CN114107091B

CN114107091B - 一种具有钝化重金属镉并促进植物生长功能的嗜碱贪铜菌菌株ky678及其应用

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Publication number: CN114107091B
Application number: CN202111268987.1A
Authority: CN
Inventors: 康耀卫; 唐珏晖; 苑莹; 麦思漫
Original assignee: Kangshengyuan Zhaoqing Bio Tech Co ltd
Current assignee: Kangshengyuan Zhaoqing Bio Tech Co ltd
Priority date: 2021-10-29
Filing date: 2021-10-29
Publication date: 2023-06-23
Anticipated expiration: 2041-10-29
Also published as: CN114107091A

Abstract

本发明提供了一种具有钝化重金属镉并促进植物生长功能的嗜碱贪铜菌(Cupriavidus alkaliphilus)及其应用，涉及微生物技术领域。本发明利用高通量方法分离筛选到一株嗜碱贪铜菌菌株KY678，该菌株具有较高的钝化重金属镉的功能，能够降低植物根系和茎叶部位对重金属镉的吸收，显著地减轻土壤重金属镉对植物的危害；此外，该菌株还同时具有促进植物生长的功能，具有良好的推广应用价值。

Description

一种具有钝化重金属镉并促进植物生长功能的嗜碱贪铜菌菌株KY678及其应用

技术领域

本发明涉及微生物技术领域，尤其是涉及一种具有钝化重金属镉并促进植物生长功能的嗜碱贪铜菌菌株KY678及其应用。

背景技术

重金属是指比重等于或大于5.0的金属或类金属有元素(硒Se等除外)，如Pb、Cd、As等，若摄入量过高，均对动植物有毒害作用。金属矿山开采冶炼、化学工业生产、重金属农药、污水灌溉和化肥施用以及高地质背景值等均会造成土壤重金属污染，其中有色金属矿业采选和冶炼所排放的含重金属的废气、废水以及废渣等废料溶蚀扩散进入土壤等是重金属污染的主要途径。矿冶活动导致周边及下游江河沿岸土壤重金属大量积累，在地理空间上沿重金属矿冶活动地区呈流域性或典型区域性分布。

重金属污染问题日渐突出，重金属和类金属(镉(Cd)、铬(Cr)、汞(Hg)、铅(Pb)、砷(As)、铜(Cu)、锌(Zn)和镍(Ni))的污染占其中的82.4％；其中，镉、铅的超标率分别达到7.0％和1.5％，是污染较严重的重金属(黄颖，2018)。重金属污染会导致耕地土壤重金属超标，进而导致粮食减产等经济损失。重金属镉非移动性大、毒性高、污染面积最大且其所有化学形态对人和动物都有毒。摄入或吸入过量的镉均可引起肾、肺、肝、骨以及生殖毒性，并诱发多种癌症(宋玉婷等，2018)。因此，国际癌症研究署(IARC)已经把镉归类为第一类人类致癌物(彭少邦， 2014)。此外，镉还会影响免疫系统，造成各种心血管系统障碍、肾功能损伤、骨矿密度降低等问题。在全球范围内，由于各种工业废水和废气的排放、农药化肥和镉化合物作原料使用增加、铅锌矿开采和有色金属冶炼及电镀业的快速发展，土壤的镉污染日益加重(周聪，2018)。寻求更好的土壤修复方法以达到改善农产品质量的目的已经成为土壤修改必须面对的问题。

目前，全世界范围内的重金属污染脱污修复技术主要分为以下五种：物理修复、化学修复、生物修复、农业修复和联合修复。物理修复是率先发展起来的一种方法，主要修复方法包括翻土、客土、固化和填埋等工程措施以及高温热解技术、玻璃化技术等(熊婕等，2018)。虽然该方法修复简单、耗时短，但工程量大、成本高、适用范围有限，操作过程中可能会破坏土壤结构，造成二次污染，不利于广泛使用。化学修复是向污染土壤中施入各种钝化剂，利用吸附、沉淀、氧化还原、络合等机制，改变污染物的形态与活性，使其转化成非活性、植物难吸收的组分，从而实现修复利用的技术(胡红青等，2017)。它可以较好地固定重金属，降低重金属的活性和环境风险，但对于面积较大的耗财费力，而且容易破坏土壤结构，导致土壤肥力下降，不建议使用(黄昕等，2019)。生物修复技术相较于现有的物理、化学等修复技术而言，被认为是最富有生命力的(熊婕等， 2018)。

在生物修复中，微生物修复技术因其种类多、繁殖快、对环境友好、成本低和适用范围广而脱颖而出，具有巨大的发展潜力和发展空间(Uslu G 等，2006)。目前，人类通过在目标污染土壤中加入已知特定功能的人工驯化微生物，使微生物主动代谢和污染物反应，降低有毒污染物的活性或将其降解为无毒物质(宋玉婷等，2018)。钝化重金属的微生物主要分为真菌、放线菌和细菌三大类。其中，作为环境中普遍存在的微生物细菌对极端的环境有较强的适应能力，并且个体较小，具有较高的相对表面积，因此很适合用于吸附重金属。常见的细菌生物吸附剂主要包括：芽孢杆菌属(Bacillus)、假单胞菌(Pseudomonas)、链霉菌属(Streptomyces)和微球菌属(Micrococcaceae)等。例如，从金属矿山分离出的假单胞菌属菌种对Cd的吸附容量为26.5mg/g，吸附过程在4h达到平衡(Liang Y等， 2019)。而栗褐芽胞杆菌(Bacillus badius)对重金属Cd的吸附容量为131.58 mg/g，整个吸附过程在30min达到平衡(Vishan I等，2019)。对于真菌的研究主要可以分为两类：一类是丝状真菌，主要包括青霉菌(Penicillium)、曲霉(Aspcrgillus)和根霉菌(Rhizopus)。例如黑曲霉(Aspergillus niger) 可以用于其它环境污染物黄体酮、柠檬醛以及其他芳香族污染物等的分解和转化(黄浩杰，2020)，具有广泛的前景。酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae)是一类广泛应用于食品生产和酿酒行业的菌种，它在60分钟内的吸附容量也仅为22.437mg/g(Rojas-Rojas Fernando Uriel，2016)，且只能在20mg/L浓度的Cd²⁺下生长。不同菌种对于重金属Cd的生物吸附容量一般在几十到几百毫克每克。鉴于此，有必要继续开发和研究更多类型的适用于微生物修复的菌种和菌株，从而为重金属污染的快速修复提供更多的解决方案。

鉴于此，特提出本发明。

发明内容

本发明的目的在于提供一种具有钝化重金属镉并促进植物生长功能的嗜碱贪铜菌(Cupriavidus alkaliphilus)菌株KY678及其应用。该菌株具有较高的钝化重金属镉的功能，能够降低植物根系和茎叶部位对重金属镉的吸收，显著地减轻土壤重金属镉对植物的危害；此外，该菌株还同时具有促进植物生长的功能。

本发明提供的技术方案如下：

在一个方面，本发明提供了一种具有钝化重金属镉并促进植物生长功能的嗜碱贪铜菌(Cupriavidus alkaliphilus)菌株KY678，所述菌株保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No. 23453。保藏日期：2021年9月18日，保藏单位地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号。

在一个具体的实施方案中，本发明菌株的16S rDNA序列如序列SEQ ID No.1所示。

本发明对所采集到的170个不同省市的土样，采用高通量筛选方法筛选具有钝化重金属镉能力的多功能微生物菌株。从大约15万株微生物中筛选得到约64株可在250ppmCd²⁺及以上生长且具初步验证具有钝化重金属能力的微生物菌株，其中30株在液体中具有较强的、高效快速钝化重金属镉的目标微生物。液体条件下培养6d后，这些微生物对重金属镉的钝化率均达30％以上。通过16s rDNA序列的测定，结果表明，这30株可在液体中钝化重金属镉的微生物菌株分布在5个属，17个种。其中菌株KY678是属于生物安全等级1的微生物，其对重金属镉的钝化率为40.35％。

在另一个方面，本发明提供了一种微生物菌剂，所述微生物菌剂所述的嗜碱贪铜菌(Cupriavidus alkaliphilus)菌株KY678或所述菌株的代谢产物。

本发明的微生物菌剂可以为含有所述菌株KY678的菌悬液、发酵液或孢子悬液等。本发明的微生物菌剂可以由所述菌株KY678与微生物领域常用的其他载体一起制备为不同的组合物。

在一个实施方案中，所述微生物菌剂为液体菌剂或固体菌剂；优选地，所述液体菌剂中所述菌株KY678的活菌数为0.1亿个/毫升以上；所述固体菌剂中所述菌株KY678的活菌数为0.1亿个/克以上。

在另一个方面，本发明保护所述嗜碱贪铜菌(Cupriavidus alkaliphilus) 菌株KY678或所述的微生物菌剂在钝化重金属镉中的应用。在一个实施方案中，所述应用包括对重金属镉污染的水体或土壤进行生物修复的应用。

在另一个方面，本发明还保护所述嗜碱贪铜菌(Cupriavidus alkaliphilus) 菌株KY678或含有其的微生物菌剂在促进植物生长或制备植物生长促进剂中的应用。所述的植物生长促进剂可以为微生物菌剂或微生物肥料。

在一个实施方案中，所述应用为促进植物在正常条件下的生长发育。本发明经实验发现在正常生长环境下，用所述菌株的菌液处理过的植物比经对照水处理过的植物，生长发育情况明显更具优势。表明本发明所述菌株对植物有促生作用。

在一个实施方案中，所述应用为促进植物在重金属镉肋迫环境下的生长发育；优选地，所述应用为降低植物根部和茎叶部对镉的吸收和储藏。

微生物在液体环境中具有钝化重金属的能力并不代表其在植物种植情况下也同样具有这样的功能。本发明经实验发现所述菌株KY678能够显著地减轻土壤重金属镉(Cd)对植物的危害；可以阻控植物对重金属Cd吸收，特别是可以明显地降低根系和茎叶部位对重金属镉(Cd)的吸收。表明所述菌株可以用于提高植物对重金属胁迫环境耐受性。

在一个实施方案中，所述植物为农作物；优选为玉米。用所述菌株 KY678的菌液对玉米的处理，与阴性对照相比，玉米地上部分和地下部分的镉含量均显著降低。说明菌株KY678可以显著减少植物玉米对重金属镉的吸收。因此，所述菌株KY678可以促进重金属镉肋迫环境下玉米生长和根系发育，从而增加其生物量、提高环境污染修复效率。

在另一个方面，本发明还提供了一种用于促进植物在正常和重金属镉胁迫下生长发育的方法，用所述嗜碱贪铜菌(Cupriavidus alkaliphilus)菌株KY678或含有其的微生物菌剂对所述植物进行拌种或者将其施用于所述植物的生长区域；优选地，所述植物为玉米。

在一个实施方案中，可以以灌根的方式将所述菌或所述微生物菌剂施入所述植物的根际。

有益效果：

本发明提供的嗜碱贪铜菌(Cupriavidus alkaliphilus)菌株KY678是一株可快速高效钝化重金属镉兼具促进植物生长的功能性微生物。一方面其具有较高的钝化金属镉的能力，其可以显著地减轻土壤重金属镉对植物的危害，降低植物根系和茎叶部位对重金属镉(Cd)的吸收，对缓解植物对重金属的毒害具有重要意义；另一方面，该菌株KY678能够促进正常和镉胁迫下植物的生长和发育，可用于提升植物在重金属镉胁迫环境下的耐受性。

现有技术中有一些关于嗜碱贪铜菌(Cupriavidus alkaliphilus)在砷、锌和铜存在的情况下正常生长以及嗜碱贪铜菌处理镉污染水的报道，然而，本发明筛选出的微生物菌株不仅可以沉降(钝化)液体培养基中的毒性镉离子，同时其非常显著地降低镉对植物的毒害作用以及降低玉米根部和地上茎叶部对镉的吸收和储藏，且该菌株还对植物(玉米)具有促进生长功能，本发明关于这样一种多功能菌株的报道属于世界首次。

附图说明

为了更清楚地说明本发明具体实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对具体实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施方式，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1为本发明实施例中镉敏感菌株KY27在系列浓度镉溶液下的生长情况；

图2为本发明实施例盆栽实验中只用重金属镉进行处理的玉米(处理组A)与具有钝化重金属镉能力的生物腐殖酸进行处理的玉米(处理组B) 的形态图(上方拍照)；

图3为本发明实施例盆栽实验中只用重金属镉进行处理的玉米(处理组A)与具有钝化重金属镉能力的生物腐殖酸进行处理的玉米(处理组B) 的形态图(正面拍照)；

图4为本发明实施例盆栽实验中只用重金属镉进行处理的玉米(处理组A)与用KY678菌液浇灌的玉米(处理组C)的形态图(上方拍照)；

图5为本发明实施例盆栽实验中只用重金属镉进行处理的玉米(处理组A)与用KY678菌液浇灌的玉米(处理组C)的形态图(正面拍照)；

图6为本发明实施例促植物生长体内试验中水处理组(处理组A’) 与用水和菌株KY678共同处理组(处理组B’)处理后玉米生长的形态图 (上方拍照)；

图7为本发明实施例促植物生长体内试验中水处理组(处理组A’) 与用水和菌株KY678共同处理组(处理组B’)处理后玉米生长的形态图 (正面拍照)。

具体实施方式

下面将结合实施例对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

实施例1：高通量筛选具耐重金属(镉(Cd))功能的微生物菌株

1.1土样采集

从全国各地(特别是受重金属镉污染严重地区)共采集170多个土样样品，包括黑土、黏土、红土等多种土样，分别来源于森林、草地、小麦地、水稻田等。这些土样样品均标明采集地(省、市、县)、采集时间、采集来源(森林、草地、小麦地、水稻田等)。

1.2高通量富集筛选具耐重金属(镉(Cd))功能的微生物菌株

取五个土壤样品(每个土壤样品各取0.2g)混合并置于50mL 250ppm 镉液体培养基中，在30℃下200r/min震荡培养3天，观察记录液体培养基浑浊度等的变化(250ppm镉液体培养基：0.5g蛋白胨、0.5g酵母、1g葡萄糖、0.5g胰蛋白胨、0.3g丙酮酸钠、0.05gMgSO₄·7H₂O、987.5mL蒸馏水，121℃高压灭菌30min后加入12.5mL 20g/L CdCl₂溶液)。

1.3平板划线分离具有耐重金属镉功能的微生物菌株

1)取适量上述步骤“1.2”中在250ppm镉液体培养基中富集生长的微生物菌株悬浮液于250ppm镉固体培养基上平板划线，观察记录固体镉培养基中微生物生长情况(250ppm镉固体培养基：0.5g蛋白胨、0.5g酵母、1g 葡萄糖、0.5g胰蛋白胨、0.3g丙酮酸钠、0.05gMgSO₄·7H₂O、987.5mL蒸馏水、琼脂粉15g，121℃高压灭菌30min后加入12.5mL 20g/LCdCl₂溶液)。

2)从步骤1)所述250ppm镉固体培养基中选取单菌落再一次在250ppm 镉固体培养基上划线培养纯化，得到具有耐镉功能的微生物菌株。

1.4重复验证

将所得耐镉微生物再次对应在250ppm镉固体培养基划线培养，排除不能在特定培养基上长出单菌落的假阳性微生物，最终得到纯化的耐镉微生物菌株。

1.5结果

170多个土壤样品(含有近15万株微生物菌株)通过含重金属镉培养基进行富集筛选，共得到130株耐镉微生物。

这些功能微生物的分类如下表所示：可以在1000ppm镉的条件下生长的微生物菌株有3株，可以耐500ppm镉的微生物菌株有35株，耐镉能力在250ppm的微生物菌株有92株。

表1.耐重金属镉(Cd)微生物统计表

实施例2.验证耐镉微生物在液体中钝化重金属镉的能力

2.1微生物方法初步验证耐镉微生物在液体中钝化重金属镉(Cd)的能力

现有文献中报道验证微生物的钝化重金属镉(Cd)能力主要是通过原子吸收光谱法对液体或者盆栽试验的植物中残留重金属的含量进行测定。该方法的优点主要体现在可以直接测定重金属镉污染体的镉含量且测定结果具有精确性。然而，若待验证钝化重金属镉(Cd)能力的微生物数量达到几十甚至上百时，这个方法在筛选效率方面存在一定的缺陷。比如，火焰原子吸收光谱法对仪器要求高且操作步骤繁琐而无法快速的测定多个样品，盆栽试验中植物的生长周期长且无法同时对几十个或上百个微生物的钝化重金属镉(Cd)能力进行验证而严重降低验证效率等。因此，本发明利用微生物生长周期短、部分微生物对重金属镉(Cd)的浓度变化敏感的特点建立起一种高效方便的验证钝化重金属镉能力的快速微生物测定方法。这种生物方法的原理在于通过观察重金属浓度敏感微生物在待验证微生物处理后的液体中的生长情况，判断液体中残留重金属镉(Cd)的含量，从而高效快速地对待验证微生物的钝化重金属镉(Cd)能力进行验证。下面是该方法的具体描述和测试结果：

2.1.1确定用于微生物测定的指示菌株

1)利用不同浓度含镉固体培养基从菌株库中筛选得到对镉敏感菌株 KY27(拉丁文为Enterobacter soli strain E15)。

2)将梯度浓度氯化镉(CdCl₂)溶液与梯度浓度KY27菌液1:1混合，取10μL混合溶液点在R2A固体培养基上。于30℃培养12h后，观察菌株生长情况(R2A固体培养基：0.5g蛋白胨、0.5g酵母、0.5g葡萄糖、0.5g 可溶性淀粉、0.5g胰蛋白胨、0.3g K₂HPO₄、0.3g丙酮酸钠0.05g MgSO₄·7H₂O、975mL蒸馏水、琼脂粉15g，121℃高压灭菌30min)。

3)结果由图1可见，KY27随着培养基中镉含量的改变，其生长情况随之改变。在12.5ppm～200ppm范围内，随着培养基中镉含量增加，KY27 的菌落逐渐减少；反之，随着培养基中镉含量减少，KY27的菌落逐渐增多。综上，可根据其生长情况初步判断样品中镉的含量。因此，选择菌株KY27 作为此方法的指示菌。

2.1.2测试耐镉微生物在液体中钝化重金属的能力

1)配置10⁶、10⁵、10⁴、10³的KY27菌液备用；

2)将耐镉微生物接种到200ppm镉液体培养基，200rpm 30℃培养6 天；取出离心，0.45μm滤膜过滤，取上清(即为所需样品)；

3)把样品稀释8倍(用培养基稀释)；

4)取10⁶的KTY27菌液和稀释后的样品混合(体积比为1：1)得到溶液A，取10μL溶液A点于R2A上；

5)依次取10⁵、10⁴、10³的KY27菌液和稀释后的样品混合(体积比为 1：1)得到溶液B、C、D，分别取10μL溶液A点于R2A上；

6)吹干；

7)12h后，观察微生物生长情况，根据微生物生长情况，初步判断样品镉含量(耐镉微生物钝化重金属能力)。

8)结果：

利用微生物测定法对130株耐镉微生物进行钝化重金属镉能力初步筛选的结果如表3。由表可见，130株耐镉微生物测定法经过初步验证，发现 64株耐镉微生物具有较好的钝化重金属镉的能力，34株镉微生物钝化重金属镉的能力次之，32株耐镉微生物没有钝化重金属镉的能力。

表2.耐镉微生物钝化重金属能力

(注：钝化能力为0时，KY27生长受抑制，仅能在10⁵和10⁶处长出少数菌落，表示该微生物菌株不具有钝化重金属镉能力；钝化能力为+时，KY27在10⁴、10⁵和10⁶处能够长出菌落，表示该微生物菌株具有钝化重金属镉的能力，但钝化重金属镉的能力一般；钝化能力为++时，KY27在10³、10⁴、10⁵和10⁶处都能够长出较多菌落，无生长抑制情况，表示该微生物菌株具有较强的钝化重金属镉的能力)。

2.2火焰原子吸收光谱法进一步验证耐镉微生物在液体中钝化重金属镉的能力

利用“2.1”中微生物测定方法快速、大量地对130株耐镉微生物进行钝化重金属能力验证，初步得到64株具有较好的钝化重金属镉能力的微生物。为进一步验证耐镉微生物在液体中钝化重金属的能力，现利用火焰原子吸收光谱法对已得到的64株具有较好的钝化重金属镉能力的微生物进行如下研究：

(1)在R2A固体培养基上培育初步验证已有钝化重金属镉能力的微生物菌株；

(2)将上一步的微生物置于灭菌水中制成菌悬液；

(3)配置50mL 200ppm镉液体培养基，将第二步菌悬液接种至200ppm 镉液体培养基中并使其OD₆₀₀≈0.05.(空白对照加入相同体积灭菌水)；

(4)200rpm 30℃培养6天；取出离心，过滤(0.45μm滤膜)，取上清；

(5)火焰原子吸收光谱法验证上清镉含量；

(6)原子吸收结果。

对以上64株微生物进行原子吸收验证，发现30株微生物对重金属镉的钝化率较高(对重金属镉的钝化率是指用微生物处理后的液体中减少的镉含量或浓度占处理前液体所含镉的含量或浓度的百分比)，如表3所示。因此，可以确定这30株微生物具有在液体中钝化重金属的能力。

表3.不同微生物菌株在液体培养6d对重金属镉的钝化率

综上，本发明通过火焰原子吸收光谱法得到30株在液体中株具有较强的、高效快速钝化重金属镉的目标微生物。液体条件下培养6d，这些微生物对重金属镉的钝化率均达26％以上。通过16s rDNA序列的测定，结果表明，这30株可在液体中钝化重金属镉，这些微生物分布在5个属，17个种。其中，KY678、KY601均为Cupriavidus alkaliphilus，属于生物安全等级1 的微生物，对重金属镉的钝化率分别为40.35％、57.52％。但是，盆栽试验结果显示只有菌株KY678可显著降低重金属镉(Cd)对玉米的伤害且能减少玉米对重金属镉的吸收。因此，本发明将菌KY678作为研究对象对其展开后续多方面试验的研究。

本发明研究发现该微生物菌株具备以下3点生物功能：(1)能够显著地减轻土壤重金属镉(Cd)对植物(玉米)的危害；(2)可以明显地降低玉米根系和茎叶部位对重金属镉(Cd)的吸收；(3)促进植物生长。对该微生物菌株的以上3点生物功能的报道均属于世界首次。

实施例3.KY678菌株鉴定-16s rDNA的测定

3.1 DNA模板的制备

3.1.1挑取纯化的单菌落至EP管底部，加入200μL的5％(w/v)的 BT-chelex 100(蒸馏水配置，121℃灭菌30min)；沸水浴煮15min，迅速置于-20℃或-80℃速冻，然后室温解冻，6000r/min离心3min，取上清2μL 作为模板。

3.2 16S rDNA扩增

按照16S扩增体系进行16S基因的扩增。16S PCR扩增体系如下：

PCR扩增程序：

第一步：95℃，5min；

第二步：94℃，1min；55℃，1min；72℃，1.5min，35个循环。

第三步：72℃，10min；4℃保存。

获得菌株KY678的16S rDNA序列(SEQ ID No.1)如下：

TGGGGCCGCATGCTTACCATGCAGTCGAACGGCAGCGCGGGCTTCGG CCTGGCGGCGAGTGGCGAACGGGTGAGTAATACATCGGAACGTGCCC TGTCGTGGGGGATAACTAGTCGAAAGATTAGCTAATACCGCATACGACCTGAGGGTGAAAGCGGGGGACCGTAAGGCCTCGCGCGATAGGAGCG GCCGATGTCTGATTAGCTAGTTGGTGGGGTAAAGGCCTACCAAGGCG ACGATCAGTAGCTGGTCTGAGAGGACGATCAGCCACACTGGGACTGA GACACGGCCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTGGGGAATTTTGGAC AATGGGGGCAACCCTGATCCAGCAATGCCGCGTGTGTGAAGAAGGCC TTCGGGTTGTAAAGCACTTTTGTCCGGAAAGAAATGGCCTGGGCTAAT ACCTCGGGTCGATGACGGTACCGGAAGAATAAGCACCGGCTAACTAC GTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGTAGGGTGCGAGCGTTAATCGGAATT ACTGGGCGTAAAGCGTGCGCAGGCGGTTTGATAAGACAGGCGTGAAA TCCCCGAGCTCAACTTGGGAATGGCGCTTGTGACTGTCAGGCTAGAG TATGTCAGAGGGGGGTAGAATTCCACGTGTAGCAGTGAAATGCGTAG AGATGTGGAGGAATACCGATGGCGAAGGCAGCCCCCTGGGACGTCAC TGACGCTCATGCACGAAAGCGTGGGGAGCAAACAGGATTAGATACCC TGGTAGTCCACGCCCTAAACGATGTCAACTAGTTGTTGGGGATTCATT TCTTCAGTAACGTAGCTAACGCGTGAAGTTGACCGCCTGGGGAGTAC GGTCGCAAGATTAAAACTCAAAGGAATTGACGGGGACCCGCACAAGC GGTGGATGATGTGGATTAATTCGATGCAACGCGAAAAACCTTACCTAC CCTTGACATGCCACTAACGAAGCAGAGATGCATCAGTGCCCGAAAGG GAAAGTGGACACAGGTGCTGCATGGCTGTCGTCAGCTCGTGTCGTGA GATGTTGGGTTAAGTCCCGC。

根据获得菌株KY678的16S rDNA序列在GenBank中Blast搜索同源序列并进行同源序列分析对比，建立系统发育树。结果表明，该菌株与 Cupriavidus alkaliphilus菌株MLR2-44具有大于99.34％的高度同源。此外， KY678菌株的16s rDNA序列与数据库里的不同Cupriavidus alkaliphilus菌株也高度同源，同源性都在99％以上。依据数据库中Cupriavidus alkaliphilus 的菌株和相近源菌株建立系统发育进化树，结果也表明，菌株KY678与 Cupriavidus alkaliphilus更为接近(方法采用的是Fast Minimum Evolution)。

实施例4.盆栽试验

4.1盆栽试验步骤

为在体内验证目标微生物菌株KY678是否具有钝化重金属的能力，现进行盆栽试验，试验步骤如下：

(1)每个花盆(5cm×10cm)装入体积为350mL的土壤。种植前，分别人工浇入35mL25ppm镉溶液。

(2)设置三个处理：A(重金属镉)、B(重金属镉+生物腐植酸)、C(重金属镉+菌株)。其中，处理组A为阴性对照；B为阳性对照，加入已报道有钝化重金属能力的生物腐殖酸的处理组。

(3)选取大小均匀的京粘一号玉米种子，每盆栽种1粒，设置10个重复，播种好立马浇入对应液体35mL(处理A浇35mL水、处理B浇35mL 500ppm生物腐植酸、处理C浇35mLOD₆₀₀＝0.05的菌液)，并随机排列。

(4)一周后，再次浇入对应液体35mL(处理A浇35mL水、处理B 浇35mL 500ppm生物腐植酸、处理C浇35mL OD₆₀₀＝0.05的菌液)

(5)其余时间按照玉米的生长要求，适时、适量、均衡的浇灌。18d左右，收获玉米苗。分别对玉米地上和地下部分烘干，根据GB 5009.15-2014 对烘干样品进行镉含量测定。

4.2盆栽试验结果

根据GB 5009.15-2014对烘干样品进行镉含量测定，结果记录至表4。由图2、图3、图4和图5可见，只用重金属镉进行处理的玉米(处理组A) 植株矮小，叶片窄，根系较短，并且出现抽叶困难；用文献报道过具有钝化重金属镉能力的生物腐殖酸进行处理的玉米(处理组B)植株稍高于处理组A的植株，叶片较宽，根系较发达；用KY678菌液浇灌的玉米(处理组C)植株高大，叶片宽，根系发达，并且没有出现抽叶困难。由此可见，菌株KY678可以有效减轻重金属镉对植物(玉米)的伤害。

同时，由表4可得：对三个处理的植物的地上部分进行镉含量测定：处理组A中植物镉含量为39mg/kg，加入已被报道具有钝化重金属能力的生物腐殖酸的处理组B中植物镉含量为1.6mg/kg，处理组C中植物镉含量为1.3mg/kg，其中，相对于处理组A，处理组B中植物的镉含量下降了 95.90％，处理组C中植物的镉含量下降了96.67％；对三个处理的植物的地下部分进行镉含量测定：处理组A中植物镉含量为6.6mg/kg，处理组B中植物镉含量为5.7mg/kg，处理组C中植物镉含量为3.7mg/kg，其中，相对于处理组A，加入已被报道具有钝化重金属能力的生物腐殖酸的处理组B 中植物的镉含量下降了13.64％，处理组C中植物的镉含量下降43.94％。处理组C中玉米地上部分和地下部分的镉含量均显著低于处理组A，也低于处理组B。

因此，上述研究结果表明菌株KY678可以显著减少植物(玉米)对重金属镉的吸收。

表4不同处理组玉米地上和地下部分镉含量

实施例5.促植物生长体内试验

5.1体内试验步骤

为在体内验证目标微生物菌株KY678是否具有促进植物生长的能力，现进行体内试验，试验步骤如下：

(1)每个花盆(直径：5cm，高：10cm)装入体积为350mL的土壤。

(2)设置两个处理：处理组A’(水)、处理组B’(水+菌株KY678)；其中，处理组A’为空白对照。

(3)选取大小均匀的京粘一号玉米种子，每盆栽种1粒，设置10个重复，播种好立马浇入对应液体35mL(处理A’浇35mL水、处理B’浇35mL OD₆₀₀＝0.05的菌液KY678)，并随机排列。

(4)一周后，再次浇入对应液体35mL(处理A’浇35mL水、处理B’ 浇35mL OD₆₀₀＝0.05的菌液KY678)

(5)其余时间按照玉米的生长要求，适时、适量、均衡的浇灌。18d左右，观察玉米生长情况，并进行记录。

5.2体内试验结果

实验结果见图6和图7，在体内试验中，分别用水和KY678菌液对不同处理组植物(玉米)进行浇灌，发现处理组B’的玉米植株比处理组A’的玉米植株高大，叶片也相对宽大。因此，初步确定KY678可以促进植物(玉米)生长。

本发明通过采用高通量富集筛选方法从全国各地采集的土壤中分离到了一株可钝化重金属镉的微生物(KY678)。对该菌株的16s rDNA的序列测定分析，结果表明该菌株与Cupriavidus alkaliphilus具有高度同源。经过火焰原子吸收光谱法，菌株KY678可在6d钝化重金属镉，钝化率达40.35％，且经过盆栽试验，发现该菌株可以钝化土壤中的重金属镉，显著减轻重金属镉对植物(玉米)的伤害和明显减少植物(玉米)对重金属镉的吸收。此外，在本研究还发现KY678可以促进植物(玉米)生长。由此可见，KY678 是一株可快速高效钝化重金属镉兼具促进植物生长的功能性微生物。

最后应说明的是：以上各实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述各实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分或者全部技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的范围。

SEQUENCE LISTING

<110> 康生元（肇庆）生物科技有限公司

<120> 一种具有钝化重金属镉并促进植物生长功能的嗜碱贪铜菌菌株KY678及其应

用

<130> PA21028445

<160> 1

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 1058

<212> DNA

<213> 嗜碱贪铜菌（Cupriavidus alkaliphilus）KY678 16S rDNA

<400> 1

tggggccgca tgcttaccat gcagtcgaac ggcagcgcgg gcttcggcct ggcggcgagt 60

ggcgaacggg tgagtaatac atcggaacgt gccctgtcgt gggggataac tagtcgaaag 120

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gatgatgtgg attaattcga tgcaacgcga aaaaccttac ctacccttga catgccacta 960

acgaagcaga gatgcatcag tgcccgaaag ggaaagtgga cacaggtgct gcatggctgt 1020

cgtcagctcg tgtcgtgaga tgttgggtta agtcccgc 1058

Claims

1. 一种具有钝化重金属镉并促进植物生长功能的嗜碱贪铜菌（Cupriavidus alkaliphilus）菌株KY678，其特征在于，所述菌株保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No. 23453。

2. 一种微生物菌剂，其特征在于，所述微生物菌剂含有权利要求1所述的嗜碱贪铜菌（Cupriavidus alkaliphilus）菌株KY678。

3.根据权利要求2所述的微生物菌剂，其特征在于，所述微生物菌剂为液体菌剂或固体菌剂；所述液体菌剂中所述菌株KY678的活菌数为0.1亿个/毫升以上；所述固体菌剂中所述菌株KY678的活菌数为0.1亿个/克以上。

4. 权利要求1所述的嗜碱贪铜菌（Cupriavidus alkaliphilus）菌株KY678或权利要求2或3所述的微生物菌剂在钝化重金属镉中的应用。

5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述应用包括对重金属镉污染的水体或土壤进行生物修复的应用。

6. 权利要求1所述的嗜碱贪铜菌（Cupriavidus alkaliphilus）菌株KY678或权利要求2所述的微生物菌剂在促进植物生长中的应用；所述植物为玉米。

7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，所述应用为促进植物在正常条件下的生长发育。

8.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，所述应用为促进植物在重金属镉肋迫环境下的生长发育；所述应用为降低植物根部和茎叶部对镉的吸收和储藏。

9. 一种用于促进植物在正常和重金属镉胁迫下生长发育的方法，其特征在于，用权利要求1所述的嗜碱贪铜菌（Cupriavidus alkaliphilus）菌株KY678或权利要求2或3所述的微生物菌剂对所述植物进行拌种或者施用于所述植物的生长区域；所述植物为玉米。