CN102719512B - 一种r-2-（4-羟基苯氧基）丙酸酯的制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种式（Ⅱ）所示的R-2-（4-羟基苯氧基）丙酸酯的制备方法，所述方法包括：以外消旋2-（4-羟基苯氧基）丙酸酯为反应底物，在微生物酯水解酶作用下，进行选择性水解反应制得所述的R-2-（4-羟基苯氧基）丙酸酯；所述微生物酯水解酶来自米曲霉（Aspergillus oryzae）CCTCC No：M 206105。本发明的有益效果主要体现在：拆分专一性强，拆分率高，大大降低了生产成本，操作简单，环境污染小，适合工业化生产。
Description
（一）技术领域
本发明涉及一种R-2-（4-羟基苯氧基）丙酸酯的制备方法。
（二）背景技术
芳氧苯氧丙酸酯类（Aryloxyph enox y propionate，简称APP）除草剂是20世纪70年代2,4-D结构基础上开发的一类著名的防除禾本科杂草的高活性除草剂，此类除草剂具有高效、低毒、对后茬作物安全等特点。该类除草剂的手性品种较多，自1975年发现禾草灵具有除草活性以来，迄今为止已有20个品种商品化，如精辟禾草灵、精稳杀得、精盖草能、炔草酯和骠马等，成为一类发展迅速的除草剂类型。该类除草剂具两种旋光异构体，活性几乎全部集中在R异构体，S异构体则无活性或活性极低。其中R-2-（4-羟基苯氧基）丙酸酯是手性芳氧苯氧丙酸酯类除草剂重要中间体。由于单一手性农药的药效高、用药量少，对环境生态更安全，成为农药发展的主要研究热点。
R-2-（4-羟基苯氧基）丙酸酯的合成目前主要采用化学法，一般通过S-2氯丙酸酯与对苯二酚反应获得。由于国内生产的2-氯丙酸酯原料多为消旋体，而进口的S-2氯丙酸酯的价格较为昂贵。
国内较多采用的化学方法为以L-乳酸为前体，经磺酰化后再与对苯二酚反应，构型发生翻转后得到R-2-（4-羟基苯氧基）丙酸酯。由于反应过程容易发生消旋化，因此产物的光学纯度不是很高。
（三）发明内容
本发明的目的是为了解决上述方法的不足，通过筛选微生物酯水解酶，提供了一种以外消旋2-（4-羟基苯氧基）丙酸酯为反应底物，在微生物酯水解酶作用下立体选择性水解反应进行制备R-2-（4-羟基苯氧基）丙酸酯的方法。
本发明采用的技术方案是：
一种式（Ⅱ）所示的R-2-（4-羟基苯氧基）丙酸酯的制备方法，所述方法包括：以式（Ⅰ）所示的外消旋2-（4-羟基苯氧基）丙酸酯为反应底物，在微生物酯水解酶作用下，进行选择性水解反应制得所述的R-2-（4-羟基苯氧基）丙酸酯；所述微生物酯水解酶来自米曲霉（Aspergillus oryzae）CCTCC No：M 206105（该菌株保藏日期为2006年10月8日，已在中国专利CN101186938A中披露）；
式（Ⅰ）、式（Ⅱ）中R为相同的取代基，选自C1~C4的烷基中的一种，包括甲基，乙基，正丙基，异丙基和正丁基，优选为乙基。
涉及的反应式如下：
所述选择性水解反应在pH6.0~8.0的缓冲液中进行，优选在pH7.0的磷酸盐缓冲液中进行。
缓冲液中底物外消旋2-（4-羟基苯氧基）丙酸酯的初始浓度为5~100g/L，微生物酯水解酶的初始浓度为1~20g/L。
所述微生物酯水解酶按如下方法制备：将米曲霉CCTCC No：M206105接种至产酶培养基，30~37℃、转速150~200r/min条件下培养2~3天，过滤得到菌丝体，离心取沉淀干燥，即得含有所述微生物酯水解酶的酶粉；所述产酶培养基终浓度组成为：葡萄糖20~60g/L，蛋白胨20~50g/L，蔗糖10~60g/L，尿素3~9g/L，NaCl 4~8g/L，k2HPO4 2~5g/L，MgSO41~3g/L，(NH4)2SO4 4~8g/L，溶剂为水，pH自然。
为提高反应效率，所述缓冲液中还可添加体积为缓冲液体积10~20%的助溶剂，所述助溶剂为下列之一：丙酮、乙腈或二甲基亚砜，优选为二甲基亚砜。
所述选择性水解反应在10~50℃下进行，反应时间1~20小时。
具体的，所述方法如下：将酯水解酶酶粉和反应底物外消旋2-（4-羟基苯氧基）丙酸乙酯加入pH6.0~8.0的缓冲液中，底物浓度为5~100g/L，酶粉加入量为1~20g/L，10~50℃下反应1~20小时，反应液经萃取后分离纯化得到所述的R-2-（4-羟基苯氧基）丙酸乙酯。优选的方法条件是：反应在pH7.0的磷酸盐缓冲液中进行，底物初始浓度为20g/L，酶粉加入量为10g/L，30℃下反应2小时。
所述米曲霉WZ007由土壤筛选得到，通过发酵得到菌体，干燥处理得到酶粉用于酶法拆分2-（4-羟基苯氧基）丙酸乙酯，一次水解率为50~55%，光学纯度对映体过量值达到98%以上，经精制可得到较高纯度的R-2-（4-羟基苯氧基）丙酸乙酯。
底物2-（4-羟基苯氧基）丙酸酯的HPLC检测条件：柱型为CHIRALPAKAD-H手性柱（46cm×25cm，4μm，Diacel chemical，Japan）；流动相为：正己烷/异丙醇=90/10，流速0.8ml/min，柱温35℃，进样量10μl，可见光检测器，检测波长为234nm。
本发明的有益效果主要体现在：拆分专一性强，拆分率高，大大降低了生产成本，操作简单，环境污染小，适合工业化生产。
（四）附图说明
图1为本发明反应过程前（A）后（B）的2-（4-羟基苯氧基）丙酸乙酯的液相色谱图。
（五）具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于此：
实施例1：
斜面培养基：NaNO3 2g，K2HPO4 1g，KCl 5g，FeSO4 0.01g，MgSO4 0.5g，蔗糖30g，琼脂15g，定容至1L，pH自然，121℃灭菌20分钟，灭菌后冷却制成斜面，接种米曲霉WZ007（CCTCC No：M206105），30℃培养3天，作为斜面活化种子；
液态发酵培养基：葡萄糖20g，蛋白胨20g，蔗糖10g，尿素3g，NaCl 5g，k2HPO4 2g，MgSO4 1g,，(NH4)2SO4 5g，定容至1L，pH自然。装液量为500ml三角瓶装液80ml，121℃灭菌20分钟，灭菌后冷却，接种斜面种子，30℃培养48小时，过滤得到菌丝体，进行干燥得4.2g酶粉。
实施例2：
0.1g按实施例1方法制得的米曲霉WZ007酶粉加入至含有20g/L外消旋2-（4-羟基苯氧基）丙酸乙酯的10ml磷酸缓冲液中，反应过程中滴加1mol/L氢氧化钠溶液维持7.0左右，30℃条件下，反应2h后，反应转化率53.2%。反应结束过滤除去菌体后加等量乙酸乙酯萃取两次后合并萃取液，经过0.1MPa压力下减压蒸馏得到R-2-（4-羟基苯氧基）丙酸乙酯。R-2-（4-羟基苯氧基）丙酸酯对映体过量值为98.2%，收率90.2%，反应过程前后的2-（4-羟基苯氧基）丙酸乙酯的液相色谱图参见图1。
实施例3：
按实施例2方法，加入不同R基团结构的外消旋2-（4-羟基苯氧基）丙酸酯作为反应底物，其他条件不变。该反应的反应转化率和底物对映体过量值见表1。表1结果表明，在反应转化率和底物对映体过量值方面上，R基团为异丙基都要优于其他基团。
表1：不同底物结构的酶转化结果
实施例3：
按实施例2方法，反应转化后的反应液，过滤获得菌体经过缓冲液漂洗后加入新的反应底物继续反应，如此反复，重复利用5次。得到的酶水解结果见表2。米曲霉WZ007酶粉使用5次后，酶转化率仍然没有明显下降。
表2：反复分批酶转化结果
实施例4：
按实施例2方法，加入10%（v/v）的有机溶剂作为助溶剂其他条件不变，对外消旋2-（4-羟基苯氧基）丙酸乙酯进行酶法转化。该反应的反应转化率和底物对映体过量值见表3。表3结果表明，在反应转化率和底物对映体过量值方面上，二甲基亚砜作为助溶剂都要优于其他溶剂。
表3：重复分批的酶转化结果
实施例5：
0.2g按实施例1方法制得的米曲霉WZ007酶粉1加入至含有20g/L外消旋2-（4-羟基苯氧基）丙酸乙酯的10ml磷酸缓冲液中，反应过程中滴加1mol/L氢氧化钠溶液维持7.0左右，30℃条件下，反应1h后，反应转化率51.2%。反应结束过滤除去菌体后加等量乙酸乙酯萃取两次后合并萃取液，经过0.1MPa压力下减压蒸馏得到R-2-（4-羟基苯氧基）丙酸乙酯。R-2-（4-羟基苯氧基）丙酸酯对映体过量值为99.1％，收率92.2%。
实施例6：
1g按实施例1方法制得的米曲霉WZ007酶粉加入至含有20g/L外消旋2-（4-羟基苯氧基）丙酸乙酯的100ml磷酸缓冲液中，反应过程中滴加1mol/L氢氧化钠溶液维持7.0左右，30℃条件下，反应2h后，反应转化率52.3%。反应结束过滤除去菌体后加等量乙酸乙酯萃取两次后合并萃取液，经过0.1MPa压力下减压蒸馏得到R-2-（4-羟基苯氧基）丙酸乙酯。R-2-（4-羟基苯氧基）丙酸酯对映体过量值为99.2%，收率94.2%。
实施例7：
20g按实施例1方法制得的米曲霉WZ007酶粉加入至含有20g/L外消旋2-（4-羟基苯氧基）丙酸乙酯的2L磷酸缓冲液中，反应过程中滴加1mol/L氢氧化钠溶液维持7.0左右，30℃条件下，反应2h后，反应转化率52.3%。反应结束过滤除去菌体后加等量乙酸乙酯萃取两次后合并萃取液，经过0.1MPa压力下减压蒸馏得到R-2-（4-羟基苯氧基）丙酸乙酯。R-2-（4-羟基苯氧基）丙酸酯对映体过量值为99.0%，收率94.8%。
实施例8：
按实施例1方法，用实验室保存的以下菌种代替米曲霉WZ007发酵得到菌体作为生物催化剂。再按实施例2方法，用这些菌种静息细胞代替米曲霉WZ007作为生物催化剂其他条件不变，对外消旋2-（4-羟基苯氧基）丙酸乙酯进行酶法转化。该反应的反应转化率和底物对映体过量值见表4。表4结果表明，黑曲霉等菌株对底物都具有一定的转化活性和立体选择性，但是效果上不如本发明米曲霉WZ007。
表4：不同菌种来源酯水解酶的转化结果
以上所述，仅是本发明的较佳实施例而已，并非对本发明的技术内容作任何形式上的限制。凡是依据本发明的技术实质对以上实施例所作的任何简单修改、等同变化与修饰，均落入本发明的保护范围内。
Claims (7)
1.一种式（Ⅱ）所示的R-2-（4-羟基苯氧基）丙酸酯的制备方法，所述方法包括：以式（Ⅰ）所示的外消旋2-（4-羟基苯氧基）丙酸酯为反应底物，在微生物酯水解酶作用下，进行选择性水解反应制得所述的R-2-（4-羟基苯氧基）丙酸酯；所述微生物酯水解酶来自米曲霉（Aspergillusoryzae）CCTCC No：M 206105；
式（Ⅰ）、（Ⅱ）中，R为C1~C4的烷基。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于所述选择性水解反应在pH6.0~8.0的缓冲液中进行。
3.如权利要求2所述的方法，其特征在于所述选择性水解反应在pH7.0的磷酸盐缓冲液中进行。
4.如权利要求2或3所述的方法，其特征在于缓冲液中底物外消旋2-（4-羟基苯氧基）丙酸酯的初始浓度为5~100g/L，微生物酯水解酶的初始浓度为1~20g/L。
5.如权利要求2或3所述的方法，其特征在于所述微生物酯水解酶按如下方法制备：将米曲霉CCTCC No：M 206105接种至产酶培养基，30~37℃、转速150~200r/min条件下培养2~3天，过滤得到菌丝体，离心取沉淀干燥，即得含有所述微生物酯水解酶的酶粉；所述产酶培养基终浓度组成为：葡萄糖20~60g/L，蛋白胨20~50g/L，蔗糖10~60g/L，尿素3~9g/L，NaCl 4~8g/L，k2HPO4 2~5g/L，MgSO4 1~3g/L，(NH4)2SO44~8g/L，溶剂为水，pH自然。
6.如权利要求2或3所述的方法，其特征在于所述缓冲液中还添加有体积为缓冲液体积10~20%的助溶剂，所述助溶剂为下列之一：丙酮、乙腈或二甲基亚砜。
7.如权利要求2或3所述的方法，其特征在于选择性水解反应在10~50℃下进行，反应时间1~20小时。
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