JPH0823978A - ポプラ属植物の硝酸還元酵素遺伝子 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【目的】 ポプラ属植物の硝酸還元酵素及びそれをコー
ドする遺伝子の提供。 【構成】 配列番号：１に示すアミノ酸配列を有するポ
プラ属植物の硝酸還元酵素、及びそれをコードする遺伝
子、例えば配列番号：１に示される塩基配列を有する遺
伝子。 【効果】 窒素酸化物の吸収・浄化能が強化された植
物、特に樹木の創成のために有用である。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は、大気汚染物質であるＮ
Ｏ₂ を吸収・代謝する能力を有する硝酸還元酵素をコー
ドする遺伝子に関する。さらに詳細にはポプラ属植物の
硝酸還元酵素ｃＤＮＡ遺伝子に関し、大気中のＮＯ₂ 浄
化能の優れた樹木を育成することに利用可能なものであ
る。

【０００２】

【従来の技術】硝酸還元酵素は電子供与体としてＮＡＤ
ＨまたはＮＡＤＰＨを利用し、硝酸イオンを亜硝酸イオ
ンに還元する反応を触媒する酵素である。ＮＡＤＨある
いはＮＡＤＰＨから由来した２個の電子は酵素分子内を
ＦＡＤ→ヘム→モリブデンコファクターの順に伝達され
て最終的には硝酸が還元される。硝酸還元酵素はＦＡ
Ｄ、ヘム、及びモリブデン・コファクターの３つのドメ
インからなり、幾つかの植物由来の酵素についてその一
次構造は解明されている（岩波講座−分子生物科学１２
植物の機能）。

【０００３】本酵素は植物界に広く存在し、植物細胞内
に吸収した大気中のＮＯ₂ を、根から吸収された無機態
窒素と同様にして代謝する能力を有している（植物細胞
工学、Ｖｏｌ．５， Ｎｏ．４，１９９３）既にトウモ
ロコシ（Ｐｌａｎｔ Ｐｈｙｓｉｏｌ．９０：７９２−
７９８（１９８９））、シロイヌナズナ（Ｐｒｏｃ．Ｎ
ａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８５：５００６−
５０１０（１９８８））、トマト（Ｇｅｎｅ ８５：３
７１−３８０（１９８９））、タバコ（Ｐｌａｎｔ Ｍ
ｏｌ．Ｂｉｏｌ．１２：５９７−６００（１９８
９））、イネ（Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１３：
７３１−７３３（１９８９））、ホウレンソウ（Ｐｌａ
ｎｔ Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１５：１８７−１９０（１９
９０））、カボチャ（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６
６：２３５４２−２３５４７（１９９１））、オオムギ
（Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ．２２７：４１１−４１
６（１９９１）），マメ（Ｐｈｙｓｉｏｌ．Ｐｌａｎｔ
ａｒｕｍ ８２５：１９７−２０４（１９９１））、シ
ラカンバ（Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ．２２７：９７
−１０５（１９９１））から遺伝子がクローニングされ
ている。また、硝酸あるいは光照射により誘導される調
節酵素としてその発現調節のメカニズムが研究されつつ
ある。

【０００４】

【発明が解決しようとする課題】ポプラを起源とする硝
酸還元酵素について遺伝子レベル、蛋白レベルでの研究
はほとんど報告されていない。従って、本発明の目的
は、ポプラの硝酸還元酵素遺伝子を単離し、植物のＮＯ
₂ 浄化能を向上させる上で効果のある硝酸還元酵素遺伝
子及び硝酸還元酵素を提供することにある。

【０００５】

【課題を解決するための手段】本発明者は、樹木の中で
ＮＯ₂ 浄化能力の優れているポプラ（トヨタ自動車・岡
村ら、日本植物生理学会１９９４年度年会講演要旨集）
に着眼し、そのｃＤＮＡライブラリーより硝酸還元酵素
遺伝子をクローニングし、塩基配列を決定し、本発明を
完成させた。従って、本発明は、配列番号：１で表わさ
れるアミノ酸配列から実質上成るポプラ属硝酸還元酵素
をコードする遺伝子に関し、その一例として配列番号：
１に示す塩基配列を有する遺伝子に関する。本発明はさ
らに、配列番号：１で示されるアミノ酸配列から実質上
成るポプラ属硝酸還元酵素に関する。

【０００６】

【具体的な説明】本発明のポプラ属硝酸還元酵素は配列
番号：１に示すアミノ酸配列から実質上成る。本発明の
ポプラ属硝酸還元酵素は典型的には配列番号：１に示さ
れるアミノ酸配列を有する。しかしながらポプラ属植物
中でも、その種又は品種の相違によりアミノ酸配列がわ
ずかに異る場合があり得る。また、同一種類の植物にお
いても、突然変異により少数のアミノ酸が変化している
場合がある。従って、本発明は、配列番号：１に示すア
ミノ酸配列に対して、少数個、例えば１〜１０個、例え
ば１〜５個のアミノ酸が置換、欠失及び／又は付加され
ているアミノ酸配列を有し、なお硝酸還元酵素活性を維
持している酵素を包含する。

【０００７】本発明はさらに、上記の酵素をコードする
遺伝子、特にＤＮＡを提供する。本発明の遺伝子は、典
型的には配列番号：１に示す塩基配列を有する遺伝子で
あるが、これに限定されるものではなく、配列番号：１
で示されるアミノ酸配列をコードするすべての遺伝子を
包含する。本発明はさらに、配列番号：１に示すアミノ
酸配列から実質上成る、例えば配列番号：１に示すアミ
ノ酸配列に対して少数の、例えば１〜１０、例えば１〜
５個のアミノ酸配列が置換、欠失及び／又は付加されて
いるアミノ酸配列を有する酵素をコードする遺伝子をも
包含する。

【０００８】本発明の遺伝子は、典型的には、ポプラ属
植物から抽出したｍＲＮＡに対するｃＤＮＡとして得る
ことができる。ｍＲＮＡの抽出及び精製、並びにｃＤＮ
Ａライブラリーの作製は常法に従って行うことができ、
その具体的な一例を実施例１に示す。ｃＤＮＡライブラ
リーから目的とする遺伝子を選択するには、例えば、ア
ミノ酸配列が既知である複数個の硝酸還元酵素遺伝子を
比較し、そのホモロジーの高い領域のアミノ酸配列に基
いて設計したオリゴヌクレオチドプライマーを用いてポ
リメラーゼ連鎖反応を行い、この増幅産物をプローブと
して用いることができる。

【０００９】一旦ｃＤＮＡがクローニングされれば、そ
れがコードしているの同じアミノ酸配列をコードしてい
る異るＤＮＡ、又は少数個のアミノ酸の置換、欠失及び
／又は付加の修飾を有するアミノ酸配列をコードするＤ
ＮＡは、常法に従って、部位特定的突然変異誘発により
作製することができる。

【００１０】本発明の遺伝子は、例えば、細胞性宿主、
例えば微生物、例えばサッカロミセス属等の酵母、大腸
菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）；バチルス
（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）属等の細菌、又は動植物細胞に導
入することにより硝酸還元酵素を製造するために使用す
ることができ、あるいは、ポプラ属植物等の植物に導入
して窒素酸化物の吸収浄化力の強化された植物、例えば
樹木、特に街路樹を得ることができる。

【００１１】

【実施例】以下に実施例をあげて本発明を具体的に説明
するが、本発明は以下の実施例にのみ限定されるもので
はない。実施例１． １）ポプラ根ｍＲＮＡの抽出、精製およびｃＤＮＡの合
成 バーミキュライトで２０cm程度に生育させたポプラ（Ｐ
ｏｐｕｌｕｓ ｎｉｇｒａ Ｌ．）をｍＲＮＡ調製の２
日前から１０，０００Ｌｘの光で連続照射し、さらに調
製の２時間前に６０mM ＫＮＯ₃ を与えた後、ｍＲＮＡ
の調製に供した。液体窒素中で１．５ｇの根を破砕し、
１０mlのＣＴＡＢ（臭化セチルトリメチルアンモニウ
ム）抽出溶液（５０mM Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ pH８．０，
０．７ＭＮａＣｌ，１０mM ＥＤＴＡ，２％ ＣＴＡ
Ｂ，１％メルカプトエタノール）を加え室温で１０分激
しく振とうした。

【００１２】１０mlのクロロホルム：イソアミルアルコ
ール（２４：１）を加え室温で５分間振とうし、９５０
０rpm 、１０分遠心し上清に１ml当たり１．１ｇ塩化セ
シウムを加えた。４８０００rpm 、１６℃、１６時間超
遠心し沈殿をＴＥ緩衝液（１０mM Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ
pH８．０，１mM ＥＤＴＡ）に溶解した。全ＲＮＡより
ｍＲＮＡを精製するためｍＲＮＡ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔ
ｉｏｎ Ｋｉｔ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）を用いて、得ら
れたＲＮＡ全量からｍＲＮＡを精製した。

【００１３】その結果、１２μｇのｍＲＮＡが得られ、
そのうち５μｇをｃＤＮＡの合成に使用した。ｃＤＮＡ
の合成には、ｍＲＮＡからｃＤＮＡを合成するためのＺ
ＡＰ−ｃＤＮＡ（登録商標）Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ Ｋｉ
ｔ（ＳＴＲＡＴＡＧＥＮＥ）を使い、ＥｃｏＲＩ−Ｘｈ
ｏＩサイトを持つ２本鎖ｃＤＮＡ ５００ngが得られ
た。

【００１４】２）ｃＤＮＡライブラリーの作製 前記１）項で調製したｃＤＮＡ １００ngをベクターλ
ＺＡＰ II アーム１μｇに連結させ、この反応液５μｌ
のうち１μｌを、パッケージング用キットであるＧｉｇ
ａｐａｃｋ（登録商標）II Ｇｏｌｄ Ｐａｃｋａｇｉ
ｎｇ Ｅｘｔｒａｃｔ（ＳＴＲＡＴＡＧＥＮＥ）を用
い、λファージにパッケージングした。宿主Ｅ．ｃｏｌ
ｉ ＳＵＲＥ株に感染させプラークを形成させ、ライブ
ラリーのタイターを測定した結果、１．７４×１０⁶ ｐ
ｆｕ（ｐｌａｑｕｅ ｆｏｒｍｉｎｇ ｕｎｉｔ）／ml
であった。

【００１５】３）硝酸還元酵素遺伝子スクリーニングの
ためのプローブの作製 ＰＣＲ法を用いてＲＮＡ発現レベルでの検出および解析
を行うためのキット、ＧｅｎｅＡｍｐ（商標登録）ＲＮ
Ａ ＰＣＲ Ｋｉｔ（Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ Ｃｅ
ｔｕｓ）に従い、Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ（最終濃度 ５
mM ＭｇＣｌ₂，１×ＰＣＲ ＢｕｆｆｅｒII，１mM
ｄＧＴＰ，１mM ＡＴＰ，１mM ＴＴＰ，１mM ＣＴ
Ｐ，１Ｕ／μｌ ＲＮａｓｅ Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ，
２．５Ｕ／μｌ Ｒｅｖｅｒｓｅ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐ
ｔａｓｅ）１７μｌに、１）項で調製したｍＲＮＡ（２
５ng）２μｌとキット内に含まれるプライマーＲａｎｄ
ｏｍＨｅｘａｍｅｒｓ（最終濃度２．５μＭ）１μｌを
加えた後、サーマルサイクラー（Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍ
ｅｒ Ｃｅｔｕｓ）を用いて、４２℃−１５分、９９℃
−５分、５℃−５分で逆転写酵素反応を行った。

【００１６】この反応液２０μｌにＰＣＲ反応液（最終
濃度２mM ＭｇＣｌ₂ 、１×ＰＣＲＢｕｆｆｅｒ II ，
０．０２５Ｕ／μｌ ＡｍｐｌｉＴａｑ ＤＮＡ Ｐｏ
ｌｉｍｅｒａｓｅ）７８μｌを添加し、次に、配列表の
配列番号３および４で示されるアミノ酸配列が既知の複
数個の硝酸還元酵素遺伝子を比較し、そのホモロジーの
高い領域のアミノ酸配列に基いて設計された一対の合成
プライマー（最終濃度０．４〜０．５μＭ）を各１μｌ
ずつ加え、ＰＣＲ反応を行った。

【００１７】反応条件は９５℃−２分を１サイクル、９
５℃−１分→６０℃−１分を３５サイクル、６０℃−７
分を１サイクルとした。ＰＣＲ反応により増幅された遺
伝子断片は予想された長さ（７１６bp）と一致してお
り、このＤＮＡ配列に対応するアミノ酸配列は既に公知
である他の植物の硝酸還元酵素と８０％以上のホモロジ
ーを有していた。この遺伝子断片を、ノンラジオシステ
ムでＤＮＡを標識するためのＤＩＧ ＤＮＡ Ｌａｂｅ
ｌｉｎｇ Ｋｉｔ（ベーリンガーマンハイム山之内）を
用い、ランダムプライマ法によりＤＩＧ（ジゴキシゲニ
ン）標識し、プローブとした。

【００１８】４）ｃＤＮＡライブラリーのスクリーニン
グ 前記２）項で作製したファージｃＤＮＡライブラリーを
宿主Ｅ．ｃｏｌｉ ＳＵＲＥ株に感染させプラークを形
成させ、３）項で調製したプローブによりプラークハイ
ブリダイゼーションを行い、目的遺伝子を含むクローン
を選択した。約３０００個のプラークをプレート上に形
成させ、これにナイロン膜（Ａｍｅｒｓｈａｍ，Ｈｙｂ
ｏｎｄ−Ｎ）を１分間付着させた。次に変性溶液（１．
５Ｍ ＮａＣｌ，０．５Ｍ ＮａＯＨ）で７分間変性さ
せ、中和溶液（１．５Ｍ ＮａＣｌ，０．５Ｍ Ｔｒｉ
ｓ−ＨＣｌ pH７．２，０．００１Ｍ Ｎａ₂ ＥＤＴ
Ａ）で６分間中和させた後、２×ＳＳＣ液（０．３Ｍ
ＮａＣｌ，０．０３Ｍ Ｎａ−ｃｉｔｒａｔｅ，pH．
７．０）で洗浄し、濾紙上で風乾した。

【００１９】ＵＶ照射を５分間行いＤＮＡを固定した。
この膜をハイブリダイゼーション溶液（５×ＳＳＣ、
０．５％ｗ／ｖブロッキング試薬、０．１％ｗ／ｖ Ｎ
−ラウリルサルコシンＮａ塩、０．０２％ｗ／ｖ ＳＤ
Ｓ（ドデシル硫酸ナトリウム））で６８℃、４時間プレ
ハイブリダイゼーションを行った。次に溶液を、直前に
変性させたＤＩＧ標識プローブを加えたハイブリダイゼ
ーション溶液と交換した。この溶液の量は膜１００cm²
あたり２．５mlとした。６８℃で一晩インキュベートし
た後、室温で２×ＳＳＣ、０．１％ｗ／ｖ ＳＤＳを用
いて膜を５分間２回洗浄し、続いて６８℃で０．１×Ｓ
ＳＣ、０．１％ｗ／ｖ ＳＤＳを用いて１５分間２回洗
浄した。

【００２０】プローブの免疫学的検出は、ＤＮＡ Ｌａ
ｂｅｌｉｎｇ ａｎｄ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ
（ベーリンガーマンハイム山之内）を用い、抗ＤＩＧア
ルカリ性ホスファターゼ標識抗体を使用してＸ−リン酸
（５−Ｂｒｏｍｏ−４−ｃｈｌｏｒｏ−３−ｉｎｄｏｌ
ｙｌ−ｐｈｏｓｐｈａｔｅ）溶液とＮＢＴ（４−Ｎｉｔ
ｒｏｂｌｕｅ ｔｅｔｒａｚｏｌｉｕｍｃｈｌｏｒｉｄ
ｅ）溶液の発色反応によって検出した。約８万個のプラ
ークをスクリーニングし、３個の陽性プラークを得た。
これらのプラークを５００μｌ ＳＭ液（５０mM Ｔｒ
ｉｓ−ＨＣｌ（pH７．５），０．１Ｍ ＮａＣｌ，７mM
ＭｇＳＯ₄ ，０．０１％ゼラチン）と２０μｌクロロ
ホルムに溶かし、４℃で一晩放置した。

【００２１】このファージ溶液２００μｌとヘルパーフ
ァージＲ４０８ １μｌを宿主Ｅ．ｃｏｌｉ ＸＬ１−
Ｂｌｕｅ株（Ｏ．Ｄ₆₀₀ ＝１．０）２００μｌに３７℃
で１５分感染させ、５mlの２×ＹＴ培地（１．６％ Ｂ
ａｃｔｏ Ｔｒｉｐｔｏｎ，１％ Ｙｅａｓｔ Ｅｘｔ
ｒａｃｔ，０．５％ ＮａＣｌ，１．５％Ａｇａｒ）を
加え、３７℃で３時間振とう培養した。７０℃で２０分
間熱処理後、４０００ｇで５分間遠心し、上清を希釈し
ＸＬ１−Ｂｌｕｅ（Ｏ．Ｄ₆₀₀ ＝１．０）２００μｌに
３７℃１５分感染させ、アンピシリンを含むＬＢ培地
（１％ Ｂａｃｔｏ Ｔｒｉｐｔｏｎ，０．５％ Ｙｅ
ａｓｔ Ｅｘｔｒａｃｔ，１％ ＮａＣｌ，１．５％
Ａｇａｒ）にプレーティングした。出現コロニーは目的
のｃＤＮＡを含む２本鎖のｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔを有
するため、ＥｃｏＲＩおよびＸｈｏＩで消化することに
よりインサートＤＮＡを切り出し、全長を含んでいると
思われるｃＤＮＡ由来のＤＮＡ断片を１クローン得た。

【００２２】これをさらにＨｉｎｄIII で消化し、ｐＢ
ｌｕｅｓｃｒｉｐｔ（商標登録）IIＳＫ（−）（東洋紡
績）にサブクローニングし、サーマルサイクラーを利用
してシーケンス反応を行うためのＴａｑ Ｄｙｅ Ｄｅ
ｏｘｙ^TM Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ Ｃｙｃｌｅ Ｓｅｑ
ｕｅｎｃｉｎｇ Ｋｉｔ（アプライドバイオシステム
ズ）を用い、ＤＮＡシーケンサー（アプライドバイオシ
ステムズ、３７３Ａ）で塩基配列を決定した。また、決
定した塩基配列をもとに合成プライマーを作製し、クロ
ーンの全塩基配列を配列番号１のように決定した。な
お、前述プローブは配列表の配列番号１の塩基番号７５
７〜１４７２を認識するプローブであった。

【００２３】

【配列表】

配列番号：１ 配列の長さ：２９８２ 配列の型：核酸 鎖の数：２本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ｃＤＮＡ ｔｏ ｍＲＮＡ 起源：Ｐｏｐｕｌｕｓ ｎｉｇａｒ Ｌ． 配列の特徴： ６４−２７６０ ポプラ硝酸還元酵素 ７５７−７７７ Ｐｒｉｍｅｒ ｂｉｎｄｉｎｇ １４４７−１４７２ Ｐｒｉｍｅｒ ｂｉｎｄｉｎｇ ２９４５−２９５０ Ｐｏｌｙａｄｅｎｙｌａｔｉｏｎ ｓｉｇｎａｌ ２９６５−２９８２ ｐｏｌｉ Ａ ｓｉｔｅ 配列：

【００２４】 CTCGAGCTCG TGCCGAATTC GGCACGAGAT TTCCTTTTCT TTCTTTCTTT 50 TTAGGCGCTT CTA ATG GCG GCT TCC GTC GAC AAC CGC CAA TTC CAC 96 Met Ala Ala Ser Val Asp Asn Arg Gln Phe His 1 5 10 CTC GAG CCC AAT CTA AAC GGG GTG GTT CGT TCC TTC AAA TCC GTC 141 Leu Glu Pro Asn Leu Asn Gly Val Val Arg Ser Phe Lys Ser Val 15 20 25 CCA ACC CAC CAG GCC AAC TCT CCG GTT AGA ACC TTC AAC TTC TCG 186 Pro Thr His Gln Ala Asn Ser Pro Val Arg Thr Phe Asn Phe Ser 30 35 40 AAC CAG GAC TTC ACT CGC TCC GAC CAG AAA CCA GTC CCA ACA TTG 231 Asn Gln Asp Phe Thr Arg Ser Asp Gln Lys Pro Val Pro Thr Leu 45 50 55 GAG GAA GAA GAT TGT TCA AGT GAC GAT GAA GCT GAT TAT AAG GAT 276 Glu Glu Glu Asp Cys Ser Ser Asp Asp Glu Ala Asp Tyr Lys Asp 60 65 70 CTG ATC CGC AAA ACC AAC AGT GAA TTA GAG CCG TCG GTT ATT GAC 321 Leu Ile Arg Lys Thr Asn Ser Glu Leu Glu Pro Ser Val Ile Asp 75 80 85 CCA CGA GAT GAA GGA ACT GCT GAC AAC TGG ATC GAA CGC AAC CCT 366 Pro Arg Asp Glu Gly Thr Ala Asp Asn Trp Ile Glu Arg Asn Pro 90 95 100 TCC ATG GTC CGT CTT ACA GGG AAA CAT CCC TTT AAC TCT GAA CCG 411 Ser Met Val Arg Leu Thr Gly Lys His Pro Phe Asn Ser Glu Pro 105 110 115 CCA TTG GCT CGT CTC ATG CAC CAC GGG TTC ATT ACA CCG GTC CCC 456 Pro Leu Ala Arg Leu Met His His Gly Phe Ile Thr Pro Val Pro 120 125 130 CTT CAC TAT GTT CGT AAC CAT GGT CCT GTC CCA AAG GCC ACA TGG 501 Leu His Tyr Val Arg Asn His Gly Pro Val Pro Lys Ala Thr Trp 135 140 145 CAA GAC TGG ACA GTT GAG GTT TGC GGT CTG GTT AAA AGG CCA GCC 546 Gln Asp Trp Thr Val Glu Val Cys Gly Leu Val Lys Arg Pro Ala 150 155 160 CGT TTC ACC ATG GAT AAG CTA GTC AAT GAA TTC CCA GCC CGT GAA 591 Arg Phe Thr Met Asp Lys Leu Val Asn Glu Phe Pro Ala Arg Glu 165 170 175

【００２５】 CTA CCT GTT ACT CTA GTT TGC GCA GGT AAC AGA CGC AAA GAG CAA 636 Leu Pro Val Thr Leu Val Cys Ala Gly Asn Arg Arg Lys Glu Gln 180 185 190 AAC ATG GTA AAA CAG ACA ATT GGC TTC AAC TGG GGT TCT GCC GGG 681 Asn Met Val Lys Gln Thr Ile Gly Phe Asn Trp Gly Ser Ala Gly 195 200 205 GTG TCT ACT TCA GTG TGG CGT GGT GTA CCA TTG CAT TTG CTG CTC 726 Val Ser Thr Ser Val Trp Arg Gly Val Pro Leu His Leu Leu Leu 210 215 220 AAG AAG TGT GGG ATC TAT AGC CGT AAA AAA GGG GCC CTC AAT GTT 771 Lys Lys Cys Gly Ile Tyr Ser Arg Lys Lys Gly Ala Leu Asn Val 225 230 235 TGT TTT GAA GGT GCT GAG GAT CTG CCA GGT GGC GGT GGG TCC AAG 816 Cys Phe Glu Gly Ala Glu Asp Leu Pro Gly Gly Gly Gly Ser Lys 240 245 250 TAC GGG ACC AGT ATC AAG CAA GAG TTC GCT ATG GAT CCA TCT CGA 861 Tyr Gly Thr Ser Ile Lys Gln Glu Phe Ala Met Asp Pro Ser Arg 255 260 265 GAT ATT ATT TTA GCC TAT ATG CAA AAC GGT GAG CCT TTG GCC CCG 906 Asp Ile Ile Leu Ala Tyr Met Gln Asn Gly Glu Pro Leu Ala Pro 270 275 280 GAC CAT GGG TTT CCG GTG AGG ATG ATC ATA CCA GGT TTT ATT GGT 951 Asp His Gly Phe Pro Val Arg Met Ile Ile Pro Gly Phe Ile Gly 285 290 295 GGG CGT ATG GTG AAA TGG TTA AAG AGA ATA ATT GTT ACC AGT GTA 996 Gly Arg Met Val Lys Trp Leu Lys Arg Ile Ile Val Thr Ser Val 300 305 310 GAG TCA GAT AAT TAT TAC CAC TAC AAG GAC AAC AGA GTA CTG CCC 1041 Glu Ser Asp Asn Tyr Tyr His Tyr Lys Asp Asn Arg Val Leu Pro 315 320 325 TCT CAT GTA GAT GCA GAG CTA GCC AAT GCC GAA GCC TGG TGG TAC 1086 Ser His Val Asp Ala Glu Leu Ala Asn Ala Glu Ala Trp Trp Tyr 330 335 340 AAG CCA GAG TAT ATC ATC AAT GAG CTG AAT ATA AAC TCG GTG ATA 1131 Lys Pro Glu Tyr Ile Ile Asn Glu Leu Asn Ile Asn Ser Val Ile 345 350 355 ACG ACG CCG TGT CAT GAA GAG ATA CTG CCG ATT AAC TCA TGG ACA 1176 Thr Thr Pro Cys His Glu Glu Ile Leu Pro Ile Asn Ser Trp Thr 360 365 370 ACT CAG ACC CCG TAC ACG CTG AGG GGT TAC GCA TAT TCT GGT GGT 1221 Thr Gln Thr Pro Tyr Thr Leu Arg Gly Tyr Ala Tyr Ser Gly Gly 375 380 385 GGG AAA AAA GTG ACG CGC GTA GAG GTG ACT CTG GAT GGT GGA GAA 1266 Gly Lys Lys Val Thr Arg Val Glu Val Thr Leu Asp Gly Gly Glu 390 395 400 ACG TGG CAA GTC TGC AGC TTG GAC CAT GAA GAG AAG CCC AAC AAG 1311 Thr Trp Gln Val Cys Ser Leu Asp His Glu Glu Lys Pro Asn Lys 405 410 415 TAC GGC AAA TAC TGG TGT TGG TGC TTC TGG TCC CTG GAG GTG GAG 1356 Tyr Gly Lys Tyr Trp Cys Trp Cys Phe Trp Ser Leu Glu Val Glu 420 425 430

【００２６】 GTG CTA GAG CTC CTC GGA GCC AAA GAG ATT GCC GTC CGG GCC TGG 1401 Val Leu Glu Leu Leu Gly Ala Lys Glu Ile Ala Val Arg Ala Trp 435 440 445 GAC GAA ACC CTT AAT ACC CAG CCG GAG AAG CTC AAT TGG AAT ATC 1446 Asp Glu Thr Leu Asn Thr Gln Pro Glu Lys Leu Asn Trp Asn Ile 450 455 460 ATG GGA ATG ATG AAC AAC TGC TGG TTC CGG GTA AAA ACA AAT GTC 1491 Met Gly Met Met Asn Asn Cys Trp Phe Arg Val Lys Thr Asn Val 465 470 475 TGC AAA CGT CAC AAG GGT GAG ATA GGG ATT GTT TGT GAG CAC CCC 1536 Cys Lys Arg His Lys Gly Glu Ile Gly Ile Val Cys Glu His Pro 480 485 490 ACC GTG CCA GGC AAC CAG TCC GGT GGG TGG ATG GCC AAG CAA AGG 1581 Thr Val Pro Gly Asn Gln Ser Gly Gly Trp Met Ala Lys Gln Arg 495 500 505 CAC CTA GAG AAA TCA TTG GAG AAT ATC CAA GCT CTG AAG AAA AGT 1626 His Leu Glu Lys Ser Leu Glu Asn Ile Gln Ala Leu Lys Lys Ser 510 515 520 GTT TCA ACC CCC TTC ATG AAC ACT TCT TCA AAA ACT TTT TCA ATG 1671 Val Ser Thr Pro Phe Met Asn Thr Ser Ser Lys Thr Phe Ser Met 525 530 535 GCT GAA GTC AAG AAA CAT AAT TCG GCG GAT TCA GCA TGG ATA ATT 1716 Ala Glu Val Lys Lys His Asn Ser Ala Asp Ser Ala Trp Ile Ile 540 545 550 GTT CAT GGT CAC GTC TAT GAT TGC ACT CGC TTC CTT AAA GAC CAT 1761 Val His Gly His Val Tyr Asp Cys Thr Arg Phe Leu Lys Asp His 555 560 565 CCC GGT GGC ACT GAC AGC ATT TTA ATC AAT GCC GGT ACT GAT TGC 1806 Pro Gly Gly Thr Asp Ser Ile Leu Ile Asn Ala Gly Thr Asp Cys 570 575 580 ACT GAA GAA TTT GAT GCT ATA CAC TCT GAT AAA GCC AAG AAA ATG 1851 Thr Glu Glu Phe Asp Ala Ile His Ser Asp Lys Ala Lys Lys Met 585 590 595 CTT GAG GAT CAT CGG ATC GGA GAG TTG GTT AAT TCA TCA GCT TAC 1896 Leu Glu Asp His Arg Ile Gly Glu Leu Val Asn Ser Ser Ala Tyr 600 605 610 ACA TCT GAT TCA AAC GCT TCC TCT CCT AAT AAC TCA GTA CAT TTG 1941 Thr Ser Asp Ser Asn Ala Ser Ser Pro Asn Asn Ser Val His Leu 615 620 625 GCT CCT ATC AAA GAA ATT GCC TCA ATA AGA AAT GTT GCT CTT GTT 1986 Ala Pro Ile Lys Glu Ile Ala Ser Ile Arg Asn Val Ala Leu Val 630 635 640 CCA CGT GAA AAA ATC CCA TGC AAG CTT ATT AAA AAG GAA ATT CTC 2031 Pro Arg Glu Lys Ile Pro Cys Lys Leu Ile Lys Lys Glu Ile Leu 645 650 655 TCT CAT GAT GTG CGT CTC TTT CGA TTT GCA TTG CCA TCA GAG GAT 2076 Ser His Asp Val Arg Leu Phe Arg Phe Ala Leu Pro Ser Glu Asp 660 665 670 CAG GTG CTG GGA TTG CCG GTG GGG AAG CAC ATA TTC TTA TGT GCT 2121 Gln Val Leu Gly Leu Pro Val Gly Lys His Ile Phe Leu Cys Ala 675 680 685

【００２７】 ACT GTT AAT GAC AAG TTG TGC ATG CGA GCT TAT ACG CCA ACT AGC 2166 Thr Val Asn Asp Lys Leu Cys Met Arg Ala Tyr Thr Pro Thr Ser 690 695 700 ACC GTC GAC GTG GTG GGG TAC TTT GAT CTT GTG ATC AAG GTT TAT 2211 Thr Val Asp Val Val Gly Tyr Phe Asp Leu Val Ile Lys Val Tyr 705 710 715 TTC AAA GGC GTG CAT CCA AAG TTC CCT AAT GGA GGG CAA ATG TCA 2256 Phe Lys Gly Val His Pro Lys Phe Pro Asn Gly Gly Gln Met Ser 720 725 730 CAG TAC CTT AAC TCA CTA TCG CTG GGG TCT GTG ATA GAC GTG AAG 2301 Gln Tyr Leu Asn Ser Leu Ser Leu Gly Ser Val Ile Asp Val Lys 735 740 745 GGT CCG TTG GGT CAC ATT GAA TAT GTT GGT CGT GGT AAG TTT TTG 2346 Gly Pro Leu Gly His Ile Glu Tyr Val Gly Arg Gly Lys Phe Leu 750 755 760 GTC CAT GAC AAG CCC AAG TTT GCC AAG AAA CTG ACT ATA CTG TCT 2391 Val His Asp Lys Pro Lys Phe Ala Lys Lys Leu Thr Ile Leu Ser 765 770 775 GGT GGG ACA GGA ATC ACA CCA ATC TAT CAA CTG ATT CAA GCC ATT 2436 Gly Gly Thr Gly Ile Thr Pro Ile Tyr Gln Leu Ile Gln Ala Ile 780 785 790 TTA AAA GAT CCA GAA GAC GAT ACC GAA ATG TAT TTG GTC TAT GCG 2481 Leu Lys Asp Pro Glu Asp Asp Thr Glu Met Tyr Leu Val Tyr Ala 795 800 805 AAC CGC ACT GAG GAC GAT ATT TTG TTG AGG GAC GAA CTT GAT TCT 2526 Asn Arg Thr Glu Asp Asp Ile Leu Leu Arg Asp Glu Leu Asp Ser 810 815 820 TGG GCT AAG GAA CAT GAG AGA TTA AAG GTG TGG CAT GTC ATT CAA 2571 Trp Ala Lys Glu His Glu Arg Leu Lys Val Trp His Val Ile Gln 825 830 835 GAA TCT ATT AAG GAA GGC TGG CAA TAC AGT GTT GGG TTC ATT ACC 2616 Glu Ser Ile Lys Glu Gly Trp Gln Tyr Ser Val Gly Phe Ile Thr 840 845 850 GAG AGT ATC CTG CGA GAG CAT GTG CCA GAA GGA TCA GAT GAT ACT 2661 Glu Ser Ile Leu Arg Glu His Val Pro Glu Gly Ser Asp Asp Thr 855 860 865 CTG GCT TTG GCT TGT GGT CCT CCA CCA ATG ATT CAA TTT GCC GTG 2706 Leu Ala Leu Ala Cys Gly Pro Pro Pro Met Ile Gln Phe Ala Val 870 875 880 CAG CCA AAC TTG GAG AAG ATG AAC TAT GAC ATC AAG GAT TCC TTG 2751 Gln Pro Asn Leu Glu Lys Met Asn Tyr Asp Ile Lys Asp Ser Leu 885 890 895 CTA GTT TTT TAGATGAGAG AGGAGCGGAT CTATTTAAAA TAATATGAGG 2800 Leu Val Phe TTGTACATAT GTTAGCTTGA TCGATCGATG CATGTGTTAC TCCATTCGTT 2850 TCTTTGATAA GAACAGGAAA AAGAGAGGCT GTTTCCCATA TGTATTATTA 2900 TCAAGTTGGA GCAACAGTTG CTTAATGTAG ACTCACTTTG TAGAATAAAT 2950 GAAAGGTTTT TCCCAAAAAA AAAAAAAAAA AA 2982

【００２８】配列番号：２ 配列の長さ：２９ 配列の型：核酸 鎖の数：１本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸（合成ＤＮＡ） アンチセンス：ＮＯ 配列の特徴： ３−８ ＥｃｏＲＩ ｓｉｔｅ ９−２９ ｂｉｎｄｉｎｇ ｓｉｔｅ １４，１５，２３，２６ 混合物 配列： GGGAATTCGG GGCYYTCAAC GTKTGYTTT 29

【００２９】配列番号：３ 配列の長さ：３４ 配列の型：核酸 鎖の数：１本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸（合成ＤＮＡ） アンチセンス：ＹＥＳ 配列の特徴： １−２６ ｂｉｎｄｉｎｇ ｓｉｔｅ ２７−３２ Ｐｓｔｌ ｓｉｔｅ ６ 混合物 配列： ATGGGWATGA TGAACAACTG CTGGTTCTGC AGGG 34

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 梶野 勉 愛知県愛知郡長久手町大字長湫字横道41番 地の１ 株式会社豊田中央研究所内 (72)発明者 平井 正名 愛知県愛知郡長久手町大字長湫字横道41番 地の１ 株式会社豊田中央研究所内 (72)発明者 木谷 重和 愛知県豊田市トヨタ町１番地 トヨタ自動 車株式会社内 (72)発明者 島田 友香子 愛知県豊田市トヨタ町１番地 トヨタ自動 車株式会社内 (72)発明者 森川 弘道 広島県東広島市鏡山一丁目３番

Claims (3)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 配列番号：１に示すアミノ酸配列から実
   質上成るポプラ属植物の硝酸還元酵素をコードする遺伝
   子。
2. 【請求項２】 配列番号：１に示す塩基配列を有する請
   求項１に記載の遺伝子。
3. 【請求項３】 配列番号：１に示すアミノ酸配列から実
   質上成るポプラ属植物の硝酸還元酵素。