CN113214274B - 八氢呋喃[2,3-b]吡啶-4,6-二醇及其制备方法和应用 - Google Patents

八氢呋喃[2,3-b]吡啶-4,6-二醇及其制备方法和应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了八氢呋喃[2,3‑b]吡啶‑4,6‑二醇及其制备方法和应用，该化合物能够抑制糖基转移酶(TGase)活性，对金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、枯草芽孢杆菌、鲍曼不动杆菌、肺炎克雷伯、耐甲氧西林金黄色葡萄球菌均有一定的抑制作用，可用于制备抗菌药物，本发明为新的抗菌药物提供了候选化合物。本发明公开的制备方法采用对海洋来源真菌Epicoccum sorghinum GXIMD02001发酵后的培养基进行化合物分离的方式得到该化合物。该方法相对于传统化学合成的方法具有环境友好、效率高的优点。

Description

八氢呋喃[2,3-b]吡啶-4,6-二醇及其制备方法和应用
技术领域
本发明属于生物制药技术领域，具体来说涉及八氢呋喃[2,3-b]吡啶-4,6-二醇及其制备方法和应用。
背景技术
随着细菌耐药性的不断增加和陆生资源的日渐枯竭，陆生生物来源的抗生素已不能满足人类健康的需要。为了发现活性显著的、靶位特殊的抗生素先导化合物并减少重复研究的机率，人们把目光逐渐转向了处于独特生态环境的、次生代谢产物繁多且新颖的、开发程度尚低的海洋生物资源。Hilary D.Marston等指出在未开发的海洋天然产物中发掘新的抗生素药物是解决抗生素耐药性重要的途径(Journal of the American MedicalAssociation,2016,316(11):1193-1204.)。
微生物药物耐药性严重威胁人类的健康以及造成了重大的经济损失。预计2015年至2050年期间大约240万人死于抗微生物药物耐药性问题，如果控制不住抗微生物药物耐药性问题，造成的经济损失可能会类似于2008-2009年全球金融危机期间的冲击，医疗保健支出大幅飙升。新作用靶点和作用机制开发新的抗生素药物的研发是解决这一公共卫生问题重要的途径之一。
临床上常见耐药细菌的细胞壁的主要组成成份是肽聚糖。它是细菌维持自身正常形态、提高机械强度、免受渗透压等外力损伤等的必要条件，该结构不能形成或被破坏就会导致耐药细菌死亡。肽聚糖结构的形成与细菌细胞膜上的青霉素结合蛋白(PBPs)密切相关，PBPs具有糖基转移酶(TGase)、肽基转移酶(TPase)两个重要酶活性区域，能够催化细菌细胞壁的肽聚糖聚合和交联。如果它们的活性被抑制，肽聚糖就无法合成，细菌无法维持正常形态、结构和功能而死亡。
目前，临床上的抗生素主要通过抑制TPase功能而达到杀菌的作用，比如青霉素、头孢菌素、单菌霉素、头孢洛林、头孢托罗、碳青霉烯等，但是这些作用于TPase功能域的抗生素药物在临床上均有相应的耐药菌出现。然而，靶向TGase发挥抗菌作用的莫诺霉素在动物饲养中应用了几十年未见耐药性。虽然莫诺霉素因其有较差的药代动力学特性而未被开发成为用于治疗人类感染的药物，但是不可否认以TGase为靶位开发抗生素药物是规避细菌耐药性的重要策略。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术的不足，提供八氢呋喃[2,3-b]吡啶-4,6-二醇及其制备方法和应用。
本发明是通过以下技术方案实现的：
八氢呋喃[2,3-b]吡啶-4,6-二醇，其结构式如式(I)所示：
Figure BDA0003062940140000021
八氢呋喃[2,3-b]吡啶-4,6-二醇的制备方法，如下所述：
步骤一、微生物发酵
将GenBank登录号为MW999224的真菌菌种Epicoccum sorghinum GXIMD02001接种于种子培养基中，经培养作为种子液，并在发酵培养基中，接入种子液进行发酵；
步骤二、浸膏的获得
将发酵后的培养基搅碎、混匀，超声提取后过滤，减压回收得到提取物浸膏；
步骤三、化合物分离
将提取物浸膏通过中压硅胶柱色谱分离，用二氯甲烷/甲醇(100:0–0:100，v/v)系统梯度洗脱，得到四个组分Fr1–Fr4，将Fr2经过C18反相柱层析，用甲醇/水(30:70–100:0，v/v)梯度洗脱，得到四个组分Fr2-1–Fr2-4，Fr2-1再用C18反相柱层析纯化，甲醇/水(15:85，v/v)等度洗脱，得到组分Fr2-1-1和Fr2-1-2，Fr2-1-2通过硅胶柱层析纯化，二氯甲烷/甲醇(20:1，v/v)等度洗脱得到化合物八氢呋喃[2,3-b]吡啶-4,6-二醇。
在上述技术方案中，在步骤一中，所述种子培养基由海盐3g、麦芽提取粉1.5g、100mL水，摇匀后在121℃下，高压灭菌20min，放冷后制得。
在上述技术方案中，在步骤一中，所述发酵培养基由150g大米放入1000mL锥形瓶中，加入含有适量海盐的水150mL，封口、摇匀，在121℃下，高压灭菌20min，取出放冷后制得。
在上述技术方案中，在步骤一中，所述发酵温度为25℃，发酵时间为25-40天。
在上述技术方案中，在步骤二中，将发酵后的大米培养基搅碎、混匀后，加入乙酸乙酯超声提取3次，过滤，合并过滤液，减压回收乙酸乙酯得到提取物浸膏。
本发明的优点和有益效果为：
本发明提供了一种新型八氢呋喃并吡啶类化合物，即八氢呋喃[2,3-b]吡啶-4,6-二醇。该化合物能够抑制糖基转移酶(TGase)活性，对金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、枯草芽孢杆菌、鲍曼不动杆菌、肺炎克雷伯、耐甲氧西林金黄色葡萄球菌均有一定的抑制作用，可用于制备抗菌药物，本发明为新的抗菌药物提供了候选化合物。
本发明还提供了八氢呋喃[2,3-b]吡啶-4,6-二醇的制备方法，即对海洋来源真菌Epicoccum sorghinum GXIMD02001发酵后的培养基进行化合物分离的方式得到该化合物。该方法相对于传统化学合成的方法具有环境友好、效率高的优点。
附图说明
图1：八氢呋喃[2,3-b]吡啶-4,6-二醇关键的1H-1H COSY(粗线)和HMBC(箭头)示图。
图2：八氢呋喃[2,3-b]吡啶-4,6-二醇关键的NOESY相关示图。
对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，可以根据以上附图获得其他的相关附图。
具体实施方式
下面结合具体实施例进一步说明本发明的技术方案。
实施例1：八氢呋喃[2,3-b]吡啶-4,6-二醇的制备与分离
1.微生物发酵
种子液制备：取海盐3g、麦芽提取粉1.5g、100mL水，摇匀。在121℃下，高压灭菌20min，放冷后作为种子培养基。在生物安全柜中将菌种Epicoccum sorghinum GXIMD02001接种于种子培养基中，封口。在25℃、180rpm下培养72小时作为种子液。
大规模发酵：称取150g大米放入1000mL锥形瓶中，加入含有适量海盐的水150mL，封口、摇匀。在121℃下，高压灭菌20min。取出放冷后，接入10mL种子液。在25℃下发酵25-40天。
2.浸膏的获得
将发酵后的大米培养基搅碎、混匀，加入乙酸乙酯超声提取3次，过滤，合并过滤液。减压回收乙酸乙酯得到提取物浸膏，共108g。
3.八氢呋喃[2,3-b]吡啶-4,6-二醇的分离和结构鉴定
化合物分离：浸膏(108g)通过中压硅胶柱色谱分离，用二氯甲烷/甲醇(100:0–0:100，v/v)系统梯度洗脱，得到四个组分(Fr1–Fr4)。Fr2(6.9g)经过C18反相柱层析，用甲醇/水(30:70–100:0，v/v)梯度洗脱，得到四个组分(Fr2-1–Fr2-4)。Fr2-1(1.9g)再用C18反相柱层析纯化，甲醇/水(15:85，v/v)等度洗脱，得到组分Fr2-1-1和Fr2-1-2。Fr2-1-2通过硅胶柱层析纯化，二氯甲烷/甲醇(20:1，v/v)等度洗脱得到化合物八氢呋喃[2,3-b]吡啶-4,6-二醇。
化合物结构鉴定：化合物为白色固体，分子式为C7H13NO3，HR-ESI-MS m/z160.0974[M+H]+，不饱和度为2。1H和13C数据见表1。综合分析1H、13C、DEPT和HSQC谱，发现化合物含有7个碳。结合COSY和HMBC谱分析，基本确定化合物的平面结构，进步分析关键的NOESY信号，确定化合物结构如式(I)，数字为碳原子编号。
Figure BDA0003062940140000041
表1八氢呋喃[2,3-b]吡啶-4,6-二醇的H和13C数据(500和125MHz，in CD3OD)
δ<sub>C</sub> δ<sub>H</sub>
1 79.0 3.93(dd,5.0,4.0)
2 40.9 2.15m；1.36(dd5.0,8.0)
3 65.6 3.96(dd,6.5,6.0)
4 42.9 2.28,m
5 38.8 2.03m；1.43m
6 71.7 4.0m；3.76(d8.0)
7 81.5 4.05(d,5.5)
实施例2：八氢呋喃[2,3-b]吡啶-4,6-二醇抑制糖基转移酶(TGase)活性
含有二甲氨基偶氮苯甲酰和香豆素基团的脂质体II类似物(5μM)、N-乙酰胞壁酶(1μg/μL)、不同浓度的化合物(0、2.5、5、10、20、30、40μM)在缓冲液中混合后，加入梭状芽孢杆菌PBP(5μg/mL)后，在37℃、80％湿度条件下培养2h，使用激发波长355nm，发射波长460nm每2min检测一次荧光浓度。阴性对照实验中用缓冲液替代脂质体II类似物。通过抑制常数Ki表示竞争抑制强度。结果见表2，八氢呋喃[2,3-b]吡啶-4,6-二醇对糖基转移酶有一定的抑制作用。
表2化合物对糖基转移酶的抑制常数
Figure BDA0003062940140000051
实施例3：八氢呋喃[2,3-b]吡啶-4,6-二醇抑菌活性
将指示菌在平板复活后，转接到LB或NB液体培养基中，在37℃，180rpm下，培养4-8h，使用时将菌液稀释到0.5-1×106cfu/mL。将待测化合物用二甲基亚砜(DMSO)溶解，初始浓度为10mM。在96孔板中首先加入100μL LB或NB培养液，然后第一列加入98μL菌液和2μL浓度为1mM的化合物溶液，混匀，二倍稀释法稀释至第11列，第11列不加菌作为阴性对照，第12列不加药作为空白对照设置10个浓度梯度。将每个孔加入上述已制备的细菌混悬液补充至200μL。37℃培养18-24h，每个浓度设置3个平行对照，环丙沙星作为阳性对照化合物。实验结果见表3，八氢呋喃[2,3-b]吡啶-4,6-二醇对金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、枯草芽孢杆菌、鲍曼不动杆菌、肺炎克雷伯、耐甲氧西林金黄色葡萄球菌均有一定的抑制作用。
表3化合物的MIC值
Figure BDA0003062940140000052
以上对本发明做了示例性的描述，应该说明的是，在不脱离本发明的核心的情况下，任何简单的变形、修改或者其他本领域技术人员能够不花费创造性劳动的等同替换均落入本发明的保护范围。

Claims (5)

1.八氢呋喃[2,3-b]吡啶-4,6-二醇，其特征在于，结构式如式(I)所示：
Figure FDA0003486362720000011
2.八氢呋喃[2,3-b]吡啶-4,6-二醇的制备方法，其特征在于：结构式如式(I)所示：
Figure FDA0003486362720000012
从真菌微生物Epicoccum sorghinum GXIMD02001的发酵培养物中分离得到。
3.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，所述八氢呋喃[2,3-b]吡啶-4,6-二醇通过以下方法制备：
制备Epicoccum sorghinum GXIMD02001的发酵产物；将发酵后的大米培养基搅碎、混匀，加入乙酸乙酯超声提取，过滤，合并过滤液，减压回收乙酸乙酯得到提取物浸膏；通过中压硅胶柱色谱分离浸膏，用二氯甲烷/甲醇系统梯度洗脱，然后经过C18反相柱层析纯化，甲醇/水梯度洗脱，再用C18反相柱层析纯化，最后运用硅胶柱层析纯化，二氯甲烷/甲醇等度洗脱得到化合物八氢呋喃[2,3-b]吡啶-4,6-二醇。
4.权利要求1所述化合物式(I)或其盐在制备抗菌药物中的应用。
5.根据权利要求4所述抗菌药物的应用，其特征在于：抗菌药物为抗金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、枯草芽孢杆菌、鲍曼不动杆菌、肺炎克雷伯的药物。
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