06 | 2023-02-06 | 一种超声基因转导强化生物修复污染环境介质的方法 |
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Citations (4)
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|---|---|---|---|---|
| WO2015043136A1 (zh) * | 2013-09-27 | 2015-04-02 | 浙江农林大学 | 去除邻硝基苯甲酸的酶制剂及应用 |
| CN104588407A (zh) * | 2015-01-06 | 2015-05-06 | 中国科学院南京土壤研究所 | 四环素与重金属复合高丰度抗性基因污染场地土壤的增效洗脱修复方法 |
| CN110283845A (zh) * | 2019-07-29 | 2019-09-27 | 中国科学院地理科学与资源研究所 | 一种转基因植物复合体系应用于污染土壤的植物修复方法 |
| CN110773562A (zh) * | 2019-11-05 | 2020-02-11 | 北京高能时代环境技术股份有限公司 | 一种重金属-多环芳烃复合污染土壤中多环芳烃的微生物修复方法 |
-
2023
- 2023-02-06 CN CN202310065485.1A patent/CN115971226A/zh active Pending
Patent Citations (4)
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| WO2015043136A1 (zh) * | 2013-09-27 | 2015-04-02 | 浙江农林大学 | 去除邻硝基苯甲酸的酶制剂及应用 |
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| 卢光华等: "汞污染土壤修复技术的研究进展", 工程科学学报, vol. 39, no. 01, 15 January 2017 (2017-01-15), pages 1 - 12 * |
| 昝启杰，谭凤仪，李喻春编著: "滨海湿地生态系统修复技术研究 以深圳湾为例", 31 August 2013, 北京：海洋出版社, pages: 207 - 213 * |
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