CN101186938B - 一种右旋生物素中间体内酯的制备方法 - Google Patents
一种右旋生物素中间体内酯的制备方法 Download PDFInfo
- Publication number
- CN101186938B CN101186938B CN2006101548324A CN200610154832A CN101186938B CN 101186938 B CN101186938 B CN 101186938B CN 2006101548324 A CN2006101548324 A CN 2006101548324A CN 200610154832 A CN200610154832 A CN 200610154832A CN 101186938 B CN101186938 B CN 101186938B
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- lactone
- enzyme
- dextral
- reaction
- zymin
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Active
Links
Classifications
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
- Y02P—CLIMATE CHANGE MITIGATION TECHNOLOGIES IN THE PRODUCTION OR PROCESSING OF GOODS
- Y02P20/00—Technologies relating to chemical industry
- Y02P20/50—Improvements relating to the production of bulk chemicals
- Y02P20/52—Improvements relating to the production of bulk chemicals using catalysts, e.g. selective catalysts
Landscapes
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
Abstract
本发明提供了一种右旋生物素中间体内酯的制备方法,所述方法是以消旋生物素中间体内酯1(tetrahydro-1,3-bis(phenylmethyl)-1H-Furo[3,4-d]imidazole-2,4-dione)水解得到的外消旋有机酸2(1,3-dibenzyl-5-(hydroxymethyl)-2-oxo-4-Imidazolidinecarboxylic acid)为反应底物,在内酯合成酶作用下选择性进行合成右旋生物素中间体内酯,所述内酯合成酶来自下列之一:①猪肝酯酶、②胰酶、③米曲霉脂肪酶、④黑曲霉脂肪酶、⑤黄曲霉脂肪酶、⑥青霉脂肪酶、⑦华根霉脂肪酶、⑧酵母脂肪酶。本发明所述右旋生物素中间体内酯的制备方法的有益效果主要体现在:拆分专一性强,拆分率高,大大降低了生产成本,操作简单,环境污染小,适合工业化生产。
Description
(一)技术领域
本发明涉及一种右旋生物素中间体内酯的制备方法,尤其是一种以外消旋生物素中间体内酯(tetrahydro-1,3-bis(phenylmethyl)-1H-Furo[3,4-d]imidazole-2,4-dione)水解后得到的外消旋有机酸(1,3-dibenzyl-5-(hydroxymethyl)-2-oxo-4-Imidazolidinecarboxylic acid)为反应底物,在内酯合成酶作用下选择性进行合成右旋生物素中间体内酯的方法。
(二)背景技术
生物素(Biotin)[CAS:5828525]又名维生素H(Vitamin H)或维生素B7和辅酶R(Coenzyme R),是一种重要水溶性B簇维生素。生物素广泛应用于医疗、多维制剂及饲料添加剂方面,尤其是配制饲料的关键组分之一。生物素是脂肪酸合成和糖代谢羧化酶的辅酶,是整个生物界所必需的,在糖质新生和氨基酸代谢中也相当重要。除了一部分细菌,酵母和植物能自身合成生物素外,几乎所有的动物和一部分微生物都要从外源获得生物素。生物素用途广泛,20-30%用于医用原料,50%用于饲料,另外还用作化妆品原料等等。d-生物素在世界上的需求量相当大,光学纯的右旋生物素中间体内酯是生产d-生物素的重要中间体。
如式1,式1a/b为外消旋内酯1,3-二苄基-六氢-1H-呋喃并[3,4-d]咪唑-2,4-二酮,其中右旋内酯1a是生产d-生物素的重要中间体;式2为内酯水解后得到的有机酸。
(1a为右旋体内酯,1b左旋体内酯,2为内酯水解后的有机酸)
中间体内酯的合成目前采用化学法,但此法工艺复杂,拆分不完全,造成原料浪费,本较高。经拆分后得到右旋体和左旋体的混旋物,该混旋物作为废弃物处理,造成了原料的极大浪费和环境污染。对该混旋物进行生物酶法拆分,得到光学纯的右旋体,不仅可以大大降低d-生物素的生产降低成本,而且环境友好,具有显著效果,符合绿色、环保的可持续发展战略,具有良好的社会经济效益,发展前景广阔。
以前一直采用化学法拆分,如陈芬儿等采用化学晶析法拆分得到e.e值为40%左右的混旋体内酯,其工艺复杂,且拆分不完全,造成原料浪费,成本较高。但到目前为止,生物素的合成方法有很多,但大部分方法都由于成本过高,不适宜工业化。所以若在前几步就得到光学活性的中间体,并能在反应过程中保持其构型,从而直接得到d(+)-生物素,也就是d-生物素,可大大降低成本。1970年,Roche公司的Gerecke等报道了原Goldberg-Stembach路线的一个重要进展:光学活性的内酯2与硫代乙酸钾,在DMF中,于150℃下反应,能保持构型,并以较高收率得到光学活性的硫代内酯3。利用3,可以不经拆分直接合成d-生物素。于是,光学活性的内酯2的合成就显得极为重要。右旋生物素中间体内酯的制备方法有以下几种:
已报道的内酯1的合成方法主要有:(1)化学拆分;(2)不对称合成;(3)生物合成。
1、化学方法拆分,如用光活性醇薄荷醇,或手性胺麻黄碱拆分前体物质,再转化得到右旋生物素中间体内酯,化学拆分法的缺点是拆分剂价格昂贵,分离不完全,还有环境污染和毒性问题;
2、物理方法拆分,如用诱导结晶拆分前体单甲酯,再还原得到右旋生物素中间体内酯,条件控制要求高,光学纯度差,收率低。
3、生物法拆分,如用猪肝酯酶不对称水解前手性二酯得到光学活性的单酯,再还原得到右旋生物素中间体内酯。此方法的缺点是工艺较复杂,得率低,光学纯度不高。
具体生物拆分法(见下式)是利用猪肝酯酶(PLE)不对称水解前手性二酯4[和6来合成内酯2的方法。PLE能优先水解4的(S)-氨基酸酯部分从而得到手性单酯5,进一步用LiBH4还原,就可得到2。在上述报道中,水解收率为85%,还原收率为64%,产品e.e.值为75%。利用6来合成内酯2的方法是:PLE催化二乙酯6得到醇7(收率70%;e.e.值92%),表明前(R)-构型的乙氧基已优先断裂了。7经Jones氧化,碱水解及内酯化作用得到2。
生物法发酵生产生物素已取得了一定进展,与化工合成生产生物素相比,其优势日益突出,但以生物技术方法获得基因工程菌,价格仍然昂贵,现在还处于小试研究阶段,要实现工业化,产量仍然有待于提高,很多技术问题还有待于解决。
(三)发明内容
本发明的目的是为了解决上述方法的不足,通过筛选微生物酶,提供了一种以外消旋生物素中间体内酯水解后得到的外消旋有机酸为反应底物,在内酯合成酶作用下选择性进行合成右旋生物素中间体内酯的方法。
为达到发明目的本发明采用的技术方案是:
一种右旋生物素中间体内酯的制备方法,所述方法是以消旋生物素中间体内酯1(tetrahydro-1,3-bis(phenylmethyl)-1H-Furo[3,4-d]imidazole-2,4-dione)水解得到的外消旋有机酸2(1,3-dibenzyl-5-(hydroxymethyl)-2-oxo-4-Imidazolidinecarboxylic acid)为反应底物,在内酯合成酶作用下选择性进行合成右旋生物素中间体内酯,所述内酯合成酶来自下列之一:①猪肝酯酶、②胰酶、③米曲霉脂肪酶、④黑曲霉脂肪酶、⑤黄曲霉脂肪酶、⑥青霉脂肪酶、⑦华根霉脂肪酶、⑧酵母脂肪酶;
本发明流程见下式和图1。其中rac-1为化学法拆分后的消旋体,在碱性条件下自发水解得到有机酸rac-2,经酯酶拆分后得到光学纯的右旋体内酯d-1和左旋的酸l-2。
所述内酯合成酶优选来自来自米曲霉WZ007(Aspergillus oryzaeWZ007),保藏于中国典型培养物保藏中心,保藏编号CCTCC No:M206105,保藏日期2006年10月8日。所述米曲霉WZ007由筛选得到,通过发酵得到菌体,干燥处理得到酶制剂用于酶法拆分生物素中间体内酯,一次酯化率为10-50%,光学纯度e.e.值达到95%以上,精制得到了较高纯度的右旋体内酯。
菌种和诱变:
从土壤中经初筛、复筛及分离纯化,获得一株产右旋内酯1a合成酶的曲霉属Aspergillus oryzaeWZ07,该菌株产酶量高,产酶稳定,立体选择性好,在产酶培养基上摇瓶发酵的菌丝体作酶源,选择性酯化有机酸2得到右旋内酯1a,经提取得到的右旋内酯1a光学纯度高。以它为出发菌种,按常规方法进行紫外线、γ射线诱变处理。紫外线照射为15W,距离27cm,时间2-3分钟;Co60-γ-射线处理条件为:在0.5、1.0、2.0KGY照射,致死率才达到99.2%,正突变率为15%,经处理的孢子悬浮液接和到含混旋生物素中间体内酯和消旋的对应的酸的基本培养基及完全培养基上,20-40℃培养3-7天,检出在含混旋生物素中间体内酯和消旋的对应的酸的基本培养基上不长,在完全培养基上生长的菌落。再在生物素中间体内酯平板中培养,取透明圈大的进行摇瓶发酵,测其酶酶活力。选育出一突变株Aspergillus oryzae WZ007酶活有明显提高。诱变分别提高了44.2%和69.8%的酶活,使出发菌株的酶活提高了247.4%,其酶活达到 10.1U/g菌体。
菌种初步鉴定结果:
菌株WZ007群体形态,肉眼观察:在斜面生长速度较快,在30℃条件下,一般需3-5天,菌落初期呈白色绒毛状,呈扩散状,表面较干燥,后生出绿色的孢子。
菌落在查氏琼脂上25℃7天直径45-65mm,10-14天扩及全皿;质地丝绒状至厚絮状,有的生长较稀疏,具辐射状沟纹;继续培养,呈浅黄褐色,近于浅褐橄榄色。分生孢子结构多或少,颜色初为浅黄绿色至黄绿色,近于橄榄浅黄色,橄榄黄色或黄桔青色,后呈淡茶褐色,近于淡褐橄榄色或古铜色至浅黄橄榄色;渗出液无或有,呈稀疏小滴,无色;菌落反面无色或呈淡粉红色至浅褐色。分生孢子头球形,后呈辐射形,散乱,直径80~250um或更长,也有少数呈短柱形者;分生孢子梗生自基质或气生菌丝,孢梗茎500~3000um或更长,直径8~20um生于气生菌丝者较短,壁通常粗糙,也有近于光滑者;顶囊近球形或烧瓶形,20~45um全面或四分之三的表面可育;产孢结构单层或双层,甚至同一顶囊上两种情况兼有:梗基8~14um×3.5~5um,偶有多育现象,瓶梗8~15um×3~5um分生孢子球形至近球形5~8.6um,或椭圆形至洋梨形4.8~9.6um×4~4.8um,壁近于光滑或粗糙。
菌落在查氏麦芽汁琼脂上25℃7天直径60—65mm,10—12天质地丝绒状生长较稀疏,黄绿色,近于黄橄榄色后变褐橄榄色;菌落反面无色。37℃生长良好。
菌株WZ007初步鉴定为曲霉属,米曲霉原变种Aspergillus oryzae。
所述方法如下:将内酯合成酶的酶制剂加入反应底物外消旋有机酸2 溶于有机溶剂得到的溶液中,底物终浓度为1~30%,酶制剂加入量为0.1~25U/g底物,30~50℃下反应3~60小时,反应液经分离纯化得到所述的右旋生物素中间体内酯,U为1个酶活力单位,所述的1个酶活力单位是在规定的条件下测定的每分钟催化合成d-内酯Ia的1μmol量的内酯合成酶的量,所述的规定条件为:取0.1g冻干菌丝体,向菌体中加入混旋体有机酸2浓度1%的甲苯溶液10ml,40℃条件下,水浴搅拌转速200rpm,反应60min后,过滤除去菌体,取反应液甲苯相用高压液相色谱分析(HPLC)测定转化得到的d-内酯Ia。凡是能溶解反应底物外消旋有机酸2或产物1的有机溶剂都在本发明的保护范围之内,本发明推荐的有机溶剂为下列之一:甲苯、苯、二氯甲烷、四氯甲烷、乙醚、丙酮、乙腈或氯仿。更优选甲苯、苯、二氯甲烷、氯仿。
本发明中物质百分比浓度均为质量体积百分比浓度,某物质浓度1%表示每100mL溶液中含有该物质1g。
所述酶制剂为市售酶制剂或经微生物常规发酵所得湿菌体干燥得到的酶制剂。
所述的内酯合成酶的酶制剂按如下方法得到:在产酶培养基上接种斜面种子,30~37℃、转速150~200r/min培养2~3天,过滤得到菌丝体,离心取沉淀冷冻干燥后即酶制剂,所述产酶培养基组成为:葡萄糖2~6%,蛋白胨2~5%,蔗糖1~6%,尿素0.3~0.9%,NaCl0.4~0.8%,k2HPO40.2~0.5%,MgSO40.1~0.3%,,(NH4)2SO40.4~0.8%,pH自然。本发明培养基中各物质浓度均以终浓度计,下同。
具体的,所述的内酯合成酶来自米曲霉CCTCC No.M206105,所述的制备方法如下:
(1)斜面培养:取米曲霉C℃TCCNo.M206105菌落转接斜面培养基,30℃培养3天,作为斜面活化种子,所述的斜面培养基组成为:NaNO30.1~0.3%,K2HPO40.1~0.2%,KCl0.3~0.7%,FeSO40.001~0.002%,MgSO40.04~0.06%,蔗糖2~5%,琼脂1.5~2.0%.pH自然,121℃灭菌20分钟;
(2)产酶培养:接种斜面种子,30℃培养48小时,过滤得到菌丝体,进行干燥得到酶制剂;所述产酶培养基组成为:葡萄糖2~6%,蛋白胨2~5%,蔗糖1~6%,尿素0.3~0.9%,NaCl0.4~0.8%,k2HPO40.2~0.5%,MgSO40.1~0.3%,,(NH4)2SO40.4~0.8%,pH自然,121℃灭菌20分钟;
(3)取步骤(2)所述的酶制剂加入外消旋有机酸2含量1~30%的甲苯溶液中,酶制剂添加量为0.1~25U/g底物,30~50℃下反应3~60小时,反应结束后反应液过滤,滤液减压蒸馏得到所述右旋生物素中间体内酯。
优选的,所述的内酯合成酶来自米曲霉CCTCC No.M206105,所述的制备方法如下:
(1)斜面培养:米曲霉CCTCC No.M206105转接斜面培养基,30℃培养3天,作为斜面活化种子,所述的斜面培养基组成为:NaNO30.2%,K2HPO40.1%,KCl0.5%,FeSO40.001%,MgSO40.05%,蔗糖3%,琼脂1.5%pH自然,121℃灭菌20分钟;
(2)产酶培养:接种斜面种子,30℃培养48小时,过滤得到菌丝体,进行干燥得到酶制剂;所述产酶培养基组成为:葡萄糖2%,蛋白胨2%,蔗糖1%g,尿素0.3%,NaCl0.5%,k2HPO40.2%, MgSO40.1%,,(NH4)2SO40.5%,pH自然;121℃灭菌20分钟;
(3)取步骤(1)所述的酶制剂加入外消旋有机酸2浓度为2%的甲苯溶液中,酶制剂添加量为0.1~25U/g底物,40℃条件下,反应12h,反应结束后反应液过滤,滤液在0.1MPa压力下减压蒸馏得到所述右旋生物素中间体内酯。
内酯1a/b及其对应的有机酸2的HPLC测定条件:柱型为shim-pack-CLC-ODS柱;流动相为:乙腈:水=3:2(v/v);流速为1mL/min;检测波长225nm。
右旋内酯1a合成酶酶转化反应:摇瓶培养的菌丝体干燥后作为酶源以外消旋有机酸2为底物,置于甲苯或丙酮等不同的有机溶剂中,底物浓度为1~30%,优选2~5%,加酶量为0.1~25U/g底物,酶反应温度为30~50℃,酶转化时间为3-60小时,优选6~24小时。酯化率为10~50%,e.e.值达到95%以上。
右旋内酯1a的提取及精制:酶转化后过滤除去菌体,产物内酯溶于甲苯,底物酸不溶于甲苯,通过过滤分离可以将二者分离,通过蒸馏除去有机溶剂得到产物右旋内酯1a,经过重结晶即可得到较纯的d-内酯1a产品。
本发明克服了诱导结晶法制备右旋内酯1a收率低,成本高,克服了化学方法拆分剂或手性诱导物价格昂贵,成本高,分离困难,有污染和毒性等不足,对其他生物法拆分的缺点,如收率低,产物光学纯度低等有所改善。
本发明所述右旋生物素中间体内酯的制备方法的有益效果主要体现在:拆分专一性强,拆分率高,大大降低了生产成本,操作简单,环境污染小,适合工业化生产。
(四)附图说明
图1为本发明反应过程流程图。
米曲霉WZ007(Aspergillus oryzae WZ007),保藏于中国典型培养物保藏中心,保藏编号CCTCC No.M206105,保藏日期2006年10月8日。
(五)具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述,但本发明的保护范围并不仅限于此:
实施例1:
斜面培养基:NaNO30.2%,K2HPO40.1%,KCl0.5%,FeSO40.001%,MgSO40.05%,蔗糖3%,琼脂1.5%,pH自然,121℃灭菌20分钟,灭菌后接种米曲霉CCTCC No.M206105(Aspergillusoryzae WZ007),30℃培养3天,作为斜面活化种子。
液态发酵培养基为葡萄糖20g,蛋白胨20g,蔗糖10g,尿素3g,NaCl5g,k2HPO42g,MgSO41g,,(NH4)2SO45g,定容至1L,pH自然,装液量为500ml三角瓶装液80ml,121℃灭菌20分钟,灭菌后冷却接种斜面种子,30℃培养48小时,过滤得到菌丝体,进行干燥得4克作为酶粉1。
酶活测定方法:取0.1g干菌丝体,向菌体中加入1%混旋体有机酸2浓度的甲苯溶液10ml,40℃条件下,水浴搅拌转速200rpm,反应60min后,过滤除去菌体,取反应液甲苯相用高压液相色谱分析(HPLC)测定转化得到的d-内酯Ia,上述条件下,每分钟催化合成d-内酯Ia的1μmol量的内酯合成酶的量,记为1个酶活力单位(1U)。
测得酶粉1的酶活为10.1U/g。
实施例2:
0.1g Aspergillus oryzaeWZ007酶粉1加入含有2%外消旋有机酸2的20mL甲苯中,40℃条件下,反应12h后,反应转化率32.6%。反应结束过滤后有机溶剂经过在0.1MPa压力下减压蒸馏得到产物内酯。产物内酯的光学纯度通过自动旋光仪测定,对映体过量值为大约96.2%。
实施例3:
0.1g Aspergillus oryzaeWZ007酶粉1加入含有2%外消旋有机酸2的20mL甲苯中,40℃条件下,反应12h后,反应转化转化后的反应液,过滤除去菌体,加入新的反应底物继续反应,如此反复,重复利用5次。得到酶水解结果见表1。经内酯化后产品d-生物素中间体内酯,经0.1Mp减压浓缩至5mL,常温下结晶,得到右旋生物素中间体内酯,对映体过量值达96%以上,收率93%,纯度达98%以上。酶粉1使用5次后,酶转化率仍然没有明显下降。
表1:反复分批酶转化结果
实施例4:
按实施例2方法,用其它有机溶剂代替甲苯作为反应溶剂其他条件不变,对外消旋有机酸2进行酶法转化。该反应的反应转化率和产物对映体过量值见表2。表2结果表明,在反应转化率和产物对映体过量值方面上,甲苯作为反应溶剂都要优于其他溶剂。
表2:反复分批酶转化结果
有机溶剂 | 反应转化率(%) | 产物对映体过量值 (%) |
苯 | 24 | 93.2 |
二氯甲烷 | 32 | 92.1 |
氯仿 | 30 | 89.6 |
实施例5:
0.1g Aspergillus oryzaeWZ007酶粉1加入含有2%外消旋有机酸2的20mL甲苯中,40℃条件下,反应24h后,反应转化率48.9%。反应结束过滤后有机溶剂经过在0.1MPa压力下减压蒸馏得到产物内酯。产物内酯的光学纯度通过自动旋光仪测定,得出对映体过量值为大约94.8%。
实施例6:
0.1g Aspergillus oryzaeWZ007酶粉1加入含有2%外消旋有机酸2的20mL甲苯中,30℃条件下,反应24h后,反应转化率40.3%。反应结束过滤后有机溶剂经过在0.1MPa压力下减压蒸馏得到产物内酯。产物内酯的光学纯度通过自动旋光仪测定,得出对映体过量值为大约95.4%。
实施例7:
0.2g Aspergillus oryzaeWZ007酶粉1加入含有2%外消旋有机酸2的20mL甲苯中,30℃条件下,反应24h后,反应转化率48.6%。反应结束过滤后有机溶剂经过在0.1MPa压力下减压蒸馏得到产物内酯。产物内酯的光学纯度通过自动旋光仪测定,得出对映体过量值为大约95.8%。
实施例8:
0.2g Aspergillus oryzaeWZ007酶粉1加入含有5%外消旋有机酸2的20mL甲苯中,30℃条件下,反应24h后,反应转化率37.2%。反应结束过滤后有机溶剂经过在0.1MPa压力下减压蒸馏得到产物内酯。产物内酯的光学纯度通过自动旋光仪测定,得出对映体过量值为大约93.8%。
实施例9:
0.2g Aspergillus oryzaeWZ007酶粉1加入含有5%外消旋有机酸2的20mL甲苯中,40℃条件下,反应24h后,反应转化率40.6%。反应结束过滤后有机溶剂经过在0.1MPa压力下减压蒸馏得到产物内酯。产物内酯的光学纯度通过自动旋光仪测定,得出对映体过量值为大约92.9%。
实施例10:
5g按实施例1方法制得的Aspergillus oryzaeWZ007酶粉1-1(酶活10.5U/g,测定方法同实施例2)加入含有2%外消旋有机酸2的1L甲苯中,40℃条件下,反应12h后,反应转化率36.6%。反应结束过滤后有机溶剂经过在0.1MPa压力下减压蒸馏得到产物内酯。产物内酯的光学纯度通过自动旋光仪测定,对映体过量值为大约93.8%。
实施例11:
5g按实施例1方法制得的Aspergillus oryzaeWZ007酶粉1-2(酶活9.8U/g,测定方法同实施例2)加入含有2%外消旋有机酸2的1L甲苯中,40℃条件下,反应24h后,反应转化率40.2%。反应结束过滤后有机溶剂经过在0.1MPa压力下减压蒸馏得到产物内酯。产物内酯的光学纯度通过自动旋光仪测定,得出对映体过量值为大约94.8%。
实施例12:
20g按实施例1方法制得的Aspergillus oryzaeWZ007酶粉1-3(酶活10.7U/g,测定方法同实施例2)加入含有2%外消旋有机酸2的1L甲苯中,30℃条件下,反应12h后,反应转化率39.4%。反应结束过滤后有机溶剂经过在0.1MPa压力下减压蒸馏得到产物内酯。产物内酯的光学纯度通过自动旋光仪测定,得出对映体过量值为大约95.7%。
实施例13:
40g按实施例1方法制得的Aspergillus oryzaeWZ007酶粉1-4(酶活11.2U/g,测定方法同实施例2)加入含有2%外消旋有机酸2的1L甲苯中,30℃条件下,反应12h后,反应转化率44.3%。反应结束过滤后有机溶剂经过在0.1MPa压力下减压蒸馏得到产物内酯。产物内酯的光学纯度通过自动旋光仪测定,得出对映体过量值为大约98.1%。
实施例14:
40g按实施例1方法制得的Aspergillus oryzaeWZ007酶粉1-5(酶活10.3U/g,测定方法同实施例2)加入含有2%外消旋有机酸2的1L甲苯中,40℃条件下,反应24h后,反应转化率46.3%。反应结束过滤后有机溶剂经过在0.1MPa压力下减压蒸馏得到产物内酯。产物内酯的光学纯度通过自动旋光仪测定,得出对映体过量值为大约97.1%。
实施例15:
40g按实施例1方法制得的Aspergillus oryzaeWZ007酶粉1-6(酶活 10.1U/g,测定方法同实施例2)加入含有2%外消旋有机酸2的1L二氯甲烷中,40℃条件下,反应24h后,反应转化率50.3%。反应结束过滤后有机溶剂经过在0.1MPa压力下减压蒸馏得到产物内酯。产物内酯的光学纯度通过自动旋光仪测定,得出对映体过量值为大约91.2%。
实施例16:
40g按实施例1方法制得的Aspergillus oryzaeWZ007酶粉1-7(酶活10.4U/g,测定方法同实施例2)加入含有5%外消旋有机酸2的1L甲苯中,30℃条件下,反应24h后,反应转化率41.2%。反应结束过滤后有机溶剂经过在0.1MPa压力下减压蒸馏得到产物内酯。产物内酯的光学纯度通过自动旋光仪测定,得出对映体过量值为大约95.5%。
实施例17:
40g按实施例1方法制得的Aspergillus oryzaeWZ007酶粉1-8(酶活10.5U/g,测定方法同实施例2)加入含有2%外消旋有机酸2的1L甲苯中,40℃条件下,反应24h后,反应转化率46.3%。转化后的反应液,过滤除去菌体,经0.1Mp减压浓缩至50mL,常温下结晶,得到右旋生物素中间体内酯,对映体过量值达95%以上,收率92.8%,纯度达96%以上。
实施例18:
60g按实施例1方法制得的Aspergillus oryzaeWZ007酶粉1-9(酶活10.0U/g,测定方法同实施例2)加入含有5%外消旋有机酸2的1L甲苯中,30℃条件下,反应12h后,反应转化率40.8%。转化后的反应液,过滤除去菌体,经0.1Mp减压浓缩至50mL,常温下结晶,得到右旋生物素 中间体内酯,对映体过量值达96%以上,收率93%,纯度达99%以上。
实施例19:
按照实施例2所述方法进行对下述所用皱褶假丝酵母脂肪酶(SIGMA公司,脂肪酶水解活力700,000-150,000U/g)进行酶活测定,测得皱褶假丝酵母脂肪酶的酶活为1.2U/g。
0.1g皱褶假丝酵母脂肪酶(SIGMA公司,脂肪酶水解活力700,000-150,000U/g)加入含有2%外消旋有机酸2的20mL甲苯中,40℃条件下,反应24h后,反应转化率13.2%。反应结束过滤后有机溶剂经过在0.1MPa压力下减压蒸馏得到产物内酯。产物内酯的光学纯度通过自动旋光仪测定,对映体过量值为大约86%。
实施例20:
按照实施例2所述方法对下述所用胰酶(杭州三叶生物化工厂,脂肪酶水解活力3,000U/g)进行酶活测定,测得胰酶的酶活为0.8U/g。
0.1g胰酶(杭州三叶生物化工厂,脂肪酶水解活力3,000U/g)加入含有2%外消旋有机酸2的20mL甲苯中,40℃条件下,反应24h后,反应转化率11.4%。反应结束过滤后有机溶剂经过在0.1MPa压力下减压蒸馏得到产物内酯。产物内酯的光学纯度通过自动旋光仪测定,对映体过量值为大约63%。
实施例21:
按照实施例2所述方法对下述所用青霉脂肪酶(深圳市绿微康生物工程有限公司,脂肪酶水解活力5,000~50,000U/g)进行酶活测定,测得青 霉脂肪酶的酶活为6U/g。
0.1g青霉脂肪酶(深圳市绿微康生物工程有限公司,脂肪酶水解活力5,000~50,000U/g)加入含有2%外消旋有机酸2的20mL甲苯中,40℃条件下,反应24h后,反应转化率20.1%。反应结束过滤后有机溶剂经过在0.1MPa压力下减压蒸馏得到产物内酯。产物内酯的光学纯度通过自动旋光仪测定,对映体过量值为大约84%。
实施例22:
按照实施例2所述方法对下述所用黑曲霉脂肪酶(深圳市绿微康生物工程有限公司,脂肪酶水解活力5,000~50,000U/g)进行酶活测定,测得黑曲霉脂肪酶的酶活为7U/g。
0.1g黑曲霉脂肪酶(深圳市绿微康生物工程有限公司,脂肪酶水解活力5,000~50,000U/g)加入含有2%外消旋有机酸2的20mL甲苯中,40℃条件下,反应24h后,反应转化率18.2%。反应结束过滤后有机溶剂经过在0.1MPa压力下减压蒸馏得到产物内酯。产物内酯的光学纯度通过自动旋光仪测定,对映体过量值为大约80%。
实施例23:
按照实施例2所述方法对下述所用米曲霉脂肪酶进行酶活测定,测得米曲霉脂肪酶(上海宝丰生化有限公司,脂肪酶水解活力≥20,000U/g)的酶活为5.5U/g。
0.1g米曲霉脂肪酶加入含有2%外消旋有机酸2的20mL甲苯中,40℃条件下,反应24h后,反应转化率19.6%。反应结束过滤后有机溶剂经过在0.1MPa压力下减压蒸馏得到产物内酯。产物内酯的光学纯度通过自 动旋光仪测定,对映体过量值为大约78%。
实施例24:
由解脂假丝酵母B017(陕西省微生物研究所,编号B017)液态发酵培养基为葡萄糖40g,酵母膏3g,(NH4)2HPO413g,KH2PO47g,MgSO4.7H2O0.8g,NaCl0.1g,定容至1L,pH自然。装液量为500ml三角瓶装液80ml,121℃灭菌20分钟,灭菌后冷却接种斜面种子,30℃培养24小时,过滤得到菌丝体,进行干燥作为酶粉2。按照实施例2所述方法对酶粉2进行酶活测定,测得酶粉3的酶活为0.5U/g。
取该菌粉20.1g加入含有2%外消旋有机酸2的20mL甲苯中,40℃条件下,反应24h后,反应转化率9.6%。反应结束过滤后有机溶剂经过在0.1MPa压力下减压蒸馏得到产物内酯。产物内酯的光学纯度通过自动旋光仪测定,对映体过量值为大约82%。
实施例23:
按照实施例2所述方法对下述所用猪肝酯酶(上海丽珠东风生物技术有限公司产品,脂肪酶水解活力>3000U/g)进行酶活测定,测得猪肝酯酶的酶活为1.4U/g。
0.1g猪肝酯酶(上海丽珠东风生物技术有限公司产品,脂肪酶水解活力>3000U/g)加入含有2%外消旋有机酸2的20mL甲苯中,40℃条件下,反应24h后,反应转化率15.2%。反应结束过滤后有机溶剂经过在0.1MPa压力下减压蒸馏得到产物内酯。产物内酯的光学纯度通过自动旋光仪测定,对映体过量值为大约65%。
实施例26:
按照实施例2所述方法对下述所用米根霉脂肪酶(上海宝丰生化有限公司,脂肪酶水解活力≥2,000,000U/g)进行酶活测定,测得华根霉脂肪酶的酶活为4.8U/g。
0.1g米根霉脂肪酶(上海宝丰生化有限公司,脂肪水解活力≥2,000,000U/g)加入含有2%外消旋有机酸2的20mL甲苯中,40℃条件下,反应24h后,反应转化率35.2%。反应结束过滤后有机溶剂经过在0.1MPa压力下减压蒸馏得到产物内酯。产物内酯的光学纯度通过自动旋光仪测定,对映体过量值为大约87%。
Claims (7)
2.如权利要求1所述的右旋生物素中间体内酯的制备方法,其特征在于所述内酯合成酶来自米曲霉WZ007(Aspergillus oryzae WZ007)保藏于中国典型培养物保藏中心,保藏编号CCTCC No.M 206105。
3.如权利要求2所述的右旋生物素中间体内酯的制备方法,其特征在于所述方法如下:将内酯合成酶的酶制剂加入反应底物外消旋有机酸2溶于有机溶剂得到的溶液中,底物终浓度为1~30%,酶制剂加入量为0.1~25U/g底物,30~50℃下反应3~60小时,反应液经分离纯化得到所述的右旋生物素中间体内酯,所述酶制剂为米曲霉CCTCC No.M 206105经发酵所得湿菌体干燥得到的酶制剂,U为1个酶活力单位,所述的1个酶活力单位是在规定的条件下测定的每分钟催化合成d-内酯Ia的1μmol量的内酯合成酶的量,所述的规定的条件为:取0.1g干菌丝体,向菌体中加入混旋体有机酸2浓度为1%的甲苯溶液10ml,40℃条件下,水浴搅拌转速200rpm,反应60min后,过滤除去菌体,取反应液甲苯相用高压液相色谱分析测定转化得到的d-内酯Ia;
4.如权利要求3所述的右旋生物素中间体内酯的制备方法,其特征在于所述的有机溶剂为下列之一:甲苯、苯或氯仿。
5.如权利要求3所述的右旋生物素中间体内酯的制备方法,其特征在于所述的内酯合成酶的酶制剂按如下方法得到:在产酶培养基上接种斜面种子,30~37℃、转速150~200rpm培养2~3天,过滤得到菌丝体,离心取沉淀干燥后即酶制剂,所述产酶培养基组成为:葡萄糖2~6%,蛋白胨2~5%,蔗糖1~6%,尿素0.3~0.9%,NaCl 0.4~0.8%,k2HPO4 0.2~0.5%,MgSO4 0.1~0.3%,,(NH4)2SO4 0.4~0.8%,pH自然。
6.如权利要求2所述的右旋生物素中间体内酯的制备方法,其特征在于所述的内酯合成酶来自米曲霉CCTCC No.M 206105,所述的制备方法如下:
(1)斜面培养:取米曲霉CCTCC No.M 206105菌落转接斜面培养基,30℃培养3天,作为斜面活化种子,所述的斜面培养基组成为:NaNO3 0.1~0.3%,K2HPO4 0.1~0.2%,KCl 0.3~0.7%,FeSO4 0.001~0.002%,MgSO4 0.04~0.06%,蔗糖2~5%,琼脂1.5~2.0%,pH自然,121℃灭菌20分钟;
(2)产酶培养:接种斜面种子,30℃培养48小时,过滤得到菌丝体,进行干燥得到酶制剂;所述产酶培养基组成为:葡萄糖2~6%,蛋白胨2~5%,蔗糖1~6%,尿素0.3~0.9%,NaCl 0.4~0.8%,k2HPO4 0.2~0.5%,MgSO4 0.1~0.3%,(NH4)2SO4 0.4~0.8%,pH自然,121℃灭菌20分钟;
(3)取步骤(2)所述的酶制剂加入外消旋有机酸2浓度为1~30%的甲苯溶液中,酶制剂添加量为0.1~25U/g底物,30~50℃下反应3~60小时,反应结束后反应液过滤,滤液减压蒸馏得到所述右旋生物素中间体内酯。
7.如权利要求2所述的右旋生物素中间体内酯的制备方法,其特征在于所述的内酯合成酶来自米曲霉CCTCC No.M 206105,所述的制备方法如下:
(1)斜面培养:米曲霉CCTCC No.M 206105转接斜面培养基,30℃培养3天,作为斜面活化种子,所述的斜面培养基组成为:NaNO3 0.2%,K2HPO4 0.1%,KCl 0.5%,FeSO4 0.001%,MgSO4 0.05%,蔗糖3%,琼脂1.5%,pH自然,121℃灭菌20分钟;
(2)产酶培养:接种斜面种子,30℃培养48小时,过滤得到菌丝体,进行干燥得到酶制剂;所述产酶培养基组成为终浓度:葡萄糖2%,蛋白胨2%,蔗糖1%,尿素0.3%,NaCl0.5%,k2HPO4 0.2%,MgSO4 0.1%,(NH4)2SO4 0.5%,pH自然;121℃灭菌20分钟;
(3)取步骤(2)所述的酶制剂加入外消旋有机酸2浓度为2%的甲苯溶液中,酶制剂添加量为0.1~25U/g底物,40℃条件下,反应12h,反应结束后反应液过滤,滤液在0.1MPa压力下减压蒸馏得到所述右旋生物素中间体内酯。
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
CN2006101548324A CN101186938B (zh) | 2006-11-17 | 2006-11-17 | 一种右旋生物素中间体内酯的制备方法 |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
CN2006101548324A CN101186938B (zh) | 2006-11-17 | 2006-11-17 | 一种右旋生物素中间体内酯的制备方法 |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
CN101186938A CN101186938A (zh) | 2008-05-28 |
CN101186938B true CN101186938B (zh) | 2010-12-08 |
Family
ID=39479544
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
CN2006101548324A Active CN101186938B (zh) | 2006-11-17 | 2006-11-17 | 一种右旋生物素中间体内酯的制备方法 |
Country Status (1)
Country | Link |
---|---|
CN (1) | CN101186938B (zh) |
Families Citing this family (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN102719512B (zh) * | 2012-06-21 | 2014-06-11 | 浙江工业大学 | 一种r-2-(4-羟基苯氧基)丙酸酯的制备方法 |
CN106191004A (zh) * | 2016-07-01 | 2016-12-07 | 浙江工业大学 | 一种米曲霉脂肪酶、编码基因、载体、工程菌及其应用 |
-
2006
- 2006-11-17 CN CN2006101548324A patent/CN101186938B/zh active Active
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
CN101186938A (zh) | 2008-05-28 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
CN101535467B (zh) | 左旋内酯水解酶产生菌及其用于制备手性羟基酸的方法 | |
JPH04360895A (ja) | Fo−1289a物質およびその製造法 | |
CN101805756B (zh) | 生物催化法生产他汀类药物中间体 | |
CN107189949A (zh) | 米根霉ljh3及在生物转化槐角苷制备染料木素中的应用 | |
CN105543108B (zh) | 紫变青霉ql-9204及在转化根皮苷制备根皮素中的应用 | |
CN101186938B (zh) | 一种右旋生物素中间体内酯的制备方法 | |
CN104560745B (zh) | 一种毕赤酵母菌Pichia sp.SIT2014及其培养方法和应用 | |
CN104726347A (zh) | 一株狐粪青霉真菌菌株以及利用该菌株制备左旋7-羟基丁苯酞的方法 | |
CN100516195C (zh) | 一种新的菌株及应用该菌株生产紫杉醇的方法 | |
CN102994429A (zh) | 微生物催化制备(S)-α-乙基-2-氧-1-吡咯烷乙酸酯的方法及菌株 | |
CA2085522A1 (en) | Microbial process for the production of trans-4-hydroxy-l-proline | |
CN103589665B (zh) | 庆笙红球菌及其在制备(s)-4-氯-3-羟基丁酸乙酯中的应用 | |
CN102120977B (zh) | 一种巧克力微杆菌及利用其制备(4s,5r)-半酯的方法 | |
CN106282032B (zh) | 桔青霉lb及在生物转化连翘苷制备连翘脂素中的应用 | |
CN105586289B (zh) | 一种能拆分(+/-)γ-内酰胺得到(-)γ-内酰胺的假单胞菌及其筛选和应用 | |
CN1333068C (zh) | 生物催化制备(s)-4-氯-3-羟基丁酸酯的菌种和方法 | |
US7939081B2 (en) | Method for producing cercosporamide | |
CN110358687B (zh) | 一株产d泛解酸内酯水解酶的赤霉菌及应用、发酵方法 | |
CN102409068B (zh) | 一种(3aS,6aR)-生物素手性内酯的制备方法 | |
CN101619330A (zh) | 一种粘红酵母菌用于生产一种泛醌的方法 | |
JP2954700B2 (ja) | 化合物ms―347 | |
CN103122319B (zh) | 一株具有立体选择性脂肪酶活性的酵母菌及其生物拆分制备s-型利斯的明的方法 | |
CN102559510B (zh) | 一种嗜盐曲霉菌f1及其应用 | |
JP4261304B2 (ja) | 微生物によるα−ホモノジリマイシンの製造方法 | |
RU2256701C1 (ru) | Штамм гриба aspergillus fumigatus - продуцент индольных алкалоидов и способ их получения |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
C06 | Publication | ||
PB01 | Publication | ||
C10 | Entry into substantive examination | ||
SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
C14 | Grant of patent or utility model | ||
GR01 | Patent grant |