CN108504614A - 一种多环芳烃降解工程菌wp4-C23O及其构建方法和应用 - Google Patents

一种多环芳烃降解工程菌wp4-C23O及其构建方法和应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开一种多环芳烃降解工程菌wp4‑C23O及其构建方法和应用，工程菌wp4‑C23O由PCR扩增克隆假单胞菌（Pseudomonas sp. wp3‑1）的邻苯二酚‑2，3‑双加氧酶（C23O）基因，连接于自杀性载体pUTmini‑Tn5得到重组载体pUTmini‑Tn5‑C23O，通过三亲接合作用经mini‑Tn5转座将重组载体pUTmini‑Tn5‑C23O中的C23O基因整合到菌株假单胞菌（Pseudomonas stutzeri wp4）的染色体DNA中获得，对芘的降解率显著高于菌株wp4，降解率提高11.45%，而且解决了遗传不稳定的问题。

Description

一种多环芳烃降解工程菌wp4-C23O及其构建方法和应用
技术领域
本发明涉及基因工程菌的技术领域，具体的涉及一种工程菌及其构建方法和应用的技术领域。
技术背景
多环芳烃(Polycyclic aromatic hydrocarbons，PAHs)普遍存在于自然界中，其有六个碳碳键以不同方式连接而成的芳香族化合物，在通常情况下PAHs是固态状，有较高沸点、熔点、低蒸汽压以及有着极其低的水溶性。一般情况，分子质量决定了PAHs的脂溶性，但是水溶性随着分子质量增加而减弱。此外，PAHs较弱的水溶性导致在土壤中很难处理。
目前，土壤中的PAHs（Polycyclic aromatic hydrocarbons，PAHs）治理主要是通过微生物降解。为了提高对PAHs的降解率，国内外学者一直尝试对微生物降解PAHs途径中的关键基因利用PCR等技术转移到各种质粒中，使其在E.coli细胞内过量表达，以此达到目的。但是目前技术中存在质粒具有容易丢失，遗传不稳定等缺点，而且基于E.coli构建出的PAHs降解工程菌对环境适应能力较差，直接去除土壤中的PAHs是不切实际的。
发明内容
针对现有技术中存在质粒容易丢失，遗传不稳定以及构建的工程菌环境适应能力较差的技术现状，本发明旨在提供一种多环芳烃降解工程菌及其构建方法和应用，得到芘降解工程菌wp4-C23O，有效提高芘降解率，而且解决了遗传不稳定的问题。
本发明采用的主要技术方案：
本发明提供一种多环芳烃降解工程菌假单胞菌(Pseudomonas sp.)wp4-C23O，该菌株已于申请日前保藏于布达佩斯条约微生物国际保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心 (CGMCC)。地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮编：100101。保藏日期是2018年01月24日，保藏号是CGMCC No.15260。
优选的，所述的多环芳烃降解工程菌wp4-C23O是由PCR扩增克隆假单胞菌（Pseudomonas sp. wp3-1；登录号：KX925840.1 ）的邻苯二酚-2，3-双加氧酶（C23O）基因，连接于自杀性载体pUTmini-Tn5得到重组载体pUTmini-Tn5-C23O，通过三亲接合作用经mini-Tn5转座将重组载体pUTmini-Tn5-C23O中的C23O基因整合到菌株假单胞菌（Pseudomonas stutzeri wp4；登录号：KX925841.1）的染色体DNA中获得。
进而，本发明提供所述的多环芳烃降解工程菌wp4-C23O的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：
（1）本发明以Pseudomonas sp. wp3-1基因组为模板，用带有NotI酶切位点特异引物对C23O基因PCR扩增；
（2）将PCR产物和自杀性载体pUTmini-Tn5分别在37℃条件下经NotI酶消化4h，之后用上述处理的C23O基因和pUTmini-Tn5在16℃条件下酶连过夜；
（3）将连接液用热激转化到感受态细胞大肠杆菌(Escherichia coli)S17-1(λpir)中，然后涂布于选择培养基进行筛选，生长出的菌落即为供体菌S17-1(λpir）-pUTmini-Tn5-C23O；
（4）运用三亲接合转化方法将供体菌S17-1(λpir）-pUTmini-Tn5-C23O、辅助菌E .coliHB101(RK2013)、受体菌Pseudomonas sp. wp4按3：3：2比例混合，然后将混合液涂布于选择培养基上进行筛选，生长出的菌落即为工程菌wp4-C23O。
优选的，所述的PCR扩增的程序为：95℃ 3 min；94℃ 60s；56℃ 60 s；72 ℃ 90s；30个循环；72℃ 10min。
优选的，所述的供体菌S17-1(λpir）-pUTmini-Tn5-C23O的选择培养基为包括邻苯二酚100mg/L、卡那霉素50mg/L以及链霉素50mg/L的LB固体培养基。
优选的，所述的三亲接合转化方法为将供体菌S17-1(λpir）-pUTmini-Tn5-C23O、辅助菌E .coli HB101(RK2013)、受体菌Pseudomonas sp. wp4在含有相应抗生素LB液体培养基中培养8 h，然后将供体菌、辅助菌、受体菌按照3：3：2的比例混合，在30℃，10000r/min条件下离心3min，收集菌体，用无菌生理盐水洗涤三次除去抗生素，加入200µl无菌LB液体培养基悬重，点样于LB固体平板的细菌滤膜；在30 ℃培养过夜，次日将菌体从平板上洗下，用1 ml生理盐水悬重混合液，然后稀释不同浓度，涂布于选择性培养基平板上，进行阳性克隆筛选，阳性克隆即为工程菌wp4-C23O。
优选的，所述的工程菌wp4-C23O的选择培养基为包括邻苯二酚100 mg/L、卡那霉素50 ml/L和链霉素50 ml/L的LB固体培养基。
进一步，本发明提供多环芳烃降解工程菌wp4-C23O在降解多环芳烃中的应用。
优选的，所述的多环芳烃降解工程菌wp4-C23O在降解多环芳烃中的应用的温度为37 ℃，pH值为7.5。
通过实施本发明具体技术指标，实现本发明内容，可以达到以下有益效果：
（1）本发明提供的工程菌wp4-C23O选用石油污染土壤中对PAHs降解优势菌株，构建的PAHs降解工程菌对环境适应能力较强。
（2）工程菌wp4-C23O菌株对芘的降解率显著高于菌株wp4，降解率提高11.45%，而且解决了遗传不稳定的问题。
（3）本发明提供的工程菌wp4-C23O是将C23O基因插入到PAHs降解优势菌株基因组，不会出现基因转移现象，避免出现基因污染问题。
附图说明
图1所示为菌株S17-1(λpir）-pUTmini-Tn5-C23O筛选结果图。
图2 所示为pUTmini-Tn5-C23O构建过程的电泳验证图。
图3所示为Km基因和C23O基因PCR 检测结果图。
图4所示为在不同温度菌株wp4和工程菌对芘降解率。
图5所示为在不同pH值菌株wp4和工程菌对芘降解率。
具体实施方式
下面，举实施例说明本发明，但是，本发明并不限于下述的实施例。本发明中选用的所有原辅材料，以及选用的菌种培养方法都为本领域熟知选用的，本发明中涉及到的%都为重量百分比，除非特别指出除外。
实施例一：多环芳烃降解工程菌wp4-C23O的构建方法
本发明由假单胞菌（Pseudomonas sp. wp3-1）的邻苯二酚-2，3-双加氧酶（C23O）基因，通过三亲接合作用将该基因因整合到菌株假单胞菌（Pseudomonas stutzeri wp4）的染色体DNA中。以下为具体构建方法：
（1）LB 培养基：酵母膏5 g；蛋白胨10g；氯化钠5g；H2O1000 mL。
以Pseudomonas sp.wp3-1基因组为模板，对C23O基因PCR扩增。
正向引物：5'-ATTTGCGGCCGCAGGTGWCGTSATGAAMAAAGG-3'；
反向引物：5'-ATTTGCGGCCGCTYAGGTSAKMACGGTCAKGAA-3'。
每个引物下划线标记为NotI酶切位点。
PCR程序为：95℃ 3 min；94℃ 60s；56℃ 60 s；72 ℃ 90s；30个循环；72℃10min。
（2）将PCR产物和自杀性载体pUTmini-Tn5分别在37℃条件下经NotI酶消化4h，之后用上述处理的C23O基因和pUTmini-Tn5在16℃条件酶连过夜。
（3）将连接液用热激转化到感受态细胞大肠杆菌(Escherichia coli)S17-1(λpir)。用涂布棒将转化菌悬液涂布于包含邻苯二酚（100mg/L）、卡那霉素（50mg/L）以及链霉素（50mg/L）的LB固体培养基上。在37℃条件下培养过夜，然后筛选阳性克隆大肠杆菌(Escherichia coli)S17-1(λpir) pUTmini-Tn5-C23O，结果如图1。
（4）提取其质粒用C23O基因特异性引物进行PCR扩增。
正向引物：5'-AGGTGWCGTSATGAAMAAAGG-3'；
反向引物：5'-TYAGGTSAKMACGGTCAKGAA-3'。
PCR程序为：95℃ 3 min；94℃ 60s；56℃ 60 s；72 ℃ 90s；30个循环；72℃10min，检验目的基因存在，结果如图2。
将供体菌S17-1(λpir）-pUTmini-Tn5-C23O、辅助菌E .coli HB101(RK2013)、受体菌Pseudomonas stutzeri wp4在含有相应抗生素LB液体培养基中培养8 h，然后将供体菌、辅助菌、受体菌按照3：3：2的比例混合，在30℃，10000r/min离心3分钟，收集菌体，用无菌生理盐水洗涤三次除去抗生素，加入200µl无菌LB液体培养基悬重，点样于LB固体平板的细菌滤膜。在30 ℃培养过夜，次日将菌体从平板上洗下，用1 ml生理盐水悬重混合液，然后稀释不同浓度，涂布于含有邻苯二酚100 mg/L、卡那霉素50 ml/L、以及链霉素50 ml/L的LB选择性培养基平板上，进行阳性克隆筛选，阳性克隆命名为wp4-C23O。
工程菌鉴定：提取菌株wp4和工程菌基因组DNA，根据重组载体pUTmini-Tn5-C23O的Km基因和C23O基因序列分别设计引物：
上游引物F：5'-GGCAGCGCAACGGAACATTCA-3'；
下游引物R：5'-GACGAACCTGGTATGGATTT-3'。
进行PCR扩增，产物预期长度为1900bp左右，检验两株菌基因组是否同时含有Km基因和C23O基因，以此确定C23O基因是否插入受体菌Pseudomonas stutzeri wp4；PCR 反应条件：94℃ 5 min；94℃ 50s；60℃ 60 s；72 ℃ 90s；30个循环；72℃ 7min，结果如图3。
实施例二：多环芳烃降解工程菌wp4-C23O的应用
（1）菌株wp4和工程菌wp4-C23O经过7d培养，在不同温度下检测对芘降解率，结果如图4。
如图 4可见，菌株wp4和工程菌wp4-C23O在一定范围内随温度提高对芘降解率增加，但在37 ℃以后对芘降解率下降，在37 ℃降解率达到最大；此温度下菌株wp4和工程菌wp4-C23O对芘降解率分别为71.75 %、82.20 %，降解率提高了10.45 %。
（2）菌株wp4和工程菌wp4-C23O经过7 d培养，在pH值下检测对芘降解率，结果如图5。
如图5可见，菌株wp4和工程菌wp4-C23O在一定pH值内，随pH值升高对芘降解率增加，pH值大于7.5之后，两株菌株对芘降解率减小，最适pH值为7.5，在此值下菌株wp4和工程菌对芘降解率分别为71.42 %、82.87 %，降解率提高了11.45 %。
综合以上实验可知，本发明提供的工程菌wp4-C23O选用石油污染土壤中对PAHs降解优势菌株，构建的PAHs降解工程菌对环境适应能力较强；工程菌wp4-C23O菌株对芘的降价率显著高于菌株wp4，降解率提高11.45%，而且解决了遗传不稳定的问题；此外，本发明提供的工程菌wp4-C23O是将C23O基因插入到PAHs降解优势菌株基因组，不会出现基因转移现象，避免出现基因污染问题。
上述实施例仅仅是为清楚地说明本发明所作的举例，而并非对实施方式的限定。对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动。这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。而由此所延伸出的显而易见的变化或变动仍处于本发明的保护范围之中。

Claims (9)

1.一种多环芳烃降解工程菌wp4-C23O，其特征在于，所述的多环芳烃降解工程菌wp4-C23O的CGMCC保藏号为No. 15260。
2.如权利要求1所述的多环芳烃降解工程菌wp4-C23O，其特征在于，所述的多环芳烃降解工程菌wp4-C23O是由PCR扩增克隆假单胞菌（Pseudomonas sp. wp3-1）的邻苯二酚-2，3-双加氧酶（C23O）基因，连接于自杀性载体pUTmini-Tn5得到重组载体pUTmini-Tn5-C23O，通过三亲接合作用经mini-Tn5转座将重组载体pUTmini-Tn5-C23O中的C23O基因整合到菌株假单胞菌（Pseudomonas stutzeri wp4）的染色体DNA中获得。
3.一种多环芳烃降解工程菌wp4-C23O的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：
（1）本发明以Pseudomonas sp. wp3-1基因组为模板，用带有NotI酶切位点特异引物对C23O基因PCR扩增；
（2）将PCR产物和自杀性载体pUTmini-Tn5分别在37℃条件下经NotI酶消化4h，之后用上述处理的C23O基因和pUTmini-Tn5在16℃条件下酶连过夜；
（3）将连接液用热激转化到感受态细胞大肠杆菌(Escherichia coli)S17-1(λpir)中，然后涂布于选择培养基进行筛选，生长出的菌落即为供体菌S17-1(λpir）-pUTmini-Tn5-C23O；
（4）运用三亲接合转化方法将供体菌S17-1(λpir）-pUTmini-Tn5-C23O、辅助菌E .coliHB101(RK2013)、受体菌Pseudomonas sp. wp4按3：3：2比例混合，然后将混合液涂布于选择培养基上进行筛选，生长出的菌落即为工程菌wp4-C23O。
4.如权利要求3所述的多环芳烃降解工程菌wp4-C23O的构建方法，其特征在于，所述的PCR扩增的程序为：95℃ 3 min；94℃ 60s；56℃ 60 s；72 ℃ 90s；30个循环；72℃ 10min。
5.如权利要求3所述的多环芳烃降解工程菌wp4-C23O的构建方法，其特征在于，所述的供体菌S17-1(λpir）-pUTmini-Tn5-C23O的选择培养基为包括邻苯二酚100mg/L、卡那霉素50mg/L以及链霉素50mg/L的LB固体培养基。
6.如权利要求3所述的多环芳烃降解工程菌wp4-C23O的构建方法，其特征在于，所述的三亲接合转化方法为将供体菌S17-1(λpir）-pUTmini-Tn5-C23O、辅助菌E .coli HB101(RK2013)、受体菌Pseudomonas sp. wp4在含有相应抗生素LB液体培养基中培养8 h，然后将供体菌、辅助菌、受体菌按照3：3：2的比例混合，在30℃，10000r/min条件下离心3min，收集菌体，用无菌生理盐水洗涤三次除去抗生素，加入200µl无菌LB液体培养基悬重，点样于LB固体平板的细菌滤膜；在30 ℃培养过夜，次日将菌体从平板上洗下，用1 ml生理盐水悬重混合液，然后稀释不同浓度，涂布于选择性培养基平板上，进行阳性克隆筛选，阳性克隆即为工程菌wp4-C23O。
7.如权利要求3所述的多环芳烃降解工程菌wp4-C23O的构建方法，其特征在于，所述的工程菌wp4-C23O的选择培养基为包括邻苯二酚100 mg/L、卡那霉素50 ml/L和链霉素50ml/L的LB固体培养基。
8.一种多环芳烃降解工程菌wp4-C23O在降解多环芳烃中的应用。
9.如权利要求9所述的多环芳烃降解工程菌wp4-C23O在降解多环芳烃中的应用，其特征在于，所述的应用的温度为37 ℃，pH值为7.5。
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