CN112522152A - 一株耐盐的脱氮副球菌gbw-hb1904及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一株耐盐的脱氮副球菌GBW‑HB1904及其应用。所述的脱氮副球菌GBW‑HB1904的分类命名为脱氮副球菌Paracoccus denitrificans，保藏编号为CGMCC No.20363；该菌菌落为圆形，乳白色，直径0.2‑0.4mm，表面光滑湿润有光泽，中间略凸起，不透明，边缘整齐，无晕环。所述脱氮副球菌GBW‑HB1904具有耐广盐性，可以在25～45‰的盐浓度下正常生长，并具有在高盐环境中快速降解垃圾渗透液中COD的能力，能够有效改善和提升垃圾渗透液中COD的生物处理效果及渗透液处理设施在高盐极端环境条件的运行稳定性，具有广阔的应用前景和价值。

Description

一株耐盐的脱氮副球菌GBW-HB1904及其应用

技术领域

本发明属于微生物技术领域，涉及一株耐盐的脱氮副球菌GBW-HB1904及其应用。

背景技术

随着生活水平的提高，生产生活中都会产生大量的垃圾。目前，垃圾处理方法主要有卫生填埋、堆肥、焚烧等；而在垃圾填埋过程中会产生大量的垃圾渗滤液，其成分复杂，主要取决于垃圾成分、垃圾的粒径、压实程度、现场的气候、水文条件和填埋时间等。垃圾渗滤液属于高浓度有机废水，COD含量普遍较高，所以研究垃圾渗滤液中COD的去除，对渗滤液的处理具有重要意义。

但由于一些沿海地区已将海水应用于工业生产和生活中，以及化学制造业、肉类加工厂或海产品加工厂等使用的杀虫剂、除草剂、有机过氧化物、制药和染料等材料，都会使得垃圾渗滤液中含有大量的无机盐，导致渗滤液的高盐度。但这些高盐度的渗透液对大多数用来处理垃圾渗透液的微生物具有较强的抑制作用。因此，寻找耐盐或嗜盐、并可以在高含盐渗透液处理中发挥积极作用的菌株对未来垃圾渗滤液的处理会具有重大的意义。

发明内容

本发明提供了一株耐盐的脱氮副球菌GBW-HB1904及其应用。所述脱氮副球菌GBW-HB1904具有很好的耐盐特性，能够高效去除高盐渗透液中的COD。

为实现上述发明目的，本发明通过下述技术方案予以实现：

本发明提供了一株耐盐的脱氮副球菌GBW-HB1904，其分类命名为脱氮副球菌Paracoccus denitrificans，保藏编号为CGMCC No.20363。

进一步的，所述脱氮副球菌GBW-HB1904的菌落为圆形，乳白色，直径0.2-0.4mm，表面光滑湿润有光泽，中间略凸起，不透明，边缘整齐，无晕环。

进一步的，所述脱氮副球菌GBW-HB1904具有广盐性，生长盐度范围为25～45‰。

进一步的，所述脱氮副球菌GBW-HB1904的生长温度为15～40℃，最适的生长温度为28-32℃。

进一步的，所述脱氮副球菌GBW-HB1904的生长pH值为6～9，最适生长pH值为7.0-8.0。

进一步的，所述脱氮副球菌GBW-HB1904为兼性厌氧菌，其生长溶解氧浓度为0.2～4mg/L。

进一步的，所述脱氮副球菌GBW-HB1904培养5h后进入对数生长期，18-20h时进入对数生长末期，菌数达到1×10¹⁰CFU/mL。

进一步的，所述脱氮副球菌GBW-HB1904的适宜生长的培养基配方包括：葡萄糖50g/L、玉米浆干粉10g/L、NaCl 5g/L、NaNO₃ 2g/L、KH₂PO₄ 0.2g/L、FeSO₄·7H₂O 0.05g/L、Na₂HPO₄ 5g/L、MgSO₄·7H₂O 0.1g/L。

进一步的，所述脱氮副球菌GBW-HB1904能够去除垃圾渗滤液中的COD。

本发明还提供了所述的脱氮副球菌GBW-HB1904在用于制备降解高盐垃圾渗滤液中COD的微生物菌剂中的应用。

进一步的，在所述应用时，将所述脱氮副球菌GBW-HB1904经发酵培养得到脱氮副球菌GBW-HB1904发酵菌液；所述发酵条件为：罐压0.1～0.2MPa，温度28～32℃，溶氧≥30％，搅拌速度180～200rpm，发酵时间20～24h。

进一步的，所述脱氮副球菌GBW-HB1904发酵菌液的菌含量为1.0×10¹⁰CFU/mL。

进一步的，所述脱氮副球菌GBW-HB1904发酵菌液的添加量为垃圾渗滤液处理生化系统中好氧池容积的1-5‰。

进一步的，所述脱氮副球菌GBW-HB1904对垃圾渗滤液中COD的去除率高于92％。

进一步的，所述微生物菌剂包括液体、粉剂、颗粒型。

与现有技术相比，本发明具有以下优点和技术效果：

本发明的脱氮副球菌GBW-HB1904分离自高盐水体环境，具有耐广盐性，在25～45‰的盐度范围内均能生长良好。脱氮副球菌GBW-HB1904在体外培养繁殖快，在18-20h就能达到对数末期；并且该菌在高盐环境中，具有快速降解垃圾渗透液中COD的能力，其降解率能够达到92％以上，因此其可作为用于开发高盐度垃圾渗滤液中去除COD的产品，进而应用于高盐污废水处理中。脱氮副球菌GBW-HB1904的使用方法简单，只需将其制备成发酵菌液并直接添加在渗透液处理系统即可，能够有效解决高盐度污水系统微生物生化性差，污染物去除效率低等问题，并能够有效改善和提升高盐废水中COD的生物处理效果及污水处理设施在高盐极端环境条件的运行稳定性，具有广阔的应用前景和价值。

附图说明

图1为所述脱氮副球菌GBW-HB1904在改良NB固体培养基平板上的菌落形态特征。

图2为所述脱氮副球菌GBW-HB1904的生长曲线。

图3为所述脱氮副球菌GBW-HB1904对垃圾渗滤液中COD降解率的影响。

图4为所述脱氮副球菌GBW-HB1904在现场垃圾渗滤液处理项目应用调试试验中对COD浓度的影响。

具体实施方式

结合以下具体实例对本发明的技术方案作进一步详细的说明。

下述实施例中，如无特殊说明，所使用的实验方法均为常规方法，所用材料、试剂等均可从生物或化学试剂公司购买。

实施例中所需培养基的配方如下：

1、高盐度硝态氮降解菌富集筛选液体培养基：葡萄糖10g，NaNO₃ 2g，Na₂CO₃ 1.5g，K₂HPO₄ 1.0g，MgSO₄·7H₂O 0.05g，FeSO₄·7H₂O 0.5g，NaCl 40g，pH 7.0-8.0，蒸馏水1L。

2、高盐度硝态氮降解菌分离纯化固体培养基：葡萄糖10g，NaNO₃ 2g，Na₂CO₃ 1.5g，K₂HPO₄ 1.0g，MgSO₄·7H₂O 0.05g，FeSO₄·7H₂O 0.5g，NaCl 40g，琼脂粉15g，pH 7.0～8.0，蒸馏水1L。

3、改良营养肉汤(NB)培养基：牛肉膏5g，蛋白胨10g，氯化钠5g，NaNO₃ 2g/L、FeSO₄·7H₂O 0.05g/L、MgSO₄·7H₂O 0.1g/L、水1L、pH 7.0～7.5。

4、改良营养肉汤(NB)固体培养基：牛肉膏5g，蛋白胨10g，氯化钠5g，NaNO₃ 2g/L、FeSO₄·7H₂O 0.05g/L、MgSO₄·7H₂O 0.1g/L、琼脂粉15g、水1L、pH 7.0～7.5。

5、发酵培养基：葡萄糖50g/L、玉米浆干粉10g/L、NaCl 5g/L、NaNO₃ 2g/L、KH₂PO₄0.2g/L、FeSO₄·7H₂O 0.05g/L、Na₂HPO₄ 5g/L、MgSO₄·7H₂O 0.1g/L、余量为水，液体培养基的pH为7.0～7.5。

以上培养基在使用前，均需在121℃下灭菌20min，然后室温保存。

实施例1：脱氮副球菌GBW-HB1904的筛选、分离与鉴定

1、脱氮副球菌GBW-HB1904的筛选与纯化

取垃圾渗滤液与食品厂腌制食品废水各5g，加入100mL的PBS缓冲溶液中，振荡30min，使样品充分混匀，1000rpm离心2min，收集样品上清液，备用。取5mL上述样品上清液，分别加入到装有100mL高盐度硝态氮降解菌富集筛选液体培养基的锥形瓶中，30℃，160rpm恒温摇床培养2d，富集3次。取培养的菌悬液梯度稀释后取100μL涂布于高盐度硝态氮降解菌富集筛选固体培养基上，置于30℃培养箱培养。在48h之后，挑取不同形态单菌落在改良营养肉汤(NB)固体培养基上划线培养，重复分离纯化3次，最后得到单菌落，将该单菌落命名为GBW-HB1904。

如图1所示，所述菌株GBW-HB1904在改良营养肉汤(NB)固体培养基平板上的菌落为圆形，乳白色，直径0.2-0.4mm，表面光滑湿润有光泽，中间略凸起，不透明，边缘整齐，无晕环。

2、脱氮副球菌GBW-HB1904的鉴定

以所述的菌株GBW-HB1904的DNA为模板，使用16S rRNA通用引物进行扩增，扩增片段进行序列测定，将得到的菌株GBW-HB1904的16S rDNA测序结果与GenBank中的序列进行比对分析，结果显示，菌株GBW-HB1904与Paracoccus denitrificans的同源性最高，因此确定该菌株GBW-HB1904为脱氮副球菌。

将筛选到的菌株GBW-HB1904进行菌种保藏，所述脱氮副球菌GBW-HB1904的保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)；地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所；保藏日期：2020年07月15日；脱氮副球菌Paracoccus denitrificans的保藏编号为：CGMCC No.20363。

实施例2：脱氮副球菌GBW-HB1904的生长测定及生理生化特征

1、脱氮副球菌GBW-HB1904的生长测定

将斜面培养的脱氮副球菌GBW-HB1904接种至改良NB培养基中，在pH 7.0-7.5，28-32℃下恒温摇床培养26h，制得GBW-HB1904菌液，其中每1.0h取样一次，在OD600nm下测定吸光值，绘制生长曲线图。如图2所示，实验结果表明，GBW-HB1904在培养的前5h为生长迟缓期，随后进入对数生长期，待培养至18-20h时进入对数生长末期，菌数达到1.0×10¹⁰CFU/mL，20-24h为生长稳定期，接着进入衰亡期，从而完成整个生长周期。

2、脱氮副球菌GBW-HB1904的生理生化特征

将制得的GBW-HB1904菌液在NB培养基中进一步培养后，根据《伯杰细菌鉴定手册》的菌株生理生化检测方法对脱氮副球菌GBW-HB1904进行检测。结果如表1所示，脱氮副球菌GBW-HB1904在15～40℃温度范围都能正常生长，最适生长温度为28～32℃；在pH值6～9的范围内均能生长，最适生长pH值为7.0～8.0；在溶氧含量0.2～4mg/L范围内都能正常生长，最适生长溶解氧浓度在1～3mg/L，脱氮副球菌GBW-HB1904属于兼性厌氧菌；并且该菌能够产生尿素酶、β-葡萄糖苷酶和甘油，同时还能够降解动力-硝酸盐和西蒙式枸橼酸盐及分解半固体琼脂。另外，脱氮副球菌GBW-HB1904适宜生长的培养基配方如下：葡萄糖50g/L、玉米浆干粉10g/L、NaCl 5g/L、NaNO₃ 2g/L、KH₂PO₄ 0.2g/L、FeSO₄·7H₂O 0.05g/L、Na₂HPO₄ 5g/L、MgSO₄·7H₂O 0.1g/L、余量为水，液体培养基的pH为7.0～7.5。

表1脱氮副球菌GBW-HB1904的生理生化特征

注：<+>表示阳性，<->表示阴性。

实施例3：脱氮副球菌GBW-HB1904的盐度耐受试验

为了检验脱氮副球菌GBW-HB1904在高盐度条件下的存活性能，对其在不同盐度条件下的生长情况进行分析检测。调整氯化钠在NB培养基中的用量，配制成不同盐浓度的培养基，然后将斜面培养的脱氮副球菌GBW-HB1904接种至不同盐浓度的NB培养基中，在pH7.0-7.5，温度为30℃的恒温摇床中培养20h，得到脱氮副球菌GBW-HB1904培养菌液，检测该脱氮副球菌在不同盐浓度培养基中的生长状况。结果如表2所示，GBW-HB1904具有广盐性，在25～45‰盐度范围内均能生长良好。

表2脱氮副球菌GBW-HB1904在不同盐浓度中的生长情况

实施例4：脱氮副球菌GBW-HB1904对垃圾渗滤液中COD去除率的评价

将斜面培养的脱氮副球菌GBW-HB1904接种至改良NB培养基中，在pH 7.0-7.5，温度为30℃的恒温摇床中培养20h，得到脱氮副球菌GBW-HB1904种子液；将脱氮副球菌GBW-HB1904种子液按10％的体积比接种至发酵培养基中，调整罐压为0.1MPa，温度28～32℃，溶氧≥30％，搅拌速度为180rpm，发酵20h，得到脱氮副球菌GBW-HB1904发酵菌液，菌液中菌含量不少于1.0×10¹⁰CFU/mL。

试验过程中采用重铬酸盐法(HJ 828-2017)检测垃圾渗滤液水体中COD的含量。采集青岛市某市政垃圾渗滤液处理厂中待处理的渗滤液水样，将水样等量分装在12个2L的广口烧杯中，每个烧杯分装1.5L的水样，共分为6组，每组2个平行，其中CK组为不加脱氮副球菌GBW-HB1904菌液的空白对照组，其他试验条件与试验组均相同，试验组分为L1、L2、L3、L4与L5组，对应每组的脱氮副球菌GBW-HB1904发酵菌液的添加量分别为水样的1‰、2‰、3‰、4％0和5‰。试验开始前对各试验组样品中COD初始浓度进行留样检测，控制各组pH值在6-9之间，且各组均用相同型号的小型增氧机进行曝气处理，控制各组水中溶氧≥2mg/L，每隔12h对各组样品中pH值与COD浓度进行跟踪检测，整个试验周期为3天。试验结果如图3所示，各组试验组较空白对照组均能显著降低COD浓度，且最终去除效率均在92％以上，同时，不同添加量的脱氮副球菌GBW-HB1904发酵菌液试验组之间没有显著差异；表明即使在较低添加量条件下，本发明的脱氮副球菌GBW-HB1904也能够显著地去除垃圾渗滤液中COD。

实施例5：脱氮副球菌GBW-HB1904在现场垃圾渗滤液处理系统中应用调试试验

将所述的脱氮副球菌GBW-HB1904发酵菌液结合实际工程案例进行应用验证，针对青岛市某垃圾渗滤液处理厂生化系统的应用调试试验，该处理系统的基本工艺流程为：预处理+AO+后处理；目前该垃圾渗滤液处理系统面临出水COD浓度不达标的问题，试验前系统进水COD浓度为600-800mg/L，出水COD浓度为200-250mg/L，远高于要求出水COD浓度标准(COD浓度≤50mg/L)。

试验开始前对系统运行各项参数进行考察检测，保障好氧段水中溶氧≥2mg/L，且控制pH值在6-9之间，脱氮副球菌GBW-HB1904发酵菌液按照1‰的使用量进行投加。将培养好的脱氮副球菌GBW-HB1904发酵菌液，直接加入至渗滤液处理系统的好氧池中，并配合现场工艺的实际情况进行24h的内循环调试，随后逐步恢复系统正常运行状态；在每天固定时间对二沉池出水端的COD浓度进行跟踪检测，整个试验调试跟踪周期为7天。

试验结果如图4所示，在经过7天的现场应用试验跟踪调试后，添加所述脱氮副球菌GBW-HB1904发酵菌液的前3天内，处理系统出水COD的浓度开始快速下降，随后则维持在30mg/L以下，且从调试的第5天开始，该系统的出水COD浓度便已经低于标准要求的50mg/L以下，成功完成该菌针对垃圾渗滤液现场应用调试试验。

综上所述，本发明所述的脱氮副球菌GBW-HB1904在室内试验与现场应用评估结果中，均能够显著降解垃圾渗滤液中COD的含量，且适应系统能力强，启动快，效率高；另外，可以将脱氮副球菌GBW-HB1904制备成菌含量不少于1.0×10¹⁰CFU/mL的发酵菌液后，按照生化处理系统中好氧池容积的1-5‰的使用比例，直接加入污水生化处理系统的好氧池中即可，使用简单，且去除COD能力强，其符合市场应用预期及具备产业化价值。

以上实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其进行限制；尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的普通技术人员来说，依然可以对前述实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换；而这些修改或替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明所要求保护的技术方案的精神和范围。

Claims (10)

1.一株耐盐的脱氮副球菌GBW-HB1904，其特征在于，其分类命名为脱氮副球菌Paracoccus denitrificans，保藏编号为CGMCC No.20363。

2.根据权利要求1所述的脱氮副球菌GBW-HB1904，其特征在于，所述脱氮副球菌GBW-HB1904的菌落为圆形，乳白色，直径0.2-0.4mm，表面光滑湿润有光泽，中间略凸起，不透明，边缘整齐，无晕环。

3.根据权利要求1所述的脱氮副球菌GBW-HB1904，其特征在于，所述脱氮副球菌GBW-HB1904具有耐盐特性，能够生长的盐度范围为25～45‰。

4.根据权利要求1所述的脱氮副球菌GBW-HB1904，其特征在于，所述脱氮副球菌GBW-HB1904的最适的生长温度为28-32℃。

5.根据权利要求1所述的脱氮副球菌GBW-HB1904，其特征在于，所述脱氮副球菌GBW-HB1904的最适生长pH值为7.0-8.0。

6.根据权利要求1所述的脱氮副球菌GBW-HB1904，其特征在于，所述脱氮副球菌GBW-HB1904为兼性厌氧菌，其生长溶解氧浓度为0.2～4mg/L。

7.权利要求1-6任一项所述的脱氮副球菌GBW-HB1904在用于制备降解高盐垃圾渗滤液中COD的微生物菌剂中的应用。

8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，在应用时，将所述脱氮副球菌GBW-HB1904经发酵培养得到脱氮副球菌GBW-HB1904发酵菌液；所述发酵条件为：罐压0.1～0.2MPa，温度28～32℃，溶氧≥30％，搅拌速度180～200rpm，发酵时间20～24h。

9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于，所述脱氮副球菌GBW-HB1904发酵菌液的添加量为垃圾渗滤液处理生化系统中好氧池容积的1-5‰。

10.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，所述脱氮副球菌GBW-HB1904对垃圾渗滤液中COD的去除率高于92％。

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