CN104099274B

CN104099274B - 一株好氧降解吲哚的贪铜菌及其应用

Info

Publication number: CN104099274B
Application number: CN201410335175.8A
Authority: CN
Inventors: 曲媛媛; 马桥; 张照婧; 沈娥; 王经伟; 沈文丽; 李端行; 李会杰; 刘紫嫣; 周集体
Original assignee: Dalian University of Technology
Current assignee: Dalian University of Technology
Priority date: 2014-07-15
Filing date: 2014-07-15
Publication date: 2016-12-07
Anticipated expiration: 2034-07-15
Also published as: CN104099274A

Abstract

一株好氧降解吲哚的贪铜菌及其应用，属于微生物生物技术领域。该菌株分离自大连黑石礁海边泥土样品，2014年6月4日保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心，保藏编号为CGMCC No. 9265。菌株IDO为革兰氏阴性菌，短杆状，经16S rRNA基因序列测定，其与Cupriavidus具有较高的相似性，因此该菌分类命名为Cupriavidussp. IDO，菌株16S rRNA基因序列的GenBank登录号为KJ875862。该菌株利用多种芳香化合物作为唯一碳源生长，对吲哚具有较高的降解能力，菌株还具有较好的pH和温度耐受性，显示了其在含高浓度吲哚废水处理中的应用前景。

Description

一株好氧降解吲哚的贪铜菌及其应用

技术领域

本发明涉及一株好氧降解吲哚的贪铜菌及其应用，属于微生物生物技术领域。

背景技术

随着工业的发展，我国的水污染情况日益严峻。焦化废水、制药废水等工业废水中都含有大量的氮杂环化合物，对环境危害严重。吲哚是工业废水中常见的氮杂环有机污染物之一，具有较高的流动性和水溶性，因此对自然环境和人类健康存在潜在的危害。

与物理化学法相比较，生物法具有对人和环境影响小、条件温和、成本低等优点，因此在污染物处理中得到广泛应用。目前，国内外已有学者筛选到对吲哚具有降解能力的菌株，如绿脓假单胞菌 (Pseudomonas aeruginosa)、产碱杆菌 (Alcaligenes sp.) 等细菌，黑曲霉菌 (Aspergillus niger)、嗜热性侧孢霉菌 (Sporotrichum thermophile) 和拟茎点霉菌 (Phomopsis liquidambari) 等真菌都能以吲哚为唯一碳源进行生长。然而，这些菌株降解吲哚的速率有限，目前为止报道最高的吲哚降解速率为60小时内降解100 mg/L的吲哚。因此挖掘新的吲哚降解菌资源，加速吲哚的生物降解研究显得尤为重要。

贪铜菌属是近年来受到普遍关注的可以用于治理环境污染的细菌，该菌属可以降解多数芳香污染物，且可以应用于修复重金属污染等领域，但国内目前对于该菌属研究不多。本发明采用的贪铜菌Cupriavidus sp. IDO不仅能以吲哚为唯一碳源进行生长，而且吲哚降解速率与已有报道具有明显的优势，因此该菌在吲哚废水处理中具有潜在的应用前景。

发明内容

本发明的目的在于提供一株好氧降解吲哚的贪铜菌及其应用，该菌株能利用多种芳香化合物作为唯一碳源生长，对吲哚具有较高的降解能力，菌株还具有较好的pH和温度耐受性，其在含高浓度吲哚废水处理中的应用前景。

本发明所涉及的一株好氧降解吲哚的贪铜菌(拉丁文分类命名为：Cupriavidussp. IDO)，所述菌株的登记入册编号为CGMCC No. 9265，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏单位地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，保藏日期为 2014年6月4日。所述菌株属于贪铜菌属，是革兰氏阴性菌，菌体为短杆状，其16S rRNA基因序列Genbank登录号为KJ875862。

所述菌株分离自大连黑石礁海边泥土样品，其纯化分离及生长培养基为无机盐培养基，无机盐培养基的组成为：2.0 g/L (NH₄)₂SO₄、2.0 g/L KH₂PO₄、3.28 g/L Na₂HPO₄•12H₂O和0.00025 g/L FeCl₃，在121 ℃高温高压灭菌20 min的无机盐培养基中按要求添加0-250 mg/L吲哚，30℃，150 rpm条件震荡。

所述菌株应用于吲哚的降解，在24小时内，菌株IDO在pH 5.0-8.0的范围内对100 mg/L吲哚的降解率保持在85%以上。

本发明的有益效果是：该菌株分离自大连黑石礁海边泥土样品，菌株IDO为革兰氏阴性菌，短杆状，经16S rRNA基因序列测定，其与Cupriavidus具有较高的相似性，因此该菌分类命名为Cupriavidussp. IDO，菌株16S rRNA基因序列的GenBank登录号为KJ875862。该菌株利用多种芳香化合物作为唯一碳源生长，包括苯甲酸、色氨酸、苯酚、儿茶酚、水杨酸、靛红等，对吲哚具有较高的降解能力，能在18小时内完全降解100 mg/L的吲哚，菌株能耐受200 mg/L吲哚。在24小时内，菌株IDO在pH 5.0-8.0的范围内对100 mg/L吲哚的降解率保持在85%以上，显示了其在含高浓度吲哚废水处理中的应用前景及具有能够处理实际焦化废水的应用潜力。

附图说明

图1是一株贪铜菌株IDO电镜图片。

图2是一株贪铜菌株IDO对不同吲哚浓度的降解曲线。

图3是一株贪铜菌株IDO在不同温度下对吲哚的降解率。

图4是一株贪铜菌株IDO在不同起始pH下对吲哚的降解率。

具体实施方式

实验材料和试剂

1. 菌株：菌株IDO由本发明人2014年从大连黑石礁海边泥土样品中分离获得，菌种以吲哚为唯一碳源培养，经过反复平板涂布分离纯化，得到纯培养物。

2. 培养基

无机盐培养基：2.0 g/L (NH₄)₂SO₄，2.0 g/L KH₂PO₄，3.28 g/L Na₂HPO₄•12H₂O，0.00025 g/L FeCl₃。

无机盐固体培养基：无机盐培养基 + 2% 琼脂。

实施例 1 ：贪铜菌菌株的获得

将来源于大连黑石礁海边泥土样品经过稀释平板涂布后，将样品涂布在1/10 LB (NaCl 1 g/L、蛋白胨 1 g/L、酵母粉0.5 g/L，pH=7，吲哚100 mg/L) 平板上，30℃培养，挑取单菌落用无机盐培养基 ((NH₄)₂SO₄ 2.0 g/L、KH₂PO₄ 2.0 g/L、Na₂HPO₄•12H₂O 3.28 g/L、FeCl₃ 0.00025 g/L、吲哚100 mg/L) 培养，30℃，pH 7.0，150 rpm下获得菌液。IDO的细胞形态为短杆状，大小为0.5 μm左右，如图1。

实施例 2 ：菌株的16S rRNA分子鉴定

挑取无机盐固体培养基平板上生长的单菌落溶于10 µL灭菌水中，99℃变性后离心取上清液作为PCR扩增反应的模板。使用TaKaRa 16S rDNA Bacterial Identification PCR Kit，以Forward primer/Reverse primer 2为引物，扩增目的片断。PCR反应体系总体积为50 µL：PCR Premix 25 µL，Forward Primer 0.5 µL，Reverse Primer 20.5 µL，模板DNA 5 µL，无菌超纯水19 µL。PCR反应条件为：94℃预变性5 min，经过30个循环，其中，94℃变性1 min，55℃退火1 min，72℃延伸1.5 min，30个循环后，再于72℃延伸5 min，取5 µL PCR产物进行1%琼脂糖凝胶电泳，EB染色后紫外检测。使用TaKaRa Agarose Gel DNA Purification Kit Ver. 2.0 (大连宝生物公司 TaKaRa) 切胶回收PCR产物。16S rRNA序列的测序工作上海生工生物工程有限公司完成。测序结果在Genbank中进行Blast比对，结果显示与其序列相似性达到99%的均为贪铜菌(Cupriavidussp.)，因此将菌株IDO归属于贪铜菌属。

>IDO 16S rRNA gene sequence

TGCAGTCGAACGGCAGCACGGGGGCAACCCTGGTGGCGAGTGGCGAACGGGTGAGTAATACATCGGAACGTGCCCTGTTGTGGGGGATAACTAGTCGAAAGATTAGCTAATACCGCATACGACCTGAGGGTGAAAGCGGGGGACCGTAAGGCCTCGCGCAATAGGAGCGGCCGATGTCTGATTAGCTAGTTGGTGGGGTAAAGGCCCACCAAGGCGACGATCAGTAGCTGGTCTGAGAGGACGATCAGCCACACTGGGACTGAGACACGGCCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTGGGGAATTTTGGACAATGGGGGCAACCCTGATCCAGCAATGCCGCGTGTGTGAAGAAGGCCTTCGGGTTGTAAAGCACTTTTGTCCGGAAAGAAATGGCCTGGGTTAATACCTCGGGTCGATGACGGTACCGGAAGAATAAGCACCGGCTAACTACGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGTAGGGTGCGAGCGTTAATCGGAATTACTGGGCGTAAAGCGTGCGCAGGCGGTTTTGTAAGACAGGCGTGAAATCCCCGAGCTTAACTTGGGAATGGCGCTTGTGACTGCAAGGCTAGAGTATGTCAGAGGGGGGTAGAATTCCACGTGTAGCAGTGAAATGCGTAGAGATGTGGAGGAATACCGATGGCGAAGGCAGCCCCCTGGGACGTCACTGACGCTCATGCACGAAAGCGTGGGGAGCAAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCACGCCCTAAACGATGTCAACTAGTTGTTGGGGATTCATTTCTTCAGTAACGTAGCTAACGCGTGAAGTTGACCGCCTGGGGAGTACGGTCGCAAGATTAAAACTCAAAGGAATTGACGGGGACCCGCACAAGCGGTGGATGATGTGGATTAATTCGATGCAACGCGAAAAACCTTACCTACCCTTGACATGCCACTAACGAAGCAGAGATGCATTAGGTGCCCGAAAGGGAAAGTGGACACAGGTGCTGCATGGCTGTCGTCAGCTCGTGTCGTGAGATGTTGGGTTAAGTCCCGCAACGAGCGCAACCCTTGTCTCTAGTTGCTACGAAAGGGCACTCTAGAGAGACTGCCGGTGACAAACCGGAGGAAGGTGGGGATGACGTCAAGTCCTCATGGCCCTTATGGGTAGGGCTTCACACGTCATACAATGGTGCGTACAGAGGGTTGCCAACCCGCGAGGGGGAGCTAATCCCAGAAAACGCATCGTAGTCCGGATCGTAGTCTGCAACTCGACTACGTGAAGCTGGAATCGCTAGTAATCGCGGATCAGCATGCCGCGGTGAATACGTTCCCGGGTCTTGTACACACCGCCCGTCACACCATGGGAGTGGGTTTTGCCAGAAGTAGTTAGCCTAACCGCAAGGAG

实施例 3 ：贪铜菌IDO的底物广谱性测定

利用实施例1中的菌液，采用无机盐培养基培养，5%接菌量，具体考察了菌株IDO以多种化合物为唯一碳源生长，包括苯甲酸、色氨酸、苯酚、儿茶酚、水杨酸、龙胆酸、吲哚、靛红、喹啉、吡啶、萘、菲、联苯等，各种化合物浓度为50 mg/L。表1为贪铜菌IDO在不同化合物为唯一碳源的培养基中的作用情况。

表1 贪铜菌IDO的底物广谱性考察

物质	结果	物质	结果
				苯甲酸	+	3-甲基吲哚	-
色氨酸	+	2-甲基吲哚	-
				苯酚	+	吲哚乙酸	-
儿茶酚	+	喹啉	-
				水杨酸	+	吡啶	-
龙胆酸	+	萘	-
				吲哚	+	菲	-
靛红	+	联苯	-

实施例 4 ：不同吲哚浓度对贪铜菌IDO好氧降解吲哚的情况

利用实施例1中的菌液，采用100 mL无机盐培养基培养，5%接菌量，吲哚浓度为 (mg/L)：25、50、100、150、200、250。30℃，pH 7.0，150 rpm，每4 h，取2 mL菌液，检测吲哚剩余浓度。图2为贪铜菌IDO对不同浓度吲哚好氧降解的实验结果。结果表明，菌株IDO在以吲哚为唯一碳源的培养基中可使不同浓度的吲哚发生降解，对浓度为0-200 mg/L吲哚的降解率均可达到99%以上，最高的吲哚耐受浓度为200 mg/L。

实施例 5 ：不同pH对贪铜菌IDO好氧降解吲哚的情况

利用实施例1中的菌液，采用100 mL无机盐培养基培养，5%接菌量，吲哚浓度为100 mg/L， pH为：3、4、5、6、7、8、9。30℃，150 rpm，好养培养24 h后，检测吲哚剩余浓度。图3为不同pH对贪铜菌IDO好氧降解吲哚的实验结果。结果表明，不同pH会影响菌株IDO好氧降解吲哚的能力，该菌株IDO在pH为5-8的范围内，对吲哚的降解率均可达到85%以上。

实施例 6 ：不同温度对贪铜菌IDO好氧降解吲哚的情况

利用实施例1中的菌液，采用100 mL无机盐培养基培养，5%接菌量，吲哚浓度为100 mg/L，温度为（℃）：20、25、30、35、40。pH 7.0，150 rpm，好养培养24 h，检测吲哚剩余浓度。图4为不同温度对贪铜菌IDO好氧降解吲哚的实验结果。结果表明，不同温度会影响菌株IDO好氧降解吲哚的能力，所述菌株IDO的最适降解温度为30℃，对吲哚的降解率达90%以上。

SEQUENCE LISTING

<110>大连理工大学

<120>一株好氧降解吲哚的贪铜菌及其应用

<210> 1

<211> 1391

<212> DNA

<213> 贪铜菌（Cupriavidus sp.）

<400> 1

TGCAGTCGAACGGCAGCACGGGGGCAACCCTGGTGGCGAGTGGCGAACGG50

GTGAGTAATACATCGGAACGTGCCCTGTTGTGGGGGATAACTAGTCGAAA100

GATTAGCTAATACCGCATACGACCTGAGGGTGAAAGCGGGGGACCGTAAG150

GCCTCGCGCAATAGGAGCGGCCGATGTCTGATTAGCTAGTTGGTGGGGTA200

AAGGCCCACCAAGGCGACGATCAGTAGCTGGTCTGAGAGGACGATCAGCC250

ACACTGGGACTGAGACACGGCCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTGGGG300

AATTTTGGACAATGGGGGCAACCCTGATCCAGCAATGCCGCGTGTGTGAA350

GAAGGCCTTCGGGTTGTAAAGCACTTTTGTCCGGAAAGAAATGGCCTGGG400

TTAATACCTCGGGTCGATGACGGTACCGGAAGAATAAGCACCGGCTAACT450

ACGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGTAGGGTGCGAGCGTTAATCGGAATT500

ACTGGGCGTAAAGCGTGCGCAGGCGGTTTTGTAAGACAGGCGTGAAATCC550

CCGAGCTTAACTTGGGAATGGCGCTTGTGACTGCAAGGCTAGAGTATGTC600

AGAGGGGGGTAGAATTCCACGTGTAGCAGTGAAATGCGTAGAGATGTGGA650

GGAATACCGATGGCGAAGGCAGCCCCCTGGGACGTCACTGACGCTCATGC700

ACGAAAGCGTGGGGAGCAAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCACGCCC750

TAAACGATGTCAACTAGTTGTTGGGGATTCATTTCTTCAGTAACGTAGCT800

AACGCGTGAAGTTGACCGCCTGGGGAGTACGGTCGCAAGATTAAAACTCA850

AAGGAATTGACGGGGACCCGCACAAGCGGTGGATGATGTGGATTAATTCG900

ATGCAACGCGAAAAACCTTACCTACCCTTGACATGCCACTAACGAAGCAG950

AGATGCATTAGGTGCCCGAAAGGGAAAGTGGACACAGGTGCTGCATGGCT1000

GTCGTCAGCTCGTGTCGTGAGATGTTGGGTTAAGTCCCGCAACGAGCGCA1050

ACCCTTGTCTCTAGTTGCTACGAAAGGGCACTCTAGAGAGACTGCCGGTG1100

ACAAACCGGAGGAAGGTGGGGATGACGTCAAGTCCTCATGGCCCTTATGG1150

GTAGGGCTTCACACGTCATACAATGGTGCGTACAGAGGGTTGCCAACCCG1200

CGAGGGGGAGCTAATCCCAGAAAACGCATCGTAGTCCGGATCGTAGTCTG1250

CAACTCGACTACGTGAAGCTGGAATCGCTAGTAATCGCGGATCAGCATGC1300

CGCGGTGAATACGTTCCCGGGTCTTGTACACACCGCCCGTCACACCATGG1350

GAGTGGGTTTTGCCAGAAGTAGTTAGCCTAACCGCAAGGAG1391

Claims

1.一株好氧降解吲哚的贪铜菌 (Cupriavidussp. ) IDO，其特征在于：所述菌株的登记入册编号为CGMCC No. 9265，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏单位地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，保藏日期为 2014年6月4日。

2.根据权利要求1所述的一株好氧降解吲哚的贪铜菌，其特征在于：所述贪铜菌的培养基为：无机盐培养基，组分为2.0 g/L (NH₄)₂SO₄、2.0 g/L KH₂PO₄、3.28 g/L Na₂HPO₄•12H₂O和0.00025 g/L FeCl₃ _，按实验要求添加0-250 mg/L吲哚。

3.权利要求1所述的一株好氧降解吲哚的贪铜菌应用于吲哚的降解。