JPH07236486A - ポプラ属植物の亜硝酸還元酵素遺伝子 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【目的】 ポプラ属植物の亜硝酸還元酵素をコードする
遺伝子を提供する。 【構成】 配列番号：１に示すアミノ酸配列もしくはそ
の部分を有する亜硝酸還元酵素をコードする遺伝子、又
はその修飾体。 【効果】 街路樹等の植物に導入することにより、大気
汚染物質であるＮＯ₂ 等の浄化能を向上させた植物を育
種するために有用である。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は、植物の窒素代謝の初期
過程で働いており、大気汚染物質であるＮＯ ₂ の浄化や
食物中に存在する発癌物質であるニトロソアミンの低減
に関与していると考えられる亜硝酸還元酵素遺伝子に関
する。さらに詳細にはポプラ属植物の亜硝酸還元酵素の
遺伝子に関し、大気汚染物質であるＮＯ₂ の浄化能力の
高い街路樹の分子育種や食物中に存在する発癌物質であ
るニトロソアミン類の少ない作物の分子育種に利用する
のに有用であると期待される。

【０００２】

【従来の技術】亜硝酸還元酵素は、４Ｆｅ４Ｓシロヘム
結合部位をもち、電子供与体として還元型フェレドキシ
ンを利用して一挙に６電子還元反応を触媒し、亜硝酸イ
オンを還元し、アンモニアに変換させる酵素である。亜
硝酸還元酵素は植物界に広く分布しており、植物では根
から吸収した硝酸イオンの還元された亜硝酸イオンを代
謝する酵素である。また、葉から取り込んだ大気汚染物
質のＮＯ₂ を代謝する系で働いている酵素である〔植物
細胞工学ｖｏｌ．５，Ｎｏ．４，ｐ２９８−３０７（１
９９３）〕。

【０００３】これまでに遺伝子レベルでの研究が進み、
ホウレンソウ〔Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ．，ｖｏ
ｌ．２１２，ｐ２０−２６（１９８８）〕、トウモロコ
シ〔Ｐｌａｎｔ Ｐｈｙｓｉｏｌ．ｖｏｌ．８８，ｐ７
４１−７４６（１９８８）〕、シラカンバ〔Ｍｏｌ．Ｇ
ｅｎ．Ｇｅｎｅｔ．，ｖｏｌ．２３１，ｐ４１１−４１
６（１９８８）〕から遺伝子がクローニングされてお
り、発現の調節メカニズムが研究されつつある。しかし
ながら、ポプラを起源とする亜硝酸還元酵素についてタ
ンパクレベル、遺伝子レベルでの研究はほとんど報告さ
れていない。

【０００４】

【発明が解決しようとする課題】ポプラ属植物の亜硝酸
還元酵素遺伝子が単離され、その構造が解明されれば、
その遺伝子を操作し、大気中のＮＯ₂ 浄化能の優れた樹
木を育種することも可能である。従って本発明の目的
は、ポプラ属植物の亜硝酸還元酵素遺伝子を提供するこ
とにある。

【０００５】

【課題を解決するための手段】本発明者は、鋭意検討の
結果、樹木の中でＮＯ₂ 浄化能力の優れているポプラの
ｃＤＮＡライブラリーから亜硝酸還元酵素遺伝子をクロ
ーニングし、その塩基配列を決定し、その知見に基いて
本発明を完成した。従って本発明は配列番号：１に示す
アミノ酸番号２のＳｅｒからアミノ酸番号５８８のＡｓ
ｐまでのアミノ酸配列を含む亜硝酸還元酵素をコードす
る遺伝子を提供する。

【０００６】本発明はまた、配列番号：１に示すアミノ
酸番号２６のＴｈｒからアミノ酸番号５８８のＡｓｐま
でのアミノ酸配列を含む亜硝酸還元酵素をコードする遺
伝子を提供する。本発明はさらに、配列番号：１に示す
アミノ酸配列に対して９５％以上の相同性を有するアミ
ノ酸配列を有するポプラ属植物由来の亜硝酸還元酵素を
コードする遺伝子を提供する。

【０００７】本発明はさらに、配列番号：１に示すアミ
ノ酸番号２のＳｅｒからアミノ酸番号５８８のＡｓｐま
でのアミノ酸配列に対して約２０個以下のアミノ酸が置
換、欠失及び／又は付加されているアミノ酸配列を有
し、且つ亜硝酸還元酵素活性を維持している蛋白質をコ
ードする遺伝子を提供する。本発明はさらに、配列番
号：１に示すアミノ酸番号２６のＴｈｒからアミノ酸番
号５８８のＡｓｐまでのアミノ酸配列に対して約２０個
以下のアミノ酸が置換、欠失及び／又は付加されている
アミノ酸配列を有し、且つ亜硝酸還元酵素活性を維持し
ている蛋白質をコードする遺伝子を提供する。

【０００８】本発明はさらに、配列番号：１に示すアミ
ノ酸番号２のＳｅｒからアミノ酸番号５８８のＡｓｐま
でを含むアミノ酸配列に対応し、配列番号：１に示され
ているヌクレオチド配列を有する遺伝子を提供する。本
発明はさらに、配列番号：１に示すアミノ酸番号２６の
Ｔｈｒからアミノ酸番号５８８のＡｓｐまでを含むアミ
ノ酸配列に対応し、配列番号：１に示されているヌクレ
オチド配列を有する遺伝子を提供する。本発明はさら
に、上記種々の遺伝子を構成するＤＮＡを含んで成るベ
クターをも提供する。

【０００９】

【具体的な説明】本発明の遺伝子の１つの態様は、配列
番号：１のアミノ酸番号１のＭｅｔからアミノ酸番号５
８８のＡｓｐまでのアミノ酸配列をコードするものであ
る。しかしながら、翻訳開始コドンに対応する１位のＭ
ｅｔは発現後プロセシングにおいては除去される場合が
あり、また目的酵素を他のペプチドとの融合蛋白質とし
て発現させる場合にも存在しない。従って、本発明の遺
伝子の他の１つの態様は、配列番号：１のアミノ酸番号
２のＳｅｒからアミノ酸番号５８８のＡｓｐまでのアミ
ノ酸配列を含む蛋白質をコードするものである。

【００１０】この遺伝子における具体例の１つは、配列
番号：１におけるヌクレオチド番号４３のＴからヌクレ
オチド番号１８０３のＣまでのヌクレオチド配列を含む
ものである。配列番号：１に示すアミノ酸配列におい
て、Ｎ−末端側の２５個のアミノ酸はトランジットペプ
チドに相当するものと考えられ、酵素活性のためには必
須でない。従って、本発明は１つの態様において、配列
番号：１においてアミノ酸番号２６のＴｈｒからアミノ
酸番号５８８のＡｓｐまでのアミノ酸配列を含む亜硝酸
還元酵素をコードする遺伝子に関する。

【００１１】この遺伝子の具体例の１つは、配列表：１
のヌクレオチド番号１１５のＡからヌクレオチド配列１
８０３のＣまでのヌクレオチド配列を含むものである。
一般に、同種又は同属に属する植物由来の同種の活性を
有する酵素であっても、例えば自然突然変異、例えばヌ
クレオチドの置換、付加及び／又は欠失によりアミノ酸
配列のわずかな相違を伴う酵素が存在することが知られ
ている。しかしながら、本明細書に詳細に記載する方法
によれば、配列番号：１に記載するアミノ酸配列と全く
同一ではないアミノ酸配列を有する酵素をコードする遺
伝子であってもクローニングすることができる。

【００１２】この様な酵素は、配列番号：１に示すアミ
ノ酸配列に対して非常に高い相同性、例えば９５％以
上、さらには９８％以上の相同性を有するであろう。従
って本発明は、配列番号：１に示すアミノ酸配列を有す
る亜硝酸還元酵素をコードする遺伝子のみならず、ポプ
ラ属に属する植物に由来し、且つ配列番号：１に示すア
ミノ酸配列に対して９５％以上、例えば９８％以上の相
同性を有するアミノ酸配列を有する亜硝酸還元酵素をコ
ードする遺伝子も本発明に属する。

【００１３】１つの酵素において、いわゆる活性中心又
は活性領域及びそれを立体的に支持する部分以外の部分
においては、必ずしも特定のアミノ酸配列が必須ではな
く、この様な非必須領域においては、本来の酵素活性を
維持しながら、１〜少数のアミノ酸の置換、欠失及び／
又は付加等の修飾を行うことができることが知られてい
る。この様な修飾が可能なアミノ酸の数としては、常用
の遺伝子修飾技法、例えば変異原プローブを用いる部位
特定変異誘発により修飾が容易な範囲であり、例えばア
ミノ酸約２０個以下、例えばアミノ酸約１０個以下であ
る。さらに、制限酵素及び／又は連結酵素リガーゼを用
いてアミノ酸配列の置換、欠失及び／又は付加を行うこ
ともできる。

【００１４】従って本発明は、配列番号：１に示すアミ
ノ酸配列に対して、２０個以下、例えば１０個以下のア
ミノ酸の置換、欠失及び／又は付加により修飾されたア
ミノ酸配列を有する亜硝酸還元酵素をコードする遺伝子
に関する。本発明の遺伝子は、ポプラ属に属する植物か
ら抽出したｍＲＮＡに対して合成されたｃＤＮＡを含ん
で成るライブラリーからクローニングすることができ
る。ｍＲＮＡの調製に当っては、ポプラ属に属する植物
に硝酸塩、例えば硝酸カリウムを与えて亜硝酸還元酵素
の誘導を行った後にｍＲＮＡを抽出するのが好ましい。
ｍＲＮＡからのｃＤＮＡライブラリーの作製は常法に従
って行うことができ、その具体例を実施例１（ａ）に記
載する。

【００１５】ｃＤＮＡから、１段階で全長の遺伝子をク
ローニングするのは困難であるため、まずｃＤＮＡライ
ブラリーから、亜硝酸還元酵素の一部分をコードするｃ
ＤＮＡをクローニングし、このクローニングされたｃＤ
ＮＡ断片を標識してプローブを作製した後、このプロー
ブを用いてｃＤＮＡを再びスクリーニングすることによ
り目的とする全長酵素をコードするｃＤＮＡを得ること
ができる。

【００１６】ｃＤＮＡライブラリーから、プローブとし
て使用するための部分的ｃＤＮＡ断片をクローニングす
るには、ｃＤＮＡライブラリーを鋳型として用いるポリ
メラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）により行うことができる。
このＰＣＲを行うための２つのプライマーとしては、他
の複数の植物に由来する亜硝酸還元酵素のアミノ酸配列
の相同性の高い部分に対応するオリゴヌクレオチドを用
いることができる。

【００１７】１つの例として、本発明においては、Ｂｅ
ｔｕｌａ ｐｅｎｄｕｌａ由来とｓｐｉｎａｃｈ由来の
亜硝酸還元酵素のアミノ酸配列の相同性の高い部分であ
る、Ｂｅｔｕｌａ ｐｅｎｄｕｌａ由来の酵素のアミノ
酸配列中のアミノ酸１１６〜１２３の配列、及びアミノ
酸２７２〜２７９の配列に対応する、配列番号：２及び
配列番号：３に示すヌクレオチド配列を有するオリゴヌ
クレオチドを用いた。

【００１８】プローブの作製方法及びｃＤＮＡライブラ
リーのスクリーニング方法は、実施例１（ｂ）及び
（ｃ）に詳細に記載する。本発明の方法は、本発明にお
いて使用した特定のポプラ植物のみならず、ポプラ属に
属する他の植物、例えばＰｏｐｕｌｕｓ ａｌｂａ，Ｐ
ｏｐｕｌｕｓ ｄｅｌｔｏｉｄｅ，Ｐｏｐｕｌｕｓ ｍ
ａｘｉｍｏｗｉｃｚｉｉ，Ｐｏｐｕｌｕｓｓｉｅｂｏｌ
ｉｉ Ｍｉｇにも同様に適用して、それぞれの植物の亜
硝酸還元酵素遺伝子をクローニングすることができる。
さらに、本発明により亜硝酸還元酵素をコードする全長
ＤＮＡの一例が開示されるから、このＤＮＡの全部又は
一部分をプローブとして用いて、ｃＤＮＡライブラリー
をスクリーニングすることができ、あるいは常法に従っ
て調製したゲノム性ライブラリーをスクリーニングする
こともできる。

【００１９】さらには、本発明により、亜硝酸還元酵素
をコードする特定のヌクレオチド配列が開示されている
から、そのヌクレオチド配列又は、それに所望の修飾を
加えたヌクレオチド配列を有するＤＮＡを、化学合成に
より調製することができる。また、亜硝酸還元酵素をコ
ードするＤＮＡがクローニングされているから、そのＤ
ＮＡ又はその一部分を鋳型として用いることにより、亜
硝酸還元酵素をコードする修飾されたＤＮＡを常法に従
って、例えば部位特定変異誘発やＰＣＲ法により合成す
ることもできる。

【００２０】こうして調製された、亜硝酸還元酵素をコ
ードするＤＮＡは、常法に従って常用の発現ベクターに
挿入した後、宿主細胞、例えば大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）
等の細菌を含めての原核性細胞、酵母等の単細胞性宿主
を含めての下等真核性細胞、カイコなどの高等真核性細
胞等を形質転換した後、これらの宿主細胞を培養するこ
とにより、亜硝酸還元酵素を製造することができる。

【００２１】しかしながら、本発明の遺伝子の最も重要
な用途は、これを植物に導入することにより、その植物
に亜硝酸還元酵素活性を付与し、又は植物がすでに有す
る亜硝酸還元酵素活性を増強することである。例えば野
菜類に本発明の遺伝子を導入することにより、発癌物質
であるニトロソアミン類の含有量の少い野菜を育種する
ことができる。また、木本性植物、例えば街路樹に本発
明の遺伝子を導入することにより、大気汚染物質である
ＮＯ₂ の浄化力の高い街路樹を得ることができる。

【００２２】

【実施例】以下、実施例をもとに具体的に説明する。本
発明は以下の実施例にのみ限定されるものでなく、本発
明の技術分野における通常の変更をすることができるこ
とは言うまでもない。

【００２３】実施例１．（ａ）ポプラ緑葉ｍＲＮＡの単離及びｃＤＮＡの合成 バーミキュライトで２０cm程度に生育させたポプラ（Ｐ
ｏｐｕｌｕｓ ｎｉｇｒａ Ｌ．ｖａｒ ｉｔａｌｉｃ
ａ）をｍＲＮＡ調製の２日前から１０，０００Lxの光で
連続照射し、さらに調製の２時間前に６０mM ＫＮＯ₃
を与えた後、ｍＲＮＡを調製した。ｍＲＮＡ調製処理と
して、まず、緑葉を収穫し、緑葉２ｇを液体窒素中でブ
レンダーにより破砕した。これに１０ml抽出溶液（５０
％（ｗ／ｖ）グアニジンチオシアネート、２５mMクエン
酸ナトリウム、０．５mMメルカプトエタノール、０．０
０２５％ラウリルサルコシン酸ナトリウム）を加え、５
分間混和し、冷却遠心機を用いて１００００rpm で１０
分間遠心した。

【００２４】上清に抽出溶液と等量のクロロホルム：イ
ソアミルアルコール（２４：１）を加え５分間激しく振
とうし６０００rpm ，１０分間遠心した。水層の分画に
１ml当り０．５ｇのＣｓＣｌを加え５．７Ｍ ＣｓＣｌ
溶液の入ったチューブに重層し４８０００rpm ，１６
℃，１６時間超遠心した。得られた沈澱をトリス−ＳＤ
Ｓ溶液（５０mM Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ pH９．０，１％Ｓ
ＤＳ）に溶解し、フェノール（pH９．０）：クロロホル
ム：イソアミルアルコール（２５：２４：１）で２回抽
出しエタノール沈澱した。得られた沈澱を２００μｌの
滅菌水に溶解し等量の４Ｍ ＬｉＣｌを加えて−８０℃
１時間放置した。

【００２５】１５０００rpm ，１５分間遠心した後、沈
澱を７０％エタノールで洗浄し２００μｌ滅菌水に溶解
し、さらに２０μｌの３Ｍ酢酸ナトリウムと４００μｌ
冷エタノールを加え、エタノール沈澱をした。得られた
沈澱の半量をｍＲＮＡ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｋ
ｉｔ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）を用いｍＲＮＡを精製し
た。その結果、３．６μｇのｍＲＮＡが得られ、これを
ｃＤＮＡ合成に使用した。ｃＤＮＡの合成にはＺＡＰ−
ｃＤＮＡ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ Ｋｉｔ（Ｓｔｒａｔａ
ｇｅｎｅ）を使った。その結果ＥｃｏＲＩ−ＸｈｏＩサ
イトをもつ精製２本鎖ｃＤＮＡが３００ngが得られた。

【００２６】（ｂ）ｃＤＮＡライブラリーの作製 このｃＤＮＡ １００ngをベクターλＺＡＰ IIアーム
１μｇに連結させ、この反応液５μｌのうち１μｌをＧ
ｉｇａｐａｃｋ IIＧｏｌｄ ｐａｃｋａｇｉｎｇ ｅ
ｘｔｒａｃｔ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）に供しλファー
ジにパッケージングした。Ｅ．ｃｏｌｉ．ＳＵＲＥ株に
感染させプラークを形成させてタイターをはかったとこ
ろ、ライブラリーの大きさは１．８６×１０⁶pfu／mlで
あった。

【００２７】（ｃ）亜硝酸還元酵素遺伝子スクリーニン
グのためのプローブの作製 配列表の配列番号：２及び３で表される合成した１対の
プライマー（各２０pmol）それぞれ１μｌと（ａ）で合
成したｃＤＮＡ １μｌ（１０ng）を加えた後、反応緩
衝液を加え、９８μｌとし、さらにＴａｑポリメラーゼ
１μｌ（５Ｕ）（宝酒造）、Ｐｅｒｆｅｃｔ Ｍａｔｃ
ｈ^TM Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ Ｅｎｈａｎｃｅｒ １μ
ｌ（１Ｕ）（ＳＴＲＡＴＡＧＥＮＥ社）を加えてＰＣＲ
を行った。なお、反応緩衝液は最終濃度が０．１２５mM
ｄＮＴＰ，１０mM Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ pH８．３，５
０mM ＫＣｌ，１．５mM ＭｇＣｌ₂ ，０．００１％ゼ
ラチンになるように調製してあるものを用いた。

【００２８】ＰＣＲ反応条件は（１）９４℃にて３０秒
（ＤＮＡの変性）、（２）６５℃にて３０秒（プライマ
ーのアニーリング）、（３）７２℃にて１分（プライマ
ー伸長反応）のサイクルを３５サイクル行い７２℃にて
１０分保温した。これにより得られたＤＮＡ断片は予想
された長さである０．５kbp と一致した。ヌクレオチド
配列の決定によりアミノ酸配列で他の植物の亜硝酸還元
酵素と８０〜９０％のホモロジーがあり、ポプラ亜硝酸
還元酵素遺伝子の一部であることが確認されたので、こ
れをプローブとすることにした。プローブはノンラジオ
システムＤＩＧ標識ＫＩＴ（ベーリンガーマンハイム山
ノ内（株））を用いランダムプライム法によりＤＮＡを
ＤＩＧ標識した。

【００２９】（ｄ）ｃＤＮＡライブラリーのスクリーニ
ング ファージｃＤＮＡライブラリーを大腸菌（Ｅ．Ｃｏｌ
ｉ）ＳＵＲＥ株に感染させてプラークを形成させ、これ
を作製したプローブでプラークハイブリダイゼーション
を行い、目的遺伝子を含むクローンを選抜した。プレー
ト１枚当たり約５０００個のプラークを形成させこれに
ニトロセルロースメンブレンを重ね１分間静置した。こ
の膜を変性溶液（１．５Ｍ ＮａＣｌ，０．５Ｎ Ｎａ
ＯＨ）で２分間変性させ、中和液（１．５Ｍ ＮａＣ
ｌ，０．５Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ pH７．２，０．００
１Ｍ ＥＤＴＡ）で２分間中和した後、２×ＳＳＣ液
（１×ＳＳＣ液：０．１５Ｍ ＮａＣｌ，０．０３５Ｍ
クエン酸ナトリウム）で洗浄し漉紙上で風乾し８０℃で
２時間焼き付けた。

【００３０】この膜をハイブリダイゼーション溶液（５
×ＳＳＣ，０．５％ｗ／ｖブロッキング試薬、０．１％
ｗ／ｖ Ｎ−ラウリルサルコシン塩、０．０２％ｗ／ｖ
ＳＤＳ）で６８℃１時間プレハイブリダイゼーション
を行った（プローブの非特異的結合を防ぐため）。次に
直前に変性させたＤＩＧ標識プローブを２６ng／mlとな
るようハイブリダイゼーション液に加え２．５ml／１０
０cm² 膜となるように交換した。６８℃で一晩振とうし
室温で２×ＳＳＣ，０．１％ｗ／ｖ ＳＤＳで５分間２
回洗浄し６８℃で０．５×ＳＳＣ，０．１％ｗ／ｖ Ｓ
ＤＳで１５分２回洗浄した。プローブの免疫学的検出は
ノンラジオシステムＤＩＧ検出ＫＩＴ（ベーリンガーマ
ンハイム山ノ内（株））を用い抗ＤＩＧアルカリ性ホス
ファターゼ標識抗体を使って、Ｘ−リン酸とＮＢＴの発
色反応によって検出した。

【００３１】約１０万個のプラークをスクリーニング
し、１２個の陽性プラークを得た。このシングルプラー
クを５００μｌ ＳＭ ｂｕｆｆｅｒと２０μｌクロロ
ホルムに溶かし一晩放置した。このファージ溶液１００
μｌとヘルパーファージＲ４０８ ０．５μｌをＯ．Ｄ
６６０＝１．０のＸＬ１−Ｂｌｕｅ１００μｌに１５分
３７℃で感染させ１．５ml ２×ＹＴ培地を加え、３７
℃で６時間振とう培養した。７０℃で２０分加熱した
後、７０００rpm ５分遠心し、上清をＯ．Ｄ６６０＝
１．０のＸＬ１−Ｂｌｕｅに１５分３７℃で感染させ、
５０μｇ／mlのアンピシリンを含むＬＢ培地にプレーテ
ィングした。

【００３２】現れたコロニーは目的のｃＤＮＡを含む２
本鎖のｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔを持っているので、これ
を調製しＥｃｏＲ Ｉ，Ｘｈｏ ＩでインサートＤＮＡ
を切りだし、全長を含んでいると考えられるｃＤＮＡ由
来のＤＮＡ断片を１つ得た。このＤＮＡ断片をＬＦ１２
３クローンと命名した。これを様々な制限酵素で消化し
ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ II（ＳＴＲＡＴＡＧＥＮＥ
社）及びｐＵＣ１１８（宝酒造（株））にサブクローニ
ングした。

【００３３】また、途中までの塩基配列をもとにプライ
マーを合成して使用した。そして、Ｄｙｅ Ｄｅｏｘｙ
Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ法で反応後、アプライドバイオ
システム社製３７３Ａ蛍光ＤＮＡシーケンサーで、ＬＦ
１２３クローンの塩基配列を配列番号：１のように決定
した。なお、前述のプローブは配列表の配列番号：１の
塩基番号３６７〜８６０を認識するプローブであった。

【００３４】

【発明の効果】本発明により、ポプラ属植物の亜硝酸還
元酵素の遺伝子が提供される。該遺伝子は樹木の遺伝子
工学の分野等において有用である。

【００３５】

【配列表】配列番号：１ 配列の長さ：２１６０bp 配列の型：核酸 鎖の数：２本鎖 配列の種類：ｃＤＮＡ ｔｏ ｍＲＮＡ 起原：Ｐｏｐｕｌｕｓ ｎｉｇｒａ Ｌ．ｖａｒ ｉｔ
ａｌｉｃａ 配列の特徴： ４０−１８０３ ポプラ亜硝酸還元酵素 ３６７−３９０ Ｐｒｉｍｅｒ ｂｉｎｄｉｎｇ ８３８−８６０ Ｐｒｉｍｅｒ ｂｉｎｄｉｎｇ ２１１４−２１１９ ｐｏｌｙａｄｅｎｙｌａｔｉｏｎ
ｓｉｇｎａｌ ２１４６−２１６０ ｐｏｌｙ Ａ ｓｉｔｅ 配列：

【００３６】 CAAAAATCCA CACTTCTCTA GAAACTATCT ACCATCATT ATG TCA TCA CTT 51 Met Ser Ser Leu 1 TCA GTT CGT TTT CTC ACG CCA CAA TTG TCA CCC ACA GTT CCA AGC 96 Ser Val Arg Phe Leu Thr Pro Gln Leu Ser Pro Thr Val Pro Ser 5 10 15 TCC TCT GCA AGA CCA AGA ACA AGA CTC TTT GCT GGA CCT CCC ACA 141 Ser Ser Ala Arg Pro Arg Thr Arg Leu Phe Ala Gly Pro Pro Thr 20 25 30 GTG GCT CAG CCA GCG GAG ACG GGG GTG GAT GCA GGG AGG TTG GAA 186 Val Ala Gln Pro Ala Glu Thr Gly Val Asp Ala Gly Arg Leu Glu 35 40 45

【００３７】 CCT AGA GTG GAG AAG AAA GAC GGA TAC TAT GTG TTG AAA GAG AAG 231 Pro Arg Val Glu Lys Lys Asp Gly Tyr Tyr Val Leu Lys Glu Lys 50 55 60 TTT AGG CAA GGT ATT AAT CCT CAA GAG AAA GTG AAG ATA GAG AAA 276 Phe Arg Gln Gly Ile Asn Pro Gln Glu Lys Val Lys Ile Glu Lys 65 70 75 GAG CCC ATG AAG CTT TTC ATG GAA AAT GGG ATC GAG GAG CTT GCT 321 Glu Pro Met Lys Leu Phe Met Glu Asn Gly Ile Glu Glu Leu Ala 80 85 90 AAA TTG TCG ATG GAA GAG ATT GAC AAA GAG AAG AGC ACT AAA GAC 366 Lys Leu Ser Met Glu Glu Ile Asp Lys Glu Lys Ser Thr Lys Asp 95 100 105 GAT ATT GAT GTT AGA CTC AAG TGG CTC GGT CTC TTT CAC AGA AGG 411 Asp Ile Asp Val Arg Leu Lys Trp Leu Gly Leu Phe His Arg Arg 110 115 120 AAG CAC CAA TAT GGT AGA TTT ATG ATG AGA CTA AAG CTA CCA AAT 456 Lys His Gln Tyr Gly Arg Phe Met Met Arg Leu Lys Leu Pro Asn 125 130 135 GGG GTA ACA ACA AGT GCA CAA ACA AGA TAC TTG GCA AGC GTG ATC 501 Gly Val Thr Thr Ser Ala Gln Thr Arg Tyr Leu Ala Ser Val Ile 140 145 150 AGG AAA TAT GGG AAA GAT GGC TGT GCA GAT GTA ACA ACA AGA CAA 546 Arg Lys Tyr Gly Lys Asp Gly Cys Ala Asp Val Thr Thr Arg Gln 155 160 165 AAC TGG CAA ATT CGT GGA GTG GTG TTG CCT GAT GTG CCA GAA ATA 591 Asn Trp Gln Ile Arg Gly Val Val Leu Pro Asp Val Pro Glu Ile 170 175 180

【００３８】 CTA AGG GGT CTA GCT GAA GTT GGT CTG ACA AGC CTG CAG AGT GGC 636 Leu Arg Gly Leu Ala Glu Val Gly Leu Thr Ser Leu Gln Ser Gly 185 190 195 ATG GAC AAC GTG AGA AAC CCC GTC GGA AAT CCG CTT GCA GGA ATT 681 Met Asp Asn Val Arg Asn Pro Val Gly Asn Pro Leu Ala Gly Ile 200 205 210 GAT CCG GAT GAG ATT GTT GAT ACC AGA CCT TAT ACC AAC TTG TTG 726 Asp Pro Asp Glu Ile Val Asp Thr Arg Pro Tyr Thr Asn Leu Leu 215 220 225 TCC CAA TTT ATC ACT GCC AAT TCT TGT GGA AAT CCT GAG TTC ACT 771 Ser Gln Phe Ile Thr Ala Asn Ser Cys Gly Asn Pro Glu Phe Thr 230 235 240 AAC TTG CCA AGG AAG TGG AAT GTA TGT GTC GTG GGT TCT CAT GAT 816 Asn Leu Pro Arg Lys Trp Asn Val Cys Val Val Gly Ser His Asp 245 250 255 CTT TAT GAG CAT CCT CAT ATC AAT GAT CTT GCT TAC ATG CCT GCC 861 Leu Tyr Glu His Pro His Ile Asn Asp Leu Ala Tyr Met Pro Ala 260 265 270 ATG AAG GAC GGG CGG TTT GGA TTC AAT TTG CTG GTT GGT GGG TTC 906 Met Lys Asp Gly Arg Phe Gly Phe Asn Leu Leu Val Gly Gly Phe 275 280 285 TTT AGT CCC AAG CGA TGT GCT GAG GCA ATT CCT CTT GAT GCT TGG 951 Phe Ser Pro Lys Arg Cys Ala Glu Ala Ile Pro Leu Asp Ala Trp 290 295 300 GTT TCA GCT GAT GAT GTG CTC CCA TCT TGC AAA GCA GTG TTA GAG 996 Val Ser Ala Asp Asp Val Leu Pro Ser Cys Lys Ala Val Leu Glu 305 310 315

【００３９】 GCC TAC AGA GAT CTT GGC ACC AGA GGG AAC AGG CAA AAG ACT AGA 1041 Ala Tyr Arg Asp Leu Gly Thr Arg Gly Asn Arg Gln Lys Thr Arg 320 325 330 ATG ATG TGG CTG ATC GAC GAG CTT GGC ATT GAA GGA TTC AGG TCA 1086 Met Met Trp Leu Ile Asp Glu Leu Gly Ile Glu Gly Phe Arg Ser 335 340 345 GAA GTA GTA AAA AGA ATG CCA CGT CAA GAG CTA GAG AGA GAA TCT 1131 Glu Val Val Lys Arg Met Pro Arg Gln Glu Leu Glu Arg Glu Ser 350 355 360 TCT GAA GAT TTG GTT CAA AAG CAA TGG GAA AGG AGG GAC TAT TTC 1176 Ser Glu Asp Leu Val Gln Lys Gln Trp Glu Arg Arg Asp Tyr Phe 365 370 375 GGT GTC CAT CCA CAG AAG CAA GAA GGC CTT AGC TAT GCA GGT CTT 1221 Gly Val His Pro Gln Lys Gln Glu Gly Leu Ser Tyr Ala Gly Leu 380 385 390 CAC ATT CCT GTC GGT CGC GTC CAA GCA GAT GAC ATG GAT GAG CTA 1266 His Ile Pro Val Gly Arg Val Gln Ala Asp Asp Met Asp Glu Leu 395 400 405 GCT CGT TTA GCT GAT ATT TAT GGC ACT GGC GAA CTC AGA CTC ACT 1311 Ala Arg Leu Ala Asp Ile Tyr Gly Thr Gly Glu Leu Arg Leu Thr 410 415 420 GTG GAG CAG AAC ATC ATA ATT CCC AAC ATT GAG GAC TCA AAG ATT 1356 Val Glu Gln Asn Ile Ile Ile Pro Asn Ile Glu Asp Ser Lys Ile 425 430 435 GAA GCC CTA CTT AAA GAA CCT CTA TTA AAA GAC AGG TTC TCA CCT 1401 Glu Ala Leu Leu Lys Glu Pro Leu Leu Lys Asp Arg Phe Ser Pro 440 445 450

【００４０】 GAG CCA CCT CTT CTC ATG CAA GGG TTG GTA GCA TGC ACT GGC AAA 1446 Glu Pro Pro Leu Leu Met Gln Gly Leu Val Ala Cys Thr Gly Lys 455 460 465 GAG TGT TGC GGG CAA GCA ATA ATT GAA ACA AAG GCT AGG GCC ATG 1491 Glu Cys Cys Gly Gln Ala Ile Ile Glu Thr Lys Ala Arg Ala Met 470 475 480 AAG GTA ACT GAG GAG GTG CAG AGG TTA GTG TCG GTG TCT AAA CCA 1536 Lys Val Thr Glu Glu Val Gln Arg Leu Val Ser Val Ser Lys Pro 485 490 495 GTG AGA ATG CAC TGG ACA GGC TGT CCT AAT ACC TGT GGG CAG GTA 1581 Val Arg Met His Trp Thr Gly Cys Pro Asn Thr Cys Gly Gln Val 500 505 510 CAA GTT GCC GAT ATT GGG TTC ATG GGT TGC ATG GCA AGA GAT GAA 1626 Gln Val Ala Asp Ile Gly Phe Met Gly Cys Met Ala Arg Asp Glu 515 520 525 AAT GGG AAA ATC TGT GAA GGA GCA GAT GTG TAC CTA GGA GGT AGA 1671 Asn Gly Lys Ile Cys Glu Gly Ala Asp Val Tyr Leu Gly Gly Arg 530 535 540 GTT GGG AGT GAC TCA CAT TTG GGA GAG CTT TAT AAG AAA AGT GTT 1716 Val Gly Ser Asp Ser His Leu Gly Glu Leu Tyr Lys Lys Ser Val 545 550 555 CCG TGC AAG GAC TTG GTG CCT TTG GTT GTG GAC ATT TTA GTT AAA 1761 Pro Cys Lys Asp Leu Val Pro Leu Val Val Asp Ile Leu Val Lys 560 565 570 CAA TTC GGA GCT GTA CCA AGG GAG AGG GAA GAG GTG GAT GAC TAG 1806 Gln Phe Gly Ala Val Pro Arg Glu Arg Glu Glu Val Asp Asp 575 580 585

【００４１】 TTCATTAAAT CAAAATGTTC ATTCTTGTTT CATGGCAAAA TCGGAGGGGA 1856 TCTAATGCAT GCTTTTGGAA TCGGAAATGA AGCACTGAAA TGATCTCACA 1906 GGACTATGAA GGGTGATAAA GGTCTGAGAA GGGAAAGGGA AGGGAGTTGT 1956 GTTCTTCGAG CTCTCACGAG CATGATTTCC AACAACTCTG GTTTCATTGT 2006 TTGGGTTTTG TATGATGGTT AGAAGCCCGG TAGGAGCTTT TATGTATGAA 2056 AATAAAACTT CGTATAGCTT ATGATGCAAA ACTAAAAACA CTCGGAGACT 2106 AAAAAACAAT AAAATTTGGA AGATTTTTGT GACTCCCTTA AAAAAAAAAA 2156 AAAA 2160

Claims (7)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 配列番号：１に示すアミノ酸番号２のＳ
   ｅｒからアミノ酸番号５８８のＡｓｐまでのアミノ酸配
   列を含む亜硝酸還元酵素をコードする遺伝子。
2. 【請求項２】 配列番号：１に示すアミノ酸番号２６の
   Ｔｈｒからアミノ酸番号５８８のＡｓｐまでのアミノ酸
   配列を含む亜硝酸還元酵素をコードする遺伝子。
3. 【請求項３】 配列番号：１に示すアミノ酸配列に対し
   て９５％以上の相同性を有するアミノ酸配列を有するポ
   プラ属植物由来の亜硝酸還元酵素をコードする遺伝子。
4. 【請求項４】 配列番号：１に示すアミノ酸番号２のＳ
   ｅｒからアミノ酸番号５８８のＡｓｐまでのアミノ酸配
   列に対して約２０個以内のアミノ酸配列が置換、欠失及
   び／又は付加されているアミノ酸配列を有し、且つ亜硝
   酸還元酵素活性を維持している蛋白質をコードする遺伝
   子。
5. 【請求項５】 配列番号：１に示すアミノ酸番号２６の
   Ｔｈｒからアミノ酸番号５８８のＡｓｐまでのアミノ酸
   配列に対して約２０個以下のアミノ酸が置換、欠失及び
   ／又は付加されているアミノ酸配列を有し、且つ亜硝酸
   還元酵素活性を維持している蛋白質をコードする遺伝
   子。
6. 【請求項６】 配列番号：１に示すヌクレオチド配列中
   で、対応する領域に記載のヌクレオチド配列を有する、
   請求項１に記載の遺伝子。
7. 【請求項７】 配列番号：１に示すヌクレオチド配列中
   で、対応する領域に記載のヌクレオチド配列を有する、
   請求項２に記載の遺伝子。