CN1656228A - 用于植物的报告系统 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种在存在外部刺激物，例如污染物的情况下，能够在植物中产生直接可监测的表型性状的报告系统。该报告系统还任选具有修复土壤的能力。本发明还涉及含有该报告系统以及任选具有修复能力的遗传修饰的植物，利用该遗传修饰的植物检测土壤污染以及任选对土壤进行生物修复的方法，以及遗传修饰的植物在监测土壤污染以及任选对土壤进行生物修复中的应用。

Description

用于植物的报告系统
发明领域
本发明涉及一种在存在外部刺激物例如污染物的情况下，能够在植物中产生直接可监测的表型性状的报告系统，此外还包括当存在于该植物中时可用于土壤的生物修复的系统。本发明还涉及含有该报告系统以及任选该生物修复系统的遗传修饰的植物，利用该遗传修饰的植物检测土壤污染以及任选对土壤进行生物修复的方法，以及遗传修饰的植物在生物检测土壤污染以及任选对土壤进行生物修复中的应用。
发明背景
土壤污染可能对环境以及人类和动物的健康产生严重的不利影响。污染是工业、农业和其他人类活动的结果，并提出了严重的、不断增长的问题。例如，在丹麦，丹麦环境部估计在1995年丹麦被工业污染的地点的数目是14000个(Miljtilstandsrapport 1997)。污染可以包括大量的化学物质，其性质既可以是无机的，也可以是有机的。
无机污染物可以是例如重金属。它们可以在不同类型的土壤中以多种浓度被发现，并且不象有机污染物，它们不能被化学转化或被微生物生物降解(Zhu等，1999)。某些重金属例如铜(Cu)和锌(Zn)在痕量时在酶的稳态中作为辅助因子具有重要结构功能，但是当过量时这些重金属，以及非必需的金属例如镉(Cd)、汞(Hg)和铅(Pb)是有毒的。有许多人类疾病已经被牵涉与重金属的摄取有关，例如Cd已经被显示增加了癌症的发病率。
在土壤中也发现了大量的有机污染物。例如含有硝基官能团的异生化合物，它们被用来生产农业化学物质、药物、染料和塑料(Gorantzy等1994，Spain等1995，White & Snape 1993)。这样的化合物也被用于开矿、种植业，它们是军火例如地雷的主要成分。最常见的残留物包括2，4，6-三硝基甲苯(TNT)、六氢-1，3，5-三硝基-1，3，5-三氮杂苯(RDX)、八氢-1，3，5，7-四硝基-1，3，5，7-tetrazocine(HMX)，以及相关的杂质和环境转化产物。这些化合物污染了它们的生产、储存和军事安装地点(Sheng等1998，Taha等1997)。此外，据估计大约有90％现在使用的地雷正在泄露(Boline 1999)，导致TNT扩散到土壤中。不象其他许多污染物那样，这些污染物中有一些对土壤的亲和性很小，它们快速迁移污染了地下水。这是值得关注的，因为已经观察到高水平的TNT具有抑制生物活性的潜力(Gong等1999)。除了污染物本身的直接结果之外，这种类型的污染物可以作为爆炸物存在的指示。因为地雷在以前的战争地区，特别是世界上遥远和贫困的部分正在使人们丧生和致残，了解它们的存身之处将是非常有价值的。
检测
在处理土壤污染时首先需要的是检测污染地点的能力。为了便于广泛的使用，需要实用和相对廉价的检测系统。现有的检测方法可以检测污染物，但是这些方法既不方便又花费高。
当参照与土壤样品相关的信息时，每个观察都与一个特定的地点和时间相关。因此除非测量的地点和/或时间是已知的并在分析中作出说明，否则了解一个属性值，例如污染物的浓度几乎是没用的。获得合算的、准确的地点特征的关键是有待收集的样品的数量、位置和类型。当样品不能准确地代表模型计划所希望它代表的区域时就发生了地点特征的错误。当污染物非均质地分布于土壤中，例如在爆炸物污染时发生的那样，这特别是一个难题。
因此，由于需要大量的样品来有效评估一个地点，被污染土壤的表征可能是昂贵的和耗时的。现有的评估环境样品的实验室方法提供了高的灵敏度和评估多种化学物质的能力，但是与这些方法相伴的时间和花费经常限制了它们的效力。因此，对许多应用来说，需要一种经济可行的、实时的、原位的对污染土壤进行作图的系统。
现在使用的用来检测重金属的技术是在激光诱导的击穿光谱(Laser Induced Breakdown Spectroscopy)(LIBS)中的原位土壤污染传感器(Cremers等2001)。
被爆炸物污染的土壤的检测通常是通过收集样品，将它们在实验室中使用各种技术，例如酶法免疫分析和高效液相色谱来进行的(Hass等1995)。
地雷的检测通常是通过使用金属探测器、狗或人工对所关注的区域进行扫描来完成的。在军事排雷中目的是使用强力尽可能快地清除雷场，在通常情况下清除率80-90％是可以接受的。另一方面，人道主义排雷更困难和危险，它需要完全排除所有的地雷，以使被清除的雷场回归正常的使用。今天，大多数人道主义排雷是使用手持金属探测器来进行的，它利用一个随时间变化的电磁场在物体中诱导涡流电流、该电流反过来又产生了一个可检测的磁场，从而发现含有金属的物体。老式地雷含有金属部件(例如撞针)，但是现代地雷只含有非常少量的金属，或完全不含金属。探测器探测少量金属的灵敏度的提高也使得它对于金属碎片非常敏感，而这些金属碎片在地雷埋放的区域是常见的。此外，金属探测器不论多么精密也只能成功地发现地里的异常现象，而不能提供爆炸物是否存在的信息。在人道主义排雷中一个主要的难题是区分“虚设”物和地雷。鉴定和排除一个无害的物体是耗时费钱的过程。狗具有极其发达的嗅觉系统，可以被训练来检测痕量的爆炸物。但是这种技术需要对狗及其操作者进行大量的训练，此外狗有限的注意广度使得难以维持连续的操作。作为现有方法的补充出现了很多地雷检测技术。它们包括穿地雷达(GPR)、红外热成像和高级金属探测器。这些技术的共同特点是它们检测到地中的“异常情况”，但是不能指出是否存在爆炸物。GPR系统工作的基本原理是通过宽带天线向地里发射短的电磁脉冲。然后测量从地的反射以形成一个矢量。天线的移动使得可以通过并排地显示连续的矢量来构建图象。为了获得良好的空间分辨率需要高的频率，但是电场的穿透深度与频率成反比，太高的频率在几厘米以下就无用了。因此频率范围的选择是分辨率和穿透深度的折衷(Borgwardt，C 1995)。尽管检测器可以被调节到足够检测现代地雷中少量金属的灵敏度，这在实践中是不可行的，因为它也导致检测到更小的碎片和增加错误报警率。现有唯一的替换方法是使用刚性的金属棍以浅的角度插入土中以确定物体的形状；这实际上是一种危险的操作。
植物以前已经被用来指示田地中被分析物的存在。这样的应用通常是基于天然存在的植物生命对分析物的存在进行粗略的指示。例如“指示”植物已经长期被用来定位含有有利可图的矿藏潜力的地点，因为土地中金属的存在对植物的生长有影响。主要基于某些天然存在的植物种类的出现/缺乏，以及对从植物物种中收集的已知能够天然积累金属的组织的分析，可以为采矿地质学家提供在地里是否存在高含量的某些金属的信息(Raines和Canney 1980)。但是，在田地中使用被加工过的能够给出更特异和敏感的反应的指示植物，例如以遗传修饰的植物的形式，还没有被描述过。
在实验室中多年来已经使用报告系统对分析物进行检测和可能的定量。这种精巧的实验室报告系统的构建通常涉及遗传工程。遗传修饰的植物系统也已经被用来研究植物基因和来自动物、微生物等的基因的表达，这通常使用了报告基因。报告基因一般编码具有容易分析的活性的酶，它被用来报告目的基因的转录活性。使用重组DNA方法，将报告基因自身的启动子去掉并用被研究的基因的启动子代替。将新的嵌合基因导入生物体中，通过分析报告基因产物来检测目的基因的表达。报告基因使得对其产物是未知的或不容易鉴定的基因的表达的研究得以进行。为了确定环境或发育调控的基因的表达类型，将报告基因置于显示出所需的发育和/或压力反应的启动子的转录调控之下。在细菌中，编码β-半乳糖苷酶的lacZ基因可以在天然的lac-或由突变造成的lac-细菌中用作报告基因。该基因也可用于许多动物系统中。其它在没有内源基因存在的动物和细菌中常用的报告基因系统包括cat(编码氯霉素乙酰转移酶)、fus(编码水母绿色荧光蛋白)和lux(编码萤火虫荧光素酶)。因为植物含有内源的lacZ，它对于植物来说一般不是有用的报告基因。在植物中广泛使用的报告基因是uidA或gusA基因，它编码β-葡萄糖醛酸酶(GUS)(Kerbundit等，1991)。该酶可以水解生色的β-D-葡萄糖醛酸底物X-gluc(5-溴-4-氯-3-吲哚基)，导致在那些显示GUS活性的植物细胞中产生不可溶的蓝色。植物细胞本身不含有GUS活性，因此当用X-gluc在特定的细胞中染色时产生蓝色表明了在该特定细胞中驱动gusA-嵌合基因转录的启动子的活性。带有这样的报告基因的植物原则上能够用来检测土壤的污染，但是这样的应用还没有被描述过。其可能的解释是，报告系统通常需要采集大量的样品，同时还需要经过高度训练的人员来执行分析，包括精密的仪器和使用昂贵的化学试剂。出于检测土壤污染的实用的目的，传统的报告系统因而是不可行的。
环境修复
在对付土壤污染中另一个需要是除去它的能力。这一般是通过简单地除去污染的土壤或通过对污染物进行化学或生物降解以修复土壤来完成。
在处理无机污染物例如重金属时需要物理地除去金属，因为大多数这些金属不能在土壤中降解。因此现有的对这样的地点清除污染的实用方法包括物理挖掘表层土，运送并重新掩埋到别处。此外，在现今的市场上还有多种土壤修复技术，但是只有几种可用于重金属的修复。一些更常用的修复技术是掩埋处理、化学或物理固定和处理、电再生、生物排泄和土壤清洗。
植物修复是使用绿色植物除去、容纳环境污染物例如重金属、微量元素、有机化合物和放射性化合物或将其变为无害的环境污染物。这种低技术、低成本的清除技术可以用于污染的土壤、地下水和废水。与常规的修复技术相比，植物修复更便宜、更容易和环境友好。使用传统的工程方法清理金属污染的地点需要大量的金钱。此外，传统的方法破坏了土壤的结构，使其失去了生物活性。使用绿色植物去除土壤中的重金属污染，这被称为植物修复，是一种正在兴起的技术，它提供了原位、低成本和环境可持续性的优点。植物修复的另一个优点是不用将污染的土壤移走以及回填泥土来代替，这种清理工作不会扰乱该地点。当重金属积累到植物组织中后，枝条可以被收割并焚烧。如果经济上可行，包含在灰中的金属可以回收。不然的话，灰可以在适当的添埋场处理。与植物修复有关的花费依赖于多种因素，包括土壤的密度、污染地点的面积、运输和添埋费用。在植物修复中使用的设备与普通农业实践中使用的相同。在某些情况下，植物修复的费用可等同于当地种植庄稼的费用。植物修复也不需要移除大量的土壤。实际上不需要移除土壤，只需要移除植物。处理的重量从例如在10英亩的地点上用提取的方法有30000吨减少到不足5％，或1400吨。与提取方法相比有极大的节约。10英亩地点的样本用传统的提取方法可能花费3.5-4.5百万美元，而使用植物修复，同样的地点将只花费1.0-1.2百万美元。一般来说在常规方法的基础上平均节约75-85％。除了经济利益之外，植物修复比传统的方法造成的环境破坏更小，因为没有移除土壤，并且金属可以从植物残渣中回收。使用植物修复可解决的其它难题包括废水处理厂。废水处理厂面对的难题是在生活废水中可能存在多种多样的有毒污染物，包括重金属。因为这些重金属既不能被生物处理降解也不能变为无害，它们可能被排放到接收的湖或海中。
植物摄取金属的知识已经存在了相当长的时间，但是将这些知识应用于植物修复相对较新。
Rugh等(1996)描述了使用遗传工程改良植物，增强了它除去金属有毒物质例如汞的能力，其中将细菌基因插入到通常被认为是杂草的植物中。
WO9922885涉及一种修复被金属离子污染的土壤的方法，包括利用天竺葵属植物在它们的根和枝条中过量积累金属离子。该专利中也提到了使用转化有可增强植物摄取金属能力的基因序列，例如重组的金属硫蛋白基因，或植物螯合肽基因，或与这些基因具有同样生物学功能的基因的天竺葵属植物。
生物修复现在正被用于处理城市污水、清理石油溢出、修复由于地下水储存泄露而被污染的地下水、处理工业废水和改造各种危险废物地点。
生物修复的例子包括将废水淤泥用作肥料浇灌耕地(Hesselsoe等2001)。遗传工程允许将微生物的酶活性导入植物。其中一个例子是镇草宁(Glyphosate)或混合型芽前除草剂(Roundup)(R)，它是最广泛使用的除草剂，用于广谱控制杂草。镇草宁抑制5-烯醇丙酮莽草酸-3-磷酸合成酶(EPSPS)，这是在微生物和植物中芳香族氨基酸生物合成途径中的一个关键酶(He等2001)。与相容的相互作用相比，在不相容的植物：微生物病源菌相互作用中宿主基因表达的形式有显著的区别，与精心构造的可诱导的防御有关。在转基因植物中组成型表达编码几丁质酶或核糖体失活蛋白的基因，产生了抵抗真菌攻击的部分保护作用(Lamb等1992)。两个细菌抗生素抗性基因，一个编码来自Tn903的新霉素磷酸转移酶(NPT I)，另一个编码来自Tn9的氯霉素乙酰转移酶，被用作植物的选择性标记。两个基因都以新的植物表达载体形式被导入烟草的基因组中(Pietrzak等1986)。
但是，不论对于无机还是有机污染物来说，使用植物修复的先决条件通常是污染的地点是已知的，而修复过程的监控是通过使用传统方法来进行的。通过使用一种组合的植物检测和生物修复系统，有可能一步鉴定污染地点并进行生物修复。这种组合系统以前还没有描述过。
从上面的描述可以看出，本发明的目的是提供一种可用于植物的报告系统以检测分析物，例如存在于土壤中的某种形式的污染，该报告系统是：
●特异的和灵敏的
●可直接监控的，不需要实验室设备和实验室人员
●可用于野外，因此便于大面积的监控，避免了采样的问题
●相对廉价
发明简述
本发明提供了一种在存在外部刺激物的情况下，能够在植物中产生直接可监测的表型性状的报告系统，包含了一种基因，该基因编码的产物参与了对所述该外部刺激物的存在作出反应从而发展出所述直接可监测的表型性状的过程。本发明还提供了一种报告系统，其中植物中直接可监测的表型性状是该基因的表达被改变的结果。
根据本发明的一个方面，外部刺激物是存在于植物所生长的土壤中的污染物。
根据本发明的另一个方面，报告系统还包括土壤生物修复系统。
在本发明的另一个方面中，提供了带有本发明的报告系统的植物。
在本发明的另一个方面中，提供了生物检测的方法，包括下列步骤：
●从本发明的植物导入种子
●监控获得的植物的表型，以及任选地
●如果植物积累了污染物，通过移除植物对土壤进行生物修复
在本发明的另一个方面中，提供了本发明的植物在检测污染物和任选用于生物修复中的应用。
本发明将在下面进行更详细的描述。
发明详述
本发明提供了一种新型的植物报告系统。该报告系统的基本成分是不属于天然植物基因组的一部分的基因，即是来源不同的基因，或来自植物基因组的基因，其中编码序列、拷贝数、在基因组中的位置或表达已经被改变而不同于在该植物中的天然状态，而它编码的产物参与了在存在外部刺激物的情况下表型性状的发展。基本特征是该表型性状可以被直接监控，即在野外不需要取样和进行复杂的实验室类型的分析。本发明提供的报告系统在理论上也可以应用于植物以外的其它生物体，例如动物，如昆虫，微生物，如细菌或真菌。
本发明的报告系统可以以两种基本机制作为存在外部刺激物的结果产生表型形状。
第一种可能性是外部刺激物与由报告系统产生的特征相互作用。该由报告系统产生的特征在不存在外部刺激物时也可以出现，但在这种情况下不发展出表型性状。这种情况的例子是本发明的一种报告系统，它包含例如组成型表达的基因，它编码的基因产物在存在外部刺激物的情况下产生例如一种独特的植物颜色。
第二种可能性是外部刺激物在其存在的情况下作为该基因的表达被改变的结果可以产生表型性状。表型性状作为被改变的基因表达的结果而发展。被改变的基因表达可以是mRNA或基因产物的转录或翻译活性改变以及其稳定性/半衰期改变的结果，并可以包括一个或多个步骤。这种情况的例子是本发明的一种报告系统，它包含一种基因，该基因的转录被只有在存在外部刺激物的情况下才具有活性的启动子所调控，并且它编码的基因产物产生例如一种独特的植物颜色。
不论表型性状以何种机制发展，外部刺激物既可以直接发挥其影响，即包含了被分析物本身，也可以间接地发挥影响，通过包含例如被分析物或另一个实体的分解产物，其形式或浓度依赖于被分析物的存在。
上面提到的例子只是为了描述的目的，不是对本发明的保护范围的限制。对于本领域的专业人员来说基于不同的机制显然有可能开发出许多具体的报告系统，而不偏离本发明的要点。因此，这样的报告系统被本发明所涵盖。
在本发明的优选实施方案中，开发了一种能够以不同颜色的形式产生可直接检测的表型性状的报告系统，使得可以通过目视检查带有该报告系统的植物，此外还包括被特定的刺激物诱导的启动子，这些刺激物例如但不限于重金属或从爆炸物产生的含氮化合物。在该特定的优选实施方案中，植物的独特颜色与可诱导的启动子相结合允许在大面积的土壤中筛选重金属污染物或爆炸物的存在。
本发明与现有方法相比方便了被分析物的检测，无需使用实验室分析。该系统的主要优点是不需要取样，测试还可以在没有常规测试方法所需的实验室设备的偏远的地区进行。此外该系统不需要为了获得可检测的信号而应用昂贵的底物，例如荧光素或X-gluc。因此本发明为现在使用的报告系统提供了不那么昂贵的替代方案。
本发明的一个方面是提供了一种在存在外部刺激物的情况下，能够在植物中产生直接可监测的表型性状的报告系统，它包含了一种基因，该基因编码的产物参与了对该外部刺激物的存在作出反应从而发展出直接可监测的表型性状的过程。
在整个说明书和随附的权利要求书中使用的术语“报告系统”意味着任何能够将一种刺激转化成另一种能够被检测或测量的特征的系统。
在整个说明书和随附的权利要求书中使用的术语“可直接监测的表型形状”意味着任何不需要取样就可以被监测的物理或化学性质的表型。这样的表型可以包括例如存活力、生长速度、大小、形状、颜色、颜色类型、气味和味道。
在整个说明书和随附的权利要求书中使用的术语“外部刺激物”意味着任何能够影响植物的外部来源的化学或物理性质的刺激物。
在本发明的另一个方面，直接可监测的表型性状是对外部刺激物的存在作出反应的该基因表达被改变的结果。改变的基因表达由传感系统对外部刺激物的存在作出反应而产生。
在整个说明书和随附的权利要求书中使用的术语“传感系统”意味着一种包含了一种或多种成分的系统，它在存在外部刺激物的情况下通过一个或多个步骤导致了该基因表达的改变。这样的系统可以包含许多传感和调控实体，例如启动子、调控元件、增强子、调控蛋白、反义RNA、转运和受体蛋白和信号传导机制的其它部分以及物理-化学条件例如pH等。传感系统可以包括这些实体的一个或它们的任何组合。
在本发明的优选实施方案中，传感系统包括了调控元件。在本发明的另一个优选实施方案中，调控元件包括金属反应元件(MRE)，其具有序列TGCACCC、TGCACGC、TGCACAC或TGCGCAC(Scudiero等2001)。
在本发明的另一个优选实施方案中，传感系统包含启动子，该启动子的活性受外部刺激物的存在的影响。在本发明的另一个优选实施方案中，该启动子与基因可操作连接。在本发明的更优选的实施方案中，启动子从下面的组中选择：拟南芥(Arabidopsis thaliana)的γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶(X80377、X81973和X84097)、拟南芥的植物螯合肽合成酶(PCS1、AF093753)、拟南芥的IRT1和IRT2金属转运蛋白(U27590和T04324)、拟南芥的AtPCS1和AtPCS2(W43439和AC003027)、大豆铁蛋白(M64337和M58336)。
对于本领域的专业人员来说显然有可能根据本发明开发一种植物报告系统，其中的表型性状是一个以上基因的表达被改变的结果，这不背离本发明的要点。因此这样的报告系统在本发明的范围之内。
在本发明的另一个优选实施方案中，一种或多种基因参与了在植物中产生可见的颜色变化。在本发明的更优选的实施方案中，一种或多种基因参与了苯基丙酸类代谢、色素的生物合成、类黄酮的生物合成或花青甙的生物合成。在本发明的最优选实施方案中，基因是查耳酮合成酶(CHS)、查耳酮异构酶(CHI)或黄烷酮醇还原酶(DFR)。
在上面的段落和随附的权利要求9-13中使用的术语“参与”既包括相关代谢途径的结构基因，也包括参与该途径调控的基因。
在整个说明书和随附的权利要求书中提到了许多具体的基因例如CHS，相应的突变体，例如tt4和转录因子例如PAP1和PAP2。这些术语用于拟南芥中。编码的蛋白具有同样的或相似的生物学功能的等价的基因、相应的突变和转录因子可以在其它具有不同名称的植物物种中发现。对于本领域的专业人员来说显然能够基于这些成分开发出报告系统而不偏离本发明的要点和保护范围。
在本发明关于植物报告系统的另一个方面中，一种或多种内源基因的功能性拷贝被赋予了非功能性。基于本发明的实际报告系统的性质，消除或减少可能干扰独特表型发生的内源基因产物的活性可能是必需的或有利的。例如，如果实际的报告系统是基于嵌合基因，它含有非必需的植物基因的编码序列和不同来源的启动子，在存在被分析物的情况下为了获得更加明显的表型可以将内源植物基因变成非功能的。基因可以通过本领域的技术人员所熟知的多种方法被变成非功能(Sambrook等1989)，而这样的基因可以通过转化或杂交引入植物。
因此，在本发明的优选实施方案中，植物的报告系统还包括参与色素产生的基因的突变。在本发明的更优选的实施方案中，植物的报告系统还包括参与类黄酮生物合成途径，参与了四羟基查耳酮的形成/查耳酮合成，或参与了2S-黄烷酮、narringenein和ligquritigenin形成的基因的突变。在本发明的最优选的实施方案中，植物的报告基因还包括CHI基因的突变(tt5突变体)或CHS基因的突变(tt4突变体)。
在本发明关于植物报告系统的另一个方面中，转录因子的表达也被改变了。转录因子是参与转录调控的蛋白。通过改变它们的表达，有可能对本发明的报告系统进行最适化以获得更显著的表型性状。例如，如果正调控途径的转录因子被过量表达，而基于编码该途径的酶之一的基因的报告系统出现在无效突变体中，在存在外部刺激物的情况下报告基因的表达可能由于该转录因子的过量表达而产生更多的终产物，从而产生更显著的表型。例子是参与类黄酮生物合成的基因的转录，所述基因置于正调控之下并导向产生花青甙；该系统在无效的背景tt4和/或tt5突变体上发展，其中没有花青甙产生，因为它们的生物合成被阻断了。
通过对突变体的互补，即将CHS和/或CHI基因插入到特定调控的启动子和/或调控元件的控制下，花青甙的生产将被控制，作为诱导该启动子的特定刺激物的结果出现了可见的表型。
在本发明的优选实施方案中，植物的报告系统还包括了含有Myb结构域的转录因子的表达的改变。在本发明的更优选的实施方案中，植物的报告系统还包括转录因子PAP1和/或PAP2的表达的改变。在本发明的另一个优选实施方案中，植物的报告系统也包括转录因子的过量表达。在本发明的最优选实施方案中，植物的报告系统还包括转录因子PAP1和/或PAP2的过量表达。
当改变转录因子的表达时，启动子的选择可以不同。通常情况下，如果转录因子将被过量表达，应该选择一个强的和组成型表达的启动子，例如35S启动子或二元启动子(Velten & Schell 1985)，但是如果组成型表达被证明是不利的，对外部刺激物具有反应性的诱导型启动子可能是有利的。
因此，在本发明的优选实施方案中，植物的报告系统包含被诱导型启动子控制的转录因子的过量表达。
在本发明的另一个优选实施方案中，植物的报告系统包含被组成型启动子控制的转录因子的过量表达。
在本发明的更优选的实施方案中，植物的报告系统包含被35S启动子控制的转录因子的过量表达。在本发明的另一个优选实施方案中，植物的报告系统包含被二元启动子控制的转录因子的过量表达。
外部刺激物在原则上可以存在于与带有本发明的报告系统的植物相接触的空气、水或土壤中。应用本发明的报告系统的目的可能是鉴定有害物质例如污染物或可能有利的物质例如贵重金属的位置，可能的话还有浓度和种类。
因此，在本发明的优选实施方案中，植物报告系统包含一种或多种在存在无机污染物的情况下其表达被改变的基因。在本发明的更优选的实施方案中，植物报告系统包含一种或多种在存在重金属的情况下其表达被改变的基因。在本发明的最优选实施方案中，植物报告系统包含一种或多种在存在属于Cu、Zn、Cd、Hg、Pb、Co、Cr、Ni、As、Be、Se、Au、Ag族的重金属的情况下其表达被改变的基因。
在本发明的另一个优选实施方案中，植物报告系统包含一种或多种在存在有机污染物的情况下其表达被改变的基因。在本发明的更优选的实施方案中，植物报告系统包含一种或多种在存在含氮有机化合物的情况下其表达被改变的基因。在本发明的另一个优选实施方案中，含氮化合物含有NO2、NO3、NH2或NH3。在本发明的另一个优选实施方案中，植物报告系统包含一种或多种在存在作为爆炸物的一部分的含氮化合物的情况下其表达被改变的基因。在本发明的最优选实施方案中，植物报告系统包含一种或多种在存在作为爆炸物的一部分的含氮化合物的情况下其表达被改变的基因。
在整个说明书和随附的权利要求书中使用的术语“污染”、“土壤污染”或“污染的土壤”应该被认为是指土壤中的任何无机或有机化合物，其含量高于对该地理区域来说必须被认为是正常的含量。不限于可能被认为是有害的化合物，也包括可能是有用的或有价值的化合物，只要它们被包含在上述的定义中。
当基因的表达由于存在一种化合物例如污染物而被改变时，相互作用可以是直接的也可以是间接的。通过直接的相互作用污染物以其在土壤中被发现的形式对基因的表达直接施加影响。通过间接的相互作用污染物被转化为第二种刺激物，再对基因的表达施加影响。第二个刺激物可以是污染物的分解产物、污染物或其分解产物是其一部分的实体、污染物或其分解产物不是其一部分或在基因的物理或化学性质环境中变化了的一种或多种实体(即分子、复合物或结构部分)。从污染物到第二个刺激物的这种转变可以包括也可以不包括扩增的步骤。从初级刺激物到次级刺激物的转变可能需要由通常在植物中不能被发现的基因编码的基因产物。当这些基因以有功能的形式被导入植物时，它们可以促进植物中的这种转化。许多微生物来源的基因具有高等生物所不能的转化化合物的能力，它们可以例如导入到植物中以方便多种物质的检测。
因此，在本发明的优选实施方案中，植物的报告系统含有一种或多种在存在污染物的情况下其表达被改变的基因，其中所述基因的表达被污染物的存在直接改变。
在本发明的另一个优选实施方案中，植物的报告系统含有一种或多种在存在污染物的情况下其表达被改变的基因，其中所述基因的表达被污染物的存在间接地改变。在本发明的另一个优选实施方案中，污染物通过一个或多个步骤被转化为第二个因子，该第二个因子改变了所述基因的表达。在本发明的更优选的实施方案中，从污染物到第二个因子的转化被微生物的代谢酶所促进。在本发明的最优选实施方案中，微生物酶是“TNT还原酶”，它能够还原污染物并释放出NO2。
在本发明的另一个优选实施方案中，从污染物到第二个因子的转化包括级联系统，方便了刺激的放大。
在本发明的优选实施方案中，表型性状可以不需进行分析就被评估。在本发明的更优选的实施方案中，表型性状可以通过视觉检查进行评估。在本发明的最优选实施方案中，表型形状是颜色。
在本发明的另一个方面，植物报告系统还包括生物修复系统。该生物修复系统可以包含由植物降解污染物，以及可以包括基因，例如微生物来源的基因，其编码的产物有利于降解。生物修复系统也可以包括在植物或植物的一部分中积累污染物，通过移除植物方便地移除污染物。在这种情况下，如果有足够的价值，随后还可以从植物中提取污染物。
因此，在本发明的优选实施方案中，生物修复系统包括了污染物的降解。
在本发明的另一个优选实施方案中，生物修复系统包括污染物的积累，从而便利了它们的移除。在本发明的更优选的实施方案中，积累是通过一个或一组重金属结合蛋白和/或金属转运蛋白的表达来完成的。在本发明的最优选的实施方案中，重金属结合蛋白和/或金属转运蛋白包含属于下面组中的基因：裂变酵母(S.pombe)编码植物螯合肽合成酶基因(GeneBank登记号Y08414)、Athyrium yokoscenseAyPCS1植物螯合肽合成酶mRNA(AB057412)、拟南芥推断的植物螯合肽合成酶(AY039951)、拟南芥植物螯合肽合成酶(CAD1，AF135155)、拟南芥推断的金属硫蛋白-1基因转录激活蛋白(AY04594)、拟南芥植物螯合肽合成酶(PCS1，AF093753)、拟南芥IRT1和IRT2金属转运蛋白(U27590和T04324)、拟南芥AtNramp1、2、3和4金属转运蛋白(AF165125、AF141204、AF202539和AF202540)、芥菜(Brassica juncea)植物螯合肽合成酶mRNA(pcs1基因AJ278627)、与植物螯合肽合成酶类蛋白相似的乳浆大戟(Euphorbia esula)cDNA(BG459096)、与拟南芥推断的植物螯合肽合成酶类似的番茄(Lycopersicon esculentum)(西红柿冠瘿)(BG130981)、宽叶香蒲(Typha latifolia)植物螯合肽合成酶(AF308658)、玉蜀黍(Zea mays)植物螯合肽合成酶类蛋白(CISEZmG，AF160475)、阿尔卑斯菥(Thalaspi caerulescens)ZNT1重金属转运蛋白(AF133267)。
重金属结合蛋白和/或金属转运蛋白既可以从组成型启动子例如35S启动子也可以从对污染物的存在有反应的诱导型启动子表达，只要有足够量的蛋白被表达以便获得所需的积累污染物的能力。
在本发明的另一个方面，提供了带有本发明的报告系统的遗传修饰的植物。
在整个说明书和随附的权利要求书中使用的术语“遗传修饰的植物”是指一种植物，其遗传背景至少有一部分是由于使用了遗传工程。从这样的植物产生的后代，或从这样的植物以植物、种子、组织培养和分离的组织和细胞的形式杂交产生的后代，其中至少包含了一部分最初由遗传工程引入的修饰，它们也包含在本定义中。
在本发明的优选实施方案中，遗传修饰的植物是单子叶植物。
在本发明的另一个优选实施方案中，遗传修饰的植物是双子叶植物。
在本发明的另一个优选实施方案中，遗传修饰的植物是一年生植物。
在本发明的另一个优选实施方案中，遗传修饰的植物是两年生植物。
在本发明的另一个优选实施方案中，遗传修饰的植物是多年生植物。
在本发明的更优选的实施方案中，遗传修饰的植物属于十字花科。在本发明的另一个优选的实施方案中，遗传修饰的植物属于拟南芥属。
在本发明的最优选的实施方案中，遗传修饰的植物属于由下列物种组成的组：甘蓝型油菜(Brassica napus)、芜菁(B.rapa)和B.junceaas、卷心菜(Brassica oleracea)、羽衣甘蓝(Brassica napus)、芜菁(Brassica rapa)、萝卜(Raphanus sativus)、芥菜(Brassica juncea)、白芥(sinapis alba)、辣根菜(Armoracia rusticana)、Alliaria petiolata、拟南芥(Arabidopsis thaliana)、A.griffithiana、A.lasiocarpa、A.petrea、普通山芥(Barbarea vulgaris)、Berteroa incana、芥菜(Brassica juncea)、黑芥(Brassica nigra)、芜菁(Brassica rapa)、疣果匙荠(Buniasorientalis)、亚麻荠(Camelina alyssum)、小果亚麻荠(Camelinamicrocarpa)、Camelina sativa、荠菜(Capsella bursa-pastoris)、群心菜(Cardaria draba)、Cardaria pubescens、Conringia orientalis、Descurainiaincana、Descurainia pinnata、播娘蒿(Descurainia sophia)、Diplotaxismuralis、Diplotaxis tenuifolia、Erucastrum gallicum、Erysimum asperum、小花糖芥(Erysimum cheiranthoides)、Erysimum hieracifolium、Erysimuminconspicuum、紫色香花芥(Hesperis matronalis)、Lepidium campestre、Lepidium densiflorum、Lepidium perfoliatum、小团扇荠(Lepidiumvirginicum)、豆瓣菜(Nasturtium officinale)、Neslia paniculata、野萝卜(Raphanus raphanistrum)、Rorippa austriaca、Rorippa sylvestris、白芥子(Sinapis alba)、野芥菜(Sinapis arvensis)、Sisymbrium altissimum、短果大蒜芥(Sisymbrium loeselii)、篱边大蒜芥(Sisymbriumofficinale)、菥幂(Thlaspi arvense)和Turritis glabra。
在本发明的另一个方面中，提供了检测被分析物的方法，包括下列步骤：
●从本发明的遗传修饰的植物导入种子
●监控获得的植物的表型，以及
●任选地，作为生物修复的步骤植物降解被分析物，或者如果植物积累了被分析物，作为生物修复的步骤可以移除植物
植物的种子可以利用常规的播种方法，手工或使用机器引入。在本发明的优选实施方案中，种子被悬浮在固化的物质中，例如琼脂或“干水”，它在干旱地区的农业中通常被用作水的“控制释放工具”。这将保证水分营养的供应并帮助将种子保持在原地和均匀地分布。
在本发明的优选实施方案中，用该方法检测的被分析物是污染物。
在本发明的另一个优选实施方案中，用该方法检测的污染物是无机污染物。
在本发明的另一个优选实施方案中，用该方法检测的污染物是重金属。
在本发明的最优选实施方案中，用该方法检测的污染物是来自Cu、Zn、Cd、Hg、Pb、Co、Cr、Ni、As、Be、Se、Au、Ag族中的重金属。
在本发明的另一个优选实施方案中，该方法能够检测的重金属的浓度至少为0.00025mM，例如0.0005，例如0.001，例如0.0015，例如0.002，例如0.0025，例如0.003，例如0.004，例如0.005，例如0.006，例如0.007，例如0.008，例如0.009，例如0.01，例如0.02，例如0.03，例如0.04，例如0.05，例如0.06，例如0.07，例如0.08，例如0.09，例如0.1，例如0.2，例如0.3，例如0.4，例如0.5，例如0.6，例如0.7，例如0.8，例如0.9，例如1，例如2，例如3，例如4，例如5，例如6，例如7，例如8，例如9，例如10mM。
在本发明的另一个优选实施方案中，用该方法检测的污染物是有机污染物。
在本发明的另一个优选实施方案中，用该方法检测的污染物是含氮化合物。
在本发明的最优选实施方案中，污染物含有NO2、NO3、NH2或NH3。
在本发明的另一个优选实施方案中，该方法能够检测的含氮化合物的浓度至少为0.00025mM，例如0.0005，例如0.001，例如0.0015，例如0.002，例如0.0025，例如0.003，例如0.004，例如0.005，例如0.006，例如0.007，例如0.008，例如0.009，例如0.01，例如0.02，例如0.03，例如0.04，例如0.05，例如0.06，例如0.07，例如0.08，例如0.09，例如0.1，例如0.2，例如0.3，例如0.4，例如0.5，例如0.6，例如0.7，例如0.8，例如0.9，例如1，例如2，例如3，例如4，例如5，例如6，例如7，例如8，例如9，例如10mM。
在本发明的另一个方面中，提供了本发明的遗传修饰植物在检测被分析物和任选用于生物修复中的应用。
在优选实施方案中，遗传修饰的植物根据本发明被用来检测污染物。
在另一个优选实施方案中，遗传修饰的植物根据本发明被用来检测无机污染物。
在另一个优选实施方案中，遗传修饰的植物根据本发明被用来检测重金属污染物。
在最优选实施方案中，遗传修饰的植物根据本发明被用来检测属于Cu、Zn、Cd、Hg、Pb、Co、Cr、Ni、As、Be、Se、Au、Ag族中的重金属。
在本发明另一个优选实施方案中，遗传修饰的植物被用来检测的重金属的浓度至少为0.00025mM，例如0.0005，例如0.001，例如0.0015，例如0.002，例如0.0025，例如0.003，例如0.004，例如0.005，例如0.006，例如0.007，例如0.008，例如0.009，例如0.01，例如0.02，例如0.03，例如0.04，例如0.05，例如0.06，例如0.07，例如0.08，例如0.09，例如0.1，例如0.2，例如0.3，例如0.4，例如0.5，例如0.6，例如0.7，例如0.8，例如0.9，例如1，例如2，例如3，例如4，例如5，例如6，例如7，例如8，例如9，例如10mM。
在另一个优选实施方案中，遗传修饰的植物根据本发明被用来检测有机污染物。
在另一个优选实施方案中，遗传修饰的植物根据本发明被用来检测含氮化合物。
在最优选实施方案中，遗传修饰的植物根据本发明被用来检测含有NO2、NO3、NH2或NH3的污染物。
在本发明的另一个优选实施方案中，遗传修饰的植物被用来检测的含氮化合物的浓度至少为0.00025mM，例如0.0005，例如0.001，例如0.0015，例如0.002，例如0.0025，例如0.003，例如0.004，例如0.005，例如0.006，例如0.007，例如0.008，例如0.009，例如0.01，例如0.02，例如0.03，例如0.04，例如0.05，例如0.06，例如0.07，例如0.08，例如0.09，例如0.1，例如0.2，例如0.3，例如0.4，例如0.5，例如0.6，例如0.7，例如0.8，例如0.9，例如1，例如2，例如3，例如4，例如5，例如6，例如7，例如8，例如9，例如10mM。
本发明的目的是提供能够便于生物修复被污染的土壤的植物，其修复程度可以使土壤中的污染物含量降低到法律规定的环境标准的限制之下。通过种植本发明的植物的种子并移除得到的植物，可以达到上述目的。为了将污染物的含量降低到所需的最大水平，植物可以在特定的地点生长并移除一次或几次。因此在本发明的优选实施方案中，植物以在土壤中获得所需的污染物浓度的降低所必要的次数被种植在污染的地点然后移除。
在本发明的优选实施方案中，植物的使用能够在每一代移除至少10％，例如20％，例如30％，例如40％，例如50％，例如60％，例如70％，例如80％，例如90％，例如95％，例如99％的污染物。
在本发明的另一个实施方案中，收获的植物生物量可以被加工以便获得有用的或有价值的化合物例如重金属。
本发明的优选实施方案是检测重金属污染的土壤。这可能包括不得不在目的区域清除已经存在的植被。这可以通过机械的方法例如切割机或者与除草剂例如混合型芽前除草剂(镇草宁)结合使用来完成。一旦土壤上的植被已经被清除，就将均匀地播种。这可以通过例如使用种子分配器或将种子分散悬浮在成胶剂的溶液中来进行，以便确保种子的位置直到它们发芽并扎根在土中。如果需要维持该区域的水分和营养，这依赖于土壤的质量。可以在例如种子发芽后5星期进行视察，并对植物显示出红色的区域进行标记。从这些地点获得的土壤样品可以用常规的方法进行分析以建立污染的程度。
在本发明的另一个优选实施方案中，当污染刚好在必须进行修复的限度以上时，植物会显示出颜色的变化。这允许使用植物的颜色直接作为土壤在用于其它人类活动之前需要进行修复的指示。
在本发明的最优选实施方案中，在植物中观察到的颜色的变化伴随着基于金属结合蛋白和/或金属转运蛋白的存在而产生的对污染物的摄取。当重金属浓度最高的植物部分位于地面上时，植物生物量被收获进行进一步处理。在一个优选的处理中，植物材料被收集并存放在一个安全的填埋场。在更优选的实施方案中，植物材料被焚烧，从烟尘中收集污染物。这种方法可以减少必须存放在填埋场的物质的体积。在本发明的最优选的实施方案中，植物材料在生物反应器中发酵，将淤浆进行电解处理以重新获得有用的金属。
在本发明的另一个实施方案中，种子被播在可能含有贵重金属的地区。有红色植物的地区指出了可能有金属埋藏的地点，在理想情况下，用于这个目的的植物在金属浓度足够允许有利润的提取时将改变颜色。
在另一个实施方案中植物被播种在封闭的地区并用废水浇灌。如果废水含有重金属，植物将改变颜色，并且减少水中重金属浓度的步骤将被启动。在最优选的实施方案中，废水通过种有植物的区域得以过滤。用于这种任务的植物应该在刚刚低于这些植物的最大摄取值时改变颜色，从而表明它们已经达到了饱和限度，继续流入的污染的水将不再被植物修复。
在本发明的实施方案中，存在于城市中的爆炸物被检测。在将要进行监测并清除爆炸物的区域的现有植被必须被移除。常规的方法使用机械车辆产生25m×25m的方块。周边用梿枷(即重装甲车)设置，然后所有的植被用固定在大约12.5米的长臂上的切割机移除。当碰到地雷时，臂和切割机一般被毁坏，可以被替换。此外除草剂可以用于清除有植被的区域。在本发明的这个实施方案中，种子可以在除草剂、染料和成胶剂的悬浮液中播撒。除草剂被用来控制不想要的植被。为了便于通过目测在整个开放的区域控制播种，可以加入除了红色和绿色之外的颜色。可以包括成胶剂以确保种子保留在它们被播种的地方，从而保证完全覆盖整个土壤。在例如5星期之后，视察这些25×25米的方块区域，如果在方块区域中发现了红色的植物，这个特定的方块区域必须通过常规的排雷方法进行清除。这种实施方案一般被称为AR(区域排除)。在本发明的另一个实施方案中，植物被用于AQI(区域质量保险)，其中已经用常规方法清除的区域被重新筛选以确保在第一次时没有漏掉地雷。在本发明的另一个实施方案中，监测了被爆炸物污染的土壤，例如弹药工厂/储存地或矿井。在这个实施方案中，可能污染的区域被清除植被，然后播种。在例如5星期后视察该地区的红色植物。红色植物下的土壤可以被移除或处理以便除去污染。
本发明将在下面的段落中进行更详细的描述。包括的使用材料和方法以及实施例是为了说明的目的，而不是对本发明的范围的限制。对于本领域的专业人员来说显然可以开发或使用其它的实验步骤而不偏离本发明的要点或范围，因此它们也被本发明所涵盖。
实施例
材料和方法
在产生构建体的分子工作中所用的基本技术被Sambrook等1989和下面的方案所描述。
PCR(大范围)
所有的大范围PCR按照下面的流程设定，使用PERKIN ELMER(GeneAmp XL PCR试剂盒#No.808-0192)的试剂进行100μl的反应，核苷酸dATP、dTTP、dGTP和dCTP来自Pharmacia Biotec；储液浓度均为100mM，使用前用miliQ水稀释。反应在Eppendorf mastercyeler5330上进行。
  大范围
  下层混合物
  反应编号   1×   6×   8×   10×   12×   18×   24×   终浓度
  水   13μl   81.25μl   107.25μl   133.25μl   162.5μl   240.5μl   321.75μl
  3.3×XL缓冲液   12μl   75μl   99μl   123μl   150μl   222μl   297μl   1×缓冲液
  dATP 10mM   2μl   12.5μl   16.5μl   20.5μl   25μl   37μl   49.5μl   200μM
  dTTP 10mM   2μl   12.5μl   16.5μl   20.5μl   25μl   37μl   49.5μl   200μM
  dGTP 10mM   2μl   12.5μl   16.5μl   20.5μl   25μl   37μl   49.5μl   200μM
  dCTP 10mM   2μl   12.5μl   16.5μl   20.5μl   25μl   37μl   49.5μl   200μM
  引物1 1μM
  引物2 1μM
  Mg(OAc)225mM   4.4μl   27.5μl   36.3μl   45.1μl   55μl   81.4μl   108.9μl   1.1mM
  体积   40μl
  上层混合物
  水   39μl   243.75μl   321.75μl   399.75μl   487.5μl   721μl   965.25μl
  3.3×XL缓冲液   18μl   112.5μl   148μl   184.5μl   225μl   333μl   445.5μl
  模板   ×   ×   ×   ×   ×   ×   ×
  rTth聚合酶   2μl   12.5μl   16.5μl   20.5μl   25μl   37μl   49.5μl   4单位
  体积   60μl
蜡覆盖层的熔化
1)80℃5分钟
2)25℃5分钟
3)结束。
标准的大范围程序
1)94℃1分钟
2)循环16次
3)94℃30秒
4)68℃10分钟
5)转到第2步
6)循环14次
7)94℃30秒
8)68℃10分钟+(延伸15秒)
9)转到第6步
10)72℃10分钟
11)6℃浸泡30秒
12)结束
PCR(Taq DNA聚合酶)
所有的Taq PCR反应按照下面的流程设定，在100μl中进行反应。Taq来自GibcoBRL life technologies # 18038-026，核苷酸dATP、dTTP、dGTP和dCTP来自Pharmacia Bjotec；储液浓度均为100mM，使用前用miliQ水稀释。反应在Eppendorf mastercycler 5330上进行。
  Taq-PCR
  反应编号   1×   6×   8×   10×   12×   18×   24×   终浓度
  水   55.5μl   346.8μl   457.8μl   568.8μl   693.7μl   1026.7μl   1373.6μl
  10×缓冲液   10μl   62.5μl   82.5μl   102.5μl   125μl   183μl   247.5μl   1×缓冲液
  dNTP混合液(1.25mM)   15μl   100μl   132μl   164μl   200μl   296μl   396μl   200mM
  引物1 300ng   300ng
  引物2 300ng   300ng
  MgCl2(25mM)   6μl   37.5μl   49.5μl   61.5μl   75μl   111μl   148μl   1.5mM
  模板
  Taq   0.5μl   3.12μl   4.12μl   5.12μl   6.25μl   9.25μl   12.37μl   2.5单位
体积   100μl
在质粒DNA上进行PC R的Taq标准程序：60℃
1)95℃3分钟
2)等待按键(加入Taq酶)
3)循环30次
4)94℃1分钟
5)60℃2分钟(根据引物和模板可以在50-60℃之间调整)
6)72℃1分钟
7)转到第4步
8)6℃30秒
细菌工作
大肠杆菌(E.coli)感受态细胞(Hannahan方法)
1)将细菌在新鲜平板上划线并生长
2)挑出5-6个新鲜的菌落，分配在含有1ml SOB的Eppendorfs管中。
3)使用1ml接种在100ml SOB的1升摇瓶中。37℃生长2-3小时，直到OD595达到0.2(低密度是关键的)。
4)在4个50ml一次性管中于4℃ 2500rpm离心15分钟收集细胞。轻轻倒出上清液，倒置离心管排干多余的液体。以8ml RF1/管(1/3体积)将沉淀重新悬浮。
5)将细胞在冰上放置15分钟。
6)于4℃ 2500rpm离心收集细胞。
7)轻轻倒出上清液，倒置离心管排干。以1ml RF2/管(1/25体积)。在冰上放置15分钟。
8)预冷40个eppendorf管(-80℃)。取40μl细胞加到每个管中，马上在液氮中冷冻。储存于-80℃。
SOB培养基500ml
10g细菌用胰蛋白胨(bactotryptone)
2.5g酵母提取物
292mg NaCl
0.9g KCl
高压灭菌后加入5ml过滤除菌(0.22μm滤膜)的1M MgCl2和5ml的1M MgSO4(也过滤除菌)，终浓度都为10mM。
RF1 100ml
1.2g RbCl
0.99g MnCl-4H2O
3ml 1M KOAC，pH7.5(用NaOH调整)
0.15g CaCl-2H2O
15g甘油
用过滤除菌(0.22μm滤膜)的0.2M醋酸将pH调整到5.8。
RF2 50ml
60mg RbCl
1ml 0.5M MOPS，pH＝6.8(用NaOH调整)
0.55g CaCl-2H2O
7.5g甘油
用过滤除菌(0.22μm滤膜)的NaOH将pH调整到6.8。
大肠杆菌的转化
1)在冰上融化感受态细胞(-70℃储存)，颠倒混合。
2)在冰上向含有DNA样品的13ml管中加入150μl细胞。
3)在冰上保温25分钟，不时混合。
4)37℃热激5分钟。
5)在冰上保温5分钟。
6)加入1ml不含抗生素的LB，37℃摇动1小时。
7)离心30分钟，吸出液体至200μl，取100μl铺板，其余的储存于4℃。
对于蓝/白斑筛选来说，在开始转化前将IPTG和X-Gal铺在平板上。
200μl 100mM IPTG(0.2g加到8.3ml水中，用0.22μm滤膜过滤除菌)。
62.5μl 4％X-Gal(0.4g加到10ml DMF中，用0.22μm滤膜过滤除菌)。
都储存在-20℃，最好能够分装。在使用前不要混合。
阳性对照使用10ng超螺旋的质粒。
微量制备-碱裂解
1)1.5ml过夜的培养物加到eppendorf管中，离心1分钟，吸出上清液
2)室温涡旋震荡5分钟重新悬浮在100μl微量制备溶液1MPS1中
3)加入200μl MPS2，将管快速颠倒3次，冰上保温5分钟
4)加入150μl MPS3，颠到地涡旋震荡10分钟，冰上保温5分钟
5)室温离心5分钟
6)转移到另外的eppendorf管中。如果测序转到7a)
7)酚/氯仿抽提
8)室温离心2分钟
9)转移到另外的eppendorf管中
10)加入900μl乙醇
11)室温保温2分钟
12)室温离心5分钟
13)吸出溶液
14)用70％乙醇洗涤并离心
15)吸出溶液，快速真空干燥
16)重新悬浮在50μl TE中，取出2μl用于酶切
7a)加入900μl乙醇
8a)室温离心5分钟
9a)吸出溶液
10a)加入1ml 70％乙醇，离心
11a)吸出溶液，重新悬浮在200ml TE中，加入2mg RNA酶A，在37℃保温15分钟
12a)酚/氯仿抽提，加入20ml 3M醋酸钠，乙醇沉淀，70％乙醇洗涤
13a)重新悬浮在30ml TE中
14a)参考测序酶手册进行变性
16)重新悬浮在50μl TE中
溶液：
MPS1，冷冻              储液             50ml
50mM葡萄糖              2M                1.25ml
10mM EDTA               0.25M             2ml
25mN Tris pH8           1M                1.25ml
MPS2，新鲜                                10ml
0.2N NaOH               10N               200μl
水                                        8.8ml
1％SDS                  10％              1ml
MPS3                                      100ml
60mM KOAc               5M                60ml
1.2M HAc                                  11.5ml
水                      -                 28.5ml
LB液体  对固体来说每升加入14g Difco细菌琼脂
1)22g/l Lainer培养基GibcoBRL
2)用milliQ水加到1升
3)高压灭菌(120℃20分钟)
4)在使用前加入抗生素(培养基在室温时)
5)(对于LB平板来说每升加入15g Difco细菌琼脂)
所有的构建体通过电穿孔转化土壤杆菌。
土壤杆菌感受态细胞
1).用牙签接种2ml含有抗生素的YEP，在摇床上于28℃培养过夜。对于ABI加入50μg/ml卡那霉素和25μg/ml氯霉素，对于gv3101加入25μg/ml庆大霉素。
2).将过夜培养物转移到200ml YEP的500ml无菌摇瓶中，250rpm摇动培养直到OD达到0.3(4-5小时)。
3).在无菌的50ml带盖离心管中于4℃ 5000rpm离心10分钟。确保细胞已经沉淀，如果没有，以更高的速度重复该步骤。
4).吸出上清液，将沉淀重新悬浮于20ml冰冷的1mM pH7的HEPES中(过滤除菌)，再次离心。
5).将第4步再重复2次。
6).吸出溶液后，将沉淀重新悬浮于2ml冰冷的10％甘油(过滤除菌)中。
7).马上在预冷的无菌eppendorf管中分装成40μl的等份，在液氮中冷冻，储存在-70℃。
土壤杆菌的电穿孔转化
DNA制备
用于电穿孔的DNA必须不含盐、RNA或蛋白。DNA(溶于TE缓冲液中)应该首先用RNA酶处理，然后用酚/氯仿抽提两次。这样可以除去蛋白和RNA。为了除去盐，用乙醇沉淀DNA，用70％的乙醇洗涤两次。以0.4-1μg/ml的浓度重新悬浮DNA。
电穿孔
用于电转化的细菌细胞、YEP培养基和DNA溶液在混合前必须放置在冰上。注意下面的步骤应该在1分钟内完成，并且应该带眼镜和手套。
16.将1-2ml DNA(600ng)与40ml细胞混合。
17.将DNA/细胞混合液转移到冰上的转化杯中，轻轻摇动转化杯以避免气泡。
18.用吸水纸擦干转化杯的外部，将转化杯插入转化杯室中，使槽口朝向你。
19.将转化杯室盖子关上。
20.将ARM/DISARM设置为ARM(ARM灯亮)。
21.将Charge/Pulse设置为Pulse，Pulse灯将将简短地亮起。
22.当Pulse灯灭了时，将ARM/DISARM设置为DISARM(ARM灯亮)，然后取出转化杯。
23.在DNA/土壤杆菌混合液还保留在转化杯中的情况下，加入500ml冷的YEP(不含抗生素)，然后轻柔地上下吹吸使溶液混合。
24.将细胞转移到一个eppendorf管中，于28℃保温2-4小时。
25.将电穿孔仪的开关放置在PULSE的位置上。
26.取200ml铺在含有抗生素的YEP平板上。
27.28℃保温，菌落将在2-3天内出现。
转化杯的重复利用
将用过的转化杯充满0.1M H2SO4，放置15分钟。用蒸馏水清洗6次，然后用96％乙醇洗两次。浸泡在70％乙醇中保存。
土壤杆菌的微量制备
用于进行植物转化的土壤杆菌首先被检查是否存在Ti质粒，因为植物的转化和转基因植物的分析非常费时。优选的方法是进行土壤杆菌的微量制备，使用PCR来确定细胞中含有正确的构建体。在这里优选使用PCR，因为Ti质粒是单拷贝的，在琼脂糖凝胶上很难被观察到。
1)将细胞在5ml含有抗生素的LB或YEP中培养过夜。对于ABI中的pMONs质粒，加入50μg/ml卡那霉素、50μg/ml链霉素、25μg/ml氯霉素。对于gv3101中的pBI类型质粒，加入50μg/ml卡那霉素、25μg/ml庆大霉素。
2)将1ml细胞转移到2个微离心管中。
3)离心45秒，吸出上清液。
4)在两个管中再加入1ml细胞，重复步骤3。
5)涡旋振荡沉淀，加入100μl MPS1溶液，再次涡旋振荡，然后将管在室温放置5分钟。
6)加入20μl 20mg/ml溶菌酶溶液，涡旋振荡1秒，37℃保温15分钟。
7)加入200μl MPS2溶液(新鲜配制)，将管架转动3-4次进行轻柔的混合，在冰上放置5分钟。
8)加入150μl MPS3，涡旋振荡至少10秒，在冰上放置5分钟。
9)离心5分钟，将上清液转移到新的管中。
10)加入400μl苯酚/氯仿/异戊醇溶液(25∶24∶1)，涡旋振荡，离心5分钟，将上清液转移到新的管中。
11)重复步骤10。
12)只使用氯仿重复步骤10。
13)加入300μl异丙醇，在冰上放置10分钟。
14)离心5分钟，用70％乙醇洗涤沉淀。
15)将沉淀干燥，将两管重新悬浮在总共50μl含有RNA酶的TE缓冲液中，取2μl进行PCR，其余的冷冻。
50ml的MPS1           储液
50mM葡萄糖            1M           2.5ml
10mM EDTA             0.5mM        1ml
25mM Tris pH＝8.0     1M           1.25ml
10ml的MPS2
0.2N NaOH             10N          200μl
1％SDS                10％         1ml
水                                 8.8ml
100ml的MPS3
5M醋酸钾                           60ml
冰醋酸                             11.5ml
水                                 28.5ml
在构建体转移到土壤杆菌后，使用下面的方案将构建体转化到植物中。
所有的构建体被转化到Agrobateria thumefasiens中，然后通过真空渗透转移到植物中。
真空渗透使用了一种在Bechtold & Pelletier 1998的基础上加以修改的方案。
植物培养
1.用刷子取种子，将它们放置在充满土壤的8cm见方的罐子中。不要将土压得太紧，用2-3倍罐体积的水充分浇灌以除去多余的养分。每个罐中放12-16颗种子。将罐子在冷室中放置2天，然后转移到培养箱中。将植物以短日(10小时以下)培养3个星期从而获得较大的植株和较大的种子产量。把罐子转移到长日培养以诱导抽苔。将植物培养到苔大约10cm长的阶段。
2.在接近莲座叶的地方煎断出现的苔以便促使产生大量的次级苔。渗透将在煎断苔后7到9天进行(植物将为10-15cm高，最大的花序已经产生了第一个小的角果)。在真空渗透的前一天不要给植物浇水。
真空渗透
3.从-80℃的储藏菌或从平板接种开始4ml土壤杆菌的培养(含抗生素的YEP)。细胞根据菌株的不同培养过夜到48小时。将该培养物加到250ml含抗生素的YEP中(250ml的培养将产生足够渗透6个罐的细胞)。根据菌株的不同培养过夜到48小时，直到OD600达到1.2-1.8。培养物将呈现珍珠般的外观(不是成块的或黑色的)。
4.在250ml离心瓶中以5000rpm离心10分钟将土壤杆菌离下，重新悬浮在渗透培养基中，使OD600＝0.8，体积最小为300ml。
5.将土壤杆菌悬浮液倒入适当大小的烧杯中(400ml就够了)。将烧杯放在真空瓶中。抽真空为溶液除气直到气泡形成。在烧杯下放一块纸巾以避免烧杯粘在真空瓶的底部。
6.在渗透前5分钟用水喷淋植物(任选)，然后将植物倒置放入培养液中。确保所有的花都被浸泡，在莲座叶与土壤杆菌悬浮液之间有2cm的距离。不要让培养物接触到莲座叶或土壤，因为这可能杀死植物。在抽真空时避免溶液沸溢。确保土壤只是潮湿的，以便罐中的水不会进入到培养悬浮液中(因此本发明人推荐在渗透的前一天不要给植物浇水)。对WS来说抽真空15-20分钟，对Col-0来说抽30分钟，压力接近0.05Bar(本发明人使用油泵)。
7.将植物从真空瓶中取出之前将塑料袋罩在罐和烧杯上。从烧杯中拉出并取走植物，将罐侧放(避免过量的渗透培养基跑进土壤中)。折叠塑料袋的顶部，用订书针订住2次。另一种可能的方法是将罐侧放在盘子中，将整个盒子用莎纶包装纸盖上。使它们在培养箱中放置一夜。第二天将它们转移到温室中。将植物垂直摆放，打开袋子。第二天取掉袋子。在植物放在盘子中的情况下，也将植物垂直摆放，使用棍棒和莎纶包装纸做出一种类似帐篷的东西围绕着植物。第二天取掉塑料。在炎热的夏天，本发明人推荐在将植物垂直摆放后淋洗植物(这样做的目的是除去来自渗透培养基的糖，从而减少真菌感染)。
8.将植物培养大约4星期，把每个罐中的苔聚在一起，但是与其它罐中的苔分开。
9.当角果开始变黄时，将罐侧放，让植物放在一个大封袋中。放置1星期，干燥，然后切下植物。让种子在封袋中干燥，10天后进行清洗(将来自一个罐中的所有种子放在一起)。在种植前将种子储存在冷室中1星期。
卡那霉素筛选方案
1.种子的杀菌：
在15ml的falcon管中等分种子(大约700颗种子/管，你可以通过先在纸上画一个9cm×9cm的方块，将种子撒在上面来估计种子的量)。加入10ml次氯酸溶液。摇动管子10分钟。除去溶液，加入10ml70％的乙醇。等待2分钟。除去乙醇，用10ml无菌水将种子清洗2-3次。用8ml 0.7％上层琼脂(不超过55℃)重新悬浮种子。
2.在选择性平板(MS+Kan)上播种。在层流罩超静台中干燥平板直到上层琼脂固化。
3.在冷室中将植物于4℃春化2个晚上。然后把平板转移到培养箱中(21℃，连续照明)。
4.在大约7天后转化子应可以清晰地鉴别，为暗绿色的植物带有健康的绿色次生叶，根伸入到选择性培养基中。在早期阶段根的生长是鉴定转化子的最清晰的标志。
为了确保转化子是阳性的，将它们转移到一个新的MS+Kan平板中放置几天(如果它们变黄了是因为它们是假阳性)。将秧苗转移到土壤中。
如果在这个步骤中你的平板污染了，将转化子尽可能早地转移到土壤中。
5.培养植物收集种子。
渗透培养基
1/2×Murashige&Skoog盐(SIGMA #5524)
1×维生素B5(1ml1000×储液)(SIGMA#G-2519)
Gamborg氏维生素粉，将11.2g溶解在100ml水中制成1000×的储液。
5％蔗糖
高压灭菌前将pH调整到5.7
高压灭菌后加入：
-苯甲基氨基嘌呤(BAP)，每升加入10μl 1mg/ml储液的DMSO。通过在使用前加入激素，你可以将渗透培养基在渗透前作为储液保存至少1星期。
-本发明人推荐在渗透培养基中加入0.01％silwet以便增加转化效率，特别是对于Landsberg和colombia生态型来说。(silwet来自LEHLE SEEDS，目录号VIS-01 VAC-IN-STUFF(silwet L-77))。
卡那霉素/潮霉素筛选方案：
1.对种子杀菌。
2.将种子悬浮在无菌的7％的55℃上层琼脂中(每ml含125颗种子)，边旋转边倒在选择平板上(象铺噬菌体一样)。在层流罩超静台中干燥平板直到倾斜平板时种子不再流动。对于正常的9×9cm平板，625个种子是合适的(5ml)。更高的密度可能使确定阳性植物的位置变得困难，因为抗生素选择的效率将降低。
3.在冷室中将植物于4℃春化2个晚上。使平板转移到培养箱中。
4.在大约7天后转化子应可以清晰地鉴别，为暗绿色的植物带有健康的绿色次生叶，根伸入到选择性培养基中。根的生长是最好的标志。
5.将小植株移植到土壤中，培养植物，收集种子。移植的成功率可以通过下面的方法提高：a)在选择性平板中使用7％琼脂，因为这更容易拔出根而不带起琼脂块或断裂；b)在移植后用水饱和土壤；以及c)在圆顶容器下培养植物(使用Aracon种子收集器在第一或第二天维持高的湿度。如果你将根弄断了，移植前将小植株在新的选择性平板上放置几天)。
选择性平板：
1×Murashige&Skoog盐
1％蔗糖
用1M KOH将pH调整到5.7
0.7％Difco琼脂
高压灭菌，冷却，然后加入：
1X MS维生素(SIGMA#M-7150，取1ml 1000×储液，储液通过将10.3g维生素溶解在100ml水中制得)。
抗生素(卡那霉素50mg/l)
上层琼脂：
1×Murashige&Skoog盐
1％蔗糖
用1M KOH将pH调整到5.7
0.7％Difco琼脂
高压灭菌
使用前在微波炉中煮沸，保持在50-55℃的水浴中。
YEP培养基(液体)：
10g/l细菌用胰蛋白胨(Difco)
10g/l酵母提取物(Difco)
5g/l NaCl
对于YEP平板来说加入15g/l Difco细菌琼脂。
次氯酸溶液：50ml
4ml 15％次氯酸钠
2551 Tween-20
加水到50ml
LUC成像
荧光素酶分析CCD相机
该方案被Meier等2000所描述。
荧光素制备：
D-荧光素钾盐(Hemica ALTA Ltd#0572)
储液：50μM(分子量318.4)将0.159g溶解在水中，分装在eppendorf管中，每管1ml(-80℃储存)。
工作浓度：5μM
10ml工作溶液的制备
1ml储液
9ml水
5μl 20％Triton X-100
过滤除菌(20μm滤膜)
工作溶液配制后储存在4℃最多2星期。
荧光素通过喷雾施加到平板上。对于9cm的平板来说使用200μl工作溶液。这应该在通风橱中进行。
所有产生的GMO植物被维持在下列的条件下：
土壤和生长条件
土壤混合物：
100l K土壤(Weillbφll，瑞典)
6l珍珠岩
6l蛭石
300g Osmocote(Scotts，3-4个月的释放时间，NPK 15-15-11)。
罐：9×9cm塑料罐，方形，用于真空渗透。
罐：4.5×4.5塑料罐，用于单个植株。
为了培养和收集单个植株的种子，使用了Aracon系统(#AS-0007Betha Tech)。
生长条件：
组织培养：21℃温室
温度：21℃
湿度：60％
长日照：20小时光/4小时暗
温室：
温度：
湿度：95％
长日照13小时
培养箱1：
短日照8小时
温度20℃
湿度：60％
培养箱2：
长日照14小时
温度20℃
湿度：60％
阿拉伯芥(Arabidopsis)植物的杂交
(花的emmansculation和花的受精准备)
在进行上述实验前，成熟的花必须出现在抽苔的阿拉伯芥植物上。
1.受粉花(子房)的准备
目的是为了除去除了子房之外所有的花的部分。
选择一个花序，除去所有太幼小的花和已经显示出白色花瓣的花(开放的花趋于已经开始自体受精)。从花序上切除所有太幼小或太老的花，在中间留下3-10朵花使用。
切除临近的其它所有植物部分，特别是角果。其目的是为了有尽可能宽松的工作环境。
当从花上切除部分时，不要将这些部分撕下。花是娇弱的，容易被损坏。实践中可以获得关于它们能够承受多少的良好感觉。
这个步骤可以使用非常小的镊子INOX1来进行。
在花之间，将镊子浸泡在95％乙醇然后在蒸馏水中来清洁它们。
当在解剖镜上观察花时使用kim-wipe无尘纸作为表面。这可以帮助将花的部分保留在纸上而不是镊子上。
2.获得花粉
获得完全成熟的花，除去雄蕊。用这些雄蕊刷制备的子房。重复这个步骤至少2次以确保在花的尖端有足够的花粉。这在通过解剖镜观察子房时是明显的，因为在绿色的子房顶端花粉看起来象粒状的棕色表面。
3.相应地标记杂交，用Raynolds 905 sahran-wrap包装纸包裹子房，以确保不会发生交叉污染。
4.在收获之前使子房继续发育直到它们开始变黄。如果太干燥，它们的种子会脱落。
质粒构建体中的选择性标记
抗生素选择性标记(卡那霉素/潮霉素)通过同源重组用其它的选择系统(LUC，GFP)代替(Court等，2002)。只有带有卡那霉素/潮霉素作为选择性标记的质粒被图示(图1-图30)。
实施例1、用于CHS-PAP报告系统的质粒构建体
pap1(产生花青甙色素1，GeneBank登记号AF325123)和pap2(产生花青甙色素2，GeneBank登记号AF325124)MYB转录因子(Borevitz等，2000)cDNAs通过LR-PCR(长距离)获得，使用RTth聚合酶和下列引物，pap1正向引物5’-AAGGATCCATGGAGGGTTCGTCCAAAGGGCTGCGA-3′和反向引物5’-AACCTAGGCTAATCAAATTTCACAGTCTCTCCATC-3′，以及PAP2正向引物5’-AAGGATCCATGGAGGGTTCGTCCAAAGGGTGAGG-3′和反向引物5’-AACCTAGGCAGACTCCAAAGTTGCTCAACGTCAAACGC-3′。扩增的序列通过限制酶消化进行检查，获得的序列加尾，然后连接到pGEM-T-easy载体中(Promega试剂盒#A1360)。使用ABI毛细管测序仪和大染料系统(#A016)对阳性克隆进行测序，以便证实扩增到了正确的序列，并且没有引入错误。两个基因使用EcoRI切割，切下的片段用绿豆核酸酶平末端化。这些平端的片段被连接到Cambria转化载体1302中。PAP1(图1)和PAP2(图2)被插入到35S启动子的3’端。1302载体事先用BglII/NheI消化切除gfp*5基因，载体被平末端化，以及按照制造商的说明用CIP(牛肠磷酸酶)处理。CHS(三羟基黄烷酮-查耳酮合成酶)GeneBank登记号AY044331，编码tt4蛋白。CHS的cDNA采用与上述的PAP1和PAP2基因相同的步骤获得，使用正向引物5′-ATGGTGATGGCTGGTGCTTCTTCTT-3’和反向引物5’-TTAGAGAGGAACGCTGTGCAAGAC-3′。PCR产物加尾，然后连接到pGEM-T-easy载体中。然后CHS基因用NotI消化切下，纯化的片段用绿豆核酸酶平末端化，并连接到Pbs35S-E9克隆载体中(图3)。该构建体的产生是为了启动子的克隆。然后用Sma I切下35S-CHS-E9片段，将片段连接到用Sma I切割并用CIP处理的cam1302载体中，产生了Cam 35S-CHS-E9转化构建体(图4)。
实施例2、用于重金属检测的质粒构建体
GSH1 5’UTR
下面给出的是重金属检测系统的一个例子，但是不限于这些重金属调控的启动子。GSH(γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶，GeneBank登记号AF0682299)(Cobbett等，1994)的5′UTR(启动子)通过LR PCR获得，使用正向引物5′-GGTGATATATAGCCATAATTGTGTT-3’和反向引物5’-GGTATATATAGCTCCTGCAATTATA-3′。扩增的序列跨度1185bp，从-1183到+2。获得的片段加尾，并连接到pGEM-T-easy载体中，然后测序。
为了检查启动子的调控，GSH启动子片段作为BamHI/BglII片段被插入到ω引导肽和ff-LUC基因的前方，它们是用BamHI切开Vipll-ω-LUC载体并用CIP处理后得到的(图5)。
GSH启动子片段作为来自T-easy载体的NcoI/SalI片段被切下。cam1302载体用Ncol/Sall酶切释放出35S启动子，留下GFP-Nos用于与GSH片段连接。这样得到构建体GSH-GFP-Nos(图6)。
GSH1启动子片段以NcoI/Sal I片段从T-easy载体切下，并用绿豆核酸酶平末端化。平末端的片段被插入Stu I位点得到序列盒pGSH1-CHS-E9。这个序列盒用Kpnl消化释放出来，片段被克隆到cam2200转化载体的Kpnl位点中(图7)。
GSH2 5′UTR(谷胱苷肽合成酶，GeneBank登记号X83411)的扩增使用下列引物组合：正向引物5’-GATATCAAGAGGATAAGAGGATTGTGTTGGA-3’(EcoR V接头)和反向引物5’-AGATCTCTTAAATGATCTCCCACACCTCAAA-3’(BglII接头)。用EcoRV/BglII消化pGEMT-easy载体释放出pGSH2从-712到-1(711bp)的启动子片段。获得的片段取代Bracon3质粒中的35S启动子，产生Pbs-pGSH2-CHS-E9序列盒。该序列盒用KpnI消化切下。将该序列盒连接到cam2200转化载体的Kpnl位点中。下面的构建体以这种方式产生(图8)。
PCS1 5′UTR(GeneBank登记号AF461180)从基因组DNA上通过LR-PCR扩增，使用下列引物：正向引物5’-GATATCAACTTTTTTGCTTCTCCTTTTTCAA-3’(EcoR V接头)和反向引物5’-AGATCTTTTTCACTGCTTGTTTTGGTATCTA-3’(BglII接头)。获得的从-915到-1(914bp)的片段被加尾并连接到pGEMT-easy载体中，然后测序以证实扩增了正确的基因。通过用EcoRV和Bgl II消化释放出插入片段。前面本发明人已经制备了Bracon3载体，用EcoRV和Bgl II切除35S启动子，将载体用凝胶纯化。连接产生了Pbs-pPCS1-CHS-E9序列盒，通过用Kpn I消化Pbs-pPCS1-CHS-E9质粒，然后将该序列盒插入到Cam2000载体的KpnI位点中可以将该序列盒转移到Cam2000转化载体中(图9)。
PCS2 5′UTR(GeneBank登记号AY044049)启动子从基因组DNA上扩增，使用下列引物组合：正向引物5’-GTTAACGATTCGACTCGGTCACGTGATATAC-3’(HpaI接头)和反向引物5’-AGATCTGTCAGAGTTTGACTATGGAGCAAAC-3’(BglII接头)。获得的跨越基因组序列从-875到-2的片段(973bp)被加尾并连接到pGEMT-easy载体中。通过用限制性酶HpaI和BglII消化释放出pPCS2片段。HpaI/BglII片段被连接到Bracon3质粒中从而取代了35S启动子，它是通过用EcoRV和Bgl II切割Bracon3质粒，然后将载体用凝胶分离而除去的。连接产生了Pbs-pPCS2-CHS-E9序列盒，通过用Kpn I消化该质粒而切下该序列盒，并将该片段连接到cam2000TDNA载体的KpnI位点中(图10)。
GST30 5′UTR(拟南芥中的谷胱苷肽-S-转移酶家族，与玉米的Bronze2基因同源，GeneBank登记号AF288191)被扩增，使用下列引物组合：正向引物5′-GATATCATAATTATGTCAATCTTGCGTGTTT-3′(EcoRV接头)和反向引物5’-AGATCTTTTCTCTTCAAAATCCAAAACAGAG-3’(BglII接头)。扩增产物从-1051到-1(1050bp)用限制性酶切检查，被加尾并连接到pGEMT-easy载体中。下一步用EcoRV和Bgl II消化释放出pGST30的启动子片段。这个粘性末端的片段连接到Bracon3的EcoRV和Bgl II位点中，Bracon3事先用EcoRV和Bgl II切除了35S启动子并通过凝胶分离。连接产生了pGST30-CHS-E9序列盒，该序列盒通过KpnI被移入转化载体中(图11)。
CAD1 5′UTR(植物螯合肽合成酶，GeneBank登记号AF135155)从基因组DNA上通过LR-PCR扩增，使用下列引物：正向引物5’-GATATCTAGGCCTTGTAATATTTTTGATGAA-3′(EcoRV接头)和反向引物5’-AGATCTTTTTCACTGCTTGTTTTGGTATCTA-3’(BglII接头)。扩增产物被加尾并连接到pGEMT-easy载体中。从819到-1的启动子片段(818bp)通过用EcoRV和Bgl II消化质粒而切下，纯化的片段被连接到Bracon3相应的位点中。含有35S-CHS-E9的Bracon3构建体事先用EcoRV和BglII消化释放出35S启动子，将载体通过凝胶纯化而制备。连接用CAD1基因的启动子取代了35S启动子。PCAD1-CHS-E9序列盒用KpnI消化切下，并将该序列盒连接到cam2000的Kpn I位点中(图12)。
实施例3、用于重金属结合的质粒构建体
GSH-1 cDNA(谷氨酸-半胱氨酸连接酶叶绿体同工型，GeneBank登记号Z29490)被扩增，使用正向引物5’-GTTAACATGGCGCTCTTGTCTCAAGCAGGAG-3′(HpaI接头)和反向引物5’-GTTAACTTATAGACACCTTTTGTTCACGTCC-3’(HpaI接头)。扩增片段被加尾并连接到pGEMT-easy载体中。用HpaI消化释放出GSH1 cDNA，将该片段连接到Pbs35S-E9克隆载体的Stu I位点中。用Sma 1消化质粒获得35S-GSH1-E9序列盒。该Sma I片段被插入到转化载体Cam2300的Sma I位点中(图13)。
GSH-2 cDNA(谷胱苷肽合成酶，GeneBank登记号X83411)通过长距离PCR从花的cDNA文库中进行扩增，使用下列引物组合：正向引物5’-GTTAACATGGAATCACAGAAACCCATTTTCG-3′(HpaI接头)和反向引物5’-GTTAACTCAATTCAGATAAATGCTGTCCAAG-3’(HpaI接头)。获得的片段被加尾并连接到pGEMT-easy载体中。用HpaI消化质粒切下插入片段，该平末端的片段被插入到定制的载体Pbs35S-E9中。用Sma 1消化质粒获得35S-GSH2-E9序列盒。该SmaI片段被插入到转化载体Cam2300的Sma I位点中(图14)。
CAD-1 cDNA(植物螯合肽合成酶， Ha等1999，GeneBank登记号AF135155)cDNA通过LR PCR使用下列带接头的引物获得：正向引物5′-GGATCCATGGCTATGGCGAGTTTATATGC-3’(BamHI接头)和反向引物5′-GCTAGCCTAATAGGCAGGAGCAGCGAGAT-3’(Nhe I接头)。该cDNA使用来自花的cDNA文库扩增。获得的cDNA被加尾并克隆到pGEMT-easy载体中，然后测序以证实扩增到了正确的基因。用EcoRI切下CAD1 cDNA，放出的片段使用绿豆核酸酶进行平末端化。该平末端的片段被连接到Pbs 35S-E9载体中，该载体事先用Stu I酶切并用CIP处理得到了脱磷酸化的平末端载体。用Sma I消化释放出完整的35S-CAD1-E9序列盒。转入Cam2300的Sma I位点，给出图15所示的构建体。
Nramp-1 cDNA(GeneBank登记号AF165125)通过LR-PCR使用下列带接头的引物获得：正向引物5′-AGATCTATGGCGCTACAGGATCTGGACG-3’(Bgl II接头)和反向引物5′-GCTAGCTCAGTCAACATCGGAGGTAGATA-3’(Nhe I接头)。扩增产物被克隆到pGEMT-easy载体系统中(Promega)并测序。测序后，用Not I限制性酶消化释放出cDNA，并用绿豆核酸酶进行平末端化。该平末端的片段被连接到Pbs 35S-E9载体中，该载体事先用Stu I酶切并用CIP处理得到了脱磷酸化的平末端载体。用Sma I消化切下35S-Nramp1-E9序列盒，连接到2300 Cambria载体的Sma I位点中。该构建体显示在图16中。
Nramp-2 cDNA(GeneBank登记号AF141204，Alonso等1999)通过与上述相同的方法获得，使用正向引物5′-CCATGGATGGAAAACGACGTCAAAGAGAA-3’(NcoI接头)和反向引物5′-GCTAGCCTAGCTATTGGAGACGGACACTC-3’(Nhe I接头)。用Not I从T-Easy载体上切下Nramp2 cDNA然后平末端化，平末端的片段被连接到Pbs35S-E9载体的Stu I位点中。用Kpn I消化载体切下35S-Nramp2-E9序列盒。该序列盒被连接到Cambria 2300的Kpn I位点中，如图17所示。
PCS-1 cDNA(GeneBank登记号AF461180)全长的cDNA通过LR-PCR使用下列引物获得：正向引物5′-GGATCCATGGCTATGGCGAGTTTATATCG-3′(BamH I接头)和反向引物5′-GCTAGCCTAATAGGCAGGAGCAGCGAGAT-3′(Nhe I接头)。PCR产物用Taq聚合酶加尾，然后连接到pGEM-T-Easy中，测序，通过用EcoRl酶从pGEM-T-Easy载体上切下该片段，用绿豆核酸酶使片段平末端化，并将片段连接到Stu I位点中，从而将片段移动到克隆载体Pbs35S-E9中。用Sma I消化载体释放出35S-PCS1-E9序列盒，将该序列盒克隆到Cam2300转化载体的Sma I位点中，如图18所示。
PCS-2 cDNA(GeneBank登记号AY044049)通过LR-PCR使用下列引物组合扩增：正向引物5′-GTTAACATGTCTATGGCGAGTTTGTATCGG-3′(Hpa I接头)和反向引物5′-GTTAACTTAGGCAGGAGCAGAGAGTTCTTC-3′(Hpa I接头)。获得的片段加尾，并连接到pGEM-T-Easy载体中。用Hpa I消化释放出PCS2 cDNA，将分离的片段连接到Pbs35S-E9的Stu I位点中。用Kpn I消化质粒抽提35S-PCS2-E9序列盒，将该序列盒连接到Cam2300转化载体的Kpn I位点中(图19)。
实施例4、用于检测含氮化合物的质粒构建体
Nr-1 5′UTR(硝酸还原酶1，GeneBank登记号AC012193)使用下列引物组合扩增：正向引物5′-GATATCCTTGAGTCATACATCTATGATA-3′(EcoRI接头)和反向引物5′-AGATCTCCATGGTTTAGTGATTGAACCGGTG-3′(Bgl II接头)。扩增的片段(pNr1)在基因组序列上从-1574到-1，产生1573bp的片段。扩增的片段pNr1加尾，并连接到pGEM-T-Easy载体中。用EcoR V/BglII消化质粒释放出启动子片段。同时用EcoR V/Bgl II消化质粒Pbs35S-CHS-E9(参见图4)，释放出35S启动子，该载体被凝胶分离，并将pNr1片段连接到Pbs-CHS-E9载体中。用Kpn I消化构建体切下pNr1-CHS-E9序列盒。切下的序列盒片段连接到cam2200的Kpn I位点中，得到图20显示的构建体。
Nr-2 5′UTR(硝酸还原酶2，GeneBank登记号X13435)通过LR-PCR从基因组DNA上使用下列引物扩增：正向引物5′-GATATCGATAATTCTTTAATTTACTGG-3′(EcoRV接头)和反向引物5′-GGATCCGCTAATATGTGAAAGGTTGTAC-3′(BamH I接头)。扩增的片段加尾，并连接到pGEM-T-Easy载体中。从-805到+3的pNr2启动子片段用EcoR V/BamH I消化pGEM-T-Easy载体后释放出来。获得的片段取代了Bracon3质粒中的35S启动子，产生Pbs-pNr2-CHS-E9序列盒。用Kpn I消化切下这个序列盒，将该序列盒连接到cam2200转化载体的Kpn I位点中。图21中的构建体就是以这种方式产生的。
Nil 5′UTR(亚硝酸还原酶，GeneBank登记号511655)的启动子从基因组DNA上使用下列引物组合扩增：正向引物5′-GTTAACCCCTAATGACCACATCAACCTTG-3′(Hpa I接头)和反向引物5′-AGATCTGATGATGGCGGAAGAAGGAG-3′(Bgl II接头)。获得的片段在基因组序列上从-999到-1(998bp)，该片段被加尾，并连接到pGEM-T-Easy载体中。用限制性酶Hpa I和Bgl II消化释放出pNii片段。Bracon3质粒用EcoR V/BglII消化除去35S启动子后，将pNii连入位点，产生pNii-CHS-E9序列盒。用Kpn I消化带有该序列盒的质粒，将该序列盒连接到cam2200转化载体的Kpn I位点中(图22)。
Ntr-2-1 5′UTR(高亲和性硝酸转运蛋白ACH2 GeneBank登记号AF019749)通过LR-PCR从基因组DNA上使用下列引物扩增：正向引物5′-GATATCCCAAAGCAGCAACCATTTTTCC-3′(EcoR V接头)和反向引物5′-AGATCTGTATTTTAAACGTATCAAGTTCC-3′(Bgl II接头)。扩增的片段被加尾，并连接到pGEM-T-Easy载体中。pNtr-2-1启动子片段从-974到-1，它通过用EcoR V/Bgl II消化pGEM-T-Easy载体而被释放。用获得的片段取代Bracon3质粒中的35S启动子。这是通过用EcoR V/Bgl II消化Bracon3质粒，然后分离载体而完成的。将pNtr-2-1片段连接到分离的载体中产生了PBS-pNtr2-1-CHS-E9序列盒。用KpnI消化切下该序列盒，并将它连接到cam2200转化载体的KpnI位点中。图23中的构建体就是通过这种方法产生的。
实施例5、用于还原含氮化合物的质粒构建体
Nr-1 cDNA(硝酸还原酶1，GeneBank登记号AC012193)使用下列引物组合扩增：正向引物5′-GTTAACATGGCGACCTCCGTCGATAAC-3′(HpaI接头)和反向引物5′-GTTAACCTAGAAGATTAAGAGATCCTCC-3′(HpaI接头)。扩增的片段加尾，并连接到pGEM-T-Easy载体中。用Hpa I消化释放出Nr-1cDNA，并连接到PBS35S-E9克隆载体的Stu I位点中。用Kpn I消化质粒获得35S-Nr1-E9序列盒。该Kpn I片段被插入cam2300转化载体的Kpn I位点中(图24)。
Nr-2 cDNA(硝酸还原酶2，GeneBank登记号X13435)通过LR-PCR使用cDNA文库作为模板和下列引物组合获得：正向引物5′-GTTAACTCGGCTGACGCGCCTCCTAGTC-3′(HpaI接头)和反向引物5′-GTTAACGAATATCAAGAAATCCTCCTTG-3′(HpaI接头)。扩增的片段加尾，并连接到pGEM-T-Easy载体中。用Hpa I消化释放出Nr-2cDNA，得到平末端的片段，该片段被连接到PBS35S-E9克隆载体的Stu I位点中。用Kpn I消化Pbs35S-Nr2-E9质粒获得35S-Nr2-E9序列盒。该Kpn I片段被插入cam2300转化载体的Kpn I位点中(图25)。
Nii cDNA(拟南芥的亚硝酸还原酶，GeneBank登记号511655)使用下列引物组合从花的cDNA文库中扩增：正向引物5′-GTTAACATGACTTCTTTCTCTCTCACTTTCA-3′(HpaI接头)和反向引物5′-GTTAACTCAATCTTCATTCTCTTCTCTTTCT3′(HpaI接头)。获得的片段加尾，并连接到pGEM-T-Easy载体中。用HpaI消化质粒切下插入片段，该平末端的片段被插入定制的载体PBS 35S-E9中。用Sma I消化切下35S-Nii-E9序列盒。该Sma I片段被连接到Cam2300的Sma I位点中(图26)。
Nrt-2-1 cDNA(拟南芥的高亲和性硝酸转运蛋白ACH2，GeneBank登记号AF019749)通过LR-PCR使用下列引物组合扩增：正向引物5′-GTTAACATGGGTTCTACTGATGAGCCCAGAA-3′(HpaI接头)和反向引物5′-GTTAACTCAAGCATTGTTGGTTGCGTTCCCT-3′(HpaI接头)。获得的片段加尾，并连接到pGEM-T-Easy载体中。用HpaI消化质粒释放出插入片段，该平末端的片段被插入定制的载体PBS 35S-E9中。用Sma I消化切下35S-ACH2-E9序列盒，并转移到Cam2300转化载体中。
下面的cDNA采用同样的步骤(图27)。
XenA cDNA(异生物质还原酶A，GeneBank登记号AF154061)使用下列引物组合扩增：正向引物5′-GTTAACATGTCCGCACTGTTCGAACCCTACA-3′(HpaI接头)和反向引物5′-GTTAACTCAGCGATAGCGCTCAAGCCAGTGC-3′(HpaI接头)。扩增的片段加尾，并连接到pGEM-T-Easy载体中。用HpaI消化质粒释放出XenA cDNA，得到平末端的片段，该片段被连接到Pbs35S-E9克隆载体的Stu I位点中。用Kpn I消化Pbs35S-XenA-E9质粒切下35S-XenA-E9序列盒。该Kpn I片段被插入Cam2300转化载体的Kpn I位点中(图28)。
XenB cDNA(异生物质还原酶B，GeneBank登记号AF154062)使用下列引物组合扩增：正向引物5′-GTTAACATGGCAATCATTTTCGATCCGATCA-3′(HpaI接头)和反向引物5′-GTTAACTTACAGCGTCGGGTAGTCGATGTAG-3′(HpaI接头)。获得的片段加尾，并连接到pGEM-T-Easy载体中。用HpaI消化释放出插入片段，该平末端的片段被插入定制的载体PBS 35S-E9中。用SmaI切下35S-XenB-E9序列盒，并转移到Cambria 2300转化载体中(图29)。
Onr cDNA(季戊四醇四硝酸酯还原酶，GeneBank登记号U68759)使用下列引物组合扩增：正向引物5′-GTTAACATGGCCGCTAAAAG-3′(HpaI接头)和反向引物5′-GTTAACGCTATCAATGTACAAAGC-3′(HpaI接头)。获得的片段加尾，并连接到pGEM-T-Easy载体中。用HpaI消化释放出插入片段，该平末端的片段被插入定制的载体PBS35S-E9中。用Kpn I切下35S-Onr-E9序列盒，并通过将该序列盒连接到Cam2300转化载体的Kpn I位点中而使该序列盒转移到Cambria中(图30)。
实施例6、植物的转化
下列的构建体被转化到野生型背景中(Bra W+，一种生长在丹麦哥本哈根附近的生态型)。
PAP1  cDNA            35S-PAP1-E9
PAP2  cDNA            35S-PAP2-E9
T1株系在潮霉素上筛选，选择红色的植株。被选出的T2株系被重新种植到抗生素上，basta标记以1∶3比例分离的植物株系(25％敏感和75％抗性的植物)被繁殖用于以后的工作，即1∶3表明单一位点的T-DNA整合。12个抗性植物被转移到土壤中结籽。T3的种子被重新种植，将表现出100％抗性的植物(选择性标记的纯合子)与tt4突变株杂交。在这个杂交中，tt4x35S-PAP1-E9的F1代种子被涂铺在basta上，12株barf植株被转移到土壤中。从杂交得到的分离的种群显示出明显的红色或绿色表型。在F2代中，不显示出颜色并对潮霉素有抗性的植株被选出并繁殖以结籽。F2种群的分离分析显示出偏离于对T-DNA预期的3∶1的比率(35S-PAP1-E9是显性的)，因此如果tt4突变与T-DNA是独立的，预期将有75％的植株是红色的。观察到的绿色∶红色的比率是230∶163，表明分离不是独立的。在分离种群的绿色个体中，barr和bars的表型都有，证明了在绿色个体中存在T-DNA，这支持了下列基本原理，即tt4突变在这些植物中阻断了色素(花青甙)的产生。在F2代的239个绿色个体中barr和bars的植物的分配是162∶77。从绿色barr个体中获得的种子的种皮显示出特征性的tt4表型。F3代被重新种植，最后选择出对选择性标记显示有100％抗性的植株。通过这种方法产生了具有tt4/tt4//35S-PAP1/35S-PAP1表型的植物。对35S-PAP2进行同样的步骤，最后获得了tt4/tt4//35S-PAP2/35S-PAP2植株。将这两个株系杂交，因为两个株系都是tt4突变的纯合子，所有的子代都是tt4突变株，使用35S正向引物和PAP1和PAP2反向引物通过PCR选择出表型为tt4/tt4//35S-PAP1/35S-PAP1//35S-PAP2/35S-PAP2株系。该株系被命名为BrC株系( Bracifeae  Cassette  Line)。
下列构建体被转化到BrC株系中：
重金属检测
GSH1-CHS
GSH2-CHS
PCS1-CHS
PCS2-CHS
GST30-CHS
CAD1-CHS
重金属结合
35S-GSH1-E9
35S-GSH2-E9
35S-CAD1-E9
35S-Nramp1-E9
35S-Nramp2-E9
35S-PCS1-E9
35S-PCS2-E9
含氮化合物检测
Nr1-CHS
Nr2-CHS
Nii-CHS
Ntr2-1-CHS
含氮化合物代谢
35S-Nr1-E9
35S-Nr2-E9
35S-Nii-E9
35S-Nrt12-1-E9
35S-XenA-E9
35S-XenB-E9
35S-Onr-E9
下列构建体被转化到BraW+和Col-0株系中：
重金属检测
GSH1-CHS
GSH2-CHS
PCS1-CHS
PCS2-CHS
GST30-CHS
CAD1-CHS
GSH1-LUC
GSH2-LUC
PCS1-LUC
PCS2-LUC
GST30-LUC
CAD1-LUC
GSH1-GFP
GSH2-GFP
PCS1-GFP
PCS2-GFP
GST30-GFP
CAD1-GFP
重金属结合
35S-GSH1-E9
35S-GSH2-E9
35S-CAD1-E9
35S-Nramp1-E9
35S-Nramp2-E9
35S-PCS1-E9
35S-PCS2-E9
含氮化合物检测
Nr1-CHS
Nr2-CHS
Nii-CHS
Ntr2-1-CHS
Nr1-LUC
Nr2-LUC
Nii-LUC
Ntr2-1-LUC
Nr1-GFP
Nr2-GFP
Nii-GFP
Ntr2-1-GFP
含氮化合物代谢
35S-Nr1-E9
35S-Nr2-E9
35S-Nii-E9
35S-Nrt12-1-E9
35S-XenA-E9
35S-XenB-E9
35S-Onr-E9
实施例7、重金属检测系统在植物中的测试
下列构建体被转化到BrC株系中：
GSH1-CHS
GSH2-CHS
PCS1-CHS
PCS2-CHS
GST30-CHS
CAD1-CHS
获得的转化株系在含有增量的下列重金属的MS平板上测试：Cu、Zn、Cd、Hg、Pb、Co、Cr、Ni、As、Be、Se、Au、Ag，浓度范围为0.00025、0.0005、0.001、0.0015、0.002、0.0025、0.003、0.004、0.005、0.006、0.007、0.008、0.009、0.01、0.02、0.03、0.04、0.05、0.06、0.07、0.08、0.09，例如0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6，例如0.7、0.8、0.9、1，例如2、3、4、5、6、7、8、9、10mM。通过这种方法本发明人筛选到了在不同重金属浓度下改变颜色的株系，同时研究了不同启动子对重金属范围的反应，即单个启动子的特异性。同时使用装有土壤的9英寸的罐进行了实验。这些罐用重金属溶液浇灌，重金属的浓度范围和种类与上述的平板实验相同。
实施例8、含氮化合物检测系统在植物中的测试
下列构建体被转化到BrC株系中：
Nr1-CHS
Nr2-CHS
Nii-CHS
Ntr2-1-CHS
获得的转化株系在含有增量的下列含氮化合物的MS平板上测试它们产生颜色变化的能力：TNT(2，4，6-三硝基甲苯)、PETN(季戊四醇四硝酸酯)或RDX(环三次甲基三硝基胺)，浓度范围为0.00025、0.0005、0.001、0.0015、0.002、0.0025、0.003、0.004、0.005、0.006、0.007、0.008、0.009、0.01、0.02、0.03、0.04、0.05、0.06、0.07、0.08、0.09、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10mM。基于在不同浓度观察到的颜色改变来选择株系。为了确定土壤的缓冲效果，用生长在带有土壤的9英寸罐中的植物进行了同样的实验。
实施例8a
用Nii-CHS-E9构建体转化Brc株系。将Nii-CHS-E9(T1)株系生长在补充有0.01mM TNT的MS平板中。植物发展为明显的红色。两星期后，将植物转移到不含TNT的土壤中，颜色逐渐消退。
实施例9、重金属结合的测试
为了增强积累重金属的能力，将下列构建体转化到Brc株系中：
35S-GSH1-E9
35S-GSH2-E9
35S-CAD1-E9
35S-Nramp1-E9
35S-Nramp2-E9
35S-PCS1-E9
35S-PCS2-E9
带有重金属结合构建体的转化株系对植物的气生部分增加重金属浓度的能力进行测试。种子被铺在含有增量的下列重金属的MS平板上：Cu、Zn、Cd、Hg、Pb、Co、Cr、Ni、As、Be、Se、Au、Ag，浓度范围为0.000、0.00025、0.0005、0.001、0.0015、0.002、0.0025、0.003、0.004、0.005、0.006、0.007、0.008、0.009、0.01、0.02、0.03、0.04、0.05、0.06、0.07、0.08、0.09，例如0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6，例如0.7、0.8、0.9、1，例如2、3、4、5、6、7、8、9、10mM。样品通过标准的重金属分析方法进行分析。显示出高、中、低结合性的株系被筛选出来，与重金属检测植株杂交。
实施例10、含氮化合物代谢的测试
将下列构建体转化到Brc株系中：
35S-Nr1-E9
35S-Nr2-E9
35S-Nii-E9
35S-Nrt12-1-E9
35S-XenA-E9
35S-XenB-E9
35S-Onr-E9
获得的转化株系在含有增量的下列含氮化合物的MS平板上测试：TNT(2，4，6-三硝基甲苯)、PETN(季戊四醇四硝酸酯)或RDX(环三次甲基三硝基胺)，浓度范围为0.00025、0.0005、0.001、0.0015、0.002、0.0025、0.003、0.004、0.005、0.006、0.007、0.008、0.009、0.01、0.02、0.03、0.04、0.05、0.06、0.07、0.08、0.09、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10mM。对炸药显示出较大/或较小抗性的植株被选择出来进行进一步分析，并与含氮化合物检测株系杂交。
实施例11、将植株杂交以获得重金属检测和结合能力
显示出较高重金属含量的株系与检测株系杂交，产生了下列的杂交株：
GSH1-CHS/35S-GSH1-E9
GSH1-CHS/35S-GSH1-E9/35S-GSH2-E9
GSH1-CHS/35S-GSH1-E9/35S-GSH2-E9/35S-CAD1-E9
GSH1-CHS/35S-GSH1-E9/35S-GSH2-E9/35S-CAD1-E9/35S-Nramp1-E9
GSH1-CHS/35S-GSH1-E9/35S-GSH2-E9/35S-CAD1-E9/35S-Nramp1-E9/35S-Nramp2-E9
GSH1-CHS/35S-GSH1-E9/35S-GSH2-E9/35S-CAD1-E9/35S-Nramp1-E9/35S-Nramp2-E9/35S-PCS1-E9
GSH1-CHS/35S-GSH1-E9/35S-GSH2-E9/35S-CAD1-E9/35S-Nramp1-E9/35S-Nramp2-E9/35S-PCS1-E9/35S-PCS2-E9
GSH2-CHS/35S-GSH1-E9
GSH2-CHS/35S-GSH1-E9/35S-GSH2-E9
GSH2-CHS/35S-GSH1-E9/35S-GSH2-E9/35S-CAD1-E9
GSH2-CHS/35S-GSH1-E9/35S-GSH2-E9/35S-CAD1-E9/35S-Nramp1-E9
GSH2-CHS/35S-GSH1-E9/35S-GSH2-E9/35S-CAD1-E9/35S-Nramp1-E9/35S-Nramp2-E9
GSH2-CHS/35S-GSH1-E9/35S-GSH2-E9/35S-CAD1-E9/35S-Nramp1-E9/35S-Nramp2-E9/35S-PCS1-E9
GSH2-CHS/35S-GSH1-E9/35S-GSH2-E9/35S-CAD1-E9/35S-Nramp1-E9/35S-Nramp2-E9/35S-PCS1-E9/35S-PCS2-E9
PCS1-CHS/35S-GSH1-E9
PCS1-CHS/35S-GSH1-E9/35S-GSH2-E9
PCS1-CHS/35S-GSH1-E9/35S-GSH2-E9/35S-CAD1-E9
PCS1-CHS/35S-GSH1-E9/35S-GSH2-E9/35S-CAD1-E9/35S-Nramp1-E9
PCS1-CHS/35S-GSH1-E9/35S-GSH2-E9/35S-CAD1-E9/35S-Nramp1-E9/35S-Nramp2-E9
PCS1-CHS/35S-GSH1-E9/35S-GSH2-E9/35S-CAD1-E9/35S-Nramp1-E9/35S-Nramp2-E9/35S-PCS1-E9
PCS1-CHS/35S-GSH1-E9/35S-GSH2-E9/35S-CAD1-E9/35S-Nramp1-E9/35S-Nramp2-E9/35S-PCS1-E9/35S-PCS2-E9
PCS2-CHS/35S-GSH1-E9
PCS2-CHS/35S-GSH1-E9/35S-GSH2-E9
PCS2-CHS/35S-GSH1-E9/35S-GSH2-E9/35S-CAD1-E9
PCS2-CHS/35S-GSH1-E9/35S-GSH2-E9/35S-CAD1-E9/35S-Nramp1-E9
PCS2-CHS/35S-GSH1-E9/35S-GSH2-E9/35S-CAD1-E9/35S-Nramp1-E9/35S-Nramp2-E9
PCS2-CHS/35S-GSH1-E9/35S-GSH2-E9/35S-CAD1-E9/35S-Nramp1-E9/35S-Nramp2-E9/35S-PCS1-E9
PCS2-CHS/35S-GSH1-E9/35S-GSH2-E9/35S-CAD1-E9/35S-Nramp1-E9/35S-Nramp2-E9/35S-PCS1-E9/35S-PCS2-E9
GST30-CHS/35S-GSH1-E9
GST30-CHS/35S-GSH1-E9/35S-GSH2-E9
GST30-CHS/35S-GSH1-E9/35S-GSH2-E9/35S-CAD1-E9
GST30-CHS/35S-GSH1-E9/35S-GSH2-E9/35S-CAD1-E9/35S-Nramp1-E9
GST30-CHS/35S-GSH1-E9/35S-GSH2-E9/35S-CAD1-E9/35S-Nramp1-E9/35S-Nramp2-E9
GST30-CHS/35S-GSH1-E9/35S-GSH2-E9/35S-CAD1-E9/35S-Nramp1-E9/35S-Nramp2-E9/35S-PCS1-E9
GST30-CHS/35S-GSH1-E9/35S-GSH2-E9/35S-CAD1-E9/35S-Nramp1-E9/35S-Nramp2-E9/35S-PCS1-E9/35S-PCS2-E9
CAD1-CHS/35S-GSH1-E9
CAD1-CHS/35S-GSH1-E9/35S-GSH2-E9
CAD1-CHS/35S-GSH1-E9/35S-GSH2-E9/35S-CAD1-E9
CAD1-CHS/35S-GSH1-E9/35S-GSH2-E9/35S-CAD1-E9/35S-Nramp1-E9
CAD1-CHS/35S-GSH1-E9/35S-GSH2-E9/35S-CAD1-E9/35S-Nramp1-E9/35S-Nramp2-E9
CAD1-CHS/35S-GSH1-E9/35S-GSH2-E9/35S-CAD1-E9/35S-Nramp1-E9/35S-Nramp2-E9/35S-PCS1-E9
CAD1-CHS/35S-GSH1-E9/35S-GSH2-E9/35S-CAD1-E9/35S-Nramp1-E9/35S-Nramp2-E9/35S-PCS1-E9/35S-PCS2-E9
实施例12、将植株杂交以获得增加的NO2释放能力
为了增加从炸药中释放NO2的能力，产生了下列的杂交株：
Nr1-CHS/35S-Nr1-E9
Nr1-CHS/35S-Nr1-E9/35S-Nr2-E9
Nr1-CHS/35S-Nr1-E9/35S-Nr2-E9/35S-Nii-E9
Nr1-CHS/35S-Nr1-E9/35S-Nr2-E9/35S-Nii-E9/35S-Nrt12-1-E9
Nr1-CHS/35S-Nr1-E9/35S-Nr2-E9/35S-Nii-E9/35S-Nrt12-1-E9/35S-XenA-E9
Nr1-CHS/35S-Nr1-E9/35S-Nr2-E9/35S-Nii-E9/35S-Nrt12-1-E9/35S-XenA-E9/35S-XenB-E9
Nr1-CHS/35S-Nr1-E9/35S-Nr2-E9/35S-Nii-E9/35S-Nrt12-1-E9/35S-XenA-E9/35S-XenB-E9/35S-Onr-E9
Nr2-CHS/35S-Nr1-E9
Nr2-CHS/35S-Nr1-E9/35S-Nr2-E9
Nr2-CHS/35S-Nr1-E9/35S-Nr2-E9/35S-Nii-E9
Nr2-CHS/35S-Nr1-E9/35S-Nr2-E9/35S-Nii-E9/35S-Nrt12-1-E9
Nr2-CHS/35S-Nr1-E9/35S-Nr2-E9/35S-Nii-E9/35S-Nrt12-1-E9/35S-XenA-E9
Nr2-CHS/35S-Nr1-E9/35S-Nr2-E9/35S-Nii-E9/35S-Nrt12-1-E9/35S-XenA-E9/35S-XenB-E9
Nr2-CHS/35S-Nr1-E9/35S-Nr2-E9/35S-Nii-E9/35S-Nrt12-1-E9/35S-XenA-E9/35S-XenB-E9/35S-Onr-E9
Nii-CHS/35S-Nr1-E9
Nii-CHS/35S-Nr1-E9/35S-Nr2-E9
Nii-CHS/35S-Nr1-E9/35S-Nr2-E9/35S-Nii-E9
Nii-CHS/35S-Nr1-E9/35S-Nr2-E9/35S-Nii-E9/35S-Nrt12-1-E9
Nii-CHS/35S-Nr1-E9/35S-Nr2-E9/35S-Nii-E9/35S-Nrt12-1-E9/35S-XenA-E9
Nii-CHS/35S-Nr1-E9/35S-Nr2-E9/35S-Nii-E9/35S-Nrt12-1-E9/35S-XenA-E9/35S-XenB-E9
Nii-CHS/35S-Nr1-E9/35S-Nr2-E9/35S-Nii-E9/35S-Nrt12-1-E9/35S-XenA-E9/35S-XenB-E9/35S-Onr-E9
Ntr1-2-CHS/35S-Nr1-E9
Ntr1-2-CHS/35S-Nr1-E9/35S-Nr2-E9
Ntr1-2-CHS/35S-Nr1-E9/35S-Nr2-E9/35S-Nii-E9
Ntr1-2-CHS/35S-Nr1-E9/35S-Nr2-E9/35S-Nii-E9/35S-Nrt12-1-E9
Ntr1-2-CHS/35S-Nr1-E9/35S-Nr2-E9/35S-Nii-E9/35S-Nrt12-1-E9/35S-XenA-E9
Ntr1-2-CHS/35S-Nr1-E9/35S-Nr2-E9/35S-Nii-E9/35S-Nrt12-1-E9/35S-XenA-E9/35S-XenB-E9
Ntr1-2-CHS/35S-Nr1-E9/35S-Nr2-E9/35S-Nii-E9/35S-Nrt12-1-E9/35S-XenA-E9/35S-XenB-E9/35S-Onr-E9
实施例13、重金属启动子的调控
为了得到启动子的更详细的描述，在野生型BraW+和Col-0中产生了下列LUC株系：
GSH1-LUC
GSH2-LUC
PCS1-LUC
PCS2-LUC
GST30-LUC
CAD1-LUC
将它们铺在含有下列重金属的MS平板上：对照、Cu++、Ni++、Zn++、Ag++、Hg++、Cd++和Pb++，然后参照Meier等2000中描述的方法用N2冷却的CCD相机照相。在重金属处理后显示出明显的诱导的株系对单个金属的特异性进行测试。
实施例13a
将GSH1-LUC-E9构建体转化到BrC株系中。将T2植株的叶子用水、100μM Cd2+或100μM Cu2+处理30分钟，30分钟后当用N2冷却的CCD相机照相进行评估时，发现两种重金属都对启动子有诱导作用。通过在潮霉素平板上筛选转化的植株，证实了相关物种CapsellaBursa-pastoris，也可以用GSH1-启动子构建体(GSH1-GFP)转化。
实施例14、重金属启动子的表达类型
为了获得启动子的表达类型，使用共聚焦显微镜分析了在BraW+和Col-0背景中带有下列构建体的株系：
GSH1-GFP
GSH2-GFP
PCS1-GFP
PCS2-GFP
GST30-GFP
CAD1-GFP
实施例15、硝基启动子的调控
为了获得硝基启动子调控的更详细的描述，在野生型BraW+和Col-0中产生了下列LUC株系：
Nr1-LUC
Nr2-LUC
Nii-LUC
Ntr2-1-LUC
种子被铺在含有下列炸药的MS平板上：TNT(2，4，6-三硝基甲苯)、PETN(季戊四醇四硝酸酯)或RDX(环三次甲基三硝基胺)。不同的炸药的浓度分别为0.01μM、0.02μM、0.03μM、0.04μM、0.05μM。在铺板10天后用N2冷却的CCD相机对平板照相。
实施例15a
用Nii-LUC-E9构建体转化BrC株系。
用Nii-LUC-E9构建体转化的植株生长在含有增加浓度(0.01μM-0.05μμM)的TNT(2，4，6-三硝基甲苯)的MS平板上。在高浓度时植物显示出生长迟缓。图31的条形图给出了不同处理时的LUC表达/面积值，显示出了对启动子的诱导。
实施例16、硝基启动子的表达类型
为了获得启动子的表达类型，使用共聚焦显微镜分析了在BraW+和Col-0背景中带有下列构建体的株系：
Nr1-GFP
Nr2-GFP
Nii-GFP
Ntr2-1-GFP
实施例17
将大肠杆菌(C)、恶臭假单胞菌(PU)、丁香假单胞菌(SY)和荧光假单胞菌(FL)的细菌细胞生长在含有增加浓度的TNT和RDX的LB平板上。PU和FL显示出对炸药更高的抗性，表明存在还原酶ExenA和ExenB。然后将它们克隆并用于植物的转化。
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Claims (82)

1.一种在存在外部刺激物的情况下能够在植物中产生直接可监测的表型性状的报告系统，该报告系统包含一种基因，该基因编码的产物参与了对该外部刺激物的存在作出反应从而发展出所述直接可监测的表型性状。
2.权利要求1所述的报告系统，其中所述直接可监测的表型性状是该基因的表达对外部刺激物的存在作出反应而发生改变的结果。
3.权利要求2所述的报告系统，其中传感系统导致了基因表达对外部刺激物的存在作出反应而发生改变。
4.权利要求3所述的报告系统，其中的传感系统包含调控元件。
5.权利要求4所述的报告系统，其中的调控元件含有金属反应元件(MRE)，其序列选自TGCACCC、TGCACGC、TGCACAC和TGCGCAC。
6.权利要求3-5任一项所述的报告系统，其中的传感系统包含启动子，该启动子的活性受外部刺激物存在的影响。
7.权利要求6所述的报告系统，其中该启动子与基因可操作连接。
8.权利要求6-7任一项所述的报告系统，其中启动子所属组为拟南芥(Arabidopsis thaliana)的γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶(X80377、X81973和X84097)、拟南芥的植物螯合肽合成酶(PCS1、AF093753)、拟南芥的IRT1和IRT2金属转运蛋白(U27590和T04324)、拟南芥的AtPCS1和AtPCS2(W43439和AC003027)。
9.权利要求1-8任一项所述的报告系统，其中的基因参与了植物中可视颜色变化的产生。
10.权利要求1-8任一项所述的报告系统，其中的基因参与了苯基丙酸类化合物的代谢。
11.权利要求1-8任一项所述的报告系统，其中的基因参与了色素的生物合成。
12.权利要求1-8任一项所述的报告系统，其中的基因参与了类黄酮的生物合成。
13.权利要求1-8任一项所述的报告系统，其中的基因参与了花青甙的生物合成。
14.权利要求1-13任一项所述的报告系统，其中的基因是查耳酮合成酶(CHS)。
15.权利要求1-13任一项所述的报告系统，其中的基因是查耳酮异构酶(CHI)。
16.权利要求1-13任一项所述的报告系统，其中的基因是二氢黄酮醇还原酶(DFR)。
17.权利要求1-16任一项所述的报告系统，其中该基因的任何其它内源拷贝都是无功能的。
18.权利要求17所述的报告系统，其中的内源基因参与了色素的产生。
19.权利要求17所述的报告系统，其中的内源基因参与了类黄酮的生物合成途径。
20.权利要求17所述的报告系统，其中的内源基因参与了四羟基查耳酮/查耳酮的合成。
21.权利要求17所述的报告系统，其中的内源基因是CHS基因(tt4突变体)。
22.权利要求17所述的报告系统，其中的内源基因参与了2S-黄烷酮、narringenein和ligquritigenin的形成。
23.权利要求17所述的报告系统，其中的内源基因是CHI基因(tt5突变体)。
24.权利要求1-23任一项所述的报告系统，其中转录因子的表达被改变了。
25.权利要求24所述的报告系统，其中的转录因子含有Myb结构域。
26.权利要求25所述的报告系统，其中的转录因子是PAP1和/或PAP2。
27.权利要求24-26任一项所述的报告系统，其中的转录因子被过量表达。
28.权利要求27所述的报告系统，其中的过量表达被可诱导的启动子控制。
29.权利要求27所述的报告系统，其中的过量表达被组成型启动子控制。
30.权利要求27所述的报告系统，其中的过量表达被35S启动子控制。
31.权利要求27所述的报告系统，其中的过量表达被双重启动子控制。
32.权利要求1-31任一项所述的报告系统，其中的外部刺激物是污染物。
33.权利要求32所述的报告系统，其中的污染物是无机物。
34.权利要求33所述的报告系统，其中的污染物是重金属。
35.权利要求34所述的报告系统，其中的重金属所属族为Cu、Zn、Cd、Hg、Pb、Co、Cr、Ni、As、Be、Se、Au、Ag。
36.权利要求32所述的报告系统，其中的污染物是有机物。
37.权利要求36所述的报告系统，其中的有机污染物是含氮化合物。
38.权利要求37所述的报告系统，其中的化合物含有NO2、NO3、NH2或NH3。
39.权利要求36或37任一项所述的报告系统，其中的含氮化合物含有部分炸药。
40.权利要求1-39任一项所述的报告系统，其中该基因的表达直接被污染物的存在而改变。
41.权利要求1-39任一项所述的报告系统，其中该基因的表达间接被污染物的存在而改变。
42.权利要求41所述的报告系统，其中的污染物通过一个或多个步骤被转化为次级因子，而该次级因子改变了该基因的表达。
43.权利要求42所述的报告系统，其中的转化被微生物代谢酶所促进。
44.权利要求42-43任一项所述的报告系统，其中的微生物酶是“TNT还原酶”，利于从TNT中释放NO2。
45.权利要求42-43任一项所述的报告系统，其中的转化包含了级联反应，利于刺激的放大。
46.权利要求1-45任一项所述的报告系统，其中的表型性状可通过目测加以评估。
47.权利要求46所述的报告系统，其中的表型性状是颜色。
48.权利要求1-47任一项所述的报告系统，其中系统还包括生物修复系统。
49.权利要求48所述的报告系统，其中的生物修复系统包含污染物的降解。
50.权利要求49所述的报告系统，其中的生物修复系统包含污染物的积累，从而方便了它的移除。
51.权利要求50所述的报告系统，其中的积累是通过重金属结合蛋白和/或金属转运蛋白中的一个或其组合的表达而完成的。
52.权利要求51所述的报告系统，其中的生物修复系统含有的基因所属组为：
裂变酵母(S.pombe)编码植物螯合肽合成酶基因(GeneBank登记号Y08414)、Athyrium yokoscense AyPCS1植物螯合肽合成酶mRNA(AB057412)、拟南芥推断的植物螯合肽合成酶(AY039951)、拟南芥植物螯合肽合成酶(CAD1，AF135155)、拟南芥推断的金属硫蛋白-1基因转录激活蛋白(AY04594)、拟南芥植物螯合肽合成酶(PCS1，AF093753)、拟南芥IRT1和IRT2金属转运蛋白(U27590和T04324)、拟南芥AtNramp 1、2、3和4金属转运蛋白(AF165125、AF141204、AF202539和AF202540)、芥菜(Brassicajuncea)植物螯合肽合成酶mRNA(pcsl基因AJ278627)、与植物螯合肽合成酶类蛋白相似的乳浆大戟(Euphorbia esula)cDNA(BG459096)、与拟南芥推断的植物螯合肽合成酶类似的番茄(Lycopersicon esculentum)(西红柿冠瘿)(BG130981)、宽叶香蒲(Typha latifolia)植物螯合肽合成酶(AF308658)、玉蜀黍(Zea mays)植物螯合肽合成酶类蛋白(CISEZmG，AF160475)、阿尔卑斯菥(Thalaspi caerulescens)ZNT1重金属转运蛋白(AF133267)。
53.含有权利要求1-52任一项所述的报告系统的遗传修饰植物。
54.权利要求53中的遗传修饰植物，其中的植物是单子叶植物。
55.权利要求53中的遗传修饰植物，其中的植物是双子叶植物。
56.权利要求53中的遗传修饰植物，其中的植物是一年生植物。
57.权利要求53中的遗传修饰植物，其中的植物是两年生植物。
58.权利要求53中的遗传修饰植物，其中的植物是多年生植物。
59.权利要求53中的遗传修饰植物，其中的植物属于十字花科。
60.权利要求59中的遗传修饰植物，其中的植物属于下列物种：甘蓝型油菜(Brassica napus)、芜菁(B.rapa)和B.junceaas、卷心菜(Brassica oleracea)、羽衣甘蓝(Brassica napus)、芜菁(Brassica rapa)、萝卜(Raphanus sativus)、芥菜(Brassicajuncea)、白芥(sinapis alba)、辣根菜(Armoracia rusticana)、Alliaria petiolata、拟南芥(Arabidopsisthaliana)、A.griffithiana、A.lasiocarpa、A.petrea、普通山芥(Barbareavulgaris)、Berteroa incana、芥菜(Brassica juncea)、黑芥(Brassicanigra)、芜菁(Brassica rapa)、疣果匙荠(Bunias orientalis)、亚麻荠(Camelina alyssum)、小果亚麻荠(Camelina microcarpa)、Camelinasativa、荠菜(Capsella bursa-pastoris)、群心菜(Cardaria draba)、Cardariapubescens、Conringia orientalis、Descurainia incana、Descurainia pinnata、播娘蒿(Descurainia sophia)、Diplotaxis muralis、Diplotaxis tenuifolia、Erucastrum gallicum、Erysimum asperum、小花糖芥(Erysimumcheiranthoides)、Erysimum hieracifolium、Erysimum inconspicuum、紫色香花芥(Hesperis matronalis)、Lepidium campestre、Lepidiumdensiflorum、Lepidium perfoliatum、小团扇荠(Lepidium virginicum)、豆瓣菜(Nasturtium officinale)、Neslia paniculata、野萝卜(Raphanusraphanistrum)、Rorippa austriaca、Rorippa sylvestris、白芥子(Sinapisalba)、野芥菜(Sinapis arvensis)、Sisymbrium altissimum、短果大蒜芥(Sisymbrium loeselii)、篱边大蒜芥(Sisymbrium officinale)、菥幂(Thlaspi arvense)和Turritis glabra。
61.一种检测被分析物的方法，包括：
●将从权利要求53-60任一项所述的遗传修饰植物获得的种子导入待监控的地点，
●监控获得的植物的表型，以及
●如果它们作为生物修复步骤积累了被分析物，任选将植物移除。
62.权利要求61中的方法，其中的被分析物是污染物。
63.权利要求62中的方法，其中的污染物是无机物。
64.权利要求63中的方法，其中的无机污染物是重金属。
65.权利要求64中的方法，其中的重金属所属族为Cu、Zn、Cd、Hg、Pb、Co、Cr、Ni、As、Be、Se、Au、Ag。
66.权利要求65中的方法，其中重金属的检测浓度是至少0.1mmol/kg土壤。
67.权利要求62中的方法，其中的污染物是有机物。
68.权利要求67中的方法，其中的无机污染物是含氮化合物。
69.权利要求68中的方法，其中的化合物含有NO2、NO3、NH2或NH3。
70.权利要求68-69任一项所述的检测土壤污染的方法，其中含氮化合物的检测浓度是至少0.1mmol/kg土壤。
71.权利要求61-70任一项所述的方法，其中的生物修复步骤将被分析物的浓度减少至少50％。
72.权利要求53-60任一项所述的遗传修饰植物在用于检测被分析物和任选用于生物修复中的应用。
73.权利要求72中的应用，其中的被分析物是污染物。
74.权利要求73中的应用，其中的污染物是无机物。
75.权利要求74中的应用，其中的无机污染物是重金属。
76.权利要求75中的应用，其中的重金属所属族为Cu、Zn、Cd、Hg、Pb、Co、Cr、Ni、As、Be、Se、Au、Ag。
77.权利要求76中的应用，其中重金属的检测浓度是至少0.1mmol/kg土壤。
78.权利要求73中的应用，其中的污染物是有机物。
79.权利要求78中的应用，其中的无机污染物是含氮化合物。
80.权利要求79中的应用，其中的化合物含有NO2、NO3、NH2或NH3。
81.权利要求80中的应用，其中含氮化合物的检测浓度是至少0.1mmol/kg土壤。
82.权利要求72-81任一项所述的应用，其中的生物修复步骤将被分析物的浓度减少至少50％。
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