CN101115837A - 可检测出环境负荷化学物质的转基因植物 - Google Patents

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Abstract

本发明提供用于植物转化的载体，其用于制备通过花色的变化检测环境负荷化学物质的植物体，含有被可表达地整合的AhR基因、AhR的配体刺激诱导型启动子及通过该启动子被可表达地整合的表达抑制因子，该表达抑制因子抑制所需参与花色素合成的基因表达。

Description

可检测出环境负荷化学物质的转基因植物
技术领域
本发明涉及用于制备通过花色变化检测环境负荷化学物质的植物体的用于植物转化的载体、使用此载体转化的转基因植物、使用此转基因植物检测环境负荷化学物质的方法等。更具体地说，本发明涉及通过使用导入含有芳香烃受体(AhR)的基因的基因组的植物，简便地检测存在于环境中的AhR的配体二恶英类及多环芳香烃的技术。
背景技术
至今为止的工业发展过程中，各种各样的化学物质被释放到环境中。其中存在着大量残留、积累在环境中，成为威胁包括人类在内的生物的健康的原因物质(以下称环境负荷化学物质)。特别是其中极低浓度即可对环境产生不良影响、被视为社会性问题的是二恶英类和多环芳香烃。二恶英类及多环芳香烃(其中包括苯并芘、甲基胆蒽等)在环境负荷化学物质中，对哺乳动物表现出免疫毒性、致畸毒性、致癌性等种种生物体毒性，不仅对人类的健康，对于生态环境的影响也非常令人担心。
急性毒性可用其化合物的LD(致死量)比较。二恶英类中毒性极高的2，3，7，8-TCDD的LD50(50％致死量)因对象生物的不同而不同，但均为极低的浓度。例如，对于与人类接近的猴子，其LD50为50～70μg/kg，与其他毒性物质相比也为非常低的浓度。而且，二恶英因显示致癌性、致畸毒性、激素样作用等的多种毒性，所以，即使是不显示急性毒性的低浓度，通过在体内积累，也会对健康产生影响。且已知包含共平面多氯联苯在内的其他二恶英类的毒性虽有强弱之差，但也显出示与2，3，7，8-TCDD同样的多种毒性(《环境激素与二恶英》、化学同人、1999年。日语原名：「環境ホルモン&ダイオキシン」、化学同人、1999年)。
因此，越来越期望有能监测环境中以低浓度存在的二恶英类及多环芳香烃的分布、动态的技术。
以往，二恶英类及多环芳香烃的监测是通过从监测地区的多个地点采样，搬运到实验设施后，通过仪器分析进行检测及定量。但是，此种仪器分析的灵敏度、精确度虽很优异，但需要分析设备和熟练技术，所以存在着花费时间且机器、试剂等的经费高的问题。现状中，每一件需花费数十万日元的测定委托费。因此，需要简便快速、高灵敏度且廉价的方法。
另一方面，生物具有识别二恶英类及多环芳香烃，并代谢上述物质的功能。因应用此种生物功能监测二恶英类等的方法，可减少由于有机溶剂的过多使用等而造成二次污染的危险性等，所以是环境负荷小、易得到公共理解的方法，至今为止，一直都在开发利用生物功能监测环境负荷化学物质的方法。例如，已知环境负荷化学物质之一的内分泌干扰物质的检测，有以对参与女性激素(雌激素)、男性激素(雄激素)、甲状腺激素等的内分泌系统功能的受体的应答性为指标的方法。且已知利用生物体内抗原抗体反应的特异性，针对环境负荷化学物质的特异性的免疫化学测定法等。二恶英类中，使用受体的体外检测法的试剂盒例如ECO-ASSAY DIOXIN ELISA KIT(大塚制药)、Ah免疫诊断试剂盒(和光纯药工业)、Dioxin/Furan EIA kit，60 test，Dfl-60(关东化学)等已有市售。
但是，上述检测法均是将採集的样品依次从採集地带回实验室，再使用适合各种分析的试剂及仪器等进行测定。因此，在无实验设施或其利用上有实质困难的场所(例如，离实验设施较远的野外)中无法实施。而且，上述检测法只能判断在实验设施内分析后得出的测定结果，所以，不能在採集地点进行迅速的现场测定。
如上所述，特别是对于哺乳类，即使二恶英类的浓度极低也能显示出强毒性。此时，二恶英类在细胞内与受体AhR特异性结合。其后，二恶英类作为配体结合的AhR-二恶英类复合物与AhR核转位蛋白(Arnt)形成异二聚体，并向核内转移。此异二聚体通过AhR中的DNA结合结构域介导与特定DNA序列结合，通过AhR中的转录激活结构域介导，激活其特定DNA序列的3’端结构基因的转录(J.Biol.Chem.270，29270-29278，1995)。
已有如下报道，通过利用哺乳动物的AhR可识别作为配体的极低浓度的二恶英类的特征来检测二恶英类，并进行了尝试，且部分获得了成功(日本特开2004-89068号公报)。如日本特开2004-89068号公报中所记载，AhR的配体特异性基因诱导表达系统中，将AhR的结构从其氨基末端开始，分割成(i)DNA结合结构域、(ii)配体结合控制结构域、(iii)转录激活结构域的3个功能区域，其中，将配体结合控制结构域作为基本的功能结构域加以利用，而且融合与其适合的DNA结合区域及单纯疱疹病毒VP16因子的转录激活区域等的功能区域。而且，此公报中记载了二恶英类存在时，导入大肠杆菌β-葡萄糖醛酸苷酶(GUS)基因被诱导的载体的烟草可通过5nM的20-甲基胆蒽(作为二恶英类的类似物使用)表达GUS基因。
但是，此方法中，为检测有无二恶英类，需采集被检植物的叶片进行GUS染色，所以不能说是简便的方法。
另一方面，花的颜色主要来自花色素苷、类胡萝卜素、甜菜拉因的3种化合物组。其中，花色素苷的呈色范围最广，对很多植物种的花色起作用。含有花色素苷的类黄酮的生物合成途径已被详细研究，高等植物中保存了此途径。已知有关花色素苷合成的酶基因也已被克隆，且通过人为调整这些基因的表达，可改变花中积累的类黄酮的结构和量，从而改变花色(Plant Cell Physiol.39，1119-1126，1998)。通过使用此种方法，培育出自然界中不存在的蓝色康乃馨、橙色矮牵牛。但是，还没有将此种颜色变化用于二恶英类的检测或其与二恶英类的相关关系的报道。
已有如下报道，与花色素苷合成有关的结构基因中，通过抑制查耳酮合成酶、黄烷酮3-羟化酶(F3H)、二氢黄酮醇还原酶、花色素合成酶的各基因的表达，可使花色变白或变浅(Plant Cell Physiol.39，1119-1126，1998；PlantCell Physiol.44，s122，2003；Plant Biotechnology，21，377-387，2004)。且还有通过使用RNAi法抑制参与花色素苷合成的基因的表达，从而改变花色的报道(Plant Cell Physiol.44，s122，2003)。但是，这些文献中均没有将这些花色的变化用于二恶英等的检测的记载或说明。
通过嫁接试验，证明包括根圈的植物下部的GUS等外源基因的沉默信号通过植物体内向植物上部转移，并在植物上部引起沉默(EMBO J.16，4738-45，1997)。但是，却没有在根圈内通过RNAi法抑制从外部导入的外源类黄酮代谢基因的表达，其信号转移到地上部后使花色改变的报道。
而且，组合上述二恶英类诱导性的转录系统和类黄酮3’，5’-羟化酶等的细胞色素P450基因时，可培育出当二恶英类存在时花色从粉色变成蓝色的矮牵牛等(日本国独立行政法人农业·生物系特定产业技术研究机构生物系特定产业技术研究支援中心、[0nline]、[平成17年1月27日检索]、网址<URL：http:∥brain.nato.affrc.go.jp/tokyo/gijutu/14kadai/hp3/kobetu/10-12.htm#kobetsu11>)。但是，此种植物的培育现在还未实现。
发明内容
基于上述状况，期待开发出可进行现场测定，环境负荷少、简便迅速、高灵敏度且廉价的检测环境中的二恶英类及多环芳香烃的方法。
本发明是为解决上述课题而进行的发明，其提供如下的用于植物转化的载体、用此载体转化的转基因植物及使用此种转基因植物检测环境负荷化学物质的方法。
(1)用于植物转化的载体，其用于制备通过花色的变化检测环境负荷化学物质的植物体，含有被可表达地整合的AhR基因、AhR的配体刺激诱导型启动子及通过该启动子被可表达地整合的表达抑制因子，该表达抑制因子抑制所需参与花色素合成的基因表达。
(2)载体，其是上述(1)中所述的用于植物转化的载体，其如下构成，包含编码DNA结合结构域、AhR的配体结合结构域及转录激活结构域的基因，并且包含编码对于参与花色素合成的基因具有RNA干涉作用的双链RNA(dsRNA)的核酸，该核酸处于前述AhR的配体刺激诱导型启动子的控制下，前述DNA结合结构域应答AhR的配体，与该诱导型启动子结合。
(3)上述(1)中所述的载体，其中，前述参与花色素合成的基因是参与花色素苷生物合成的基因。
(4)上述(3)中所述的载体，其中，前述参与花色素苷生物合成的基因是编码黄烷酮3羟化酶(F3H)或类黄酮3’，5’-羟化酶(F3’，5’H)的基因。
(5)上述(1)中所述的载体，其中，前述AhR的配体是二恶英类及/或多环芳香烃或上述物质的类似物。
(6)上述(1)中所述的载体，其含有XD4V或XD5V。
(7)上述(1)中所述的载体，其中，前述诱导型启动子含有LexA启动子序列。
(8)上述(1)中所述的载体，其还含有1个以上的所需基因。
(9)上述(8)中所述的载体，其中，前述所需基因是抗药性基因。
(10)上述(8)中所述的载体，其中，前述所需基因是康乃馨THC2’GT基因。
(11)上述(1)中所述的载体，其中，前述植物是矮牵牛、蓝猪耳或美女樱。
(12)转基因植物，其是应答AhR的配体而使花色改变的转基因植物，是用上述(1)中所述的载体转化的转基因植物。
(13)上述(12)中所述的转基因植物，其是矮牵牛、蓝猪耳或美女樱。
(14)繁殖材料，其是上述(12)中所述的转基因植物的繁殖材料。
(15)方法，其是使用转基因植物检测土壤中的AhR的配体的方法，包括将上述(12)中所述的转基因植物移植到需进行试验的土壤中进行栽培以观察花色变化的工序。
(16)上述(15)中所述的方法，其中，前述AhR的配体是二恶英类及/或多环芳香烃或上述物质的类似物。
通过本发明，首次提供了利用应答二恶英类及多环芳香烃所诱发的参与花色素合成的基因的表达抑制作用，使植物的花色产生变化的方法。且本发明的环境负荷化学物质的检测方法，具有可现场测定、环境负荷少的作用。并且本发明的优选检测方法具有简便迅速、高感度且廉价的效果。
附图说明
图1表示使用参考例1及2的表达构建物(PAB、PD4B、PD5B及TAG)以及使用实施例1及2及3的表达构建物(PD4F、PD5F、TD4F、TD5F、PD5dB及SKD5dB)的构成模式图。
图2表示本发明中的RNA干涉作用的模式图。
图3表示将用本发明的载体转化的矮牵牛及蓝猪耳在不存在及存在有二恶英类的条件下分别栽培时所呈现的花色的照片。(a)及(b)对应实施例1及2，(c)对应实施例3。
且图中的字母表示的略号(：大小[注册号])表示如下事项。
a：  AhR：1.2kb，D4：1.2kb，D5：1.5kb  [D38417]
b：  Arnt：2.1kb  [U14333]
c：  XRE：0.1kb
d：  5’-UTR(U)
e：  CaMV35S-promoter(35S-P)：0.2kb  [E05206]
f：  mas-terminator(T2)：0.8kb
g：  Mac-promoter(Mac-P)：1.2kb
h：  NPTII：1.0kb  [U09635]
i：  HPT：1.0kb  [AF309825]
j：  LexA(X)：0.6kb  [AF309825]
k：  LexA binding domain(8xLexA)：0.3kb  [AF309825]
l：  VP16(V)：0.2kb  [AF309825]
m：  GFP：0.7kb  [AY598428]
n：  蝶豆F3’5’H：1.7kb
o：  蓝猪耳dsANS：1.0kb
p：  蓝猪耳dsF3H(Tr)：1.7kb
q：  矮牵牛dsF3H(Pt)：1.6kb
r：  美女樱dsF3H(Ha)：1.9kb
s：  康乃馨THC2’GT：1.7kb
t：  NPTII和HPT的启动子中使用的Nos-promoter：0.3kb  [U09365]
u：  NPTII和HPT的启动子中使用的Nos-terminater(T1)：0.3kb  [U09365]
v：  G10-90promoter(G10-90-P)：0.2kb  [AF309825]
w：  Ω序列(插入到G10-90-P和XD4V/XD5V之间)
x：  核定位信号(插入到XD4V/XD5V的X和D4/D5之间)
y：  RbcS E9-terminator(T3)：0.5kb  [AF309825]
z：  RbcS 3A-terminator(T4)：0.5kb  [AF309825]
α： 来自大鼠的糖皮质激素受体3’非翻译区域[AF309825]
β： 蝶豆dsF3’5’H：1.5kb
具体实施方式
如前所述，已有报道记载了组合上述二恶英类诱导性转录系统和类黄酮3’，5’-羟化酶等的细胞色素P450基因时，可培育出二恶英类存在时花色由粉色变成蓝色的矮牵牛等。但是，实际上根据本发明者的实验，此种方法中，通过二恶英类的类黄酮3’，5’-羟化酶基因的诱导水平低，所以并未观察到花色的变化(参照本说明书的参考例1及2)。
因此，本发明者基于如下设想，反复进行了实验，即通过使用由环境负荷化学物质的刺激诱导表达的启动子，由其启动子的表达诱导抑制参与其被检植物的花色素合成的基因的表达，从而检测出使花色变化的环境负荷化学物质。而且，本发明者由应答环境负荷化学物质AhR的配体(例如，二恶英类及/或多环芳香烃)所诱发，通过RNA干涉(RNAi)，诱发与内源性花色素有关的基因表达的抑制，成功地使花色产生了变化，从而完成了本发明。
即本发明提供用于植物转化的载体，其用于制备通过花色的变化检测出环境负荷化学物质的植物体，含有被可表达地整合的AhR基因、AhR的配体刺激诱导型启动子及通过该启动子被可表达地整合的表达抑制因子，该表达抑制因子抑制所需参与花色素合成的基因表达。
本说明书中，“环境负荷化学物质”是指被释放到环境中，在环境中残留、积累期间成为威胁包括人类在内的生物健康的原因，且对生态系统造成负荷的物质。代表性的环境负荷化学物质可以是AhR的配体的二恶英类及多环芳香烃。
本发明中使用的用于植物转化的载体的“AhR基因”，考虑到可将AhR的结构分割为(1)DNA结合结构域、(2)AhR的配体结合结构域及(3)转录激活结构域的3个功能区域，优选编码以来自人体、小鼠、大鼠、豚鼠等各个种的适合的AhR的配体结合结构域为基本结构，融合了与其对应的适合的DNA结合结构域(例如，小鼠AhR的DNA结合结构域、大肠杆菌LexA蛋白的DNA结合结构域)及适合的转录激活结构域(例如，单纯疱疹病毒VP16因子的转录激活区域)等的同种或异种功能区域的AhR融合蛋白质的重组AhR基因。当然，不一定必须是融合蛋白质，上述3个结构域也可以来自同种。
本说明书中，“AhR的配体刺激诱导型启动子”是指应答如AhR的配体的诱导因子，根据所规定的分子生物学的程序，使其控制下的转录单位转录的诱导性启动子。
本说明书中，“被可表达地整合的”基因，是指在被导入的细胞内可表达地整合到载体中的基因。“(在载体中)被可表达地整合的基因”，可通过将控制该基因表达的适合的如启动子的表达调控因子配置在该载体中的可调控该基因表达的位置(例如，该基因的上游)等来实现。
本说明书中，“参与花色素合成的基因”是指与使花显色的色素的生物合成有关的一组基因，例如，包含于如花色素苷、类胡萝卜素、甜菜拉因的色素组中的与色素的生物合成有关的酶基因。用于本发明的参与花色素合成的基因的优选例子，可为参与花色素苷生物合成的基因。花色素苷在上述色素组的化合物中呈色范围最广，是因为其对很多植物种的花色均起作用。含有花色素苷的类黄酮的生物合成途径已被详细研究，高等植物中保存了此途径。与花色素苷合成有关的酶基因也被克隆，且可人为地调整上述基因的表达(例如，参照Plant Cell Physiol.39，1119-1126，1998)。已知参与花色素苷生物合成的基因为查耳酮合成酶、黄烷酮3-羟化酶(F3H)、二氢黄酮醇还原酶、花色素合成酶、类黄酮3’，5’-羟化酶(F3’，5’H)等，优选使用F3H或F3’，5’H基因。F3H是催化柚皮素转化为二氢堪非醇(dihydrokaempferol)的反应的酶，通过抑制F3H基因的表达可阻碍从二氢堪非醇的下游的类黄酮的生物合成，所以可阻碍花色素苷的积累。其结果，通过有色色素的花色素苷的积累应呈现的花色减退，变成接近白色的花色。F3’，5’H是催化将二氢堪非醇转化为双氢杨梅树皮素的反应的酶，通过促进F3’，5’H基因的表达，可使二氢堪非醇的色素转化率低的植物品种的花色从浅色变成深紫色。而且，对于已经通过促进表达使花色变为深紫色的系统再导入抑制该F3’，5’H基因表达的构建物，还可使花色从深紫色再变成浅色。
本说明书中，“表达抑制因子”是指为抑制特定基因的表达而插入到本发明的载体中的DNA序列，例如，包括RNAi法中编码对于特定基因诱发RNA干涉作用的dsRNA的DNA序列，反义法中编码对于特定基因起表达抑制作用的反义RNA的DNA序列，共抑制法中与特定基因有相同序列的DNA序列等。一般地，抑制植物内源基因表达的方法，至今为止已知有反义法、共抑制法、RNAi法等，特别是RNAi法可最高效地引起内源性基因的表达抑制(Plant Cell Physiol.44，s122.2003)。因此，本发明中，“表达抑制因子”优选编码诱发RNA干涉作用的dsRNA的DNA序列。且抑制的基因，除了内源基因外，也可以是导入、表达的外源基因，此时转化植物体的培育方法，优选将同一载体上的该基因及编码dsRNA的该基因连接后导入植物中，或将该基因和编码dsRNA的该基因改变时间分2次导入的方法，但不限于此。
以下，更详细地说明本发明。
(载体的构建)
本发明中，构建环境负荷化学物质诱导型的基因表达系统。用于此基因表达系统的转录系统不特别限定于此，优选使用日本特开2004-89068号公报中记载的转录系统。例如，本发明的环境负荷化学物质诱导型表达体系中，(1)在促进组成性表达的第1启动子序列的下游连接编码含有DNA结合区域、核定位信号序列、AhR的配体结合控制区域及转录激活区域的融合蛋白质的基因，(2)在含有与前述DNA结合区域特异性结合的序列的第2启动子序列的下游连接表达抑制因子，该表达抑制因子抑制导入植物时参与该植物的花色素合成的基因的表达，连接上述两者，构建包含上述一系列序列的载体。且构建此种载体时，可参照日本特开2004-89068号公报的记载。
本发明的优选形态中所涉及的载体如下构成，(1)包含编码DNA结合结构域、AhR的配体结合结构域及转录激活结构域的基因，(2)还包含编码对于参与花色素合成的基因具有RNA干涉作用的dsRNA的核酸，(3)该核酸在前述AhR的配体刺激诱导型启动子的控制下，前述DNA结合结构域应答AhR的配体，与该诱导型启动子结合。
本说明书中，“AhR的配体”是指与AhR结合，诱发AhR的生理活性的物质。本发明中优选的“AhR的配体”，可为二恶英类及多环芳香烃。二恶英类，代表性的可为多氯二苯并二恶英(PCDDs)、多氯二苯并呋喃(PCDFs)、共平面多氯联苯PCB(Co-PCBs)等的物质。多环芳香烃，代表性的可为苯并芘、甲基胆蒽等物质。本说明书中，只要能与AhR结合，诱发AhR的生理活性，上述化合物的类似物(类似体)也称为“AhR的配体”。此种化合物，例如可为20-甲基胆蒽(MC)、β-萘黄酮、靛蓝等。
本说明书中，“AhR的配体结合结构域”是指例如来自人体、小鼠、大鼠、豚鼠等各个种的AhR的配体结合结构域。只要可构成可激活AhR的配体刺激诱导型启动子的AhR蛋白质的AhR的配体结合结构域，可以是任一种的AhR的配体结合结构域。AhR的配体与AhR的配体结合结构域特异性结合，形成AhR-AhR的配体复合物。且在不失去上述AhR的配体原本功能的情况下，上述AhR的配体结合结构域的氨基酸序列缺失、附加或取代1个以上[例如，1～数个(例如6个)]氨基酸的氨基酸序列所组成的其突变体也包含于“AhR的配体结合结构域”中。
本说明书中，“编码AhR的配体结合结构域的基因”是指编码上述AhR的配体结合结构域的基因。例如，编码小鼠AhR(PDB Accession No.D38417)的氨基酸序列中83-593位的氨基酸序列的DNA序列、编码83-493位的氨基酸序列的DNA序列等均可用于本发明。
本说明书中，“DNA结合结构域”是在AhR蛋白质的氨基酸序列中，与诱导型启动子所规定的序列结合的区域对应的结构域，来自人体、小鼠、大鼠、豚鼠等各个种的DNA结合结构域均可用于本发明中。形成AhR-AhR的配体复合物时，DNA结合结构域与诱导型启动子结合。且在不失去上述DNA结合结构域原本功能的情况下，上述DNA结合结构域的氨基酸序列缺失、附加或取代1个以上(例如，1～数个(例如6个))氨基酸的氨基酸序列组成的其突变体也包含于“DNA结合结构域”中。
本说明书中，“编码DNA结合结构域的基因”是指编码上述DNA结合结构域的DNA序列。依赖于使用的诱导型启动子，适当选择编码DNA结合结构域的基因。例如，可适当使用编码小鼠的AhR的DNA结合结构域(氨基酸残基编号1～82的氨基酸序列)、LexA的DNA结合结构域(细菌阻遏物LexA的氨基酸残基编号1～202的氨基酸序列)的DNA序列。
本说明书中，“转录激活结构域”是指AhR-AhR的配体复合物与诱导型启动子在DNA结合结构域结合时，激活诱导型启动子的AhR中的结构域，来自人体、小鼠、大鼠、豚鼠等各个种的转录激活结构域可用于本发明。且在不失去上述转录激活结构域原本功能的情况下，上述转录激活结构域的氨基酸序列缺失、附加或取代1个以上[例如，1～数个(例如6个)]氨基酸的氨基酸序列组成的其突变体，也包含于此处所述的“转录激活结构域”。
本说明书中，“编码转录激活结构域的基因”是指编码上述转录激活结构域的基因，编码来自各个种的转录激活区域的DNA序列也可用于本发明。可优选使用与编码单纯疱疹病毒VP16蛋白质的转录激活区域的DNA序列对应的DNA序列，更优选使用与编码单纯疱疹病毒VP16蛋白质的转录激活结构域中氨基酸编号为413-490的DNA序列对应的DNA序列。
本说明书中，“RNA干涉”可在该领域中所使用的通常意义上使用，指通过双链RNA(dsRNA)促进互补靶mRNA特异性降解从而特异性抑制蛋白质表达的现象。本发明中，由于诱导型启动子被诱导因子激活，所以，转录对于参与花色素合成的基因(例如，参与黄烷酮3-羟化酶生物合成的基因)具有RNA干涉作用的dsRNA，从而阻碍与内源性花色素合成有关的基因的表达(参照图2)。
本发明中，诱导型启动子特异性结合DNA结合结构域时，受到转录激活结构域的作用，激活其控制下的结构基因的转录。本发明中，可依赖于作为编码上述DNA结合结构域的DNA序列而使用的序列，适当选择适合的诱导型启动子。例如，使用编码小鼠AhR的DNA结合结构域(氨基酸1～82)的DNA序列作为编码DNA结合结构域的DNA序列时，优选使用来自大肠杆菌的6×XRE序列(将6个小鼠XRE序列串联连接的序列)，此外，使用编码大肠杆菌的阻遏物LexA的DNA结合结构域的DNA序列作为编码DNA结合结构域的DNA序列时，优选使用8×LexA-46-P序列[在花椰菜花叶病毒的35S启动子的操纵子区域(转录起始点上游的46碱基处)将LexA结合序列重复8次]。
优选形态中，本发明的载体还可含有1个以上的所需基因。此种基因，例如可为抗药性基因[例如，NPTII(新霉素磷酸转移酶II)]、编码康乃馨THC2’GT、Arnt、类黄酮3’-羟化酶、类黄酮3’，5’-羟化酶、二氢黄酮醇4-还原酶的基因等。上述基因优选在适当的启动子(例如，胭脂碱合成酶启动子、Mac启动子)的控制下配置。
本发明的载体通常含有与核定位信号序列对应的DNA序列。核定位信号序列使本发明的AhR基因的翻译产物蛋白质在细胞核内定位。优选使用来自SV40的核定位信号序列，但不限于此。
本发明的载体通常含有依赖于适合导入上述载体的宿主的种类等的适合的启动子及终止子等的表达调控区及复制起点等。例如，为使基因在植物细胞内表达，制备以可起作用的形态具有(1)植物细胞内可起作用的启动子、(2)基因及(3)植物细胞内可起作用的终止子的DNA分子(表达盒)，导入植物细胞。此种DNA分子，不仅含有启动子，还可含有为进一步增强转录的DNA序列，例如增强子序列。所使用的启动子，只要在植物细胞内可起作用，无特别限制，例如，可以是35S(Shcell，J.S.，1987，Science，237：1176-1183)、Nos(Schell，J.S.，1987，Science，237：1176-1183)、rbcS(Benefy，P.N.及N-H.Chua，1989，Science，244：174-181)、PR1a(Ohshima，M.等、1990、Plant Cell，2：95-106)、ADH(Benefy，P.N.及N-H.Chua，1989，Science，244：174-181)、patatin(Benefy，P.N.及N-H.Chua，1989，Science，244：174-181)、Cab(Benefy，P.N.及N-H.Chua，1989，Science，244：174-181)、及PAL(Lian，X.等、1989、Proc.Natl.Acad.Sci.USA，86：9284-9288)等。
(转基因植物的制备)
如上所述的载体的构建，可使用公知的限制性内切酶等依据通常方法进行。例如，使用土壤杆菌时，可使用PBI121等的双元载体，使用基因枪时，可使用PUC19等的大肠杆菌载体。并且，将用该载体转化的植物细胞，例如使用抗生素抗性基因等的标记基因筛选，使用适合的植物激素等的条件使其再分化，可得到用目的基因转化的植物体。
向植物细胞的载体导入，可使用本领域技术人员周知的方法进行。例如，可使用利用了根癌土壤杆菌、发根土壤杆菌的间接导入法(Heiei，Y.等、PlantJ.，6，271-282，1994、Takaiwa，F.等、Plant Sci.111，39-49，1995)，以电穿孔法(Tada，Y.等、Theor.Appl.Genet，80，475，1990)、聚乙二醇法(Datta，S.K.等、Plant Mol Biol.，20，619-629，1992)、基因枪法(Christou，P.等、Plant J.2，275-281，1992、Fromm，M.E.，Bio/Technology，8，833-839，1990)等为代表的直接导入法。本发明中进行基因导入的植物细胞，只要能在植物体内再生，无特别限制，例如，包括构成悬浮培养细胞、愈伤组织、原生质体、叶片切片等的细胞等。
经转化的植物细胞可通过再生培育植物体。因此，在本发明的其他形态中还提供用本发明的载体转化的转基因植物。用本发明的载体转化时优选的植物种，可为花色素苷已在花瓣中积累或有通过基因导入使花色素苷容易积累的希望的植物种。且如果是可获得转化体的植物种，则更优选。此种植物种，例如，可为矮牵牛、蓝猪耳、美女樱、烟草、月季、菊花、康乃馨、金鱼草、仙客来、兰花、洋桔梗、小苍兰、非洲菊、唐菖蒲、霞草、伽蓝菜、百合、天竺葵(Pelargonium)、天竺葵(Geranium)、郁金香等。
通过将本发明的载体导入植物体及进行表达，不仅花色被改变了的植物体，从其繁殖材料(例如，种子、后代、切花、块根、块茎、果实、切穗等)得到的植物体，也包含于本发明的技术范围内。
(环境负荷化学物质的检测方法)
本发明的进一步的其他形态中，提供将土壤中的环境负荷化学物质(例如，AhR的配体)使用由本发明的载体转化的转基因植物检测的方法。此方法，包括将用本发明的载体转化的转基因植物移植到需进行试验的土壤中进行栽培，并观察花色变化的工序。当花色改变时，(例如，花色减退变成接近白色的花色)可判断为检测出了环境负荷化学物质。土壤中的环境化学负荷物质，代表性的可为AhR的配体的二恶英类及/或多环芳香烃。当然，本发明的转基因植物不只用于土壤检测，还可用于培养用培养基、水、大气等中含有的环境负荷化学物质的检测。
以下，使用实施例进一步具体说明本发明，但本发明的范围不局限于以下实施例。
实施例
在以下的实施例中，分子生物学的方法在无特殊情况下，根据WO96/25500或Molecular Cloning(Sambrook et al.(1989)Cold SpringHarbour Laboratory Press)中所记载的方法。
因是通过园艺植物的花色变化监测二恶英类化合物，所以，运用了日本特开2004-89068号公报中所记载的AhR的配体特异性基因表达诱导因子及以其功能为基础的异种基因的诱导表达系统的利用技术。同技术利用了2个转录结构。第1转录结构包括组成性表达启动子以及在其调控下的DNA结合结构域、核定位信号序列、配体结合结构域、转录激活结构域。第2转录结构由激活配体与第1转录结构转录翻译后合成的蛋白质结合时的转录的诱导型启动子以及其诱导型启动子下的报告基因(GUS、GFP或细胞色素P450基因等)组成。本实施例中，通过将与花色素苷合成有关的基因(花色基因)作为当此第2转录结构中存在二恶英类时被转录的基因使用，进行了开发花色改变的植物的尝试。开发此种植物时，因可期待只有二恶英类存在时花色才改变，所以，此种植物对于简便而广域地监测环境污染状况非常有效。
制备作为上述第1转录结构的3种转录结构。1、将小鼠AhR的转录激活结构域替换为人单纯疱疹病毒的转录激活结构域(VP16)[作为AhRV(参照图1)]。其他的2个是将AhRV的DNA结合结构域替换为大肠杆菌的阻遏物LexA的DNA结合结构域，使用日本特开2004-89068号公报中所记载的LexA-AhR83-494-VP16、LexA-AhR83-593-VP16[分别记为XD4V、XD5V(参照图1)]。XD4V、XD5V中，因使用来自大肠杆菌的序列(LexA)作为DNA结合结构域，所以，第1转录结构结合的序列不是AhRV时的6×XRE序列，而是8×LexA-46-P序列[花椰菜花叶病毒的35S启动子的操纵子区域(转录起始点开始上游的46碱基处)上LexA的结合序列重复8次连接的序列]。作为二恶英类结合结构域，XD4V含有小鼠AhR的83位到494位的氨基酸序列，XD5V含有83位到593位的氨基酸序列。即关于AhR的区域，使用的XD5V只比XD4V长100氨基酸残基。
首先，第1转录结构使用AhRV、XD4V、XD5V的3种，第2转录结构中使用了蝶豆的类黄酮3’5’-羟化酶(F3’5’H)基因。并进行了如下尝试，培育由于土壤中存在二恶英时花色会变为紫色从而可监测二恶英类的园艺植物。且进行了如下尝试，培育使用第2转录结构中作为报告基因的sGFP基因从而可确认应答二恶英的目的基因(第2转录结构)是否表达了的植物体。
(参考例1)
PAB、PD 4 B、PD 5 B及TAG的构建物的构建
PAB用构建物的构建
从将花椰菜花叶病毒35S启动子上游具有2个增强子重复序列的El235S启动子序列[Plant Cell Physiol.37，49-59(1996)]、和蝶豆的F3’5’HcDNA序列(WO2004/020637中所记载)、胭脂碱合成酶(nos)的终止子序列导入双元载体pBinPlus[Trangenic Research4，288-290(1995)]后形成的pSPB748(Plant Cell Physiol.44，s122，2003)中，将蝶豆F3’5’H cDNA和nos终止子连接后的DNA片段(约2.0kb)通过BamHI酶切和EcoRI的部分酶切回收，再通过导入到pBluescriptII(sk-)(Stratagene公司)的BamHI/EcoRI位点，制成质粒pB-Bn。从将小鼠的异物应答序列(XRE)重复6次后所具有的6xXRE启动子序列和GUS基因、nos终止子导入pBluescriptII(ks+)(Stratagene公司)后形成的pBlueSXXREGUS中，将GUS基因和nos终止子的基因表达盒通过用XbaI和KpnI酶切筛选，在同位点插入从pB-Bn中通过XbaI和KpnI酶切后切出的蝶豆F3’5’H和nos终止子连接后的DNA片段(约2.0kb)，获得pB-X6Bn。在双元载体pBin19(Nucl.Acids Res，12，8711-8721，1984)上，将花椰菜花叶病毒35S启动子和nos终止子组成的表达单元2组中分别附加了苜蓿花叶病毒的5’非翻译(UTR)序列后的AhRV及Arnt按顺向插入后，在插入后的载体pSKAVAt的SalI位点上，通过导入将pB-X6Bn用XhoI酶切后切出的6xXRE启动子序列和蝶豆F3’5’H cDNA、nos终止子序列的基因表达盒(2.2kb)，构建pSPB1459(参照图1)。将pSPB1459导入根癌土壤杆菌Agl0株[BioTechnology 9，963-967(1991)]中，将矮牵牛[品种PL，Skr4 xSw63(参照Nature，366，276-279)]用使用了叶盘转化法的土壤杆菌法转化。向土壤杆菌的质粒导入、转化的方法根据公知的方法(Plant J.  5，p81-92、1994)。品种PL由于缺少类黄酮3’，5’-羟化酶基因、类黄酮3’-羟化酶基因，所以，花色为白到浅粉色。且本实施例中，虽使用了品种PL，但用于本发明目的的矮牵牛品种不限于PL。获得了38系统独立的转化矮牵牛PAB。
TAG用构建物的构建
通过将CaMV35S-sGFP(S65T)-NOS3’(Plant J，18，455-463，1999)用BamHI和EcoRI酶切，将sGFP基因和nos终止子基因的连接DNA(1.0kb)导入pBluescriptII(sk-)的BamHI/EcoRI位点，构建质粒pB-Gn。从pBlueSXXREGUS中，将GUS基因和nos终止子的基因表达盒用XbaI和KpnI筛选，在同位点插入从pB-Gn中用XbaI和KpnI酶切后切出的sGFP和nos终止子的基因表达盒(1.0kb)，构建pB-X6Gn。在pSKAVAt的SalI位点上，导入将pB-X6Gn用XhoI酶切后切出的6xXRE启动子和sGFP、nos终止子的基因表达盒(1.2kb)，构建pSPB1458(参照图1)。
将pSPB1458导入根癌土壤杆菌Agl0株中，用使用了叶盘的土壤杆菌法转化到蓝猪耳[品种Summer Wave Blue SWB(日本三得利花卉公司(Suntory FlowersLimited))]的叶盘上。蓝猪耳的转化根据公知的方法[Suzuki et al.(2000)Mol.Breeding 6，p239-246]。品种SWB的花色为蓝色。且在本实施例中虽使用了品种SWB，但用于本发明目的的蓝猪耳品种不限于SWB。获得40系统独立的转化蓝猪耳(为TAG)。
PD 4 B，PD 5 B用构建物的构建
日本特开2004-89068号公报中所记载的诱导AhR的配体特异性基因表达的系统(XDV)中，将包含LexA-AhR83-494-VP16(XD4V)的双元载体pGPΩD4VGUS和包含LexA-AhR83-593-VP16(XD5V)的双元载体pGPΩD5VGUS的GUS基因部分替换成蝶豆的F3’5’H cDNA的双元载体的构建如下进行。将pGPΩD4VGUS通过XhoI和SpeI酶切除去GUS基因区域，制备在同位点上通过SpeIXhoI-F和SpeIXhoI-R的寡核苷酸插入Adapter Cassette的pSPB2229。同样由pGPΩD5VGUS制备pSPB2221。将包含于pBluescriptII(sk-)的蝶豆的F3’5’H cDNA(约1.7kb)通过用SpeI和XhoI酶切进行回收，与将pSPB2229用SpeI和XhoI酶切后的DNA片段连接，构建pSPB2222(参照图1)。同样由pSPB2221和蝶豆F3’5’H cDNA构建pSPB2219(参照图1)。如前所述，将pSPB2222导入根癌土壤杆菌Agl0株，使用此土壤杆菌，转化矮牵牛PL株。获得42系统独立的转化矮牵牛(为PD4B)。且获得38系统导入了pSPB2219的独立的转化矮牵牛(为PD5B)。
使用的SpeIXhoI-F及SpeIXhoI-R的碱基序列如下所示。
SpeIXhoI-F)5’-tcgactagtccctcgag-3’  (序列号：1)
SpeIXhoI-R)5’-ctagctcgagggactag-3’  (序列号：2)
(参考例2)
通过PAB、PD 4 B、PD 5 B及TAG的二恶英类药物的诱导实验
在含有二恶英类药物的培养基、土壤中栽培转化植物，确认目的基因(此时为F3’5’H基因或GFP基因)表达、花色是否变化的诱导实验，分以下2步进行诱导实验，在使用以与诱导有关的优良系统的筛选为目的的in vitro组织培养苗的琼脂培养基上的诱导实验(1次评价)和花开放时能实际上看见花色变化的土壤栽培的诱导实验(2次评价)。
1次评价
1次评价中，使用20甲基胆蒽(MC)作为二恶英类。已知MC是二恶英类的类似物，与AhR结合。移植到含有5μM的20-MC的MS琼脂培养基(Physiol Plant，15，473-493，1962)中，回收1星期后的叶和根，从各部分中使用RNeasy PlantMini Kit(QIAGEN公司)分离total RNA。从所得到的total RNA 1μg中，使用Super ScriptTM First-Strand Synthesis System for RT-PCR(Invitrogen公司)，根据制造者推荐的说明书合成cDNA。以所得到的cDNA中的1μl为模板，为测定PAB、PD4B及PD5B中蝶豆的F3’5’H的表达量，将ChBHF-F和ChBHF-R作为引物使用，进行RT-PCR。且为测定TAG的sGFP的表达量，以EGFP-F1和EGFP-R1为引物进行RT-PCR。反应条件为95℃1分钟、55℃1分钟、72℃1分钟的30个循环。且应得到的PCR产物的大小，蝶豆的F3’5’H为0.4kb、sGFP为0.7kb。其结果，确认了PAB的38系中的8系统、PD4B中42系统中的4系统、PD5B中38系统中的12系统中MC特异性F3’5’H的表达量的增加。且确认了TAG的40系统的5系统中，MC特异性sGFP的表达量的增加。从以上共29系统的各系统中通过营养繁殖得到各2个个体，将其驯化，移植上盆。并且到长出花蕾的1个月左右为止在温室内栽培。其后，将每个系统中的1个个体的植物体用于使用二恶英污染土壤(接受独立行政法人农业环境技术研究所的提供)的诱导实验(2次评价)。
使用的各引物的碱基序列如下所示。
ChBHF-F)5’-agctcgtgcattcctcaaaacc-3’  (序列号：3)
ChBHF-R)5’-tcgattccgaaccctttgtctc-3’  (序列号：4)
EGFP-F1)5’-atggtgagcaagggcagga-3’     (序列号：5)
EGFP-R1)5’-ttacttgtacagctcgtccat-3’(序列号：6)
2次评价
将用上述1次评价筛选的29系统中有希望的系统的苗移植到二恶英污染土壤，观察6星期以后的花色变化和通过RT-PCR监测蝶豆F3’5’H基因的表达或sGFP基因的表达。所使用的二恶英污染土壤中的二恶英类浓度为360pg-TEQ/g，比日本国内的环境基准值中的1000p-TEQ/g土壤浓度低。回收花和叶，如前所述回收RNA，进行RT-PCR。在PAB的8系统中的4系统、PD5B的12系统中的5系统的花蕾中，可确认出二恶英类特异性蝶豆F3’5’H基因的表达。未确认出PD4B的花蕾的4系统中F3’5’H基因的表达。PAB和PD5B的花蕾中，F3’5’H基因表达后的9系统的花色与基因导入株的PL株的花色同样为粉色，未能确认花色变化。对TAG只采集了叶子的样品，进行RT-PCR反应。可确认5系统中4系统的二恶英特异性的sGFP的表达。
综上结果，可确认土壤中存在二恶英类时，矮牵牛·蓝猪耳的花、叶的第2转录结构的蝶豆F3’5’H或sGFP基因进行了诱导。但是，大概因其表达量少，所以未能使花色改变。
(实施例1)
PD 4 F、PD 5 F、TD 4 F及TD 5 F的构建物构建
如参考例1及2中所进行的，在用矮牵牛PL株通过二恶英类诱导蝶豆的F3’5’H基因的表达的尝试中，因其诱导水平低，所以未能使花色改变。因此，进行了通过由二恶英类特异性抑制参与内源性花色素苷合成的基因，抑制花色素苷的合成，使花色产生变化的尝试。
本实施例中，使用参与花色素苷合成的基因作为第2转录结构时使用黄烷酮3羟化酶(F3H)，基因表达的抑制方法使用RNAi法。F3H是催化将柚皮素转换为二氢堪非醇的反应的酶，通过抑制F3H基因的表达，阻碍二氢堪非醇的下游的类黄酮生成。因此，原本通过有色色素花色素苷的积累所呈现的花色，通过F3H基因的表达抑制使花色素苷不再积累，而变成接近白色的花色。
对于第1转录结构，使用XD4V及XD5V的2种，植物使用矮牵牛及蓝猪耳。
PD 4 F的构建物的构建
矮牵牛的dsF3H的构建物，根据WO2004/018682的实施例8的矮牵牛F3HcDNA双链构建物构建的方法获得。
在将来自pUC的载体上载有Mac启动子和mas终止子的pSPB560用SpeI和SacI酶切后的位点上，将矮牵牛F3H的cDNA基因片段PhF3H-1(SacI/ClaI片段：0.7kb)和PhF3H-1’(SpeI/ClaI片段：0.9kb)通过3DNA片段连接导入，构建pSPB1497。将矮牵牛的dsF3H基因表达盒从pSPB1497中用SpeI酶切切出，插入上述pSPB2229的SpeI位点，构建pSPB2249。从WO2004/018682的实施例6所述的pSPB1500中，将由Mac启动子、查耳酮2’糖苷酶(T170)基因、mas终止子组成的3.6kb基因表达盒用AscI切出后，通过DNA BluntingKit(Takara公司)平滑化(以下的平滑化全部使用DNA Blunting Kit)，获得MT170m片段。将pSPB2249用SacII酶切后，末端平滑化，在同位点插入MT170m，构建pSPB2274(参照图1)。且图1中的“康乃馨THC2’GT”是使黄色色素查耳酮的2’位糖苷化的酶，因可防止由于查耳酮异构酶、查耳酮自身的自动闭环转化成无色色素的柚皮素，可使查耳酮稳定，所以，为使花色成为黄色时可插入此酶。但是，因查耳酮的黄色色素为浅色调，同时THC糖苷的积累少，所以，未看出所期待的变成黄色的花色变化。
如上所述，将pSPB2274导入根癌土壤杆菌Agl0株，转化红色矮牵牛。此品种因缺少了类黄酮3’，5’-羟化酶基因而使花色为红色，但用于本实验目的矮牵牛不限于红色品种，只要是有颜色的品种即可。获得16系统独立的转化矮牵牛(为PD4F)。
PD 5 F的构建物的构建
从pSPB1497中，用SpeI酶切，切出矮牵牛的dsF3H基因表达盒，插入上述pSPB2221的SpeI位点，构建pSPB2250。从pSPB1500中获得MT170m片段，在pSPB2250的SacII酶切后平滑化了的位点上插入MT170m，构建pSPB2275(参照图1)。如上所述，将pSPB2274导入根癌土壤杆菌Agl0株，转化矮牵牛BaccaraRed株。获得15系统独立的转化矮牵牛(为PD5F)。
TD 4 F的构建物的构建
以从紫苏中得到的F3H cDNA[Zhizhong Gong et al.(1997)PlantMol Biol.35，p915-927]为探针，如下获得编码蓝猪耳的此酶的cDNA。使用非放射性DIG-核酸检测系统(Roche Diagnostics公司)，根据制造者推荐的条件通过PCR标记探针。此时，模板使用含有1ng的cDNA的质粒，作为引物，使用上述各基因特异性的寡核苷酸100ng，以95℃1分钟、55℃1分钟、72℃2分钟为1反应循环，进行25个循环。以紫苏F3H基因的PCR扩增产物作为杂交探针，筛选蓝猪耳cDNA文库[Suzuki et al.(2000)Mol.Breeding 6，p239-246]约20万的噬菌体。杂交在含有30％甲酰胺的5×SSC中，37℃进行一夜，杂交膜的清洗使用5×SSC，1％SDS，55℃进行30分钟。使用通过合成寡核苷酸引物的引物步查法(primer walking)确定cDNA序列。将上述cDNA的氨基酸编码区域的碱基序列用序列表、序列号7表示。所得到的蓝猪耳F3HcDNA包含于载体pBluescriptII(sk-)中，将其作为质粒pSPB266。以其为模板，使用在来自载体序列的M13反向引物(序列号：8)和在蓝猪耳F3HcDNA序列中用碱基置换插入SalI识别位点的引物ThF3H-SalI-1(序列号：9)，进行PCR。将所得到的约0.9kb的片段克隆到pCR2.1-TOPO(Invitrogen公司)上，以确认碱基序列。同样，使用在蓝猪耳F3H cDNA序列中用碱基置换插入SalI识别位点的引物ThF3H-SalI-2(序列号10)和M13RV引物，制备约0.75kb的DNA片段，克隆到pCR2.1-TOPO上，以确认碱基序列。
将pBE2113-GUS[Plant Cell Physiol.37，45(1996)]用SnaBI酶切，从存在于启动子下游的omega序列中除去相当于GUS基因的5’端的部分，在其中插入BamHI接头(Takara公司)。将所得到的质粒作为pUE6。将pUE6用HindIII和EcoRI切割，回收具有GUS表达盒的片段。将其插入到pUCAA的HindIII和EcoRI位点，将所得到的质粒作为pSPB541。将pSPB541用BamHI和SacI切割，除去GUS基因部分，在其中插入从pCR2.1-TOPO中用BamHI和Sall切断切出的0.9kb的片段和从pCR2.1-TOPO中用SacI和SalI切割切出的0.7kb的片段，使两片段的SalI位点连接。如此所得到的质粒pSFL313的构建是为了在导入植物体时，在El235S启动子的控制下，表达来自蓝猪耳的F3H基因序列的双链RNA，通过RNAi法抑制蓝猪耳的F3H基因表达。
使用的各引物的碱基序列如下所示。
M13RV)5’-caggaaacagctatgac-3’              (序列号：8)
ThF3H-SalI-1)5’-ttctctgtcgacgcccattgcc-3’  (序列号：9)
ThF3H-SalI-2)5’-cgccgtgtcgactcgcttgaag-3’  (序列号：10)
将蓝猪耳dsF3H基因表达盒(1.6kb)从pSFL313中用BamHI切出，导入pBluescriptII(sk-)的BamHI位点，构建pSPB2251。将蓝猪耳的dsF3H基因表达盒从pSPB2251中用SpeI和EcoRV切出，将前述的pGPΩD4VGUS用XhoI酶切后平滑化，之后再插入SpeI酶切位点，构建pSPB2260。将pSPB2260用SacII酶切后平滑化，在同位点导入上述的MT170m片段(3.6kb)，构建pSPB2277(参照图1)。如前所述，将pSPB2277导入根癌土壤杆菌Agl0株，转化蓝猪耳SWB株。获得40系统独立的转化蓝猪耳(为TD4F)。
TD 5 F的构建物构建
将从pSPB2251中用SpeI和EcoRV切出的蓝猪耳的dsF3H基因表达盒(1.6kb)、pGPΩD5VGUS用XhoI酶切后平滑化，之后再插入到SpeI酶切位点，获得pSPB2261。将pSPB2261用SacII酶切后平滑化，在同位点导入前述的MT170m片段(3.6kb)，构建pSPB2278(参照图1)。将pSPB2278导入根癌土壤杆菌Agl0株，转化蓝猪耳SWB株。获得40系统独立的转化蓝猪耳(为TD5F)。
(实施例2)
通过PD 4 F、PD 5 F、TD 4 F及TD 5 F的二恶英类药物的诱导实验
与导入外源性基因(蝶豆F3’5’H，sGFP)的PAB、PD4B、PD5B及TAG不同，在导入抑制内源性基因(F3H)构建物的PD4F、PD5F、TD4F及TD5F中，因只在花瓣中发现F3H的表达，所以，不采集植物体的花蕾就看不到二恶英类的影响。
因此，在PD4F、PD5F、TD4F及TD5F中不实施参考例2所示的1次评价，而是将转化体的全部上盆，只实施在二恶英类污染土壤中移植、栽培的2次评价的诱导实验。
2次评价
将PD4F的16系统、PD5F的15系统、TD4F的48系统、TD5F的40系统与参考例2的2次评价同样，移植到二恶英类污染土壤(二恶英类浓度360pg-TEQ/g的土壤)中，观察4星期后的花色变化。
如图3(a)及(b)所示，所有的系统均可看出变为白色的花色变化。认为所有的均是二恶英类特异性dsF3H表达结果所产生的花色变化。如上所述，对于矮牵牛、蓝猪耳，可获得土壤中存在二恶英类时显示花色变化的转化体。并确认可通过使用上述矮牵牛PD4F、PD5F及蓝猪耳TD4F、TD5F的系统，通过观察这些系统的花色监测土壤中的二恶英类污染。
(实施例3)
转化矮牵牛P3B及美女樱Sk3B的培育
通过前述的方法，将pSPB748导入根癌土壤杆菌Agl0株中，使用此土壤杆菌转化矮牵牛PL株时，可获得27系统独立的转化矮牵牛P3B。PL株的花色是浅粉色，但所得到的系统的花色呈现紫红色。同样使用此土壤杆菌转化美女樱(品种：「花手毬サクラ」[三得利花卉公司(Suntory Flowers Limited)]。转化通过公知的方法(Plant Cell Rep.21，459-466，2003)。通过此转化，获得6系统独立的转化美女樱Sk3B。美女樱(花手毬サクラ)株的花色是粉色，但所得到的系统的花色呈紫色。
PD 5 dB，SkD 5 dB用构建物的构建
将含有LexA-AhR83-593-VP16(XD5V)的双元载体pSPB2219(PD5B用构建物)的蝶豆F3’5’H基因部分替换为蝶豆的dsF3’5’H cDNA，如下构建整合了由35S启动子潮霉素抗性基因(HPT)-nos终止子组成的HPT基因表达盒的双元载体。首先，将pSPB2219用Sac II酶切后平滑末端化，在同位点，插入从含有HPT基因表达盒的双元载体pLAN101MHYG(Plant Cell Physiol.41，1397-1406，2000)中将同表达盒用HindIII酶切后切出、平滑末端化后的产物，构建pSPB2295。其次，在将pBluescriptII(sk-)载体用Spe I和BamH I酶切的位点上，将从pSPB748中得到的蝶豆F3’5’H的cDNA基因片段BHF-1(Spe I/Hinc II酶切后平滑末端化的片段：0.6kb)和BHF-1’(BamH I/Fok I酶切后平滑末端化的片段：0.9kb)通过3DNA片段连接导入，构建具有蝶豆dsF3’5’H基因表达盒(1.5kb)的pSPB2727。将前述的pSPB2295通过XhoI和SpeI酶切，除去蝶豆F3’5’H基因区域，在同位点插入将pSPB2727通过XhoI和SpeI酶切而切出的蝶豆dsF3’5’H基因表达盒，构建pSPB2736(参照图1)。
转化矮牵牛PD 5 dB及美女樱SkD 5 dB的培育
前述的转化所得到的P3B中，以花色变化最大的P3B-3株为母株，使用导入了pSPB2736的土壤杆菌进行转化，获得13系统独立的转化矮牵牛PD5dB。同样，在Sk3B中，以花色变化最大的Sk3B-5株为母株进行转化。转化是将公知的方法(Plant Cell Rep.21，459-466，2003)的一部分修改后通过潮霉素进行筛选。通过此转化，获得14系统独立的转化美女樱SkD5dB。
PD 5 dB及SkD 5 dB的通过二恶英污染土壤的诱导实验
在含有二恶英类的土壤中栽培转化植物，为确认蝶豆F3’5’H基因的表达受到抑制后花色是否改变，用土壤栽培进行了诱导实验。
通过营养繁殖，从PD5dB及SkD5dB的各系统中各获得2个个体，将上述植物个体驯化并移植上盆。到长出花蕾的1个月到2个月左右在温室内栽培。其后，将每个系统的1个个体的植物体移植到二恶英污染土壤(接受独立行政法人农业环境技术研究所的提供)，PD5dB栽培10星期，SkD5dB栽培14星期，观察花色变化。使用的二恶英污染土壤中的二恶英类浓度如前所述。
如图3(c)所示，可确认PD5dB的花色变成粉色的系统。由于SkD5dB所有系统中花色发生变化的比例小，所以通过实时PCR进行基因表达分析。从移植到二恶英土壤后第14星期的美女樱的叶片采样，用前述方法回收RNA，合成cDNA。为测定蝶豆F3’5’H的表达量，以所得到的cDNA中的1μl为模板，引物使用BHF-F和BHF-R，探针使用BHF-T，并使用TaqMan Universal PCR MasterMix(Applied Biosystems公司)进行实时PCR。关于实时PCR的方法，根据制造者推荐的说明书进行。为测定作为对照的非污染土壤的表达量，将各系统均留下1个个体不移植到污染土壤，而是继续在温室内栽培，用同样的方法进行实时PCR。结果如表1所示。
(表1)
    SkD5dB   第14星期
    1     0.07
    2     0.29
    3     0.47
    4     0.14
    5     0.50
    6     0.79
表中的数字表示，将用本发明的载体转化的美女樱在不存在及存在二恶英类的条件下栽培时，叶中蝶豆F3’5’H基因的表达量的比，即表示为(存在下的表达量)/(非存在下的表达量)。
如表1所示，可证明使用本发明的载体转化的美女樱通过二恶英类达到了表达抑制。
且使用的各引物及探针的碱基序列如下所示。
BHF-F)5’-GCTCATCATACCAACGAGTCTCA-3’                  (序列号11)
BHF-R)5’-GATGATGTATCTGTGCCTGCAGT-3’                  (序列号12)
BHF-T)5’-FAM-AACTGTCGCTCACCAACATCAAAGCACTC-TAMRA-3’  (序列号13)
本发明的载体可用于转化植物细胞，用本发明的载体转化的植物可应答AhR的配体使花色改变。因此，此种转基因植物，例如，因可用现场测定的方式检测土壤中存在的如二恶英类的环境负荷化学物质，所以，作为环境负荷少，简便迅速，感度高且廉价的检测方法有利用价值。
序列表
<110>三得利株式会社(Suntory Limited)
<120>可检测出环境污染物质的转基因植物
Transgenic plant for detecting environmental chemicals
<130>G07-0062CN
<150>JP2005-036338
<151>2005-02-14
<160>13
<170>PatentIn version 3.3
<210>1
<211>17
<212>DNA
<213>人工序列(Artificial)
<220>
<223>SpeIXhoI-F
<400>1
tcgactagtc cctcgag             17
<210>2
<211>17
<212>DNA
<213>人工序列(Artificial)
<220>
<223>SpeIXhoI-R
<400>2
ctagctcgag ggactag                    17
<210>3
<211>22
<212>DNA
<213>人工序列(Artificial)
<220>
<223>ChBHF-F
<400>3
agctcgtgca ttcctcaaaa cc              22
<210>4
<211>22
<212>DNA
<213>人工序列(Artificial)
<220>
<223>ChBHF-R
<400>4
tcgattccga accctttgtc tc      22
<210>5
<211>19
<212>DNA
<213>人工序列(Artificial)
<220>
<223>EGFP-F1
<400>5
atggtgagca agggcagga          19
<210>6
<211>21
<212>DNA
<213>人工序列(Artificial)
<220>
<223>EGFP-R1
<400>6
ttacttgtac agctcgtcca t                                              21
<210>7
<211>1101
<212>DNA
<213>蓝猪耳(Torenia fournieri)
<400>7
atggcacgag caggaccact aaccctaact tcgctagcgc tcgagaaatc gctgcatgaa     60
aagtttataa gggacgaaga cgagaggcct aacttagcat acgatcaatt tagcagtcag    120
attccattga tctctctctc tgggatcgac gatgaatgta ataagaggaa agagctgtgc    180
aagagaatag cgcaggcatg cgaagattgg ggtatttttc aagtgatcga tcatgggatc    240
gatttgaaac tcgtcaacga tatgactcgt ttggctcgtg agttcttcga tttgcccgac    300
gaagagaagc tgaggttcga tatgtctggt gggagaaaag gaggtttcat tgtttcgagc    360
caccttcagg gcgaggtggt ccaagactgg cgcgagatcg tgacctactt cacataccct    420
atcaaaggcc gtgactattc cctgtggccc gacaagcccg aggcatggcg ggccgtgaca    480
gagacctaca gctcgcagct aatgtgcctg ggctgcaaat  tgctaggaat cctatccgag   540
gcaatgggcc tcgaaagaga agcgctgacc aaggcctgtc tgaacatgga ccaaaaagtt    600
gtggtcaact tttacccaaa atgccctcag cccaatttga cattgggcct gaagaggcac    660
tcggacccag gtttgatcac tctgctgttt caggataacg ttggcgggct tcaagcgact    720
cgagacggcg ggaagtcgtg gatcacggtc cagcccgttg agggtgcatt cgtggtcaat    780
cttggtgatt ttgctcatta cttgagcaat ggaaggttca agaacgcgga tcatcgagcg    840
gtggtgaatt caaacacgaa tagaatgtcg atcgcgacgt ttcaaaaccc atcgccagag    900
gctatcgtgt accctctcaa gatcggagac gacgggaagc ccattataga aaagcccatc    960
acttatggag aaatgtacaa gaggaagatg gctaaagaca ttgaacttgc caagctcaag   1020
aagctagcca aggaacaaaa gttgcaagaa gaagttgtta ataatgttga agatcatcat   1080
cttaacaatg ggaaaactaa a                                             1101
<210>8
<211>17
<212>DNA
<213>人工序列(Artificial)
<220>
<223>M13RV
<400>8
caggaaacag ctatgac         17
<210>9
<211>22
<212>DNA
<213>人工序列(Artificial)
<220>
<223>ThF3H-SalI-l
<400>9
ttctctgtcg acgcccattg cc    22
<210>10
<211>22
<212>DNA
<213>人工序列(Artificial)
<220>
<223>ThF3H-SalI-2
<400>10
cgccgtgtcg actcgcttga ag    22
<210>11
<211>23
<212>DNA
<213>人工序列(Artificial)
<220>
<223>BHF-F
<400>11
gctcatcata ccaacgagtc  tca    23
<210>12
<211>23
<212>DNA
<213>人工序列(Artificial)
<220>
<223>BHF-R
<400>12
gatgatgtat ctgtgcctgc agt    23
<210>13
<211>29
<212>DNA
<213>人工序列(Artificial)
<220>
<223>BHF-T；还在5’端有荧光发光基团FAM和在3’端有荧光吸收基团TAMRA(additionally having reporter dye FAM at the 5’end and quencher dye TAMRA at the3’end)
<400>13
aactgtcgct caccaacatc aaagcactc    29

Claims (16)

1.用于植物转化的载体，其是用于制备通过花色的变化检测环境负荷化学物质的植物体的用于植物转化的载体，含有被可表达地整合的AhR基因、AhR的配体刺激诱导型启动子及通过该启动子被可表达地整合的表达抑制因子，该表达抑制因子抑制所需参与花色素合成的基因表达。
2.载体，其是权利要求1中所述的用于植物转化的载体，其如下构成，包含编码DNA结合结构域、AhR的配体结合结构域及转录激活结构域的基因，并且包含编码对于参与花色素合成的基因具有RNA干涉作用的双链RNA的核酸，该核酸处于前述AhR的配体刺激诱导型启动子的控制下，前述DNA结合结构域应答AhR的配体，与该诱导型启动子结合。
3.权利要求1中所述的载体，其中，前述参与花色素合成的基因是参与花色素苷生物合成的基因。
4.权利要求3中所述的载体，其中，前述参与花色素苷生物合成的基因是编码黄烷酮3羟化酶(F3H)或类黄酮3’，5’-羟化酶(F3’，5’H)的基因。
5.权利要求1中所述的载体，其中，前述AhR的配体是二恶英类及/或多环芳香烃或上述物质的类似物。
6.权利要求1中所述的载体，其含有XD4V或XD5V。
7.权利要求1中所述的载体，其中，前述诱导型启动子含有LexA启动子序列。
8.权利要求1中所述的载体，其还含有1个以上的所需基因。
9.权利要求8中所述的载体，其中，前述所需基因是抗药性基因。
10.权利要求8中所述的载体，其中，前述所需基因是康乃馨THC2’GT基因。
11.权利要求1中所述的载体，其中，前述植物是矮牵牛、蓝猪耳或美女樱。
12.转基因植物，其是应答AhR的配体使花色改变的转基因植物，是用权利要求1中所述的载体转化的转基因植物。
13.权利要求12中所述的转基因植物，其是矮牵牛、蓝猪耳或美女樱。
14.繁殖材料，其是权利要求12中所述的转基因植物的繁殖材料。
15.方法，其是使用转基因植物检测土壤中AhR的配体的方法，包括将权利要求12中所述的转基因植物移植到需进行试验的土壤中进行栽培以观察花色变化的工序。
16.权利要求15中所述的方法，其中，前述AhR的配体是二恶英类及/或多环芳香烃或上述物质的类似物。
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