CN101892163A - 一种沙门柏干酪青霉及其应用 - Google Patents
一种沙门柏干酪青霉及其应用 Download PDFInfo
- Publication number
- CN101892163A CN101892163A CN2010102118279A CN201010211827A CN101892163A CN 101892163 A CN101892163 A CN 101892163A CN 2010102118279 A CN2010102118279 A CN 2010102118279A CN 201010211827 A CN201010211827 A CN 201010211827A CN 101892163 A CN101892163 A CN 101892163A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- phosphonomycin
- described application
- substratum
- penicillium
- culture medium
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Granted
Links
Landscapes
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
Abstract
本发明提供了一种沙门柏干酪青霉(Penicillium camemberti),该菌株已于2010年6月2日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC),保藏编号为CGMCC No.3904。该菌株具有如下特征:菌株在PDA斜面上生长良好。在PDA上,菌落直径28mm左右,菌落灰绿色,质地短绒毛状,中心突起,气生菌丝白色,无褶皱,基内菌丝淡黄色,无溢出物。菌落在5℃、37℃条件下不生长。分生孢子梗光滑,柄长100~400μm,顶端膨大,直径约2~4μm,产孢结构多轮生,瓶梗安瓿瓶状,长7~10μm×2~2.5μm。分生孢子链生,椭圆形,直径3.0~3.5μm,光滑。本发明还提供了一种利用微生物生物转化右旋磷霉素制备药物左旋磷霉素的方法,该方法包括培养沙门柏干酪青霉,并从培养上清液中分离药物左旋磷霉素的步骤。
Description
技术领域:
本发明属于医药技术领域,涉及一种沙门柏干酪青霉及其应用,具体涉及一种沙门柏干酪青霉(Penicillium camemberti)及其利用沙门柏干酪青霉生物转化右旋磷霉素制备药物左旋磷霉素的方法。
背景技术:
磷霉素[(-)-(1R,2S)-1,2-环氧丙烯磷酸,(-)-(1R,2S)-1,2-epoxypropylphosphonicacid,fosfomycin,phosphonomycin,FOM]是一种抑制细菌细胞壁合成的临床常用的重要广谱抗生素,1969年由Hendlin等人自弗氏链霉菌中发现。它与丙酮酰转移酶共价结合,导致该酶不可逆失活,抑制N-乙酰胞壁酸的合成。磷霉素与其他抗生素无交叉耐药性,因而在临床上可用于耐药性金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、变形杆菌、绿脓杆菌及沙门氏菌等引起的感染,如:败血症、脑膜炎、肺炎及尿道、肠道、皮肤软组织等的感染。由于磷霉素的结构简单,目前工业上以化学全合成进行生产,得到磷霉素的外消旋体,经化学拆分,得到磷霉素,由顺丙烯磷酸(cis-propenylphosphonic acid,PPOH)到磷霉素的实际收率低于32%。由于右旋磷霉素完全废弃,加之需要大量的化学拆分试剂,造成资源浪费和环境污染。
上个世纪70年代开始就有很多研究开始关注于磷霉素的生物转化,因为通过生物转化法合成磷霉素,可用完整的微生物细胞或从微生物细胞中提取的酶作为生物催化剂,其区域和立体选择性强、反应条件温和、操作简便成本较低、公害小,因此倍受重视。但至今为止,大多数报道均以顺丙烯磷酸为底物进行生物转化(如表1所示),近两年才有报道以右旋磷霉素为底物进行生物转化的研究,但是转化率很低(只有5.41%),转化物浓度为0.27mg/ml【周丽沙;安海英;李慧;杨伟超;徐慧;史荣久.应用混合菌系实现右旋磷霉素手性生物转化的初步研究.生物技术通报,2008增刊,374-377.】。
表1部分已报道的可将顺丙烯磷酸转化为磷霉素的菌株
发明内容:
本发明的一个目的是提供一种微生物菌种沙门柏干酪青霉(Penicillium camemberti)。
本发明的另一个目的是提供了一种利用沙门柏干酪青霉生物转化右旋磷霉素制备药物左旋磷霉素的方法。
本发明的技术方案如下:
本发明所述的沙门柏干酪青霉(Penicillium camemberti),采自土壤中,经富集培养,筛选得到。该菌株已在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)保藏,保藏编号为:CGMCC No.3904。
该菌株具有如下特征:菌株在PDA斜面上生长良好。在PDA上,菌落直径28mm左右,菌落灰绿色,质地短绒毛状,中心突起,气生菌丝白色,无褶皱,基内菌丝淡黄色,无溢出物。菌落在5℃、37℃条件下不生长。分生孢子梗光滑,柄长100~400μm,顶端膨大,直径约2~4μm,产孢结构多轮生,瓶梗安瓿瓶状,长7~10μm×2~2.5μm。分生孢子链生,椭圆形,直径3.0~3.5μm,光滑。
该菌株具有如下转化特点:该菌产磷霉素的量随着底物浓度的增加而增加,但转化率下降,在底物浓度10mg/mL时,转化率为13.35%,但产物浓度高;在底物浓度3mg/mL时,转化率高达27.8%。
本发明还提供了一种利用沙门柏干酪青霉生物转化右旋磷霉素制备药物左旋磷霉素的方法,该方法包括培养沙门柏干酪青霉,并从培养上清液中分离药物左旋磷霉素的步骤。
(1)沙门柏干酪青霉的培养
培养所述的沙门柏干酪青霉的种子培养基为PDA完全培养基,含有马铃薯,葡萄糖。
其中,种子培养基中葡萄糖的最佳用量为培养基总体积的1%(重量/体积)。
种子培养基的最佳初始pH为6.8。
种子培养基的最佳接种量为1.6×108个孢子/30ml种子培养基。
种子培养基的培养温度为28℃
种子的最佳转种量为10%(体积/体积)
种子的最佳种龄为24h。
(2)培养上清液中分离药物左旋磷霉素
转化培养基为PDA培养基,含有马铃薯,底物右旋磷霉素。
其中,转化培养基中底物右旋磷霉素在转化培养基中的浓度为3mg/ml。
pH对转化的影响:转化培养基初始pH偏酸利于生物转化进行,转化培养基的最佳初始pH为5.7。
温度对转化的影响:转化培养基的最佳培养温度为28℃。
培养时间:转化培养4天~7天达到最高水平。
本发明的一个特点是,使用本发明所述真菌菌株可以对右旋磷霉素进行手性转化,且不需要在培养基中添加任何辅因子和钒酸,而且转化产物浓度高(达0.834~1.335mg/mL);相对应的,周丽沙等人报道的右旋磷霉素手性转化产物浓度只有0.27mg/mL,而且在培养的过程中不需要添加任何辅因子或者钒酸,故生产成本较低。
本发明的另一个特色在于,以工业上化学合成法制备磷霉素的废弃物-右旋磷霉素为底物,实现废弃物的生物转化,且转化产物为左旋磷霉素,增加工业产值的同时,避免了大量有机磷类污染物的排放和处理,具有降低环境污染和增加产值的双重效果,因此具有重要意义。
生物材料保藏说明:
本发明提供的沙门柏干酪青霉(Penicillium camemberti),保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC);地址:北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所(100101);保藏编号:CGMCC No.3904,保藏日期:2010年6月2日。
具体实施方式:
实施例一、磷霉素的制备
1、沙门柏干酪青霉(Penicillium camemberti),在PDA琼脂斜面上28℃培养24h。
2、种子培养基:葡萄糖10.0g,马铃薯浸汁定容至1L。pH6.8,121℃灭菌20min。马铃薯浸汁:去皮马铃薯200.0g,加蒸馏水1L煮沸30min,四层纱布过滤得浸汁。分装到250ml三角瓶中,每个三角瓶30ml。
3、转化培养基:右旋磷霉素复盐3.0g,马铃薯浸汁定容至1L。pH自然(pH5.7),121℃灭菌20min。马铃薯浸汁:去皮马铃薯200.0g,加蒸馏水1L煮沸30min,四层纱布过滤得浸汁。分装到250ml三角瓶中,每个三角瓶60ml。
4、把步骤1的菌株按照接种量1.62×108个孢子/瓶接种到步骤2中的种子培养基中,在28℃,280r/min的摇床上培养24h后按照转种量10%(体积/体积)接入3中,在28℃,280r/min的摇床上培养4-7d。
5、转化液抽滤获得上清液,经生物鉴定法测其产物含量,用旋转蒸发仪真空浓缩至原体积的1/10,12000rpm离心20min,弃沉淀,上清液待用。将上一步所得上清液,调pH至7.2~7.5后上样,500mL 717阴离子树脂上样体积为10mL,水洗2倍柱体积后,用2%NH4Cl溶液洗脱2倍柱体积,每1/10个柱体积(即50mL)接为一个馏分。所得馏分分别浓缩25倍,通过滤纸片法观察抑菌圈的有无并测量抑菌圈的大小,确定流出液中转化产物的量。合并上一步骤中有活性的组分,12000rpm离心20min,弃沉淀。上清pH调至5.5~6.0,按左旋产物量与α-(+)-苯乙胺摩尔比等于1∶1计算出α-(+)-苯乙胺的加入量,加入后真空浓缩除去80%的水,加入8倍体积的无水乙醇,4℃过夜析出沉淀。抽滤得沉淀,加无水乙醇洗涤2次,干燥后称重。以复盐∶NaOH=8∶9的比例加入到NaOH溶液中(NaOH∶H2O=1∶2),静置1~2h,分层后移走上层,在下层内加入732阳离子交换树脂28mg,静态吸附20min,抽滤除去树脂。所得溶液加入8倍体积的无水乙醇,结晶,测其旋光度,得磷霉素粗品。
实施例二、磷霉素的检测与鉴定
1、指示菌培养与悬液的配制
指示菌:藤黄微球菌
培养基:蛋白胨10.0g、酵母粉5.0g、NaCl 10.0g、琼脂20.0g,蒸馏水定容至1L。pH7.2~7.4,121℃灭菌20min后,摆斜面备用。
指示菌的培养:37℃培养24h,菌苔呈黄色。
指示菌悬液的配制:取生长状况良好的一支斜面,加入无菌的生理盐水,用竹签轻轻将菌苔刮下,待OD600达到0.2-0.3,转移至无菌的空瓶中,4℃保存备用。2、生物检定培养基及其鉴定平板的制备
生物检定培养基:蛋白胨10.0g、酵母粉5.0g、NaCl 10.0g、琼脂20.0g,蒸馏水定容至1L。pH 7.2~7.4,121℃灭菌20min;
将灭菌后的上述培养基200mL倒入无菌的鉴定盘中,制成下层平板;在灭菌后冷却至40℃左右的100ml上述培养基中加入指示菌悬液,摇匀后倒入上述鉴定盘中,制成上层平板。
磷霉素检测:将10ul样品加于直径8mm的圆形滤纸片上,吹干,贴于含指示菌的鉴定盘上,37℃倒置培养24h,磷霉素可产生清晰透明的抑菌圈。抑菌圈的直径与磷霉素浓度的对数在一定范围内成正比,据此可得磷霉素浓度标准曲线。按照此标准曲线可计算磷霉素的浓度。
3、薄层色谱和生物显影结合鉴定转化产物
将样品进行薄层层析,展开剂为正丁醇∶甲醇∶水=4∶3∶2(体积比)。展开后的层析板风干,置于生物鉴定平板上,完全浸润后放置1h,将层析板取下,生物鉴定平板37℃倒置培养24h,观察并测量抑菌圈直径和位置,比较样品与磷霉素标准品的Rf,磷霉素标准品Rf为0.51,从而鉴定转化产物。
实施例三、影响转化的因素
1、投料时间对生物转化的影响
投料时间是影响生物转化的最重要因素之一,表2显示在底物浓度为3.0mg/mL时,投料时间和转化率的关系。
表2不同投料时间与转化的关系
2、底物投料量对生物转化的影响
底物浓度也是影响生物转化的重要因素之一,表3部分显示了底物浓度和转化的关系。
表3不同底物浓度与转化的关系
3、转化时间对转化的影响
确定合适的转化终点,对提高产物的生产能力和经济效益是很重要的。表4显示,在底物浓度为3.0mg/mL时转化时间和转化的关系。
表4转化时间与转化的时间的关系
总结上述实验数据,可以看出,右旋磷霉素的手性转化率受到底物浓度、投料时间和转化时间的影响很大,其中以底物投料量为3.0mg/mL时、在转化的开始阶段加入、转化时间为4天,转化物的产量较大,为最佳的选择方案。
Claims (13)
1.一种沙门柏干酪青霉(Penicillium camemberti),其特征在于,其保藏编号为CGMCCNo.3904。
2.一种沙门柏干酪青霉的应用,其特征在于,所述的沙门柏干酪青霉通过生物转化右旋磷霉素制备药物左旋磷霉素,包括培养沙门柏干酪青霉和从培养上清液中分离药物左旋磷霉素两个步骤。
3.按照权利要求2所述的应用,其特征在于,培养沙门柏干酪青霉的种子培养基为PDA完全培养基,含有马铃薯,葡萄糖;从培养上清液中分离药物左旋磷霉素中的转化培养基为PDA培养基,含有马铃薯,底物右旋磷霉素。
4.按照权利要求3所述的应用,其特征在于,种子培养基中葡萄糖的用量为培养基总体积的1%(重量/体积)。
5.按照权利要求3所述的应用,其特征在于,种子培养基的初始pH为6.8。
6.按照权利要求3所述的应用,其特征在于,种子培养基的接种量为1.6×108个孢子/30ml种子培养基。
7.按照权利要求3所述的应用,其特征在于,种子培养基的培养温度为28℃
8.按照权利要求3所述的应用,其特征在于,种子的转种量为10%(体积/体积)
9.按照权利要求3所述的应用,其特征在于,种子的种龄为24h。
10.按照权利要求3所述的应用,其特征在于,底物右旋磷霉素在转化培养基中的浓度为0.3%(重量/体积)。
11.按照权利要求3所述的应用,其特征在于,转化培养基的初始pH为5.7。
12.按照权利要求3所述的应用,其特征在于,转化培养基的培养温度为28℃。
13.按照权利要求3所述的应用,其特征在于,转化时间为4-7天。
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
CN 201010211827 CN101892163B (zh) | 2010-06-29 | 2010-06-29 | 一种沙门柏干酪青霉及其应用 |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
CN 201010211827 CN101892163B (zh) | 2010-06-29 | 2010-06-29 | 一种沙门柏干酪青霉及其应用 |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
CN101892163A true CN101892163A (zh) | 2010-11-24 |
CN101892163B CN101892163B (zh) | 2013-07-31 |
Family
ID=43101511
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
CN 201010211827 Expired - Fee Related CN101892163B (zh) | 2010-06-29 | 2010-06-29 | 一种沙门柏干酪青霉及其应用 |
Country Status (1)
Country | Link |
---|---|
CN (1) | CN101892163B (zh) |
Cited By (3)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN113039267A (zh) * | 2018-11-16 | 2021-06-25 | 赛文西亚公司 | 沙门柏干酪青霉的新菌株 |
US11920126B2 (en) | 2018-03-28 | 2024-03-05 | Ecovative Design Llc | Bio-manufacturing process |
US11932584B2 (en) | 2006-12-15 | 2024-03-19 | Ecovative Design Llc | Method of forming a mycological product |
Citations (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN101153302A (zh) * | 2007-08-24 | 2008-04-02 | 中国科学院沈阳应用生态研究所 | 一种把右旋磷霉素转变为左旋磷霉素的方法 |
-
2010
- 2010-06-29 CN CN 201010211827 patent/CN101892163B/zh not_active Expired - Fee Related
Patent Citations (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN101153302A (zh) * | 2007-08-24 | 2008-04-02 | 中国科学院沈阳应用生态研究所 | 一种把右旋磷霉素转变为左旋磷霉素的方法 |
Non-Patent Citations (1)
Title |
---|
陈奕等: "侵袭性感染丝状真菌的分子鉴定", 《诊断学理论与实践》 * |
Cited By (3)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US11932584B2 (en) | 2006-12-15 | 2024-03-19 | Ecovative Design Llc | Method of forming a mycological product |
US11920126B2 (en) | 2018-03-28 | 2024-03-05 | Ecovative Design Llc | Bio-manufacturing process |
CN113039267A (zh) * | 2018-11-16 | 2021-06-25 | 赛文西亚公司 | 沙门柏干酪青霉的新菌株 |
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
CN101892163B (zh) | 2013-07-31 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
CN101186932B (zh) | 一种液体发酵法同时生产竹红菌素和竹黄多糖的方法 | |
CN101914478B (zh) | 一种枯草芽孢杆菌及其应用 | |
CN106978350A (zh) | 一株黑曲霉及其在普洱茶素类化合物的制备中的应用 | |
CN1232632C (zh) | 蝉拟青霉新菌株apc-20及其人工培养发酵方法 | |
CN102660519A (zh) | 一种利用发酵废液制备生物酶的方法 | |
CN103255061B (zh) | 灰黄青霉、由其产生的抗菌活性化合物及应用 | |
CN103898004A (zh) | 假诺卡氏菌及其发酵生产骨化二醇的方法 | |
CN103305430B (zh) | 一株产漆酶齿毛菌及其应用 | |
CN1821383A (zh) | 木霉菌液体深层发酵生产厚垣孢子的方法 | |
CN114381378A (zh) | 降解木质素的产黄青霉及其应用 | |
CN102634460B (zh) | 米根霉rh1-5及其分离培养方法 | |
CN101892163B (zh) | 一种沙门柏干酪青霉及其应用 | |
CN108823110B (zh) | 一株产灰黄霉素的菌株及其应用 | |
CN108841889B (zh) | 利用微生物发酵生产松刚霉素主份——灰黄霉素的方法 | |
CN102399839B (zh) | 一种冷解糖芽孢杆菌胞外多糖的生产工艺 | |
CN1124350C (zh) | 草酸青霉亚美尼亚变种的菌株及其应用 | |
CN106613276A (zh) | 一种青蒿幼苗培育方法及其专用深绿木霉菌肥 | |
CN105296357B (zh) | 一种通过补料提高冬虫夏草菌液体发酵菌丝体产量的方法 | |
CN102286402B (zh) | 产acc脱氨酶并拮抗多种病原真菌的大豆根际固氮菌及其用途 | |
CN1242055C (zh) | 万古霉素产生菌及其应用 | |
CN101875905B (zh) | 一株高产竹红菌素的毛竹种子内生真菌菌株及其应用 | |
CN103305481B (zh) | 一种发酵齿毛菌生产漆酶的方法 | |
CN104726379A (zh) | 一株生物农药武夷菌素的高产菌株w-273及其应用 | |
CN101265459B (zh) | 一种蜡状芽孢杆菌cpu0029菌株及用它制备石斛类生物碱的方法 | |
CN101280333B (zh) | 一种利用灰玫瑰青霉制备青霉源性抗菌肽的方法 |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
C06 | Publication | ||
PB01 | Publication | ||
C10 | Entry into substantive examination | ||
SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
C14 | Grant of patent or utility model | ||
GR01 | Patent grant | ||
CF01 | Termination of patent right due to non-payment of annual fee |
Granted publication date: 20130731 Termination date: 20180629 |
|
CF01 | Termination of patent right due to non-payment of annual fee |