JP4912292B2 - 環境負荷化学物質を検出し得るトランスジェニック植物 - Google Patents
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Description
(1)環境負荷化学物質を花色の変化によって検知する植物体を作製するための植物の形質転換用ベクターであって、発現可能に組み込まれたAhR遺伝子、AhRリガンド刺激誘導型プロモーター、及び該プロモーターによって発現可能に組み込まれた所望の花色素合成に関与する遺伝子の発現を抑制する発現抑制因子を含有する、植物の形質転換用ベクター。
(2)上記(1)に記載の植物の形質転換用ベクターであって、DNA結合ドメイン、AhRリガンド結合ドメインおよび転写活性化ドメインをコードする遺伝子を含み、さらに、花色素合成に関与する遺伝子に対してRNA干渉作用を有する二本鎖RNA(dsRNA)をコードする核酸を含み、該核酸は前記AhRリガンド刺激誘導型プロモーターの制御下にあり、該誘導型プロモーターにはAhRリガンドに応答して前記DNA結合ドメインが結合するように構成されたベクター。
(3)前記花色素合成に関与する遺伝子がアントシアニン生合成に関与する遺伝子である、上記(1)に記載のベクター。
(4)前記アントシアニン生合成に関与する遺伝子がフラバノン3水酸化酵素(F3H)またはフラボノイド3',5'-水酸化酵素(F3',5'H)をコードする遺伝子である、上記(3)に記載のベクター。
(5)前記AhRリガンドがダイオキシン類および/もしくは多環状芳香族炭化水素またはそれらのアナログである、上記(1)に記載のベクター。
(6)XD4VまたはXD5Vを含む、上記(1)に記載のベクター。
(7)前記誘導型プロモーターがLexAプロモーター配列を含む、上記(1)に記載のベクター。
(8)さらに1つ以上の所望の遺伝子を含む、上記(1)に記載のベクター。
(9)前記所望の遺伝子が薬剤耐性遺伝子である、上記(8)に記載のベクター。
(10)前記所望の遺伝子がカーネーションTHC2'GT遺伝子である、上記(8)に記載のベクター。
(11)前記植物がペチュニア、トレニア、またはバーベナである、上記(1)に記載のベクター。
(12)AhRリガンドに応答して花色を変化させるトランスジェニック植物であって、上記(1)に記載のベクターで形質転換したトランスジェニック植物。
(13)ペチュニア、トレニア、またはバーベナである、上記(12)に記載のトランスジェニック植物。
(14)上記(12)に記載のトランスジェニック植物の繁殖材料。
(15)土壌中のAhRリガンドをトランスジェニック植物を用いて検出する方法であって、上記(12)に記載のトランスジェニック植物を試験すべき土壌に移植して栽培し、花色変化を観察する工程を含む、方法。
(16)前記AhRリガンドがダイオキシン類および/もしくは多環状芳香族炭化水素またはそれらのアナログである、上記(15)に記載の方法。
以下、本発明をより詳細に説明する。
本発明においては、環境負荷化学物質誘導型の遺伝子発現系を構築する。この遺伝子発現系に用いられる転写システムとしては、特にこれに限定されないが、特開2004−89068号公報に記載された転写システムが好ましく用いられる。例えば、本発明の環境負荷化学物質誘導型発現系においては、(1)構成的な発現を促す第1プロモーター配列の下流に、DNA結合領域、核局在化シグナル配列、AhRリガンド結合制御領域および転写活性化領域を含む融合タンパク質をコードする遺伝子を繋いだものと、(2)前記DNA結合領域と特異的に結合する配列を含む第2プロモーター配列の下流に、植物に導入された場合に当該植物の花色素合成に関与する遺伝子の発現を抑制する発現抑制因子を繋いだものを連結し、これら一連の配列を含むベクターを構築する。なお、このようなベクターの構築に際しては、特開2004−89068号公報の記載を参照することができる。
上記のようなベクターの構築は、公知の制限酵素等を用いて、常法に従って行い得る。例えば、アグロバクテリウムを用いる場合には、PBI121などのバイナリーベクターを、パーティクルガンを用いる場合には、PUC19などの大腸菌ベクターを用いることができる。さらに、当該ベクターで形質転換された植物細胞を、例えば、抗生物質耐性遺伝子などのマーカー遺伝子を用いて選抜し、適切な植物ホルモン等の条件を用いて再分化させ、目的の遺伝子で形質転換された植物体を得ることができる。
本発明はさらに、別の態様において、土壌中の環境負荷化学物質(例えば、AhRリガンド)を、本発明のベクターで形質転換したトランスジェニック植物を用いて検出する方法を提供する。この方法は、本発明のベクターで形質転換したトランスジェニック植物を試験すべき土壌中に移植して栽培して、花色変化を観察する工程を包含する。花色が変化した場合(例えば、花色が減退し、白色に近い花色に変化した場合)、環境負荷化学物質が検出されたと判断される。土壌中の環境化学負荷物質としては、代表的には、AhRリガンドであるダイオキシン類および/または多環状芳香族炭化水素が挙げられる。また、本発明のトランスジェニック植物は、土壌に限られず、培養培地や水、大気などに含まれる環境負荷化学物質の検出にも使用し得ることはもちろんである。
PAB、PD 4 B、PD 5 B、およびTAGのコンストラクトの構築
PAB用コンストラクトの構築
カリフラワーモザイクウイルス35Sプロモーター上流にエンハンサー配列を2回繰り返し持つEl235Sプロモーター配列(Plant Cell Physiol. 37,49−59(1996))と、チョウマメのF3'5'H cDNA配列(WO2004/020637に記載)、ノパリン合成酵素(nos)のターミネーター配列をバイナリ−ベクターpBinPlus(Trangenic Research4,288−290(1995))に導入してあるpSPB748(PlantCell Physiol.44, s122, 2003)より、チョウマメF3'5'H cDNAとnosターミネーターの連結したDNA断片(約2.0kb)をBamHI消化とEcoRIの部分消化によって回収し、pBluescriptII (sk−)(Stratagene社)のBamHI/EcoRIサイトに導入することにより、プラスミドpB−Bnとした。マウスの異物応答配列(XRE)を6回繰り返し持つ6xXREプロモーター配列と、GUS遺伝子、nosターミネーターをpBluescriptII (ks+)(Stratagene社)に導入してあるpBlueSXXREGUSよりGUS遺伝子とnosターミネーターの遺伝子カセットをXbaIとKpnIでの消化により抜き出し、同サイトにpB−BnからXbaIとKpnI消化で切り出したチョウマメF3'5'Hとnosターミネーターの連結したDNA断片(約2.0kb)を挿入し、pB−X6Bnを得た。バイナリーベクターpBin19(Nucl.Acids Res, 12, 8711-8721, 1984)上に、カリフラワーモザイクウイルス35Sプロモーターとnosターミネーターからなる発現ユニット2組にアルファルファモザイクウイルスの5'非翻訳(UTR)配列をそれぞれ付加させたAhRV及びArntを順方向に挿入したベクターpSKAVAtのSalIサイトに、pB−X6BnをXhoI消化して切り出した6xXREプロモーター配列とチョウマメF3'5'H cDNA、nosターミネーター配列の遺伝子カセット(2.2kb)を導入することにより、pSPB1459を構築した(図1を参照)。pSPB1459をアグロバクテリウム・ツメファンシスAgl0株(BioTechnology 9,963−967(1991))に導入し、ペチュニア(品種PL,Skr4 xSw63(Nature,366,276−279を参照))をリーフディスクを用いるアグロバクテリウム法で形質転換した。アグロバクテリウムへのプラスミドの導入、形質転換の方法は公知の方法(Plant J. 5,p81−92、1994)によった。品種PLはフラボノイド3',5'−水酸化酵素遺伝子、フラボノイド3'−水酸化酵素遺伝子を欠損しているため花色は白ないし薄いピンクである。なお、本実施例では、品種PLを用いたが、本発明の目的に使用するペチュニア品種はPLに限定されない。独立した形質転換ペチュニアPABを38系統取得した。
CaMV35S−sGFP(S65T)−NOS3'(Plant J, 18, 455-463, 1999)をBamHIとEcoRIで消化し、sGFP遺伝子とnosターミネーター遺伝子の連結DNA(1.0kb)をpBluescriptII(sk−)のBamHI/EcoRIサイトに導入することにより、プラスミドpB−Gnを構築した。pBlueSXXREGUSよりGUS遺伝子とnosターミネーターの遺伝子カセットをXbaIとKpnIで抜き出し、同サイトにpB−GnからXbaIとKpnI消化で切り出したsGFPとnosターミネーターの遺伝子カセット(1.0kb)を挿入、pB−X6Gnを構築。pSKAVAtのSalIサイトに、pB−X6GnをXhoI消化して切り出した6xXREプロモーターとsGFP、nosターミネーターの遺伝子カセット(1.2kb)を導入、pSPB1458を構築した(図1を参照)。
特開2004−89068号公報に記載されているAhRリガンド特異的に遺伝子発現が誘導されるシステム(XDV)のうち、LexA−AhR83−494−VP16(XD4V)を含むバイナリーベクターpGPΩD4VGUSとLexA−AhR83−593−VP16(XD5V)を含むバイナリーベクターpGPΩD5VGUSのGUS遺伝子部分をチョウマメのF3'5'H cDNAに入れ替えたバイナリーベクターの構築を以下のように行った。pGPΩD4VGUSをXhoIとSpeIにより消化してGUS遺伝子領域を除き、同サイトにSpeIXhoI−FとSpeIXhoI−Rのオリゴヌクレオチドによるアダプターカセットを挿入したpSPB2229を作製した。同様にしてpGPΩD5VGUSからpSPB2221を作製した。pBluescriptII (sk−)に含まれているチョウマメのF3'5'H cDNA(約1.7kb)をSpeIとXhoIで消化することにより回収し、pSPB2229をSpeIとXhoIにより消化したDNA断片と連結し、pSPB2222を構築した(図1を参照)。同様にpSPB2221とチョウマメF3'5'HcDNAよりpSPB2219を構築した(図1を参照)。前述のように、pSPB2222をアグロバクテリウム・ツメファンシスAgl0株に導入し、このアグロバクテリウムを用いて、ペチュニアPL株を形質転換した。独立した形質転換ペチュニア(PD4Bとした)を42系統取得した。また、pSPB2219を導入した独立した形質転換ペチュニア(PD5Bとした)を38系統取得した。
SpeIXhoI−R)5'−ctagctcgagggactag−3'(配列番号:2)
PAB、PD 4 B、PD 5 B、およびTAGのダイオキシン類薬物による誘導実験
ダイオキシン類薬物を含む培地・土壌中で形質転換体植物を栽培し、目的の遺伝子(この場合F3'5'H遺伝子またはGFP遺伝子)が発現して花色が変化するかどうかを確認する誘導実験は、誘導のかかりうる優良な系統の選抜を目的としたin vitroの組織培養苗を用いた寒天培地での誘導実験(1次評価)と、実際に花を咲かせて花色の変化を見る土壌栽培での誘導実験(2次評価)の2段階に分けて誘導実験を行った。
1次評価ではダイオキシン類として20メチルコランスレン(MC)を用いた。MCはダイオキシン類のアナログで、AhRに結合することが知られている。5μMの20−MCを含むMS寒天培地(Physiol Plant, 15, 473-493, 1962)に移植し、1週間後に葉と根を回収し、それぞれからRNeasy Plant Mini Kit(QIAGEN社)を用いてtotal RNAを単離した。得られたtotal RNA 1μgよりSuper ScriptTM First−Strand Synthesis System for RT−PCR(Invitrogen社)を用いて製造者の推奨するプロトコールに従ってcDNAを合成した。得られたcDNAのうち1μlを鋳型とし、PAB、PD4B、およびPD5BではチョウマメのF3'5'Hの発現量を調べるため、ChBHF−FとChBHF−Rをプライマーとして用い、RT−PCRを行った。また、TAGではsGFPの発現量を調べるため、EGFP−F1とEGFP−R1をプライマーとしてRT−PCRを行った。反応条件は、95℃で1分、55℃で1分、72℃で1分のサイクルを30サイクルとした。なお、得られるべきPCR産物のサイズはチョウマメのF3'5'Hが0.4kb、sGFPが0.7kbである。その結果、PABでは38系中8系統、PD4Bでは42系統中4系統、PD5Bでは38系統中12系統においてMC特異的にF3'5'Hの発現量の増加が確認された。また、TAGでは40系統中5系統においてMC特異的にsGFPの発現量の増加が認められた。以上計29系統の各系統から栄養増殖により2個体ずつを得、これらを馴化し、鉢に移植した。さらに花蕾をつけるまで1ヶ月程度温室にて栽培した。その後、各系統につき1個体の植物体をダイオキシン汚染土壌(独立行政法人農業環境技術研究所により供与を受けた)を用いた誘導実験(2次評価)に使用した。
ChBHF−F)5'−agctcgtgcattcctcaaaacc−3'(配列番号:3)
ChBHF−R)5'−tcgattccgaaccctttgtctc−3'(配列番号:4)
EGFP−F1)5'−atggtgagcaagggcagga−3'(配列番号:5)
EGFP−R1)5'−ttacttgtacagctcgtccat−3'(配列番号:6)
上記1次評価で選抜した29系統の有望系統の苗をダイオキシン汚染土壌に移植、6週間にわたり花色変化とチョウマメF3'5'H遺伝子の発現もしくはsGFP遺伝子の発現をRT−PCRによりモニターした。使用したダイオキシン汚染土壌中のダイオキシン類濃度は360pg−TEQ/g 土壌で、日本の国の環境基準値中の1000pg−TEQ/g 土壌より低い濃度である。花と葉を回収し、前述のようにRNAを回収し、RT−PCRを行った。PABの8系統中4系統で、PD5Bでは12系統中5系統で花蕾においてダイオキシン類特異的にチョウマメF3'5'H遺伝子の発現を確認できた。PD4Bの花蕾では4系統中F3'5'H遺伝子の発現を確認できるものはなかった。PABとPD5Bの花蕾でF3'5'H遺伝子の発現していた9系統の花色は遺伝子導入株のPL株の花色と同じピンク色で、花色変化は確認できなかった。TAGは葉のみサンプリングし、RT−PCR反応を行った。5系統中4系統においてダイオキシン特異的にsGFPの発現が確認できた。
PD 4 F、PD 5 F、TD 4 F、およびTD 5 Fのコンストラクト構築
参考例1および2で行ったような、ペチュニアPL株でダイオキシン類によりチョウマメのF3'5'H遺伝子の発現を誘導する試みでは、誘導レベルが低く、花色が変化するに至らなかったと考えられる。そこで、内在性のアントシアニン合成に関与する遺伝子をダイオキシン類により特異的に抑えることで、アントシアニンの合成を抑制し、花色変化を生じさせる試みを行った。
ペチュニアのdsF3HのコンストラクトはWO2004/018682の実施例8のペチュニアF3HcDNA二本鎖コンストラクト構築の方法によった。
ペチュニアのdsF3H遺伝子カセットをpSPB1497よりSpeI消化で切り出し、上述のpSPB2221のSpeIサイトに挿入、pSPB2250を構築した。pSPB1500からMT170m断片を取得、pSPB2250のSacII消化後平滑化したサイトにMT170mを挿入、pSPB2275を構築した(図1参照)。上述のように、pSPB2274をアグロバクテリウム・ツメファンシスAgl0株に導入し、ペチュニアバカラレッド株を形質転換した。独立した形質転換ペチュニア(PD5Fとした)を15系統取得した。
シソから得られたF3H cDNA(Zhizhong Gong et al.(1997) Plant Mol Biol. 35,p915−927)をプローブとして、トレニアの同酵素をコードするcDNAを以下のように取得した。プローブはノンラジオアイソトープDIG−核酸検出システム(Roche Diagnostics社)を用いて、製造者が推奨する条件に従いPCRによりラベルした。この際、鋳型として1ngのcDNAを含むプラスミドを用い、プライマーとして、上記の各遺伝子特異的なオリゴヌクレオチド100ngを使用し、95℃1分、55℃1分、72℃2分からなる反応を1サイクルとし、これを25サイクル行った。シソF3H遺伝子のPCR増幅産物をハイブリダイゼーションのプローブとして、トレニアcDNAライブラリー(Suzuki et al. (2000) Mol. Breeding 6,p239−246)約20万のファージをスクリーニングした。ハイブリダイゼーションは30%ホルムアミドを含む5×SSC中、37℃で一晩行い、フィルターの洗浄は5×SSC,1%SDSを用いて55℃で30分間行った。合成オリゴヌクレオチドプライマーによるプライマーウォーキング法によってcDNA配列を決定した。これらcDNAのアミノ酸コード領域の塩基配列を配列表・配列番号:7に示した。得られたトレニアF3HcDNAは、ベクターpBluescriptII(sk−)に含まれており、これをプラスミドpSPB266とした。これを鋳型とし、ベクター配列に由来するM13リバースプライマー(配列番号:8)とトレニアF3HcDNA配列に塩基置換でSalI認識部位を挿入したプライマーThF3H−SalI−1(配列番号:9)を用いて、PCRを行った。得られた約0.9kbのフラグメントをpCR2.1−TOPO(Invitrogen社)にクローニングし、塩基配列を確認した。同様にして、トレニアF3H cDNA配列に塩基置換でSalI認識部位を挿入したプライマーThF3H−SalI−2(配列番号10)とM13RVプライマーを用いて、約0.75kbのDNA断片を調製し、pCR2.1−TOPOにクローニングし、塩基配列を確認した。
M13RV) 5'−caggaaacagctatgac−3'(配列番号:8)
ThF3H−SalI−1)5'−ttctctgtcgacgcccattgcc−3'(配列番号:9)
ThF3H−SalI−2)5'−cgccgtgtcgactcgcttgaag−3'(配列番号:10)
トレニアdsF3H遺伝子カセット(1.6kb)をpSFL313よりBamHIで切り出し、pBluescriptII(sk−)のBamHIサイトに導入しpSPB2251を構築した。トレニアのdsF3H遺伝子カセットをpSPB2251よりSpeIとEcoRVで切り出し、前述のpGPΩD4VGUSをXhoI消化した後平滑化し、その後更にSpeI消化したサイトに挿入し、pSPB2260を構築した。pSPB2260をSacIIで消化後平滑化、同サイトに上記のMT170m断片(3.6kb)を導入、pSPB2277を構築した(図1を参照)。前述のように、pSPB2277をアグロバクテリウム・ツメファンシスAgl0株に導入し、トレニアSWB株を形質転換した。独立した形質転換トレニア(TD4Fとした)を40系統取得した。
pSPB2251よりSpeIとEcoRVで切り出したトレニアのdsF3H遺伝子カセット(1.6kb)を、pGPΩD5VGUSをXhoIで消化した後平滑化し、その後更にSpeI消化したサイトに挿入し、pSPB2261を得た。pSPB2261をSacIIで消化後平滑化、同サイトに前述のMT170m断片(3.6kb)を導入、pSPB2278を構築した(図1を参照)。pSPB2278をアグロバクテリウム・ツメファンシスAgl0株に導入し、トレニアSWB株を形質転換した。独立した形質転換トレニア(TD5Fとした)を40系統取得した。
PD 4 F、PD 5 F、TD 4 F、およびTD 5 Fのダイオキシン類薬物による誘導実験
外来性遺伝子(チョウマメF3'5'H, sGFP)を導入しているPAB、PD4B、PD5B、およびTAGと異なり、内在性遺伝子(F3H)を抑制させるコンストラクトを導入しているPD4F、PD5F、TD4F、およびTD5Fでは、F3Hの発現が花弁でしか見られないため、植物体の花蕾をサンプリングしないとダイオキシン類の影響をみることができない。そのため参考例2に示した様な1次評価はPD4F、PD5F、TD4F、およびTD5Fでは実施せず、得られた形質転換体の全てを鉢上げし、ダイオキシン類汚染土壌に移植・栽培する2次評価のみの誘導実験を実施した。
PD4Fの16系統、PD5Fの15系統、TD4Fの48系統、TD5Fの40系統を参考例2の2次評価と同様に、ダイオキシン類汚染土壌(ダイオキシン類濃度360pg−TEQ/g 土壌)に移植し、4週間後の花色変化を観察した。
形質転換ペチュニアP3BおよびバーベナSk3Bの作出
前述の方法により、pSPB748をアグロバクテリウム・ツメファシエンスAgl0株に導入し、このアグロバクテリウムを用いて、ペチュニアPL株を形質転換したところ、独立した形質転換ペチュニアP3Bを27系統取得した。PL株の花色は薄いピンクであるが、得られた系統の花色は赤紫を呈した。同様に、このアグロバクテリウムを用いて、バーベナ(商品名:花手毬(登録商標)サクラ(サントリーフラワーズ株式会社))を形質転換した。形質転換は公知の方法(Plant Cell Rep. 21, 459-466, 2003)によった。この形質転換により、独立した形質転換バーベナSk3Bを6系統取得した。花手毬サクラ株の花色はピンクであるが、得られた系統の花色は紫を呈した。
LexA-AhR83-593-VP16(XD5V)を含むバイナリーベクターpSPB2219(PD5B用コンストラクト)のチョウマメF3'5'H遺伝子部分をチョウマメのdsF3'5'H cDNAに入れ替え、35Sプロモーター−ハイグロマイシン耐性遺伝子(HPT)−nosターミネーターからなるHPT遺伝子カセットを組み込んだバイナリーベクターの構築を以下のように行った。まず、pSPB2219をSacIIで消化後平滑末端化し、同サイトに、HPT遺伝子カセットを含むバイナリーベクターpLAN101MHYG(Plant Cell Physiol. 41, 1397-1406, 2000)から同カセットをHindIIIで消化して切り出し、平滑末端化したものを挿入してpSPB2295を構築した。次に、pBluescriptII (sk-)ベクターをSpeIとBamHIで消化したサイトに、pSPB748から得たチョウマメF3'5'HのcDNA遺伝子断片BHF-1(SpeI/HincII消化後平滑末端化した断片:0.6kb)とBHF-1'(BamHI/FokI消化後平滑末端化した断片:0.9kb)を3断片のDNAライゲーションによって導入し、チョウマメdsF3'5'H遺伝子カセット(1.5kb)を有するpSPB2727を構築した。前述のpSPB2295をXhoIとSpeIにより消化してチョウマメF3'5'H遺伝子領域を除き、同サイトにpSPB2727をXhoIとSpeIにより消化して切り出したチョウマメdsF3'5'H遺伝子カセットを挿入し、pSPB2736を構築した(図1参照)。
前述の形質転換で得られたP3Bのうち、最も花色変化の大きかったP3B-3株を親株として、pSPB2736を導入したアグロバクテリウムを用いて形質転換を行い、独立した形質転換ペチュニアPD5dBを13系統取得した。同様にして、Sk3Bの中で、最も花色変化の大きかったSk3B-5株を親株として形質転換を行った。形質転換は公知の方法(Plant Cell Rep. 21, 459-466, 2003)を一部改変してハイグロマイシンによる選抜を行った。この形質転換により、独立した形質転換バーベナSkD5dBを14系統取得した。
ダイオキシン類を含む土壌中で形質転換植物を栽培し、チョウマメF3'5'H遺伝子の発現が抑制されて花色が変化するかどうかを確認するため、土壌栽培での誘導実験を行った。
BHF-F) 5'-GCTCATCATACCAACGAGTCTCA-3'(配列番号11)
BHF-R) 5'-GATGATGTATCTGTGCCTGCAGT-3'(配列番号12)
BHF-T) 5'-FAM-AACTGTCGCTCACCAACATCAAAGCACTC-TAMRA-3'(配列番号13)
a: AhR:1.2kb, D4:1.2kb, D5:1.5kb [D38417]
b: Arnt:2.1kb [U14333]
c: XRE:0.1kb
d: 5'−UTR(U)
e: CaMV35S−promoter(35S−P):0.2kb [E05206]
f: mas−terminator(T2):0.8kb
g: Mac−promoter(Mac−P):1.2kb
h: NPTII:1.0kb [U09635]
i: HPT:1.0kb [AF309825]
j: LexA(X):0.6kb [AF309825]
k: LexA binding domain(8xLexA):0.3kb [AF309825]
l: VP16(V):0.2kb [AF309825]
m: GFP:0.7kb [AY598428]
n: チョウマメF3'5'H:1.7kb
o: トレニアdsANS:1.0kb
p: トレニアdsF3H(Tr):1.7kb
q: ペチュニアdsF3H(Pt):1.6kb
r: バーベナdsF3H(Ha):1.9kb
s: カーネーションTHC2'GT:1.7kb
t: NPTIIとHPTのプロモーターに使用しているNos−promoter:0.3kb [U09365]
u: NPTIIとHPTのプロモーターに使用しているNos−terminator
(T1):0.3kb [U09365]
v: G10−90promoter(G10−90−P):0.2kb [AF309825]
w: Ω配列(G10−90−PとXD4V/XD5Vの間に挿入)
x: 核移行シグナル(XD4V/XD5VのXとD4/D5の間に挿入)
y: RbcS E9−terminator(T3):0.5kb [AF309825]
z: RbcS 3A−terminator(T4):0.5kb [AF309825]
α: ラット由来のグルココルチコイドレセプター3'非翻訳領域[AF309825]
β: チョウマメdsF3'5'H:1.5kb
Claims (13)
- 花色素合成に関与する遺伝子を含む第1の発現ベクターと、
発現可能に組み込まれたAhR遺伝子を含む第1転写構造体、並びにAhRリガンド刺激誘導型プロモーター及び該プロモーターによって発現可能に組み込まれた前記花色素合成に関与する遺伝子の発現を抑制する発現抑制因子を含有する第2転写構造体を含む第2の発現ベクターと、
を含む、環境負荷化学物質を花色の変化によって検知するトランスジェニック植物体であって、
前記花色素合成に関与する遺伝子は、アントシアニン、カロチノイドまたはベタレイの生合成に関わる酵素遺伝子であり、
前記発現抑制因子は、アンチセンス法、コサプレッション法又はRNAi法により前記花色素合成に関与する遺伝子の発現を抑制する因子であり、さらに、
前記第1の発現ベクターから花色素合成に関与する遺伝子が発現することにより、AhRリガンド刺激を受ける前に花弁の色が薄い色から濃い紫色へと変化しており、その後AhRリガンド刺激に応じて花色素合成に関与する遺伝子の発現が抑制されることにより花弁の色が花色を濃い色から薄い色へと変化することを特徴とする、植物体。 - 前記AhR遺伝子がDNA結合ドメイン、AhRリガンド結合ドメインおよび転写活性化ドメインをコードする遺伝子であり、さらに、前記発現抑制因子が花色素合成に関与する遺伝子に対してRNA干渉作用を有する二本鎖RNAをコードする核酸であり、該核酸は前記AhRリガンド刺激誘導型プロモーターの制御下にあり、該誘導型プロモーターにはAhRリガンドに応答して前記DNA結合ドメインが結合するように構成されたものである、請求項1に記載の植物体。
- 前記花色素合成に関与する遺伝子が、アントシアニン生合成に関与する遺伝子である、請求項1に記載の植物体。
- 前記アントシアニン生合成に関与する遺伝子が、フラバノン3水酸化酵素(F3H)またはフラボノイド3’,5’−水酸化酵素(F3’,5’H)をコードする遺伝子である、請求項3に記載の植物体。
- 前記AhRリガンドがダイオキシン類および/もしくは多環状芳香族炭化水素またはそれらのアナログである、請求項1に記載の植物体。
- 前記第1転写構造体がLexA−AhR83−494−VP16またはLexA−AhR83−593−VP16である、請求項1に記載の植物体。
- 前記誘導型プロモーターがLexAプロモーター配列を含む、請求項1に記載の植物体。
- さらに1つ以上の所望の遺伝子を含む、請求項1に記載の植物体。
- 前記所望の遺伝子が薬剤耐性遺伝子である、請求項8に記載の植物体。
- 前記所望の遺伝子がカーネーションTHC2’GT遺伝子である、請求項8に記載の植物体。
- 前記植物がペチュニア、トレニア、またはバーベナである、請求項1に記載の植物体。
- 土壌中のAhRリガンドをトランスジェニック植物を用いて検出する方法であって、
請求項1に記載のトランスジェニック植物を試験すべき土壌に移植して栽培し、花色変化を観察する工程を含む、方法。 - 前記AhRリガンドは、ダイオキシン類および/もしくは多環状芳香族炭化水素またはそれらのアナログである、請求項12に記載の方法。
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WO2004018682A1 (ja) * | 2002-08-20 | 2004-03-04 | Suntory Limited | 新規糖転移酵素遺伝子 |
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