CN104630085A - 一株可降解多种芳香族化合物的细菌及其用途 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一株可降解多种芳香族化合物的细菌及其用途,该细菌可以将含有多种芳香族污染物的废水中的污染物进行有效的分解;该细菌为陶厄氏属TM1菌株。保藏号为CGMCC No.9732。该细菌分离自焦化废水处理反硝化反应池,对工业废水有较强的适应性,可以有效降解废水中的苯酚、甲基酚、二甲基酚、乙基甲基酚、吲哚、丁基羟基甲苯、酞酸二丁酯等污染物。在COD为1100mg/L的焦化废水中,该菌株对苯酚、甲基酚、二甲基酚、乙基甲基酚、吲哚、丁基羟基甲苯、酞酸二丁酯的去除率在90%以上。
Description
技术领域
本发明属于微生物技术领域和水处理技术领域,具体涉及一株可降解多种芳香族化合物的细菌及其用途。
背景技术
煤炭化工和炼焦等工业过程产生大量的含芳香族污染物的废水,这些废水所含的芳香族污染物如苯酚类及其衍生物、喹啉类化合物、苯类及其衍生物,这些废水的排放导致水源污染,毒死鱼虾,危害农作物,并严重威胁人类的健康,在我国水污染控制中已被列为重点解决的有害废水之一。
研究已发现在很多的废水处理系统中Thauera都具有比较高的含量,并可能起着重要的作用。本实验室Liu等人对一个喹啉为碳源的反硝化反应器驯化过程的研究结果,同样表明Thauera应该是反应器中最优势的喹啉降解菌。本实验室Yan等人焦化废水实验室处理装置的研究中发现,Thauera可能不仅在苯酚的降解起作用,在废水COD的去除方面可能也起到主要作用。近年来,在很多的废水处理装置中,尤其是含芳香族污染物的废水处理中,含有较高丰度的Thauera属细菌。然而,废水处理装置中Thauera细菌的分离具有一定的难度,本实验室的毛跃建依据分子生物学的指导从焦化废水处理A2池中分离获得了三株Thauera细菌。因此,对Thauera属细菌分离物的降解功能的研究还不多,尤其是具有多种芳香族化合物降解能力的细菌菌株的应用没有得到充分重视。本发明正是在这种背景下,从含有多种芳香族污染物的焦化废水处理装置中分离了一株Thauera属细菌,并发现该细菌不仅可以耐受高浓度废水,而且对多种芳香族化合物都具有有效的降解能力。
关于陶厄氏细菌的用途,中国发明专利申请“一株腐殖质还原陶厄氏菌及应用和微生物制剂”(公开(公告)号:CN102634466B)公开了一株陶厄氏菌的应用,但主要是用于腐殖质还原的用途。
发明内容
针对现有技术中的缺陷,本发明的目的是提供一株可降解多种芳香族化合物的细菌及其用途。
本发明所涉菌株已提交中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心进行保藏,保藏单位地址:北京市朝阳区北辰西路1号院3号;保藏日期:2014年9月24日;保藏编号:CGMCC 9732;分类命名:陶厄氏菌,Thauera sp.。
本发明是通过以下技术方案实现的:
第一方面,本发明提供一株可降解多种芳香族化合物的细菌,所述细菌菌株为陶厄氏菌(Thauera sp.)CGMCC 9732。
优选地,所述细菌具有反硝化相关的基因nirS。
优选地,所述细菌具有反硝化相关的基因nirS的序列如SED ID No.6所示。
优选地,所述细菌的16S rRNA基因序列如SED ID No.3所示;所述细菌的16S rRNA基因序列的GenBank登录号为KM596507。
优选地,所述细菌的16S rRNA基因序列与Thauera sp.PIV-1(GenBank:AJ505850.1)和Thauera sp.Q20-C(GenBank:EU850614.1)具有100%的相似性;
其中Thauera sp.PIV-1已公开于如下文献:Probian,C.,Wulfing,A.and Harder,J.Anaerobic mineralization of quaternary carbon atoms:isolation of denitrifying bacteria on pivalic acid(2,2-dimethylpropionic acid).Appl.Environ.Microbiol.2003,69(3),1866-1870;
Thauera sp.Q20-C已公开于如下文献:Mao Y,Zhang X,Xia X,Zhong H,Zhao L.Versatile aromatic compound-degrading capacity and microdiversity of Thauera strains isolated from a coking wastewater treatment bioreactor.J Ind Microbiol Biotechnol.2010,37(9):927-34.doi:10.1007/s10295-010-0740-7。
优选地,所述细菌的形态特征为短杆状,长为1.8~3μm,宽为0.3~0.8μm,革兰氏阴性。
优选地,所述细菌的培养特征为在LB琼脂培养基平板上过夜培养后,目视观察到菌落形态为乳白色,表面光滑,边缘整齐,中央有突起的圆形菌落。
第二方面,本发明涉及一株可降解多种芳香族化合物的细菌的用途。
优选地,所述用途包括:所述细菌可用于降解多种有机污染物。
优选地,所述用途具体包括:对焦化废水中的多种有机污染物进行去除、对含多种有机污染物的工业废水的生物处理、对受多种有机污染物污染的环境的生物修复等。
优选地,所述有机污染物包括芳香族化合物等。
优选地,所述芳香族化合物包括苯酚、甲基酚、二甲基酚、乙基甲基酚、吲哚、 丁基羟基甲苯、酞酸二丁酯等。
优选地,所述细菌还可在反硝化条件下去除环境中的硝酸盐。
与现有技术相比,本发明具有如下有益效果:
本发明通过对一株细菌的分离以及其对焦化废水中多种成分的降解研究,发现了TM1菌株的用途,该菌株在高浓度废水中可以有效地降解多种芳香族化合物,有效去除废水中污染物,在COD为1100mg/L的焦化废水中,对苯酚、甲基酚、二甲基酚、乙基甲基酚、吲哚、丁基羟基甲苯、酞酸二丁酯的去除率在90%以上。本发明将推动芳香族污染物降解细菌在废水处理及其相关领域的应用。
附图说明
通过阅读参照以下附图对非限制性实施例所作的详细描述,本发明的其它特征、目的和优点将会变得更明显:
图1为分离株TM1菌株的ERIC指纹图谱;
其中,M泳道为分子量标准;
图2为Thauera菌株TM1在好氧条件下的焦化废水有机污染物的降解图谱;
其中,曲线1为原废水的气相色谱图谱;曲线2为不接菌的对照样品的气相色谱图谱;曲线3为TM1菌株的气相色谱图谱;曲线4为基本培养基的空白对照。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明进行详细说明。以下实施例将有助于本领域的技术人员进一步理解本发明,但不以任何形式限制本发明。应当指出的是,对本领域的普通技术人员来说,在不脱离本发明构思的前提下,还可以做出若干变形和改进。这些都属于本发明的保护范围。
对于本领域的技术人员而言,通过本发明记载的实施例,很显然可知本发明的方法能够适用于本领域的诸多微生物或各类由微生物组成的群落,而不限于本发明实施记载的微生物。当然,本发明的方法很显然地适用于与实施例记载的该细菌菌株的相类似的用途,如对各类含芳香族污染物的废水的处理、芳香族化合物污染的土壤的生物修复等。
实施例1
本实施例涉及一种细菌菌株的分离、鉴定,具体包括如下所述:
(1)细菌菌株TM1的分离方法:
原废水培养基:用0.22微米的滤菌膜对焦化废水进行过滤除菌后加热至60℃左右,然后与融化状态下已灭菌的7.5%的琼脂按照4:1的比例混合。
用于细菌分离的样品采自某焦化厂废水处理装置的反硝化池。将新鲜采集的样品用无菌水适当稀释后,取100μL菌悬液涂布于原废水培养基上,置于28℃的培养箱中培养至有明显菌落形成。挑取单菌落进行划线纯化,将获得的单菌落分别进行保存和后续的鉴定与功能分析。
(2)细菌分离株TM1的鉴定:
基因组DNA提取:采用Triton X-100煮沸裂解法进行DNA提取。具体方法为:用无菌的牙签将单菌落挑至装有1%Triton X-100的1.5毫升离心管中,强烈震荡1分钟后,放入沸水中水浴10分钟,放冰上冷却3分钟,8000g离心1分钟后取上清。用DyNA quantTM 200浓度测定仪(美国,Amersham Pharmacia Biotech)测定DNA浓度。
细菌16S rRNA基因PCR扩增体系如下:50微升PCR反应体系含有1.25国际单位Taq DNA聚合酶(Promega公司),5微升10倍缓冲液,1.5毫摩尔/升MgCl2,200微摩尔/升dNTP,0.5微摩尔/升引物以及2微升基因组DNA。
使用的引物为P0(如SEQ ID No.1所示)and P6(如SEQ ID No.2所示)。PCR反应条件:预变性5分钟,95℃变性30秒,56℃退火30秒,72℃延伸1分钟20个循环,最后72℃延伸8分钟。
测序与序列分析:PCR的产物割胶纯化后,由上海生工生物工程技术服务有限公司测序。序列通过NCBI数据库(http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)寻找其最接近的序列,确定序列的系统发育地位。
通过PCR扩增和测序后获得的TM1菌株的16S rRNA基因的全长序列如SEQ ID No.3所示。
序列经比对后,与数据库的已知细菌最相似的序列为:德国不莱梅海洋微生物研究所分离的Thauera sp.PIV-1和本实验室之前分离到的Thauera sp.Q20-C,与这两株菌的16S rRNA基因的相似性均为100%。前者是可利用特戊酸(2,2-dimethylpropionic acid)生长的反硝化细菌。而后者是分离自焦化废水的反硝化细菌。
实施例2
本实施例涉及细菌分离株TM1的反硝化基因研究,具体包括如下:
nirS基因PCR扩增体系如下:25微升PCR反应体系含有1国际单位Taq DNA聚合酶(Promega公司),2.5微升10倍缓冲液,1.5毫摩尔/升MgCl2,200微摩尔/升dNTP,0.4微摩尔/升引物以及1微升模板DNA。
使用的上下游引物分别是nirS-1F(如SEQ ID No.4所示)and nirS-6R(如SEQ ID No.5所示)。PCR扩增程序:94℃预变性5分钟,94℃变性30秒,60℃退火30秒,72℃延伸1分钟30个循环,最后72℃延伸7分钟。
使用1.2%(wt/vol)的琼脂糖凝胶(含有0.5mg/mL的锈化乙锭EB)电泳检测扩增得到的PCR产物。
通过PCR扩增和测序后获得的TM1菌株的反硝化基因nirS的序列如SEQ ID No.6所示。
实施例3
本实施例涉及细菌分离株TM1的ERIC图谱。
使用上游引物E1(如SEQ ID No.7所示)和下游引物E2(如SEQ ID No.8所示)进行ERIC-PCR扩增。PCR扩增体系如下(25微升):2.5微升扩增缓冲液(10倍)、2微升dNTP(2.5毫摩尔/升)、2微升MgCl2(毫摩尔/升)、引物E1和E2(12.5微摩尔/升)各0.5微升、1微升模板DNA、0.5微升Taq酶,双蒸水补足体积。PCR扩增程序:95℃预变性7分钟,然后30个循环进行变性(95℃ 30秒)、退火(50℃ 1分钟)、延伸(65℃ 8分钟),最后在65℃延伸16分钟。
扩增得到PCR产物后,用DyNA quantTM200荧光仪测定DNA浓度,取200ng PCR产物在1.2%(wt/vol)的琼脂糖凝胶(含0.5mg/mL锈化乙锭)中电泳。通过UVI凝胶成像系统(UVItec,Cambridge,UK)电泳胶照相,并保存结果(结果见图1)。
该ERIC图谱是该菌株特定基因组的体现,可作为TM1菌株的特征图谱。
实施例4
本实施例涉及细菌分离株TM1的降解功能研究,具体如下所述:
苯酚是焦化废水中主要的有毒有害物质之一,对焦化废水中苯酚最有效的处理方法是生物降解。
方法:该焦化原废水的COD浓度为1100mg/L,通过上述方法共从中检测到15个吸收峰(图2)。使用串联质谱的方法对这些峰进行了鉴定,结果见表1。发现焦化废水中最主要的有机污染物是苯酚和甲酚。在原废水中接入TM1菌株,并经过4天的好氧培养后,气相色谱检测结果发现,除了喹啉(11号峰)以外,几乎所有的有机污染物都被完全降解了。而在未接菌的阴性对照中,有机污染物的数量和含量都基本保持不变。说明TM1菌株对除喹啉外的至少7种污染物(苯酚、甲基酚、二甲基酚、乙基甲基酚、吲哚、丁基羟基甲苯、酞酸二丁酯)都具有很高的去除效果,去除率至少在90%以上。
表1焦化废水中有机污染物的鉴定
a原废水中的污染物浓度;b4天好氧培养后,这些菌株对每个峰的对应化合物的降解能力.+,完全去除;△,部分去除;-,不降解。
以上对本发明的具体实施例进行了描述。需要理解的是,本发明并不局限于上述特定实施方式,本领域技术人员可以在权利要求的范围内做出各种变形或修改,这并不影响本发明的实质内容。
Claims (9)
1.一株可降解多种芳香族化合物的细菌,其特征在于,所述细菌菌株为陶厄氏菌(Thauera sp.)CGMCC 9732。
2.根据权利要求1所述的可降解多种芳香族化合物的细菌,其特征在于,所述细菌具有反硝化相关的基因nirS。
3.根据权利要求1所述的可降解多种芳香族化合物的细菌,其特征在于,所述细菌具有反硝化相关的基因nirS的序列如SED ID No.6所示。
4.根据权利要求1所述的可降解多种芳香族化合物的细菌,其特征在于,所述细菌的16S rRNA基因序列如SED ID No.3所示。
5.一株根据权利要求1所述的可降解多种芳香族化合物的细菌的用途,其特征在于,所述用途包括:用于降解多种有机污染物。
6.根据权利要求5所述的可降解多种芳香族化合物的细菌的用途,其特征在于,所述用途包括对焦化废水中的多种有机污染物进行去除、对多种有机污染物的工业废水的生物处理或对受多种有机污染物的污染的环境的生物修复。
7.根据权利要求5或6所述的可降解多种芳香族化合物的细菌的用途,其特征在于,所述有机污染物包括芳香族化合物。
8.根据权利要求7所述的可降解多种芳香族化合物的细菌的用途,其特征在于,所述芳香族化合物包括苯酚、甲基酚、二甲基酚、乙基甲基酚、吲哚、丁基羟基甲苯、酞酸二丁酯中的一种或几种。
9.根据权利要求5所述的可降解多种芳香族化合物的细菌的用途,其特征在于,所述细菌还可在反硝化条件下去除环境中的硝酸盐。
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