CN110773562A - 一种重金属-多环芳烃复合污染土壤中多环芳烃的微生物修复方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种重金属‑多环芳烃复合污染土壤中多环芳烃的微生物修复方法，包括：具有重金属抗性的多环芳烃降解菌的制备；具有重金属抗性的多环芳烃降解菌的培养；具有重金属抗性的多环芳烃降解菌修复重金属‑多环芳烃复合污染土壤中的多环芳烃。本发明的微生物修复方法属于原位修复，操作简单、不破坏土壤肥力、不存在土壤的二次污染，且使得降解菌对污染土壤的适应性增强，大大提高了微生物降解多环芳烃污染物的速率和效果。

Description

一种重金属-多环芳烃复合污染土壤中多环芳烃的微生物修 复方法

技术领域

本发明涉及污染土壤修复处理技术领域，具体涉及一种重金属-多环芳烃复合污染土壤中多环芳烃的微生物修复方法。

背景技术

近年来，随着城市化和工业化的不断发展，土壤污染日益严重。土壤污染物种类繁多，常见的有重金属、硫化物等无机污染物以及农药、多环芳烃、石油等有机污染物。随着国家“退二进三”等政策的实施，出现了大批焦化厂、钢铁厂等多环芳烃和重金属复合污染的土壤。复合污染土壤中各种污染物之间的相互作用增加了修复的难度，仅针对单一污染物进行治理通常难以达到土壤修复的要求。

微生物修复法是向多环芳烃污染土壤中添加微生物，通过微生物新陈代谢等作用，来降解污染物浓度。该方法操作简单、不需要大型设备，且没有二次污染，是修复多环芳烃污染土壤经常选用的方法之一。但是研究表明，一些土壤中由重金属浓度过高，对微生物产生胁迫，使得微生物无法生长或者活性降低，影响了修复效率。

发明内容

针对上述问题中存在的不足之处，本发明提供一种重金属-多环芳烃复合污染土壤中多环芳烃的微生物修复方法。

本发明公开了一种重金属-多环芳烃复合污染土壤中多环芳烃的微生物修复方法，包括：

步骤1、具有重金属抗性的多环芳烃降解菌的制备；包括：

扩增模板DNA，切胶纯化后得到镉抗性基因；

将镉抗性基因片段连接到pEASY-T1载体上，将其导入感受态的多环芳烃降解菌细胞；

将感受态细胞涂布在含诱导剂的LB固体培养基上，进行培养；

挑取单克隆细胞接种于含镉的LB液体培养基，进行培养；

将菌液进行测序，测序结果与NCBI数据库进行比对，确定选取的克隆子包含镉抗性基因片段；

步骤2、具有重金属抗性的多环芳烃降解菌的培养；包括：

将TA克隆成功的降解菌接种到LB固体平板上活化；

在LB培养基上加入镉离子溶液，混合均匀；然后加入活化好的降解菌，进行培养；

步骤3、具有重金属抗性的多环芳烃降解菌修复重金属-多环芳烃复合污染土壤中的多环芳烃。

作为本发明的进一步改进，在步骤1中：

感受态细胞在含诱导剂的LB固体培养基上的培养条件为：37℃下培养24h；

单克隆细胞在含镉的LB液体培养基上的培养条件为：37℃培养6～12h。

作为本发明的进一步改进，在步骤1中：

所述模板DNA是由DAN提取试剂盒提取重金属抗性菌液得到的；

所述切胶纯化是用1％的琼脂糖凝胶电泳分离纯化目的片段。

作为本发明的进一步改进，在步骤1中：

所述多环芳烃降解菌为分枝杆菌和芽孢杆菌中的一种。

作为本发明的进一步改进，在步骤2中：

活化好的降解菌的培养条件为：做好重金属离子的空白对照，置于摇床上37℃、150-200rpm，培养18-24h。

作为本发明的进一步改进，在步骤2中：

所述镉离子溶液的浓度为700-850mg/L。

作为本发明的进一步改进，所述步骤3包括：

将步骤2的降解菌培养液加入到重金属-多环芳烃复合污染的土壤中，添加比例为每亩污染土壤喷施10～20L培养液，翻耕表层土壤，使降解菌与污染土壤充分混合，吸附降解深层土壤中的多环芳烃。

作为本发明的进一步改进，污染土壤的湿度是最大持水量的30％-65％。

与现有技术相比，本发明的有益效果为：

1、本发明以原有的多环芳烃降解菌为基础，制备具有重金属抗性的多环芳烃降解菌，使得这些菌种在重金属-多环芳烃的复合污染土壤中适应性更好，稳定地发挥高效能；

2、经过改性的降解菌剂可根据污染程度直接投加，操作简单，不产生二次污染。

3、本修复方法属于原位修复，对土壤扰动较小，较大程度上避免了人为破坏生物酶的活性和生化反应的稳定性。

附图说明

图1为本发明一种实施例公开的重金属-多环芳烃复合污染土壤中多环芳烃的微生物修复方法的流程图。

具体实施方式

为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明的一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动的前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

下面结合附图对本发明做进一步的详细描述：

如图1所示，本发明提供一种重金属-多环芳烃复合污染土壤中多环芳烃的微生物修复方法，包括：

步骤1、具有重金属抗性的多环芳烃降解菌的制备；

包括：

步骤11、用普通PCR仪扩增模板DNA，切胶纯化后得到镉(Cd)抗性基因；其中，模板DNA是由DAN提取试剂盒提取重金属抗性菌液得到的，切胶纯化是用1％的琼脂糖凝胶电泳分离纯化目的片段；

步骤12、将镉抗性基因片段连接到pEASY-T1载体上，将其导入感受态的多环芳烃降解菌细胞；

步骤13、将感受态细胞涂布在含诱导剂的LB固体培养基上，37℃下培养24h；

步骤14、挑取单克隆细胞接种于含镉的LB液体培养基，并在LB固体平板上划线保存，LB液体培养基37℃培养6～12h；

步骤15、将菌液进行测序，测序结果与NCBI数据库进行比对，若比对成功，则确定选取的克隆子包含镉抗性基因片段(目的片段)；若比对失败，则返回步骤11。

进一步，多环芳烃降解菌为分枝杆菌和芽孢杆菌中的一种。

步骤2、具有重金属抗性的多环芳烃降解菌的培养；

包括：

步骤21、将TA克隆成功的降解菌接种到LB固体平板上活化；

步骤22、在三角瓶中装入25mL的LB培养基，加入镉离子溶液，混合均匀，然后加入活化好的降解菌，并做好重金属离子的空白对照，置于摇床上37℃、150-200rpm，培养18-24h。

进一步，镉离子溶液的浓度为700-850mg/L。

步骤3、具有重金属抗性的多环芳烃降解菌修复重金属-多环芳烃复合污染土壤中的多环芳烃；

包括：

将步骤2的降解菌培养液加入到重金属-多环芳烃复合污染的土壤中，添加比例为每亩污染土壤喷施10～20L培养液，翻耕表层土壤，使降解菌与污染土壤充分混合，吸附降解深层土壤中的多环芳烃。

进一步，污染土壤的湿度是最大持水量的30％-65％。

下面通过具体实施例进一步来说明本发明。

实施例1

取安徽省某焦化厂污染场地土壤，土壤样品风干过筛后备用。土壤基本理化性质为其基本理化性质如下：pH 6.5，有机质26g/kg，全氮1.4g/kg，有效磷56mg/kg。土壤中多环芳烃浓度为310mg/kg，且有Cd、Zn、As三种重金属污染。

用普通PCR仪扩增镉(Cd)抗性基因。反应体系共20μL，包括：PCR Mix10μL、正、反向引物各1μL、模板DNA 2μL、灭菌的超纯水6μL。得到的扩增产物用1％琼脂糖进行凝胶电泳(110V，30min)，之后用凝胶成像系统观测目的基因位置，将目的片段切胶回收并进行纯化，测定胶回收产物的浓度。随后将目的基因片段连接到pEASY-T1载体上，将其导入感受态的多环芳烃降解菌细胞，将感受态细胞涂布在含诱导剂的LB固体培养基上，37℃下培养24h。随后挑取单克隆接种于含镉的LB液体培养基，并在LB固体平板上划线保存。LB液体培养基37℃培养8h，将菌液送至公司进行测序，记录测序成功的降解菌。

随后将TA克隆成功的降解菌接种到LB固体平板上活化，在三角瓶中装入50mL镉离子浓度为750mg/L的LB培养基，用灭菌牙签蘸取少量降解菌放入上述培养基中，于摇床上37℃、150rpm，培养24h。之后将上述菌液和原始降解菌分别稀释至相同倍数以15L菌液/亩的比例加入到实验用土中，加水使土壤湿度达到30％左右，再加入约5％的锯末，充分混合搅拌均匀，分别记为处理组1(改性降解菌)和处理组2(原始降解菌)。养护40-50d，养护期间期间保持土壤湿度，并定期搅拌混合。培养结束后处理组2的多环芳烃降解率较处理组1增加了6％～8％，处理组2的修复效果更加显著。

实施例2

取兰州市某污染场地土壤，土壤样品风干过筛后备用。该土壤中多环芳烃浓度为420mg/kg，且Cd和As两种重金属超标。与实施例1不同的是该污染土壤的有机质含量较低，为了使微生物修复效果较好，具体施用于土壤阶段增加了有机肥。具体实施方式如下：

将TA克隆成功的降解菌接种到LB固体平板上活化，在三角瓶中装入50mL镉离子浓度为850mg/L的LB培养基，用灭菌牙签蘸取少量降解菌放入上述培养基中，于摇床上37℃、200rpm，培养6h。之后将上述改性菌菌液(处理组1)和原始菌液(处理组2)分别以15L菌液/亩的比例加入到实验用土中，加水使土壤湿度达到30％左右，再加入约5％的锯末和20％-35％的鸡粪、猪粪混合有机肥，充分混合搅拌均匀，养护40-50d，养护期间期间保持土壤湿度，并定期搅拌混合。培养结束后处理组2的多环芳烃降解率较处理组1增加了6％～9％，处理组2的修复效果更加显著。此外，相比于原始污染土壤，处理后的土壤肥力和微生物多样性均有所增加。

以上仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (8)

1.一种重金属-多环芳烃复合污染土壤中多环芳烃的微生物修复方法，其特征在于，包括：

步骤1、具有重金属抗性的多环芳烃降解菌的制备；包括：

扩增模板DNA，切胶纯化后得到镉抗性基因；

将镉抗性基因片段连接到pEASY-T1载体上，将其导入感受态的多环芳烃降解菌细胞；

将感受态细胞涂布在含诱导剂的LB固体培养基上，进行培养；

挑取单克隆细胞接种于含镉的LB液体培养基，进行培养；

将菌液进行测序，测序结果与NCBI数据库进行比对，确定选取的克隆子包含镉抗性基因片段；

步骤2、具有重金属抗性的多环芳烃降解菌的培养；包括：

将TA克隆成功的降解菌接种到LB固体平板上活化；

在LB培养基上加入镉离子溶液，混合均匀；然后加入活化好的降解菌，进行培养；

步骤3、具有重金属抗性的多环芳烃降解菌修复重金属-多环芳烃复合污染土壤中的多环芳烃。

2.如权利要求1所述的微生物修复方法，其特征在于，在步骤1中：

感受态细胞在含诱导剂的LB固体培养基上的培养条件为：37℃下培养24h；

单克隆细胞在含镉的LB液体培养基上的培养条件为：37℃培养6～12h。

3.如权利要求1所述的微生物修复方法，其特征在于，在步骤1中：

所述模板DNA是由DAN提取试剂盒提取重金属抗性菌液得到的；

所述切胶纯化是用1％的琼脂糖凝胶电泳分离纯化目的片段。

4.如权利要求1所述的微生物修复方法，其特征在于，在步骤1中：

所述多环芳烃降解菌为分枝杆菌和芽孢杆菌中的一种。

5.如权利要求1所述的微生物修复方法，其特征在于，在步骤2中：

活化好的降解菌的培养条件为：做好重金属离子的空白对照，置于摇床上37℃、150-200rpm，培养18-24h。

6.如权利要求1所述的微生物修复方法，其特征在于，在步骤2中：

所述镉离子溶液的浓度为700-850mg/L。

7.如权利要求1所述的微生物修复方法，其特征在于，所述步骤3包括：

将步骤2的降解菌培养液加入到重金属-多环芳烃复合污染的土壤中，添加比例为每亩污染土壤喷施10～20L培养液，翻耕表层土壤，使降解菌与污染土壤充分混合，吸附降解深层土壤中的多环芳烃。

8.如权利要求7所述的微生物修复方法，其特征在于，污染土壤的湿度是最大持水量的30％-65％。

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