CN110819562B - 强化构树修复锰污染土壤的皮氏罗尔斯顿菌hm8、复合菌剂及其制备方法与应用 - Google Patents

强化构树修复锰污染土壤的皮氏罗尔斯顿菌hm8、复合菌剂及其制备方法与应用 Download PDF

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Abstract

本发明涉及强化构树修复锰污染土壤的皮氏罗尔斯顿菌HM8、复合菌剂及其制备方法与应用，属于土壤治理技术领域。为解决现有植物原位修复治理锰污染土壤效果差的问题，本发明提供了一种强化构树修复锰污染土壤的皮氏罗尔斯顿菌HM8及复合菌剂，复合菌剂由皮氏罗尔斯顿菌HM8和蜡样芽胞杆菌HM5复配制得。本发明提供的皮氏罗尔斯顿菌HM8具有锰金属抗性和促生能力，能够强化构树的修复作用；与蜡样芽胞杆菌HM5复配后，两种菌相互协同、对锰污染环境的抵抗力和适应性更强。将本发明复合菌剂施加到构树根系土壤中，能够更加高效的在促进构树生长的同时富集根际土壤中的锰，达到快速治理锰污染土壤的效果。

Description

强化构树修复锰污染土壤的皮氏罗尔斯顿菌HM8、复合菌剂及 其制备方法与应用
技术领域
本发明属于土壤治理技术领域，尤其涉及强化构树修复锰污染土壤的皮氏罗尔斯顿菌 HM8、复合菌剂及其制备方法与应用。
背景技术
锰污染土壤会影响植物生长，过量的锰会降低植物光合作用、抑制蛋白的合成、影响植物根系的伸长而使植物的生长量减少，甚至出现植株死亡的现象。高浓度的锰会影响植物在土壤中养分的吸收，引起氧化损伤，破坏细胞结构和影响光合速率，使植物的矿物质吸收和细胞代谢受阻。
传统的锰污染土壤处理方法是化学和物理方法，这些方法对锰污染土壤的修复有一定的效果，然而它们存在成本高、适用面积小、易产生二次污染和影响土壤结构等问题。植物修复技术因为其成本低、环境友好且不引入二次污染而被广泛用于重金属污染土壤的治理之中。尽管与物理化学修复方法相比，植物修复于成本等方面具有优势，但是在实际应用中有诸多缺陷。例如，部分重金属超积累植物具有生长缓慢或生物量低等缺点，以至于修复周期长。此外，土壤中重金属的有效浓度也是限制植物恢复的重要因素。
构树为桑科(Moraceae)桑亚科(Moroideae)构树族(Broussonetieae)植物，主要分布与我国南北各地及东亚、东南亚、南亚北部等地。落叶乔木或灌木状，小枝密被灰色粗毛。叶宽卵形或长椭圆状卵形，先端尖，基部近心形、平截或圆，具粗锯齿，不裂至 5裂多型，上面粗糙，基出3脉。花雌雄异株，雄花序粗，花被4裂，雌花序头状。聚花果球形，熟时橙红色，肉质。花期4-5月，果期6-7月。构树具有易繁殖、生长快、分布广的特点。构树能抵抗干旱或盐碱环境的干扰和空气污染，在许多气候类型中生长良好，易成为污染地区的先锋物种，并被认为是重新造林的候选植物。
在寻找具有快速生长、生物量高和耐受高浓度重金属的候选修复植物的基础上，利用其它生物技术加强植物修复效果，同时开发有效的原位生物修复技术将更有利于污染环境的治理。近年来，植物-微生物联合修复重金属污染土壤已取得一定成果，但仍缺少能够在锰矿区或锰污染地区对乔木植物进行原位修复来治理锰污染土壤的有效方法。
发明内容
为解决现有植物原位修复治理锰污染土壤效果差的问题，本发明提供了强化构树修复锰污染土壤的皮氏罗尔斯顿菌HM8、复合菌剂及其制备方法与应用。
本发明的技术方案：
一株强化构树修复锰污染土壤的皮氏罗尔斯顿菌HM8，其分类命名为皮氏罗尔斯顿菌(Ralstonia pickettii)，已于2019年10月9日保藏于中国典型培养物保藏中心，地址为湖北省武汉市武昌区八一路299号武汉大学校内，保藏登记号为CCTCC NO:M 2019787。
进一步的，所述皮氏罗尔斯顿菌HM8的16S rDNA的核苷酸序列如SEQ ID No：1 所示。
一种强化构树修复锰污染土壤的复合菌剂，包括皮氏罗尔斯顿菌HM8(Ralstoniapickettii)和蜡样芽胞杆菌HM5(Bacillus cereus)，所述皮氏罗尔斯顿菌HM8已于2019 年10月9日保藏于中国典型培养物保藏中心，地址为湖北省武汉市武昌区八一路299号武汉大学校内，保藏登记号为CCTCC NO:M 2019787；所述蜡样芽胞杆菌HM5已于2019 年10月9日保藏于中国典型培养物保藏中心，地址为湖北省武汉市武昌区八一路299号武汉大学校内，保藏登记号为CCTCC NO:M 2019785。
进一步的，所述复合菌剂是由皮氏罗尔斯顿菌HM8的发酵液和蜡样芽胞杆菌HM5的发酵液混合制得的液体复合菌剂，或者由皮氏罗尔斯顿菌HM8的发酵液和蜡样芽胞杆菌HM5的发酵液与固定化载体混合制得的固体复合菌剂，其中皮氏罗尔斯顿菌HM8发酵液和蜡样芽胞杆菌HM5发酵液的OD600均为1.0～1.5。
进一步的，所述液体复合菌剂中皮氏罗尔斯顿菌HM8发酵液和蜡样芽胞杆菌HM5发酵液的体积比为1～10:1。
进一步的，所述固体复合菌剂中皮氏罗尔斯顿菌HM8发酵液、蜡样芽胞杆菌HM5 发酵液和固定化载体的体积质量比为1～10mL：1mL：20～200g。
进一步的，所述固定化载体为活性炭、沸石、硅藻土、高岭土或草炭中的一种或几种的组合。
本发明提供的强化构树修复锰污染土壤的复合菌剂的制备方法，使用无菌接种环挑取少量皮氏罗尔斯顿菌HM8和蜡样芽胞杆菌HM5分别接种至牛肉膏蛋白胨液体培养基中于一定温度下震荡培养，将培养所得皮氏罗尔斯顿菌HM8发酵液和蜡样芽胞杆菌HM5 发酵液混合即得到液体复合菌剂；或者将培养所得皮氏罗尔斯顿菌HM8发酵液和蜡样芽胞杆菌HM5发酵液与固定化载体混合即得到固体复合菌剂。
进一步的，所述震荡培养的温度为28～30℃，培养时间为48～56h，培养所得皮氏罗尔斯顿菌HM8发酵液和蜡样芽胞杆菌HM5发酵液的OD600均为1.0～1.5。
进一步的，所述液体复合菌剂中皮氏罗尔斯顿菌HM8发酵液和蜡样芽胞杆菌HM5发酵液的体积比为1～10:1。
进一步的，所述固体复合菌剂中皮氏罗尔斯顿菌HM8发酵液、蜡样芽胞杆菌HM5 发酵液和固定化载体的体积质量比为1～10mL：1mL：20～200g。
本发明提供的一株强化构树修复锰污染土壤的皮氏罗尔斯顿菌HM8在治理锰污染土壤中的应用。
本发明提供的一种强化构树修复锰污染土壤的复合菌剂在治理锰污染土壤中的应用。
进一步的，在锰污染地区土壤中种植构树并在其根系土壤中施加复合菌剂。
进一步的，所述锰污染地区包括锰污染地区周边土壤、锰矿区风化土和锰矿区锰矿渣，所述锰污染土壤中锰浓度为0-20000mg/kg。
进一步的，使用构树幼苗和构树种子对锰污染土壤进行原位修复，所述构树为野生构树或杂交构树，其中野生构树苗或构树种子以采自于矿区为宜，但不限于矿区。
进一步的，野生构树苗或购买的杂交构树苗均为经多次扦插培养后获得的长势一致的幼苗，在锰污染地区土壤中每隔3～5m定植一棵构树幼苗，在每棵构树根系施加20～50mL 的液体复合菌剂或50-200g固体复合菌剂。
进一步的，在锰污染地区土壤中，每隔3～5m挖一个10×10cm的土坑并在坑中播撒20～50颗构树种子，埋土后每个播种点施加20～50mL的液体复合菌剂或50-200g固体复合菌剂。
进一步的，在定植构树幼苗或种子之前在土壤中施加有机肥，在定植构树幼苗或种子之后，每隔1～2月可在构树根系施加有机肥。
进一步的，在定植构树幼苗或种子之后，每隔1～2月在构树周边除杂草。
本发明的有益效果：
本发明提供的皮氏罗尔斯顿菌HM8具有锰金属抗性和促生能力，能够强化构树的修复作用；将其与蜡样芽胞杆菌HM5复配，两种菌相互促进、相互补充，抗土传病害效果远大于单一菌种，对锰污染环境的抵抗力和适应性更强，更有利于增加土壤有机质和调节土壤中的生命活动，在降低锰毒性、改善构树生长和锰吸收过程中至关重要。
将皮氏罗尔斯顿菌HM8或复合菌剂施加到构树根系土壤中，一方面，菌株能够通过自身解毒功能降低土壤环境的金属毒性，即通过生物吸附、富集、转化和矿化作用将毒害性强的锰离子固定、转化为低毒或无毒状态，从而减小锰对植物生长的影响，改善土壤环境并提高金属有效性；另一方面，菌株通过分泌铁载体、有机酸和特定酶等有益物质，转化和溶解土壤中钾、氮和磷酸盐等矿物养分来降低污染物对植物的毒性，同时促进植物生长，从而提高植物对锰的耐受性和吸收量。
本发明提供的皮氏罗尔斯顿菌HM8及复合菌剂绿色环保、无二次污染，复合菌剂制备方法简单，成本低廉。将皮氏罗尔斯顿菌HM8或复合菌剂应用到构树原位修复治理锰污染土壤中，能够在促进构树生长的同时高效促进构树对锰的富集积累，从而减少土壤中的锰含量，实现锰污染土壤的高效治理。
附图说明
图1为皮氏罗尔斯顿菌HM8的扫描电镜图；
图2为蜡样芽胞杆菌HM5的扫描电镜图；
图3为皮氏罗尔斯顿菌HM8的发育树；
图4为蜡样芽胞杆菌HM5的发育树；
图5为实施例13和对比例3中定植的构树种植90天后的根系扫描图。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明的技术方案做进一步的说明，但并不局限于此，凡是对本发明技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的精神和范围，均应涵盖在本发明的保护范围中。
实施例1
采用平板稀释涂布法和平板划线法从湖南省湘潭市锰矿渣堆积废弃地(地处112°45′E～122°55′E，27°53′N～28°03′N)的土壤中分离纯化获得一株具有锰金属抗性的细菌，将其编号为HM8。对该菌株进行生理生化特性及分子生物学鉴定，结果如下：
(1)生理生化特性
从葡萄糖氧化发酵试验、V-P试验、过氧化氢酶试验、硫化氢试验、甲基红反应试验和明胶液化试验鉴定HM8的生理生化特性。
根据理化特性分析发现，HM8为短杆状、不显色、革兰氏阴性菌，在过氧化氢酶试验、V-P试验、葡萄糖氧化发酵试验中均呈阳性，在硫化氢试验中呈阴性，在甲基红反应试验和明胶液化试验中均呈阴性。
(2)分子生物学鉴定-16SrDNA序列测定及系统进化分析
用细菌基因组DNA提取试剂盒(天根生化科技有限公司，北京)提取菌株HM8的基因组DNA，以基因组DNA为模板，采用通用引物进行16S rDNAPCR扩增，利用胶回收试剂盒将含目的DNA片段的琼脂糖凝胶进行胶回收，将PCR回收后产物交由美吉生物(上海)进行测序，得到如SEQ ID No：1所示的16S rDNA的核苷酸序列；对HM8 的16S rDNA的核苷酸序列进行鉴定，将其提交到NCBI的GenBanK数据库中，用Blast 进行分析，并与已报道的序列进行同源性比对，构建得到如图3所示的系统发育树。HM8 与Ralstonia pickettii(NR 043152.1)具有99％的遗传相关性，且亲缘关系最为接近。因此，将菌株HM8鉴定为皮氏罗尔斯顿菌(Ralstonia pickettii)，并于2019年10月9日保藏于中国典型培养物保藏中心，地址为湖北省武汉市武昌区八一路299号武汉大学校内，保藏登记号为CCTCC NO:M 2019787。
实施例2
采用平板稀释涂布法和平板划线法从湖南省湘潭市锰矿渣堆积废弃地(地处112°45′E～122°55′E，27°53′N～28°03′N)的土壤中分离纯化获得一株具有锰金属抗性的细菌，将其编号为HM5。对该菌株进行生理生化特性及分子生物学鉴定，结果如下：
(1)生理生化特性
从葡萄糖氧化发酵试验、V-P试验、过氧化氢酶试验、硫化氢试验、甲基红反应试验和明胶液化试验鉴定HM5的生理生化特性。
根据理化特性分析发现，HM5为短杆状、不显色、革兰氏阳性菌，在过氧化氢酶试验、V-P试验、葡萄糖氧化发酵试验中均呈阳性，在硫化氢试验中呈阴性，在甲基红反应试验和明胶液化试验中均呈阳性。
(2)分子生物学鉴定-16SrDNA序列测定及系统进化分析
用细菌基因组DNA提取试剂盒(天根生化科技有限公司，北京)提取菌株HM5的基因组DNA，以基因组DNA为模板，采用通用引物进行16S rDNAPCR扩增，利用胶回收试剂盒将含目的DNA片段的琼脂糖凝胶进行胶回收，将PCR回收后产物交由美吉生物(上海)进行测序，得到如SEQ ID No：2所示的16S rDNA的核苷酸序列；对HM5 的16S rDNA的核苷酸序列进行鉴定，将其提交到NCBI的GenBanK数据库中，用Blast 进行分析，并与已报道的序列进行同源性比对，构建得到如图4所示的系统发育树。HM5 与Bacillus cereus NR114422.1具有99％的遗传相关性，且亲缘关系最为接近。因此，将菌株HM5鉴定为蜡样芽胞杆菌(Bacilluscereus)，并于2019年10月9日保藏于中国典型培养物保藏中心，地址为湖北省武汉市武昌区八一路299号武汉大学校内，保藏登记号为CCTCC NO:M 2019785。
实施例3
一种强化构树修复锰污染土壤的复合菌剂，是由皮氏罗尔斯顿菌HM8的发酵液和蜡样芽胞杆菌HM5的发酵液按体积比1:1混合制得的液体复合菌剂。
本实施例提供的复合菌剂的制备方法为：
使用无菌接种环挑取少量皮氏罗尔斯顿菌HM8和蜡样芽胞杆菌HM5分别接种至牛肉膏蛋白胨液体培养基中于30℃温度下震荡培养48h，待皮氏罗尔斯顿菌HM8发酵液和蜡样芽胞杆菌HM5发酵液的OD600均为1.0时，将培养所得皮氏罗尔斯顿菌HM8发酵液和蜡样芽胞杆菌HM5发酵液按体积比1:1混合即得到液体复合菌剂。
本实施例中牛肉膏蛋白胨培养基制备方法为：蛋白胨10g，牛肉膏3g，氯化钠5g，去离子水1L，pH 5.4-5.6，121℃灭菌30min。
实施例4
一种强化构树修复锰污染土壤的复合菌剂，是由皮氏罗尔斯顿菌HM8的发酵液和蜡样芽胞杆菌HM5的发酵液按体积比5:1混合制得的液体复合菌剂。
本实施例提供的复合菌剂的制备方法为：
使用无菌接种环挑取少量皮氏罗尔斯顿菌HM8和蜡样芽胞杆菌HM5分别接种至牛肉膏蛋白胨液体培养基中于29℃温度下震荡培养52h，待皮氏罗尔斯顿菌HM8发酵液和蜡样芽胞杆菌HM5发酵液的OD600均为1.2时，将培养所得皮氏罗尔斯顿菌HM8发酵液和蜡样芽胞杆菌HM5发酵液按体积比5:1混合即得到液体复合菌剂。
实施例5
一种强化构树修复锰污染土壤的复合菌剂，是由皮氏罗尔斯顿菌HM8的发酵液和蜡样芽胞杆菌HM5的发酵液按体积比10:1混合制得的液体复合菌剂。
本实施例提供的复合菌剂的制备方法为：
使用无菌接种环挑取少量皮氏罗尔斯顿菌HM8和蜡样芽胞杆菌HM5分别接种至牛肉膏蛋白胨液体培养基中于28℃温度下震荡培养56h，待皮氏罗尔斯顿菌HM8发酵液和蜡样芽胞杆菌HM5发酵液的OD600均为1.5时，将培养所得皮氏罗尔斯顿菌HM8发酵液和蜡样芽胞杆菌HM5发酵液按体积比10:1混合即得到液体复合菌剂。
实施例6
一种强化构树修复锰污染土壤的复合菌剂，是由皮氏罗尔斯顿菌HM8的发酵液和蜡样芽胞杆菌HM5的发酵液与活性炭按体积质量比为1mL：1mL：200g混合制得的固体复合菌剂。
本实施例提供的复合菌剂的制备方法为：
使用无菌接种环挑取少量皮氏罗尔斯顿菌HM8和蜡样芽胞杆菌HM5分别接种至牛肉膏蛋白胨液体培养基中于30℃温度下震荡培养48h，待皮氏罗尔斯顿菌HM8发酵液和蜡样芽胞杆菌HM5发酵液的OD600均为1.0时，将所得皮氏罗尔斯顿菌HM8发酵液和蜡样芽胞杆菌HM5发酵液与活性炭按体积质量比为1mL：1mL：200g混合即得到固体复合菌剂。
实施例7
一种强化构树修复锰污染土壤的复合菌剂，是由皮氏罗尔斯顿菌HM8的发酵液和蜡样芽胞杆菌HM5的发酵液与高岭土按体积质量比为4mL：1mL：100g混合制得的固体复合菌剂。
本实施例提供的复合菌剂的制备方法为：
使用无菌接种环挑取少量皮氏罗尔斯顿菌HM8和蜡样芽胞杆菌HM5分别接种至牛肉膏蛋白胨液体培养基中于29℃温度下震荡培养52h，待皮氏罗尔斯顿菌HM8发酵液和蜡样芽胞杆菌HM5发酵液的OD600均为1.2时，将所得皮氏罗尔斯顿菌HM8发酵液和蜡样芽胞杆菌HM5发酵液与高岭土按体积质量比为4mL：1mL：100g混合即得到固体复合菌剂。
实施例8
一种强化构树修复锰污染土壤的复合菌剂，是由皮氏罗尔斯顿菌HM8的发酵液和蜡样芽胞杆菌HM5的发酵液与硅藻土按体积质量比为8mL：1mL：150g混合制得的固体复合菌剂。
本实施例提供的复合菌剂的制备方法为：
使用无菌接种环挑取少量皮氏罗尔斯顿菌HM8和蜡样芽胞杆菌HM5分别接种至牛肉膏蛋白胨液体培养基中于28℃温度下震荡培养56h，待皮氏罗尔斯顿菌HM8发酵液和蜡样芽胞杆菌HM5发酵液的OD600均为1.5时，将所得皮氏罗尔斯顿菌HM8发酵液和蜡样芽胞杆菌HM5发酵液与硅藻土按体积质量比为8mL：1mL：150g混合即得到固体复合菌剂。
实施例9
本实施例应用皮氏罗尔斯顿菌HM8发酵液原位修复锰污染地区周边土壤。
本实施例锰污染地区位于湖南省湘潭市，土壤中锰含量为753.883±2.021mg/kg。
本实施例使用的野生构树苗采自于湖南湘潭锰矿区构树植株，经多次扦插培养后获得长势一致的幼苗，幼苗长约30cm。
本实施例具体修复方法为：
1、在锰污染地区周边供试土壤中施加40kg有机肥；
2、种植构树幼苗，每隔3～5m定植一棵构树幼苗，共定植10棵；
3、在每棵构树幼苗根系土壤中施加50mL实施例3所得皮氏罗尔斯顿菌HM8发酵液；
4、在定植构树之后，每月定时在构树根系施加有机肥并在构树周边清楚杂草。
本实施例施加的有机肥购自烟台雅苒化肥有限公司。
实施例10
本实施例应用实施例3制备的液体复合菌剂原位修复锰污染地区周边土壤。
本实施例锰污染地区位于湖南省湘潭市，土壤中锰含量为753.883±2.021mg/kg。
本实施例使用的野生构树苗采自于湖南湘潭锰矿区构树植株，经多次扦插培养后获得长势一致的幼苗，幼苗长约30cm。
本实施例具体修复方法为：
1、在锰污染地区周边供试土壤中施加40kg有机肥；
2、种植构树幼苗，每隔3～5m定植一棵构树幼苗，共定植10棵；
3、在每棵构树幼苗根系土壤中施加50mL实施例3制备的液体复合菌剂；
4、在定植构树之后，每月定时在构树根系施加有机肥并在构树周边清楚杂草。
本实施例施加的有机肥购自烟台雅苒化肥有限公司。
实施例11
本实施例应用实施例6制备的固体复合菌剂原位修复锰污染地区周边土壤。
本实施例锰污染地区位于湖南省湘潭市，土壤中锰含量为753.883±2.021mg/kg。
本实施例使用的野生构树苗采自于湖南湘潭锰矿区构树植株，经多次扦插培养后获得长势一致的幼苗，幼苗长约30cm。
本实施例具体修复方法为：
1、在锰污染地区周边供试土壤中施加40kg有机肥；
2、种植构树幼苗，每隔3～5m定植一棵构树幼苗，共定植10棵；
3、在每棵构树幼苗根系土壤中施加50g实施例6制备的固体复合菌剂；
4、在定植构树之后，每月定时在构树根系施加有机肥并在构树周边清楚杂草。
本实施例施加的有机肥购自烟台雅苒化肥有限公司。
实施例12
本实施例应用实施例3制备的液体复合菌剂原位修复锰矿区风化土土壤。
本实施例锰污染地区位于湖南省湘潭市，土壤中锰含量为8943.437±30.221mg/kg。
本实施例使用的野生构树苗采自于湖南湘潭锰矿区构树植株，经多次扦插培养后获得长势一致的幼苗，幼苗长约30cm。
本实施例具体修复方法为：
1、在锰矿区风化土供试土壤中施加40kg有机肥；
2、种植构树幼苗，每隔3～5m定植一棵构树幼苗，共定植10棵；
3、在每棵构树幼苗根系土壤中施加50mL实施例3制备的液体复合菌剂；
4、在定植构树之后，每月定时在构树根系施加有机肥并在构树周边清楚杂草。
本实施例施加的有机肥购自烟台雅苒化肥有限公司。
实施例13
本实施例应用实施例3制备的液体复合菌剂原位修复锰矿区锰矿渣土壤。
本实施例锰污染地区位于湖南省湘潭市，土壤中锰含量为15225.166±46.862mg/kg。
本实施例使用的野生构树苗采自于湖南湘潭锰矿区构树植株，经多次扦插培养后获得长势一致的幼苗，幼苗长约30cm。
本实施例具体修复方法为：
1、在锰矿区锰矿渣供试土壤中施加40kg有机肥；
2、种植构树幼苗，每隔3～5m定植一棵构树幼苗，共定植10棵；
3、在每棵构树幼苗根系土壤中施加50mL实施例3制备的液体复合菌剂；
4、在定植构树之后，每月定时在构树根系施加有机肥并在构树周边清楚杂草。
本实施例施加的有机肥购自烟台雅苒化肥有限公司。
实施例14
本实施例应用实施例3制备的液体复合菌剂原位修复锰污染地区周边土壤。
本实施例锰污染地区位于湖南省湘潭市，土壤中锰含量为753.883±2.021mg/kg。
本实施例使用的构树种子于每年8-11月采自湖南湘潭锰矿区构树植株。
本实施例具体修复方法为：
1、在锰污染地区周边供试土壤中施加40kg有机肥；
2、播撒构树种子，在锰污染地区周边土壤中，每隔3～5m挖10×10cm土坑后播撒20-30颗构树种子；
3、埋土后向每个播种点所处土壤中施加50mL实施例3制备的液体复合菌剂；
4、在定植构树之后，每月定时在构树根系施加有机肥并在构树周边清楚杂草。
本实施例施加的有机肥购自烟台雅苒化肥有限公司。
对比例1
本对比例在锰污染地区周边土壤中种植构树之后不施加菌剂作为空白对照。
本对比例使用的野生构树苗采自于湖南湘潭锰矿区构树植株，经多次扦插培养后获得长势一致的幼苗，幼苗长约30cm。
本实施例具体修复方法为：
1、在锰污染地区周边供试土壤中施加40kg有机肥；
2、种植构树幼苗，每隔3～5m定植一棵构树幼苗，共定植10棵；
3、在定植构树之后，每月定时在构树根系施加有机肥并在构树周边清楚杂草。
本对比例施加的有机肥购自烟台雅苒化肥有限公司。
对比例2
本对比例在锰矿区风化土土壤中种植构树之后不施加复合菌剂作为空白对照。
本对比例使用的野生构树苗采自于湖南湘潭锰矿区构树植株，经多次扦插培养后获得长势一致的幼苗，幼苗长约30cm。
本实施例具体修复方法为：
1、在锰矿区风化土供试土壤中施加40kg有机肥；
2、种植构树幼苗，每隔3～5m定植一棵构树幼苗，共定植10棵；
3、在定植构树之后，每月定时在构树根系施加有机肥并在构树周边清楚杂草。
本对比例施加的有机肥购自烟台雅苒化肥有限公司。
对比例3
本对比例在锰矿区锰矿渣中种植构树之后不施加复合菌剂作为空白对照。
本对比例使用的野生构树苗采自于湖南湘潭锰矿区构树植株，经多次扦插培养后获得长势一致的幼苗，幼苗长约30cm。
本实施例具体修复方法为：
1、在锰矿区锰矿渣供试土壤中施加40kg有机肥；
2、种植构树幼苗，每隔3～5m定植一棵构树幼苗，共定植10棵；
3、在定植构树之后，每月定时在构树根系施加有机肥并在构树周边清楚杂草。
本对比例施加的有机肥购自烟台雅苒化肥有限公司。
对比例4
本对比例应用蜡样芽胞杆菌HM5发酵液原位修复锰污染地区周边土壤。
本对比例使用的野生构树苗采自于湖南湘潭锰矿区构树植株，经多次扦插培养后获得长势一致的幼苗，幼苗长约30cm。
本实施例具体修复方法为：
1、在锰污染地区周边供试土壤中施加40kg有机肥；
2、种植构树幼苗，每隔3～5m定植一棵构树幼苗，共定植10棵；
3、在构树幼苗根系土壤中施加50mL实施例3所得蜡样芽胞杆菌HM5发酵液；
4、在定植构树之后，每月定时在构树根系施加有机肥并在构树周边清楚杂草。
对比例5
本对比例在锰污染地区周边土壤中种植构树种子之后不施加复合菌剂作为空白对照。
本对比例使用的构树种子于每年8-11月采自湖南湘潭锰矿区构树植株。
本实施例具体修复方法为：
1、在锰污染地区周边供试土壤中施加40kg有机肥；
2、播撒构树种子，在锰污染地区周边土壤中，每隔3～5m挖10×10cm土坑后播撒20-30颗构树种子；
3、在定植构树之后，每月定时在构树根系施加有机肥并在构树周边清楚杂草。
在实施例9-13和对比例1-4种植构树90天后，收获植物，测量植物总生物重以及根、茎、叶中的锰吸收量结果如表1所示；土壤锰含量、构树转移系数和富集系数结果如表2所示；供试土壤中有效磷和有机质含量如表3所示。
富集系数＝植物体内重金属浓度/土壤中重金属浓度；
转移系数＝地上部分(茎和叶)的重金属浓度/地下部分(根)的重金属浓度。
表1
Figure RE-GDA0002326108540000111
由表1数据对比可知，在3种锰污染土壤中，构树根际土壤施加菌剂后，构树生物量均大于未施加菌剂的对照组，而且施加本发明提供的复合菌剂的构树生物量大于仅施加单一皮氏罗尔斯顿菌HM8发酵液或蜡样芽胞杆菌HM5发酵液的对照组，这说明皮氏罗尔斯顿菌HM8和蜡样芽胞杆菌HM5均具有促生作用，而且两者复配后能够进一步促进构树在锰污染土壤中的生长。
图5为实施例13和对比例3中定植的构树种植90天后的根系扫描图。由图3的对比也可以明显看出，施加复合菌剂之后构树的根系明显发育的更好，从而证明复合菌剂对锰污染土壤中的构树生长具有促生作用。
表2
处理组 土壤锰含量mg/kg 富集系数 转移系数
锰污染地区周边土壤 753.883±2.021 - -
对比例1 747.333±18.175 1.118±0.287 0.0961±0.021
实施例10 739.333±10.774 2.128±0.550 0.111±0.016
实施例11 720.779±13.127 2.353±0.387 0.132±0.021
锰矿区风化土 8943.437±30.221 - -
对比例2 8910.778±27.662 1.142±0.477 0.016±0.002
实施例12 8892.892±34.521 1.777±0.98 0.017±0.003
锰矿渣 15225.166±46.862 - -
对比例3 15169.667±53.353 2.551±0.420 0.036±0.003
实施例13 15102.833±60.002 3.016±0.761 0.039±0.004
实施例9 740.166±30.376 1.877±0.034 0.104±0.017
对比例4 741.333±12.174 1.868±0.006 0.101±0.020
在锰吸收方面，由表1数据对比可知在所有锰污染土壤处理组中，施加菌剂后构树根部的锰含量都要低于各自的对照组，茎和叶的锰含量都高于对照组。同时表2数据显示，在锰污染处理土壤中，构树根际土壤施加复合菌剂后，其转移系数和富集系数均大于未施加复合菌剂或仅施加单一皮氏罗尔斯顿菌HM8发酵液或蜡样芽胞杆菌HM5发酵液的对照组，说明复合菌剂具有促进构树植株从土壤中富集锰的能力，同时增强了构树从地下部分向地上部分的转移锰的能力，最终达到了修复锰污染土壤的目的。
表3
处理组 有效磷(g/kg) 有机碳(g/kg)
对比例1 0.4551±0.0753 66.8943±0.2819
实施例10 0.5257±0.0471 68.3088±0.0650
实施例11 0.5564±0.0342 69.0054±0.2133
对比例2 0.3627±0.0249 66.8818±0.1721
实施例12 0.4170±0.1141 67.8206±0.0650
对比例3 0.1779±0.0249 27.6890±1.5503
实施例13 0.3192±0.0815 29.3414±0.9737
实施例9 0.5003±0.0431 67.8976±0.6135
对比例4 0.5094±0.0188 68.0334±0.1775
在土壤成分变化方面，不同锰污染土壤施加复合菌剂后构树根系土壤的有效磷和有机碳均大于未施加复合菌剂或仅施加单一皮氏罗尔斯顿菌HM8发酵液或蜡样芽胞杆菌HM5发酵液的对照组，说明复合菌剂改善了构树根际土壤的环境，在种植构树3个月之间内实现了对锰污染土壤的修复。
采用实施例14和对比例5相同的方法在锰污染土壤中种植构树，180天后收获植物，测量植物总生物重以及根、茎、叶的生物量如表4所示；根、茎、叶的锰吸收量、土壤锰含量、构树转移系数和富集系数结果如表5所示。
表4
处理组 根(g,DW) 茎(g,DW) 叶(g,DW) 总生物量(g,DW)
对比例1 0.32±0.04 0.46±0.04 0.55±0.01 1.33±0.03
实施例13 0.28±0.02 0.41±0.04 0.49±0.04 1.18±0.05
表5
指标 对比例1 实施例13
根的锰含量(mg/kg) 39.63±3.19 49.13±3.75
茎的锰含量(mg/kg) 28.81±1.15 45.94±0.90
叶的锰含量(mg/kg) 57.81±3.19 70.00±4.90
修复后土壤锰含量(mg/kg) 743.12±21.22 732.56±18.65
富集系数 0.16±0.012 0.20±0.054
转移系数 0.64±0.21 0.69±0.34
由表4、5数据可知，构树种子在接种了混合菌剂后萌发，180d后其生物量要大于未施加复合菌剂的构树种子组，说明该复合菌剂促进了种子萌发后的构树幼苗的生长。在锰含量方面，施加了复合菌剂的构树种子组各部位的锰含量都高于未施加复合菌剂组的，说明该复合菌剂促进了萌发后的构树幼苗各部位对锰的积累，转移系数和富集系数也表明，施加复合菌剂促进了种子萌发后的构树幼苗对土壤中锰的积累和向地上部分的转移能力。
SEQUENCE LISTING
<110> 中南林业科技大学 湖南复生环境科技有限公司
<120> 强化构树修复锰污染土壤的皮氏罗尔斯顿菌HM8、复合菌剂及其制备方法与应用
<130> 1
<160> 2
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 1429
<212> DNA
<213> 皮氏罗尔斯顿菌HM8（Ralstonia pickettii）
<400> 1
gttggcgtag ctaccatgca gtcgacggca gcatgatcta gcttgctaga ttgatggcga 60
gtggcgaacg ggtgagtaat acatcggaac gtgccctgta gtgggggata actagtcgaa 120
agattagcta ataccgcata cgacctgagg gtgaaagtgg gggaccgcaa ggcctcatgc 180
tataggagcg gccgatgtct gattagctag ttggtgaggt aaaggctcac caaggcgacg 240
atcagtagct ggtctgagag gacgatcagc cacactggga ctgagacacg gcccagactc 300
ctacgggagg cagcagtggg gaattttgga caatgggcga aagcctgatc cagcaatgcc 360
gcgtgtgtga agaaggcctt cgggttgtaa agcacttttg tccggaaaga aatggctctg 420
gttaatacct ggggtcgatg acggtaccgg aagaataagg accggctaac tacgtgccag 480
cagccgcggt aatacgtagg gtccaagcgt taatcggaat tactgggcgt aaagcgtgcg 540
caggcggttg tgcaagaccg atgtgaaatc cccgagctta acttgggaat tgcattggtg 600
actgcacggc tagagtgtgt cagagggggg gtagaattcc cggtgtagca gtgaaatgcg 660
tagagatgtg gaggaatacc gatggcgaag gcagccccct gggataacac tgacgctcat 720
gcacgaaagc gtggggagca aacaggatta gataccctgg tagtccacgc cctaaacgat 780
gtcaactagt tgttggggat tcatttcctt agtaacgtag ctaacgcgtg aagttgaccg 840
cctggggagt acggtcgcaa gattaaaact caaaggaatt gacggggacc cgcacaagcg 900
gtggatgatg tggattaatt cgatgcaacg cgaaaaaacc ttaccctacc cttgacatgc 960
cactaacgaa gcagagatgc attaggtgct cgaaagagaa agtggacaca ggtgctgcat 1020
ggctgtcgtc agctcgtgtc gtgagatgtt gggttaagtc ccgcaacgag cgcaaccctt 1080
gtctctagtt gctacgaaag ggcactctag agagactgcc ggtgacaaac cggaggaagg 1140
tggggatgac gtcaagtcct catggccctt atgggtaggg cttcacacgt catacaatgg 1200
tgcatacaga gggttgccaa gccgcgaggt ggagctaatc ccagaaaatg catcgtagtc 1260
cggatcgtag tctgcaactc gactacgtga agctggaatc gctagtaatc gcggatcagc 1320
atgccgcggt gaatacgttc ccgggtcttg tacacaccgc ccgtcacacc atgggagtgg 1380
gctttaccag aagtagttag cctaaccgca aggagggcga tacccgtgt 1429
<210> 2
<211> 1447
<212> DNA
<213> 蜡样芽胞杆菌HM5（Bacillus cereus）
<400> 2
gcggggggtg catacatgca gtcgagcgaa tggattaaga gcttgctctt atgaagttag 60
cggcggacgg gtgagtaaca cgtgggtaac ctgcccataa gactgggata actccgggaa 120
accggggcta ataccggata acattttgaa ccgcatggtt cgaaattgaa aggcggcttc 180
ggctgtcact tatggatgga cccgcgtcgc attagctagt tggtgaggta acggctcacc 240
aaggcaacga tgcgtagccg acctgagagg gtgatcggcc acactgggac tgagacacgg 300
cccagactcc tacgggaggc agcagtaggg aatcttccgc aatggacgaa agtctgacgg 360
agcaacgccg cgtgagtgat gaaggctttc gggtcgtaaa actctgttgt tagggaagaa 420
caagtgctag ttgaataagc tggcaccttg acggtaccta accagaaagc cacggctaac 480
tacgtgccag cagccgcggt aatacgtagg tggcaagcgt tatccggaat tattgggcgt 540
aaagcgcgcg caggtggttt cttaagtctg atgtgaaagc ccacggctca accgtggagg 600
gtcattggaa actgggagac ttgagtgcag aagaggaaag tggaattcca tgtgtagcgg 660
tgaaatgcgt agagatatgg aggaacacca gtggcgaagg cgactttctg gtctgtaact 720
gacactgagg cgcgaaagcg tggggagcaa acaggattag ataccctggt agtccacgcc 780
gtaaacgatg agtgctaagt gttagagggt ttccgccctt tagtgctgaa gttaacgcat 840
taagcactcc gcctggggag tacggccgca aggctgaaac tcaaaggaat tgacgggggc 900
ccgcacaagc ggtggagcat gtggtttaat tcgaagcaac gcgaagaacc ttaccaggtc 960
ttgacatcct ctgaaaaccc tagagatagg gcttctcctt cgggagcaga gtgacaggtg 1020
gtgcatggtt gtcgtcagct cgtgtcgtga gatgttgggt taagtcccgc aacgagcgca 1080
acccttgatc ttagttgcca tcattaagtt gggcactcta aggtgactgc cggtgacaaa 1140
ccggaggaag gtggggatga cgtcaaatca tcatgcccct tatgacctgg gctacacacg 1200
tgctacaatg gacggtacaa agagctgcaa gaccgcgagg tggagctaat ctcataaaac 1260
cgttctcagt tcggattgta ggctgcaact cgcctacatg aagctggaat cgctagtaat 1320
cgcggatcag catgccgcgg tgaatacgtt cccgggcctt gtacacaccg cccgtcacac 1380
cacgagagtt tgtaacaccc gaagtcggtg gggtaacctt ttggagccag ccgcctaagt 1440
gcaaagg 1447

Claims (10)

1.一株强化构树修复锰污染土壤的皮氏罗尔斯顿菌HM8，其分类命名为皮氏罗尔斯顿菌(Ralstoniapickettii)，已于2019年10月9日保藏于中国典型培养物保藏中心，地址为湖北省武汉市武昌区八一路299号武汉大学校内，保藏登记号为CCTCC NO:M 2019787。
2.一种强化构树修复锰污染土壤的复合菌剂，其特征在于，包括皮氏罗尔斯顿菌HM8(Ralstoniapickettii)和蜡样芽胞杆菌HM5(Bacillus cereus)，所述皮氏罗尔斯顿菌HM8已于2019年10月9日保藏于中国典型培养物保藏中心，地址为湖北省武汉市武昌区八一路299号武汉大学校内，保藏登记号为CCTCC NO:M 2019787；所述蜡样芽胞杆菌HM5已于2019年10月9日保藏于中国典型培养物保藏中心，地址为湖北省武汉市武昌区八一路299号武汉大学校内，保藏登记号为CCTCC NO:M 2019785。
3.根据权利要求2所述一种强化构树修复锰污染土壤的复合菌剂，其特征在于，所述复合菌剂是由皮氏罗尔斯顿菌HM8的发酵液和蜡样芽胞杆菌HM5的发酵液混合制得的液体复合菌剂，或者由皮氏罗尔斯顿菌HM8的发酵液和蜡样芽胞杆菌HM5的发酵液与固定化载体混合制得的固体复合菌剂，其中皮氏罗尔斯顿菌HM8发酵液和蜡样芽胞杆菌HM5发酵液的OD600均为1.0～1.5。
4.根据权利要求3所述一种强化构树修复锰污染土壤的复合菌剂，其特征在于，所述液体复合菌剂中皮氏罗尔斯顿菌HM8发酵液和蜡样芽胞杆菌HM5发酵液的体积比为1～10:1。
5.根据权利要求3所述一种强化构树修复锰污染土壤的复合菌剂，其特征在于，所述固体复合菌剂中皮氏罗尔斯顿菌HM8发酵液、蜡样芽胞杆菌HM5发酵液和固定化载体的体积质量比为1～10mL：1mL：20～200g。
6.一种如权利要求2所述强化构树修复锰污染土壤的复合菌剂的制备方法，其特征在于，将皮氏罗尔斯顿菌HM8和蜡样芽胞杆菌HM5分别接种至液体培养基中于一定温度下震荡培养，将培养所得皮氏罗尔斯顿菌HM8发酵液和蜡样芽胞杆菌HM5发酵液混合即得到液体复合菌剂；或者将培养所得皮氏罗尔斯顿菌HM8发酵液和蜡样芽胞杆菌HM5发酵液与固定化载体混合即得到固体复合菌剂。
7.根据权利要求6所述一种强化构树修复锰污染土壤的复合菌剂的制备方法，其特征在于，所述震荡培养的温度为28～30℃，培养时间为48～56h，培养所得皮氏罗尔斯顿菌HM8发酵液和蜡样芽胞杆菌HM5发酵液的OD600均为1.0～1.5。
8.如权利要求1所述一株强化构树修复锰污染土壤的皮氏罗尔斯顿菌HM8在治理锰污染土壤中的应用。
9.一种如权利要求2-5任一所述强化构树修复锰污染土壤的复合菌剂在治理锰污染土壤中的应用。
10.根据权利要求9所述一种强化构树修复锰污染土壤的复合菌剂在治理锰污染土壤中的应用，包括在锰污染地区土壤中种植构树并在其根系土壤中施加复合菌剂。
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Biosorption characteristics of a highly Mn(II)- resistant Ralstonia pickettii strain isolated from Mn ore;黄慧敏等;《PLOS ONE》;20180831;全文 *
Biosorption Characteristics of Mn (II) by Bacillus cereus Strain HM-5 Isolated from Soil Contaminated by Manganese Ore;Xu Zhenggang等;《Pol.J.Environ.Stud.》;20180831;全文 *

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