CN104588407A - 四环素与重金属复合高丰度抗性基因污染场地土壤的增效洗脱修复方法 - Google Patents

Abstract

四环素与重金属复合高丰度抗性基因污染场地土壤的增效洗脱修复方法，先对污染土壤颗粒进行破碎筛分；再将土粒置于土壤多元异位修复设备中，加入草鱼精子DNA粉末作为的洗脱液，同时采用超声强化和升温处理的方式，进行连续异位增效洗脱；再对洗脱后土壤施加等同于土壤质量10%-20%的营养源缓冲液；人工培养生长完成修复。该方法可同时高效洗脱去除土壤中的四环素、相关四环素抗性基因与多种重金属；添加外源营养物质有利于土壤洗脱后环境微生物生态功能多样性和稳定性的快速恢复，并有效缓解土壤中四环素类抗性基因丰度的二次提升和扩散。

Description

四环素与重金属复合高丰度抗性基因污染场地土壤的增效洗脱修复方法

技术领域

本发明属于有机-无机复合污染土壤修复技术领域，尤其涉及四环素与重金属复合高丰度抗性基因污染土壤的增效洗脱修复方法。

背景技术

近年来，随着我国经济的快速发展，人民生活水平的不断提高，对畜禽供给量的需求也逐年增加。因而，许多饲料厂和规模化养殖场在经济利益的催动下，为了促进动物的快速生长和预防疾病的爆发，普遍在饲料中添加了大量含有重金属的四环素类抗生素。由于畜禽对四环素体内吸收利用的生物有效性较低，大部分四环素往往被畜禽以母体或代谢物的形式直接或间接的随粪便、尿液等排泄物进入到土壤环境中，造成了大批在我国农村地区或城郊养殖场附近的四环素和重金属复合污染场地。这些场地中存在的高浓度四环素和多种重金属复合污染物将会通过食物链对食物安全和人体健康产生较严重的隐患（致癌、致畸和致突变等），甚至以及由此诱导出现的土壤中高丰度四环素类抗性基因也会通过食物链的传递作用“悄无声息”的严重影响人类得病后使用抗生素治疗成功的概率。此类复合污染物已成为人类身边显现或隐现的“化学定时炸弹”，是当前亟需解决的土壤环境问题。增效洗脱修复技术因其修复效率高、周期短、成本低等特点，被认为是污染土壤修复的一种有效手段，然而针对高浓度抗生素和多种重金属复合场地污染土壤的洗脱修复技术研发则相对较少，并且兼顾考虑环境安全和风险来集成研发洗脱后土壤微生物生态功能恢复的技术则更加稀少。因此，针对此类复合污染土壤，开展具有我国自主知识产权的增效洗脱修复技术研发尤为迫切。

目前现有四环素污染环境介质的修复对象主要是针对水体环境，专利申请号：CN201410325850、CN201410042276、CN201310011876 、CN201410083651和CN200710025044分别采用特定的吸附材料、氧化试剂、修复植物、降解菌和紫外-可见光强化降解去除和修复水体中的四环素。然而现有针对四环素污染土壤的修复技术非常稀少，申请号：CN201410348058提供了一种菌根真菌菌剂及其在降解残留四环素类抗生素方面应用的技术，该技术先在四环素类抗生素污染的土壤中接种菌根真菌菌剂，再在该土壤中播种宿主植物，从而构建四环素类抗生素污染的土壤修复体系，但该技术并未兼顾考虑抗生素与重金属复合高丰度抗性基因污染土壤的情况，该降解菌并未显示出是否可以继续耐受高浓度重金属的毒害，也未显示出是否可以在土壤中高丰度抗性基因表达的情况下继续发挥降解作用。申请号：CN201410311296提供了一种畜禽粪便中四环素抗性基因污染处理方法及装置。该方法采用高温处理、厌氧缺氧培养、高pH处理和强光照处理等方式，通过连续串联或部分串联技术的操作，可减少90%以上畜禽粪便中的四环素抗性基因污染，但该方法只针对四环素抗性基因的去除进行了研发，并未兼顾考虑四环素与重金属复合污染的情况，。

通过相关文献查阅和专利检索，并未发现有关四环素与重金属复合高丰度抗性基因污染场地土壤的增效洗脱修复技术的公开发表和受理，与本发明最接近的现有技术是表面活性剂洗脱技术，申请号：200710010441.X提供了一种重金属污染土壤淋洗装置及其方法，但该方法只针对重金属复合污染土壤的修复，而对于四环素和重金属复合污染土壤淋洗修复效果缺乏验证；申请号：CN201010558286.7提供了一种淋洗修复有机-无机复合污染土壤的方法，该方法主要使用十二烷基硫酸钠和二乙胺二琥珀酸淋洗污染土壤，但该方法针对的有机污染物主要是氯苯类和三氯乙烯类有机污染物，针对的重金属主要是铜和铬污染土壤，采用的是化学淋洗剂，对修复后土壤具有潜在的二次环境风险；申请号：CN200810123622和CN201210486441.8分别提供了一种淋洗修复重金属－有机物复合污染土壤的方法和一种多环芳烃与重金属复合污染场地土壤的化学-微生物联合修复方法，该两种方法都是针对多环芳烃与重金属的复合污染土壤修复，缺少对于四环素和多种重金属复合高丰度抗性基因污染场地土壤的效用验证。

现有技术存在的主要缺陷是：缺乏同时针对高浓度四环素与重金属复合高丰度抗性基因污染土壤的协同增效洗脱技术、选用的化学洗脱剂环境友好性较差、污染物去除效果不彻底和洗脱后土壤环境生态功能恢复效果不理想，相关的协同配套修复技术研发明显跟进不足等，因而现有技术市场运用前景并不明朗。

缺陷产生的主要原因有：近年来，许多饲料厂和畜禽养殖场为了促进动物的快速生长和预防疾病的爆发，普遍在饲料中添加了大量含有重金属成份的四环素类抗生素药物，许多含有四环素母体或代谢物的药物随畜禽粪便排出体外堆积至土壤中，由于未能及时有效的处理此类畜禽粪便的排泄物，出现了大批在我国农村地区或城郊养殖场附近的四环素和重金属复合污染场地土壤；前期科技人员对此类污染土壤关注度较少，尤其是在四环素和重金属复合污染条件下诱发的高丰度抗性基因的新型土壤污染情况关注更少，因而现有可供选用的针对性修复技术研发严重滞后；现有修复技术主要针对原先污染浓度相对较低的农田土壤，而对于污染浓度较高的场地土壤，修复效果欠佳；现有修复技术对于修复后土壤环境微生物生态功能多样性和稳定性的恢复兼顾考虑较少。因此，研发环境友好的增效洗脱修复技术，对于解决当下我国大量四环素和重金属复合高丰度抗性基因污染土壤的环境问题具有重要的社会价值和科学意义。

发明内容

解决的技术问题：本发明针对上述现有技术缺陷，提供一种四环素与重金属复合高丰度抗性基因污染场地土壤的增效洗脱修复方法，该方法对污染土壤中总量四环素、多种重金属和四环素抗性基因等污染物具有广谱性的协同高效去除效果，洗脱修复结束后，土壤生态环境功能多样性与稳定性得到显著恢复，是一种兼具环境友好性的联合修复技术。

技术方案：四环素与重金属复合高丰度抗性基因污染场地土壤的增效洗脱修复方法，先对污染土壤颗粒进行破碎筛分，得到粒径不超过2mm的土粒；再将土粒置于土壤多元异位修复设备中，加入质量浓度为0.5-1.0 g L^-1的草鱼精子DNA干粉洗脱液，投加进入土壤多元异位修复设备中的用量为污染土壤体积的2-4倍，同时采用超声强化和升温处理的方式，进行连续异位增效洗脱，具体洗脱方法为：调节土壤多元异位修复设备的转速，开启加热器，同时开启超声发射仪，搅拌停止后，将设备内的上层液体分离，而对下层土壤悬液体系以板框压滤实现土水分离，完成一次洗脱修复，重复1～2次；再对洗脱后土壤施加N/P营养源缓冲液；人工培养土壤微生物生长完成修复。

所述使用的洗脱液具体为质量浓度为0.5 g L^-1的草鱼精子DNA干粉。

所述施加营养源缓冲液具体指对洗脱后土壤在45-60天内分1-2次施加等同于土壤质量10%-20%的N/P营养源缓冲液，由30.0 g N·L^-1 的NH₄NO₃和3.0 g P·L^-1的K₂HPO₄/KH₂PO₄组成，缓冲液pH值调控在6.4±0.1，营养源的N/P质量比例为10:1。

所述人工培养生长时间为自然条件下25℃暗光培养45-60天后，完成整体修复过程。此条件下洗脱后土壤微生物生态功能多样性恢复情况最佳。

所述调节土壤多元异位修复设备的转速至25-50rpm，同时开启加热器加热至20±2~50±2℃，持续30-60min，并打开功率为100-200kHz的超声发射仪，持续10-20min，产生升温和超声强化的协同去除效果。搅拌停止后，将设备内的上层液体分离，而对下层土壤悬液体系以板框压滤实现土水分离，重复2次后，完成洗脱修复环节。

此时四环素和多种重金属浓度均降低至相同理化性质清洁土壤样品含量浓度以下，洗脱后土壤中Pb、Cd、Cr、Zn、Cu、Ni均以残渣态形式存在，四环素抗性基因绝对拷贝数稳定在10²以下。

本发明的工作原理是：1、草鱼精子DNA脱氧核糖核酸是一种具有双链螺旋结构的生物大分子，由脱氧核糖及四种含氮碱基组成，并含有大量的磷酸基团，具有亲脂和亲水的双重特性；2、水溶性的草鱼精子DNA作为洗脱剂后，其双螺旋结构可有效包裹和增溶土壤中极性有机污染物类的四环素药物；3、其DNA螺旋结构上的磷酸基团解离后在水溶液中带负电荷，可同时络合多种重金属离子和带正电荷的四环素，促进重金属和四环素从土壤颗粒固相向水相的解吸迁移能力，提高洗脱去除率的作用；4、草鱼精子DNA属于生物大分子物质，在洗脱过程中，对土壤中四环素抗性基因的生物小分子物质具有天然的相似相容性，可高效的包裹、缠绕和去除多种四环素抗性基因；5、草鱼精子DNA源自于自然生物，具有良好的环境兼容性，洗脱后土壤中残留的少量草鱼精子DNA还可作为良好的氮磷营养源自然降解；6、升温处理可显著加速洗脱反应进程，超声强化处理的空化效应与扰动效应可显著增强污染物传质过程，二者集成可产生大于单一处理的协同效应； 7、添加适量外源营养物质，调节N/P比例，更加有利于显著缓解由于前端强烈的物化洗脱技术对土壤结构和微生物生态系统的破坏，并促进洗脱后土壤微生物生态功能多样性和稳定性的恢复。所以本发明中强化洗脱修复技术与调节添加N/P营养源技术的有机结合可以显著促进对四环素和重金属复合高丰度抗性基因污染土壤的协同增效修复效果。

有益效果：本发明针对四环素和重金属复合高丰度抗性基因污染土壤，提供一种快速洗脱修复技术。其具有的主要优点是：1、可同时高效洗脱去除场地土壤中四环素、多种重金属和四环素相关抗性基因；2、连续洗脱修复效率高，操作简便，广谱性高，易于推广；3、使用的洗脱剂成本低廉，环境友好性，可自然降解、对土壤不造成二次污染；4、添加外源营养物质有利于土壤洗脱后微生物生态功能多样性和稳定性的恢复。该方法对于我国大批畜禽养殖场周边四环素和重金属复合高丰度抗性基因污染场地土壤的修复工作具有广泛的运用前景。

附图说明

图1为CN103182394A的专用洗脱设备示意图；

图2为使用本发明技术方案，当洗脱液成分为0.5 g/L草鱼DNA干粉配制成的洗脱液时，对江苏省台州市郊某肉猪养殖场粪便堆积地污染土壤中复合污染物去除效果的验证图；

图3为使用本发明技术方案，当洗脱液成分为1.0 g/L草鱼DNA干粉配制成的洗脱液时，对安徽省蚌埠市某肉鸡养殖场粪便堆积地污染土壤中复合污染物去除效果的验证图；

图4为使用本发明技术方案，当洗脱液成分为1.0 g/L草鱼DNA干粉配制成的洗脱液时，对浙江省宁波市某肉鸡养殖场粪便堆积地污染土壤中复合污染物去除效果的验证图。

具体实施方式 

以下具体实施方式不以任何形式限制本发明的技术方案，凡是采用等同替换或等效变换的方式所获得的技术方案均落在本发明的保护范围。

所用洗脱液：浓度0.5 g/L 草鱼精子DNA干粉配制的洗脱液。

CN103182394A的专用洗脱设备（图1），包括搅拌装置、洗脱剂注入装置、洗脱剂回收装置5、超声发生器和加热器8；所述搅拌装置包括搅拌腔体1、螺旋搅拌器2和不锈钢气动球阀7；所述搅拌腔体上设有进料口6，螺旋搅拌器2设于搅拌腔体1内并由电机9驱动，不锈钢气动球阀7设于搅拌腔体远离电机的端面下方；所述洗脱剂注入装置包括至少两个洗脱剂注入器，包括第一洗脱剂注入器3和第二洗脱剂注入器4，其中至少一个洗脱剂注入器外覆有保温材料，上述洗脱剂注入装置设于搅拌腔体顶部；洗脱剂回收装置5包括回收管和回收泵，所述回收管一端与回收泵连接，另一端活动连接于搅拌腔体上；加热器8和超声发生器分布于搅拌腔体壁上。

所述搅拌腔体截面为半椭圆形，腔体上方设有罩合的挡泥板，进料口6、洗脱剂注入装置的出口和洗脱剂回收装置5的进口设于挡泥板上。

所述螺旋搅拌器的搅拌刀片与电机同轴设置，搅拌刀片直径为搅拌腔体高度的2/3，刀片运行速率在25~50 rpm。

所述搅拌腔体底边，以靠近不锈钢气动球阀端为顶点，与水平线呈4°倾角，以便顺利排出洗脱修复完成后的清洁土壤。

所述电机、不锈钢气动球阀、泥浆泵与搅拌腔体连接处密封。

所述加热器8包括电加热装置和保温材料，电加热装置和保温材料覆盖于搅拌腔体外壁上，搅拌腔体加热温度控制在20±2~50±2℃。

所述超声发射器包括一组超声波振头，超声波振头均匀分布在搅拌腔体内壁上，每个超声波振头的功率为2.5~5kW。

所述搅拌腔体1还设有臭氧管和热电偶测温装置。还包括触摸屏式的人工智能电子操作平台，连接控制修复设备的全部组件。

利用所述设备修复有机氯农药污染土壤的方法，修复步骤为：a. 土壤预处理：首先将污染场地土壤筛分至粒径约2 mm；b. 修复体系设置：加入相当于土壤2~5倍体积的洗脱剂至搅拌器中，搅拌腔体体积与土壤-洗脱剂混合泥水的体积比不低于1.25；c. 设定修复运行参数：螺旋搅拌速率为25-50 rpm，温度为20±2~50±2℃，保持时间为60 min；开启超声发射器，运行时间30 min；d. 洗脱完成：设备运行60 min后，停止搅拌并静置，使用洗脱剂回收器将搅拌腔体中上层洗脱剂回收，而对下层土壤通过不锈钢气动球阀排出，以板框压滤实现土水分离完成洗脱修复。

实施例1：

对于四环素总浓度大于1 mg kg^-1且小于10 mg kg^-1，Cu 浓度大于50 mg kg^-1且小于100 mg kg^-1，Zn 浓度大于50 mg kg^-1且小于100 mg kg^-1，四环素抗性基因丰度大于1×10⁵小于1×10⁶拷贝数的复合污染土壤：

供试土壤采自江苏省泰州市某肉猪养殖场粪便堆积污染场地。土壤样品风干，拣出杂质，过10目筛后备用。土壤基本理化性质为pH值6.6，有机质含量47.3 g kg^-1，全氮3.6 g kg^-1，有效态氮89.5 mg kg^-1，全磷0.9 g kg^-1，有效磷85.4 mg kg^-1。土壤机械组成为含有5.3 wt.%沙粒，61.8 wt.%壤粒，32.9 wt.%黏粒。土壤中总量四环素，Cu，Zn和四环素抗性基因的背景污染浓度分别6.42 ± 0.53 mg kg^-1、71.25 ± 0.56 mg kg^-1、57.36 ± 2.13 mg kg^-1和3.63 ×10⁵拷贝数。洗脱前，先将污染土壤风干过筛，去除土壤中粒径较大的石块、植物根系等不易破碎的物质，再取粒径小于2毫米的土壤颗粒倾倒入土壤多元异位修复设备（CN103182394A）中，之后加入相当于土壤2倍体积的混合洗脱液，其洗脱液成分为0.5 g/L草鱼精子DNA干粉，溶剂为去离子水；接着调节土壤多元异位修复设备的转速为50 rpm，持续60 min，开启加热器至25±2℃，持续15 min，同时开启功率为200 kHz的超声发射仪，持续20 min；停止搅拌并静置，将洗脱修复设备内部中上层液体分离，而对下层土壤悬液体系以板框压滤实现土水分离完成洗脱环节的修复；从图2中可知，经过检测发现洗脱1次后土壤中总量四环素，Cu，Zn和四环素抗性基因去除率分别为99.38±1.2%、66.15±5.3%，41.56±6.2%和99.94±0.3%。洗脱后土壤中四环素，Cu，Zn和四环素相关抗性基因浓度约为未洗脱修复前初始污染土壤中相应污染物浓度的0.62％，33.85%，58.44%和0.58‰；

对洗脱1次后的每千克泰州土壤添加等同于土壤质量10%（以30.0 g N L^-1 的NH₄NO₃和3.0 g P L^-1的K₂HPO₄/KH₂PO₄组成）的营养缓冲液，缓冲液pH值调控在6.4±0.1，N/P营养源质量比例为10:1，自然条件下25℃暗光培养45天后，发现土壤环境微生物生态多样性指标，AWCD指数、Shannon-Weaver指数和Simpson指数分别为4.2±0.3，4.7±0.2和2.5±0.4，均较刚刚洗脱后土壤的对应指数（1.1±0.4、1.3±0.3和2.7±0.1）显著升高（p<0.05），说明污染土壤环境微生物生态多样性得到了显著的恢复。同时发现四环素相关抗性基因丰度保持在10²拷贝数范围内，未见显著提升，说明该修复技术对缓解抗性基因的扩散具有显著效果。

实施例2：

对于四环素总浓度大于10 mg kg^-1且小于50 mg kg^-1，Cu 浓度大于100 mg kg^-1且小于200 mg kg^-1，Zn 浓度大于100 mg kg^-1且小于200 mg kg^-1，四环素抗性基因丰度大于1×10⁶小于1×10⁷拷贝数的复合污染土壤：

供试土壤采自安徽省蚌埠市某肉鸡养殖场粪便堆积地污染土壤。土壤样品风干，拣出杂质，过10目筛后备用。土壤基本理化性质为pH值6.9，有机质含量26.6 g kg^-1，全氮3.1 g kg^-1，有效态氮58.7 mg kg^-1，全磷0.9 g kg^-1，有效磷61.3 mg kg^-1。土壤机械组成为含有4.2 wt.%沙粒，53.6 wt.%壤粒，42.2 wt.%黏粒。土壤中总量四环素，Cu，Zn和四环素抗性基因的背景污染浓度分别37.31 ± 2.32 mg kg^-1、132.33 ± 3.42 mg kg^-1、163.55 ± 5.54 mg kg^-1和7.43 ×10⁶拷贝数。洗脱前，先将污染土壤风干过筛，去除土壤中粒径较大的石块、植物根系等不易破碎的物质，再取粒径小于2毫米的土壤颗粒倾倒入土壤多元异位修复设备（CN103182394A）中，之后加入相当于土壤2倍体积的混合洗脱液，其洗脱液成分为1.0 g/L草鱼精子DNA干粉，溶剂为去离子水；接着调节土壤多元异位修复设备的转速为25 rpm，开启加热器至25±2℃，持续15 min，同时开启功率为100 kHz的超声发射仪，持续10 min；停止搅拌并静置，将洗脱修复设备内部中上层液体分离，而对下层土壤悬液体系以板框压滤实现土水分离完成洗脱环节的修复；从图3中可知，经过检测发现，洗脱2次后土壤中总量四环素，Cu，Zn和四环素抗性基因去除率分别为92.53±2.72%、72.62±4.15%，78.34±5.53%和99.93±0.07%。洗脱后土壤中四环素，Cu，Zn和四环素相关抗性基因浓度约为未洗脱修复前初始污染土壤中相应污染物浓度的7.47％，27.38%，21.66%和0.67‰；

对洗脱2次后的每千克泰州土壤添加等同于土壤质量15%（以30.0 g N L^-1 的NH₄NO₃和3.0 g P L^-1的K₂HPO₄/KH₂PO₄组成）的营养缓冲液，缓冲液pH值调控在6.4±0.1，N/P营养源质量比例为10:1，自然条件下25℃暗光培养60天后，发现土壤环境微生物生态多样性指标，AWCD指数、Shannon-Weaver指数和Simpson指数分别为5.7±0.2，5.5±0.6和4.7±0.3，均较刚刚洗脱2次后土壤的对应指数（1.5±0.1、1.7±0.2和1.9±0.3）显著升高（p<0.05），说明污染土壤环境微生物生态多样性得到了显著的恢复。同时发现四环素相关抗性基因丰度保持在10³拷贝数范围内，未见显著提升，说明该修复技术对缓解抗性基因的扩散具有显著效果。

实施例3：

对于四环素总浓度大于50 mg kg^-1，Cu 浓度大于200 mg kg^-1，Zn 浓度大于200 mg kg^-1，四环素抗性基因丰度大于1×10⁷拷贝数的复合污染土壤：

供试土壤采自浙江省宁波市某肉鸡养殖场粪便堆积地污染土壤。土壤样品风干，拣出杂质，过10目筛后备用。土壤基本理化性质为pH值6.1，有机质含量15.7 g kg^-1，全氮1.2 g kg^-1，有效态氮34.1 mg kg^-1，全磷0.3 g kg^-1，有效磷42.4 mg kg^-1。土壤机械组成为含有7.8 wt.%沙粒，58.1 wt.%壤粒，34.1 wt.%黏粒。土壤中总量四环素，Cu，Zn和四环素抗性基因的背景污染浓度分别61.44 ± 3.54 mg kg^-1、211.29 ± 6.65 mg kg^-1、251.14 ± 7.65 mg kg^-1和2.47 ×10⁷拷贝数。洗脱前，先将污染土壤风干过筛，去除土壤中粒径较大的石块、植物根系等不易破碎的物质，再取粒径小于2毫米的土壤颗粒倾倒入土壤多元异位修复设备（CN103182394A）中，之后加入相当于土壤2倍体积的混合洗脱液，其洗脱液成分为1.0 g/L草鱼精子DNA干粉，溶剂为去离子水；接着调节土壤多元异位修复设备的转速为25 rpm，开启加热器至50±2℃，持续15 min，同时开启功率为100 kHz的超声发射仪，持续10 min；停止搅拌并静置，将洗脱修复设备内部中上层液体分离，而对下层土壤悬液体系以板框压滤实现土水分离完成洗脱环节的修复；从图4中可知，经过检测发现，洗脱2次后土壤中总量四环素，Cu，Zn和四环素抗性基因去除率分别为98.68±1.03%、87.32±7.32%，93.51±6.72%和99.996±0.006%。洗脱后土壤中四环素，Cu，Zn和四环素相关抗性基因浓度约为未洗脱修复前初始污染土壤中相应污染物浓度的1.32％，12.68%，6.49%和0.04‰；

对洗脱2次后的每千克泰州土壤添加等同于土壤质量20%（以30.0 g N L^-1 的NH₄NO₃和3.0 g P L^-1的K₂HPO₄/KH₂PO₄组成）的营养缓冲液，缓冲液pH值调控在6.4±0.1，N/P营养源质量比例为10:1，自然条件下25℃暗光培养60天后，发现土壤环境微生物生态多样性指标，AWCD指数、Shannon-Weaver指数和Simpson指数分别为5.3±0.4，6.1±0.3和5.5±0.4，均较刚刚洗脱2次后土壤的对应指数（1.2±0.5、1.8±0.3和1.4±0.5）显著升高（p<0.05），说明污染土壤环境微生物生态多样性得到了显著的恢复。同时发现四环素相关抗性基因丰度保持在10³拷贝数范围内，未见显著提升，说明该修复技术对缓解抗性基因的扩散具有显著效果。

结果表明，上述用于修复四环素和重金属复合高丰度抗性基因污染土壤的增效洗脱修复方法，不仅污染物洗脱去除效率高，而且修复后土壤中抗性基因丰度不会迅速扩散，环境友好性上佳，是一种具有良好运用前景的场地土壤修复技术。

Claims (5)

1.四环素与重金属复合高丰度抗性基因污染场地土壤的增效洗脱修复方法，其特征在于：先对污染土壤颗粒进行破碎筛分，得到粒径不超过2mm的土粒；再将土粒置于土壤多元异位修复设备中，加入质量浓度为0.5-1.0 g L^-1的草鱼精子DNA干粉洗脱液，投加进入土壤多元异位修复设备中的用量为污染土壤体积的2-4倍，同时采用超声强化和升温处理的方式，进行连续异位增效洗脱，具体洗脱方法为：调节土壤多元异位修复设备的转速，开启加热器，同时开启超声发射仪，搅拌停止后，将设备内的上层液体分离，而对下层土壤悬液体系以板框压滤实现土水分离，完成一次洗脱修复，重复1～2次；再对洗脱后土壤施加N/P营养源缓冲液；人工培养土壤微生物生长完成修复。

2.根据权利要求1所述四环素与重金属复合高丰度抗性基因污染场地土壤的增效洗脱修复方法，其特征在于所述使用的洗脱液具体为质量浓度为0.5g L^-1的草鱼精子DNA干粉。

3.根据权利要求1所述四环素与重金属复合高丰度抗性基因污染场地土壤的增效洗脱修复方法，其特征在于所述施加营养源缓冲液具体指对洗脱后土壤在45-60天内分1-2次施加等同于土壤质量10%-20%的N/P营养源缓冲液，由30.0 g N·L^-1 的NH₄NO₃和3.0 g P·L^-1的K₂HPO₄/KH₂PO₄组成，缓冲液pH值调控在6.4±0.1，营养源的N/P质量比例为10:1。

4.根据权利要求1所述四环素与重金属复合高丰度抗性基因污染场地土壤的增效洗脱修复方法，其特征在于所述人工培养生长时间为自然条件下25℃暗光培养45-60天后，完成整体修复过程。

5.根据权利要求1所述四环素与重金属复合高丰度抗性基因污染场地土壤的增效洗脱修复方法，其特征在于所述调节土壤多元异位修复设备的转速至25-50rpm，同时开启加热器加热至20±2~50±2℃，持续30-60min，并打开功率为100-200kHz的超声发射仪，持续10-20min，产生升温和超声强化的协同去除效果；搅拌停止后，将设备内的上层液体分离，而对下层土壤悬液体系以板框压滤实现土水分离，重复2次后，完成洗脱修复环节。