CN114381378A - 降解木质素的产黄青霉及其应用 - Google Patents

降解木质素的产黄青霉及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一株降解木质素的产黄青霉，名称为AF06，分类命名为：产黄青霉(Penicillium chysogenum)，保藏号为CGMCC No.22468，保藏日期为：2021年7月8日，保藏单位为：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，北京市朝阳区北辰西路1号院3号。本发明菌株具有生产速率快、易培养，对小麦秸秆、玉米秸秆与水稻秸秆的木质素降解率分别为46.5％、52.0％与49.1％，且半纤维素、纤维素留存率高，优于已报道菌株，可在农作物秸秆肥料化、饲料化以及农业环境保护等方面具有广泛的应用前景。

Description

降解木质素的产黄青霉及其应用
技术领域
本发明属于微生物技术领域，尤其是一株降解木质素的产黄青霉及其应用。
背景技术
我国是农业大国，也是秸秆资源最丰富的国家之一，年产各类秸秆约6.4亿吨(其中水稻、玉米和小麦秸占76.1％)，占世界秸秆总产量的20-30％。农作物秸秆资源的科学开发利用，不但可以缓解农村饲料、肥料、燃料和工业原料的紧张状况，又是保护农村生态环境、促进农业可持续协调发展的迫切要求。然而，农作物秸秆富含木质素，其化学结构为苯丙烷类的高分子聚合物，机械强度较高，与半纤维素相互交联，并将纤维素镶嵌于内，形成坚固的酯键或醚键，形成一种致密的外围基质，阻碍微生物和酶对纤维素和半纤维素的降解。所以，秸秆细胞壁的这种木质素－纤维素－半纤维素的特殊复合体限制了动物微生物对纤维素、半纤维素等成分的降解和利用，使得秸秆细胞内的营养物质不能被释放出来，从而导致秸秆的消化率低。因此，提高秸秆消化率的关键是降解木质素，打断酯键或醚键。
近几十年来国内外学者开展了大量研究，一致认为利用白腐真菌高效降解木质素的特性，可有效提高秸秆的营养价值，是最有希望和潜力的解决秸秆资源化利用的途径。但是白腐真菌在实际生产中的应用，由于受到生产速率慢，营养要求高，发酵周期长等诸多局限，并未实现大范围的应用。因此，寻找其他类型新的木质素高效降解菌株依然收到极大的关注。
通过检索，尚未发现与本发明专利申请相关的专利公开文献。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术的不足之处，提供一株降解木质素的产黄青霉及其应用。
本发明解决技术问题所采用的技术方案是：
一株降解木质素的产黄青霉，名称为AF06，分类命名为：产黄青霉(Penicilliumchysogenum)，保藏编号为CGMCC No.22468，保藏日期为：2021年7月8日，保藏单位为：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，北京市朝阳区北辰西路1号院3号。
进一步地，所述菌株生长速度较快，易培养，对秸秆木质素的降解率最高可达65.8％。
进一步地，所述菌株AF06的rDNA-ITS序列为SEQ ID NO.1。
包含如上所述的降解木质素的产黄青霉的木质素降解菌剂。
进一步地，所述木质素降解菌剂还包括培养基，所述培养基含麸皮和葡萄糖。
如上所述的木质素降解菌剂的制备方法，步骤如下：
用接种环，从斜面保藏菌株中挑取产黄青霉(Penicillium chysogenum)AF06孢子，接种于无菌水中，并转移至无菌喷壶中，在无菌条件下以喷洒形式接种到灭菌的麸皮培养基中，加盖无菌纱布在霉菌培养箱中28℃培养3天。培养结束后，取麸皮培养菌剂到真空冷冻干燥箱中去除水分后，菌剂中活菌数为1010个/g以上，即得木质素降解菌剂；
其中，所述麸皮培养基的配方为：粉碎后的0.2-0.5cm的麸皮1kg，添加葡萄糖2g，加自来水0.6L，让麸皮充分吸水后，121℃灭菌30分钟。
如上所述的降解木质素的产黄青霉在木质素降解方面中的应用。
本发明取得的有益效果是：
1、本发明提供了一种木质素降解真菌产黄青霉(Penicillium chysogenum)AF06，该菌株具有生产速率快、易培养，对小麦秸秆、玉米秸秆与水稻秸秆的木质素降解率分别为56.5％、65.8％与49.1％，且半纤维素、纤维素留存率高，优于已报道菌株，可在农作物秸秆肥料化、饲料化以及农业环境保护等方面具有广泛的应用前景。
2、本发明产黄青霉Penicillium chysogenumAF06可以应用于农业资源环境领域，可以用于降解秸秆中木质素，优选得到的的产黄青霉Penicillium chysogenum AF06，生产速度快，易培养，作为单一菌株以0.5％接种量与秸秆木质素进行共代谢28d，对木质素降解率最高可达65.8％)，且纤维素、半纤维素留存率高，优于已报道的真菌菌株。
3、本发明菌株在贫营养条件下对秸秆木质素有较高的降解作用，具有广泛的应用前景。
4、本发明从林地腐木中筛选得到高降解性能的木质素菌种，其在农作物秸秆肥料化、饲料化以及环境保护等方面具有很大的意义。
附图说明
图1为本发明中产黄青霉(Penicillium chysogenum)AF06在PDA培养基上的菌落形态及显微特征图；其中，左图为菌落形态图，右图为显微特征图；
图2为本发明中产黄青霉(Penicillium chysogenum)AF06产生的木质素过氧化物(Lip)、漆酶(Lac)与锰过氧化物酶(MnP)活性图；
图3为本发明产黄青霉(Penicillium chysogenum)AF06对秸秆木质素(小麦秸秆、玉米秸秆、水稻秸秆)的降解率图；
图4为本发明中皿内显色平板初筛结果图；其中，图从上至下依次为PDA-α-萘酚平板显色初筛结果图、PDA-氯化锰平板显色初筛结果图、PDA-天青B平板显色初筛结果图。
具体实施方式
为更好理解本发明，下面结合实施例对本发明做进一步地详细说明，但是本发明要求保护的范围并不局限于实施例所表示的范围。
本发明中所使用的的原料，如无特殊说明，均为常规市售产品，本发明中所使用的方法，如无特殊说明，均为本领域常规方法，本发明所使用的各物质质量均为常规使用质量。
一株降解木质素的产黄青霉，名称为AF06，分类命名为：产黄青霉(Penicilliumchysogenum)，保藏编号为CGMCC No.22468，保藏日期为：2021年7月8日，保藏单位为：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，北京市朝阳区北辰西路1号院3号。
较优地，所述菌株生长速度较快，易培养，对秸秆木质素的降解率最高可达65.8％。
较优地，所述菌株AF06的rDNA-ITS序列为SEQ ID NO.1。
包含如上所述的降解木质素的产黄青霉的木质素降解菌剂。
较优地，所述木质素降解菌剂还包括培养基，所述培养基含麸皮和葡萄糖。
如上所述的木质素降解菌剂的制备方法，步骤如下：
用接种环，从斜面保藏菌株中挑取产黄青霉(Penicillium chysogenum)AF06孢子，接种于无菌水中，并转移至无菌喷壶中，在无菌条件下以喷洒形式接种到灭菌的麸皮培养基中，加盖无菌纱布在霉菌培养箱中28℃培养3天。培养结束后，取麸皮培养菌剂到真空冷冻干燥箱中去除水分后，菌剂中活菌数为1010个/g以上，即得木质素降解菌剂；
其中，所述麸皮培养基的配方为：粉碎后的0.2-0.5cm的麸皮1kg，添加葡萄糖2g，加自来水0.6L，让麸皮充分吸水后，121℃灭菌30分钟。
如上所述的降解木质素的产黄青霉在木质素降解方面中的应用。
具体地，相关的制备及检测如下：
本发明从四川省成都市林地腐木分离得到一株产黄青霉(Penicilliumchysogenum)AF06，分别进行了形态学和分子生物学方法鉴定。形态学分析包括平板培养特征与显微特征鉴定，分子生物学方法选择真菌基因组中ITS段基因扩增测序，结果显示，与产黄青霉(Penicillium chysogenum)基因高度同源。名称为AF06，分类命名为：产黄青霉(Penicillium chysogenum)，保藏号为CGMCC No.22468，保藏日期为：2021年7月8日，保藏单位为：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，北京市朝阳区北辰西路1号院3号。
本发明在实验室条件研究了产黄青霉(Penicillium chysogenum)AF06产木质素过氧化物酶、漆酶、锰过氧化物酶等三种木质素降解的关键酶活性以及对小麦秸秆、玉米秸秆、水稻秸秆三种常见秸秆降解情况，为该菌株在秸秆肥料化、饲料化、农业环境保护领域的应用提供了科学依据。
上述菌株筛选、产酶特性、以及对秸秆的降解试验步骤如下：
(1)样品采集与分离纯化
采集腐木于无菌保藏袋中，低温带回实验室。用0.1％的升汞溶液进行样品表面消毒20分钟，已去除样品表面粘附的杂菌。然后在超净工作台中用解剖刀纵切样品，将切面在无菌操作下插入马铃薯葡萄糖琼脂培养基(PDA)培养5天。通过以上步骤，从发软的腐木中分离到一株真菌，用接种环挑取样品四周长出的菌丝至PDA培养基上，28℃培养3天，重复该步骤3次，获得纯培养。
(2)产木质素降解酶菌株筛选
A、皿内显色平板初筛：
采用PDA-天青B平板、PDA-氯化锰平板以及PDA-α-萘酚三种显色平板作为筛选培养基对分离得到的菌株进行定性筛选。若菌株在PDA-天青B上产生无色或微黄色脱色圈的或在PDA-氯化锰平板产生黑棕色显色环或PDA-α-萘酚平板上产生棕色显色圆环即可初步断定为木质素降解菌株。如图4所示，结果显示分离的菌株在采用PDA-天青B平板与PDA-α-萘酚平板上有明显的显色圈，表明该菌株有降解木质素的潜力，初步编号为AF06。
B、木质素降解酶活试验复筛
采用液体培养方法，取在PDA平板上培养5d的初筛菌株，接种与产酶液体培养基中(Kirk培养基中)，28℃，110r·min-1恒温振荡恒温培养，定期取培养液分别定量测定木质素过氧化物酶、锰过氧化物酶以及漆酶活性。三种酶活性中任一活性较高，即可确定该菌株AF06可降解木质素。
①木质素过氧化物酶活性定量测定方法(LiP)：
定量反应混合液3mL：2.3mL的0.5mol/L的酒石酸钠缓冲成分(pH4.0)，0.1mL的1.2mmol/L的亚甲基蓝，0.5mL酶液，加0.1mL的2.7mmol/L的H2O2启动反应。对照中用0.5mL的蒸馏水取代酶液。测定反应液5min内的吸光度变化值。基本原理是在664nm处测定吸光度的减少，根据每分钟吸光度的变化，标志LiP量的增加，一个酶活单位定义为每毫升反应液中每分钟引起波长664nm处吸光度减少0.1单位变化所需要的酶液量。(在Lip的催化下，亚甲基蓝发生脱甲基反应，转化为天青C(Azure C)；亚甲基蓝由略显绿的蓝色，变为紫蓝色的天青C)。
锰过氧化物酶活性测定方法(MnP)：
共4mL反应液。取50mmol·L-1的乳酸钠缓冲液(pH4.5)3.4mL，1.6mmol·L-1的MnSO4溶液0.1mL，0.4mL的粗酶液，加入到试管中。预热至37℃时，加入1.6mmol·L-1H2O2溶液0.1mL启动反应，测240nm处反应4min内OD改变值。以煮沸灭活15min酶液作对照，以蒸馏水代替H2O2溶液作对照。测定对照用蒸馏水。酶活定义为：每升反应液中每分钟使1μmol·L-1的Mn2+转化为Mn3+所需的酶量为1个酶活单位。
漆酶活性测定方法(Lac)：
取比色管，分别加入3.0mL0.1 mmol·L-1醋酸钠缓冲液(pH4.6)、0.5mL3.36mmol·L-1邻联甲苯胺、和0.5mL酶液，混合均匀后，于28℃反应10min，在600nm测吸光值。酶活以吸光率的增值表示。一个酶活单位定义每分钟以ΔA＝0.1规定为一个酶活单位。以0.1mL蒸馏水代替酶液作对照。
木质素降解酶活性测定结果见图2，结果表明，该菌株的产漆酶和木质素过氧化物酶活性较高，且酶活性持续时间较长，是一株优良的木质素降解菌株。
(3)秸秆木质素降解试验
A、菌剂的制备
用接种环，从斜面保藏菌株中挑取产黄青霉(Penicillium chysogenum)AF06孢子，接种于无菌水中，并转移至无菌喷壶中，在无菌条件下以喷洒形式接种到灭菌的麸皮(配方如下)培养基中(盛放于无菌金属托盘中)，加盖无菌纱布在霉菌培养箱中28℃培养3天。培养结束后，取麸皮培养菌剂到真空冷冻干燥箱中去除水分后，即可作为生产型接种菌剂。制备的菌剂经稀释平板法测定活菌数为1010个/g以上。
麸皮培养基配方为：粉碎后的麸皮(0.2-0.5cm)1kg，添加葡萄糖2g，加自来水0.6L，让麸皮充分吸水后121℃灭菌30分钟备用。
B、秸秆木质素降解
将制备的产黄青霉(Penicillium chysogenum)AF06菌剂按0.5％接种量的接种于秸秆降解培养基中，于28℃恒温保湿培养，28天后取出样品测定木质素降解率、半纤维素降解率、纤维素降解率。
秸秆降解培养基配方为：秸秆(粉碎至0.5-1cm)100g，葡萄糖1g，添加自来水60mL，充分吸水后121℃灭菌30分钟备用。
试验结果：显示菌株对小麦秸秆、玉米秸秆、水稻秸秆的木质素降解率分别为57.5％、65.8与49.1％(见图3)，且对半纤维素、纤维素的留存率均在30％以下，是一株优良的秸秆木质素降解菌株，具有应用前景。
(4)菌株鉴定
菌株的鉴定采用菌落特征和显微特征观测与rDNA-ITS分子生物学共同鉴定。
A、菌落特征：菌落平坦，质地丝绒状兼有絮状，深灰绿色，边缘白色，表面有少许黄褐色渗出液；菌落背面茶褐色，无水溶性色素。
B\显微特征：营养菌丝壁光滑，无色，具分隔，宽1.5-2.4μm，分生孢子大量产生，帚状枝轮生，梗基每轮3-5个，产孢瓶梗安瓿形，梗颈较短，顶端渐细，4.8-8.3×1.5-2.1μm；分生孢子串生，球形，近球形到宽椭圆形，淡绿色，壁光滑，直径1.6-2.7×2.5μm。
可以如图1所示。
rDNA-ITS序列如下所示：
GAGGTCACCTGGATAAAATTTGGGTTGATCGGCAAGCGCCGGCCGGGCCTACAGANCGGGTGACAAAGCCCCATACGCTCGAGGACCGGACGCGGTGCGCCGCTGCCTTTCGGGCCCGTCCCCCGGGATCGGAGGACGGGGCGCAATGTGCGTTCAAAGACTCGATGATTCACTGAATTTGCAATTCACATTACGTATCGCATTTCGCTGCGTTCTTCATCGATGCCGGAACCAAGAGATCCGTTGTTGAAAGTTTTAAATAATTTATATTTTCACTCAGACTACAATCTTCAGACAGAGTTCGAGGGTGTCTTCGGCGGGCGCGGGCCCGGGGGCGTAAGCCCCCGGCGGCCAGTTAAGGCGGGCCCGCCGAAGCAACAAGGTAAAATAAACACGGGTGGGAGGTTGGACCCAGAGGGCCCTCACTCGGTAATGATCCTTCCGCAGGTTCACCTACGGAAACCTTGTT
尽管为说明目的公开了本发明的实施例，但是本领域的技术人员可以理解：在不脱离本发明及所附权利要求的精神和范围内，各种替换、变化和修改都是可能的，因此，本发明的范围不局限于实施例所公开的内容。
序列表
<110> 农业农村部环境保护科研监测所
<120> 降解木质素的产黄青霉及其应用
<160> 1
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 469
<212> DNA
<213> 菌株AF06的rDNA-ITS序列(Unknown)
<400> 1
gaggtcacct ggataaaatt tgggttgatc ggcaagcgcc ggccgggcct acagancggg 60
tgacaaagcc ccatacgctc gaggaccgga cgcggtgcgc cgctgccttt cgggcccgtc 120
ccccgggatc ggaggacggg gcgcaatgtg cgttcaaaga ctcgatgatt cactgaattt 180
gcaattcaca ttacgtatcg catttcgctg cgttcttcat cgatgccgga accaagagat 240
ccgttgttga aagttttaaa taatttatat tttcactcag actacaatct tcagacagag 300
ttcgagggtg tcttcggcgg gcgcgggccc gggggcgtaa gcccccggcg gccagttaag 360
gcgggcccgc cgaagcaaca aggtaaaata aacacgggtg ggaggttgga cccagagggc 420
cctcactcgg taatgatcct tccgcaggtt cacctacgga aaccttgtt 469

Claims (7)

1.一株降解木质素的产黄青霉，其特征在于：名称为AF06，分类命名为：产黄青霉(Penicillium chysogenum)，保藏编号为CGMCC No.22468，保藏日期为：2021年7月8日，保藏单位为：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，北京市朝阳区北辰西路1号院3号。
2.根据权利要求1所述的降解木质素的产黄青霉，其特征在于：所述菌株生长速度较快，易培养，对秸秆木质素的降解率最高可达65.8％。
3.根据权利要求1或2所述的降解木质素的产黄青霉，其特征在于：所述菌株AF06的rDNA-ITS序列为SEQ ID NO.1。
4.包含如权利要求1至3任一项所述的降解木质素的产黄青霉的木质素降解菌剂。
5.根据权利要求4所述的木质素降解菌剂，其特征在于：所述木质素降解菌剂还包括培养基，所述培养基含麸皮和葡萄糖。
6.如权利要求4或5所述的木质素降解菌剂的制备方法，其特征在于：步骤如下：
用接种环，从斜面保藏菌株中挑取产黄青霉(Penicillium chysogenum)AF06孢子，接种于无菌水中，并转移至无菌喷壶中，在无菌条件下以喷洒形式接种到灭菌的麸皮培养基中，加盖无菌纱布在霉菌培养箱中28℃培养3天。培养结束后，取麸皮培养菌剂到真空冷冻干燥箱中去除水分后，菌剂中活菌数为1010个/g以上，即得木质素降解菌剂；
其中，所述麸皮培养基的配方为：粉碎后的0.2-0.5cm的麸皮1kg，添加葡萄糖2g，加自来水0.6L，让麸皮充分吸水后，121℃灭菌30分钟。
7.如权利要求1至3任一项所述的降解木质素的产黄青霉在木质素降解方面中的应用。
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