KR20070070170A

KR20070070170A - 신규한 ｄ-세린 합성 활성을 갖는 효소를 코드하는 ｄｎａ,상기 효소의 제조방법, 및 이것을 이용한 ｄ-세린의제조방법

Info

Publication number: KR20070070170A
Application number: KR1020077007621A
Authority: KR
Inventors: 타다시 아라키; 토모노리 히데사키; 세이이치 와타나베; 케이타 니시다; 키요테루 나가하라; 미츠오 코이토
Original assignee: 미쓰이 가가쿠 가부시키가이샤
Priority date: 2004-10-13
Filing date: 2005-10-07
Publication date: 2007-07-03
Also published as: US9695452B2; EP2602319B1; US20170327853A1; JPWO2006041143A1; US20160046970A1; EP2295566A1; CN102925467A; EP1806401A1; CN101040047B; EP2602320A1; WO2006041143A1; KR20090003352A; CN101040047A; JP2011172582A; CN104073506B; KR100901554B1; JP4800965B2; KR100980541B1; DE05793824T1; US9212376B2

Abstract

본 발명은, 글리신과 포름알데히드로부터 D-세린을 합성하는 활성을 갖는 신규한 효소를 코드하는 DNA, 상기 DNA를 벡터에 삽입하여 이루어지는 재조합 DNA, 상기 재조합 DNA로 형질전환한 형질전환체, 및 상기 효소를 이용한 포름알데히드와 글리신으로부터 D-세린을 제조하는 방법에 관한 것이다.

Description

신규한 Ｄ-세린 합성 활성을 갖는 효소를 코드하는 ＤＮＡ, 상기 효소의 제조방법, 및 이것을 이용한 Ｄ-세린의 제조방법{DNA ENCODING NOVEL ENZYME HAVING D-SERINE SYNTHASE ACTIVITY, METHOD OF PRODUCING THE ENZYME AND METHOD OF PRODUCING D-SERINE BY USING THE SAME}

본 발명은, 포름알데히드와 글리신으로부터 D-세린을 합성하는 활성을 갖는 신규한 효소를 코드하는 DNA, 상기 DNA를 벡터에 삽입하여 이루어지는 재조합 DNA, 상기 재조합 DNA로 형질전환한 형질전환체, 포름알데히드와 글리신으로부터 D-세린을 합성하는 활성을 갖는 신규한 효소 및 상기 효소를 이용한 포름알데히드와 글리신으로부터 D-세린을 제조하는 방법에 관한 것이다.

D-세린은 D-사이클로세린 등의 의약품의 합성 중간체로서 유용한 화합물인 것이 알려져 있다.

종래, 포름알데히드와 글리신으로부터 D-세린을 합성하는 활성을 갖는 효소로서는, 아스로박터(Arthrobacter) sp. DK-19에 유래하는 D-트레오닌알드라제 (이하, 「DTA」라 약기한다.)가 알려져 있는 것에 불과하다(일본국특개소 58-116690호 공보를 참조).

이 DTA는, 포름알데히드 및 글리신을 각각 50mmol 사용하여 30℃에서 40시간 반응시킨 후의 D-세린의 생성량은 2.5mmol(포름알데히드에 대한 수율은 거의 5%)이었던 것이 보고되어 있다.

이것에 대하여, 동일한 아스로박터속의 미생물인, 아스로박터 sp. DK-38에 유래하는 DTA는, D-트레오닌, D-β-히드록시페닐세린, D-β-히드록시-α-아미노 발레르산 등에 반응하는 넓은 기질특이성을 갖고 있음에도 불구하고, D-세린에는 반응하지 않는 것이 보고되어 있다(Eur. J. Biochem., 1997, 248, p385~393을 참조).

또한, 크산토모나스속(Xanthomonas) 유래의 DTA를 이용하는 것에 의해, 글리신과 알데히드 화합물로부터 D-β-히드록시 아미노산류를 제조할 수 있는 것이 보고되어 있지만, 크산토모나스속 유래의 DTA를 이용하여 포름알데히드와 글리신으로부터 D-세린을 합성할 수 있다는 보고는 되어 있지 않다(일본국특개평 5-168484호 공보를 참조).

발명의 개시

본 발명은, 상기의 배경기술에 비추어 보아, 포름알데히드와 글리신으로부터 D-세린을 합성하는 활성을 갖는 신규한 효소를 코드하는 DNA, 상기 DNA를 벡터에 삽입하여 이루어지는 재조합 DNA, 상기 재조합 DNA로 형질전환한 형질전환체, 포름알데히드와 글리신으로부터 D-세린을 합성하는 활성을 갖는 신규한 효소, 및 상기 효소를 이용한 포름알데히드와 글리신으로부터 D-세린을 제조하는 방법을 제공하는 것을 목적으로 한다.

본 발명자들은, 공지의 DTA와 유사한 구조를 갖는 미지인 효소 중에, 포름알데히드와 글리신으로부터 D-세린을 합성하는 능력을 갖는 효소가 존재할 가능성이 있다고 생각하여, 공지의 DTA의 아미노산 서열에 관한 정보에 관한 조사를 행하였다. 그 결과, 크산토모나스속(GenBank accession No.EO5055), 아크로모박터(Achromobacter)속(GenBank accession No.ABO26892), 및 아스로박터속(GenBank accession No.ABO10956)에 유래하는 DTA의 아미노산 서열에 관한 정보를 찾아냈다. 이들의 아미노산 서열을 비교 검토한 결과, DTA의 N말단영역 및 C말단영역에 상당하는 아미노산 서열에 높은 상동성을 갖는 것을 찾아냈다.

본 발명자들은, 이들의 아미노산 서열로부터 N말단영역과 C말단영역을 기초로 프라이머를 설계하고, 이 프라이머를 이용하여 각종 미생물의 염색체 DNA로부터 PCR에 의한 증폭을 시도한 바, 아크로모박터속의 미생물로부터 포름알데히드와 글리신으로부터 D-세린을 합성하는 활성을 갖는 효소를 코드하는 DNA의 증폭에 성공했다.

이 DNA에 상당하는 아미노산 서열과 공지의 아크로모박터속에 유래하는 DTA의 아미노산 서열과의 상동성은 약 50% 정도이며, 공지의 아크로모박터속에 유래하는 DTA의 아미노산 서열과는 상당히 다른 것이었다. 한편, 공지의 크산토모나스속에 유래하는 DTA의 아미노산 서열과의 상동성은 약 90%이었다.

본 발명자들은 다음에, 상기의 신규한 DNA를 벡터에 삽입하여 이루어지는 재조합 DNA로 형질전환된 재조합 Escherichia coli를 이용하여 포름알데히드와 글리신을 반응시켜 D-세린의 합성을 시도한 바, 놀랍게도 종래 알려져 있는 DTA와는 달리, 100mM의 글리신과 포름알데히드로부터 반응수율 70%이상이라는 고수율로 D-세린을 합성할 수 있다는 것을 찾아냈다.

더욱이, 이 재조합 Escherichia coli를 이용하여 D-세린의 축적반응을 행하면, 조금이지만 L-세린을 생성하는 것이 확인되었다.

D-세린을 의약중간체 등의 고순도가 요구되는 분야에 이용할 경우, D-세린으로의 L-세린의 혼입은 바람직하지 않다. D-세린의 제조시에 L-세린이 부생하는 것은, D-세린의 용해도보다 DL-세린의 용해도가 낮은 것으로부터 D-세린의 정제 수율을 대폭 저하시킨다.

본 발명자들은, 이 문제를 해결하기 위하여, 더욱 검토한 결과, 2가 금속이온의 존재하, 유기용매처리 및/또는 가열처리를 실시하는 것으로 L-세린의 부생을 억제할 수 있다는 것을 찾아냈다. 또한, 이와 같은 처리를 실시하지 않더라도 반응중의 포름알데히드 농도를 150mM 이상으로 유지함으로써 L-세린의 부생을 억제할 수 있다는 것을 찾아냈다. 더욱이, D-세린 합성에 이용하는 DSA를 생산하는 숙주 로서 L-세린 합성 효소유전자가 결실되어 있는 미생물을 이용함으로써 L-세린의 부생을 억제할 수 있다는 것을 찾아냈다.

이상의 지견을 기초로, 본 발명을 완성하였다. 즉, 본 발명은 이하와 같다.

(1) 이하의 (a) 또는 (b)의 단백질을 코드하는 DNA.

(a) 서열번호 4, 6, 8의 어느 하나에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 단백질

(b) (a)의 아미노산 서열에 있어서 1 또는 수 개의 아미노산이 결실, 치환, 삽입 또는 부가된 아미노산 서열을 포함하고, 또한 글리신과 포름알데히드로부터 D-세린을 합성하는 효소활성을 갖는 단백질

(2) 이하의 (a) 또는 (b)의 DNA.

(a) 서열목록의 서열번호 3, 5, 7의 어느 하나에 기재된 염기서열 또는 그들의 상보서열로 이루어지는 DNA

(b) 서열목록의 서열번호 3, 5, 7의 어느 하나에 기재된 염기서열 또는 그들의 상보서열 중의 적어도 20염기의 연속한 DNA서열을 포함하는 DNA단편과 엄격한 조건하에서 하이브리다이즈하고, 또한 글리신과 포름알데히드로부터 D-세린을 합성하는 활성을 갖는 효소를 코드하는 DNA

(3) 상기 (1) 또는 (2)에 기재된 DNA를 벡터에 삽입하여 이루어지는 재조합 DNA.

(4) 상기 (3)에 기재된 재조합 DNA를 이용하여 숙주세포를 형질전환하여 얻어진 형질전환체.

(5) 형질전환되는 숙주세포가 미생물인 상기 (4)에 기재된 형질전환체.

(6) 형질전환되는 미생물이 D-세린데아미나아제가 결손한 미생물인 상기 (5)에 기재된 형질전환체.

(7) 이하의 (a) 또는 (b)의 단백질.

(8) 상기 (4)로부터 (6)의 어느 하나에 기재된 형질전환체를 배양하고, 얻어진 배양물로부터 글리신과 포름알데히드로부터 D-세린을 합성하는 효소활성을 갖는 단백질을 채취하는 것을 특징으로 하는, 글리신과 포름알데히드로부터 D-세린을 합성하는 활성을 갖는 효소의 제조방법.

(9) 상기 (4)로부터 (6)의 어느 하나에 기재된 형질전환체 또는 그 처리물의 존재하에서 글리신과 포름알데히드를 반응시키는 것을 포함하는 D-세린의 제조방법.

(10) 상기 (7)에 기재된 단백질의 존재하에서 글리신과 포름알데히드를 반응시키는 것을 포함하는 D-세린의 제조방법.

(11) 글리신과 포름알데히드로부터 D-세린을 합성하는 활성을 갖는 미생물 또는 그 처리물의 존재하에서, 글리신과 포름알데히드를 반응시켜서 D-세린을 합성하는 D-세린의 제조방법으로, 상기 반응의 반응액 중의 L-세린의 부생을 D-세린에 대하여 1.5몰% 이하로 억제시키는 이하의 (i)∼(iv)의 하나 이상의 수단을 갖는 D-세린의 제조방법.

(i) 글리신과 포름알데히드로부터 D-세린을 합성하는 활성을 갖는 미생물을 유기용매처리 및/또는 가열처리하는 방법,

(ii) 반응액 중의 포름알데히드 농도를, a) 상기 (i)의 방법에 의해 유기용매처리 및/또는 가열처리를 실시하는 경우에는 2M 이하로 제어하고, b) 유기용매처리 및/또는 가열처리를 실시하지 않는 경우에는, 150mM 이상 2M 이하로 제어하는 방법,

(iii) 글리신과 포름알데히드로부터 D-세린을 합성하는 활성을 갖는 효소를 함유하고, 또한, L-세린 합성 효소유전자가 결실되어 있는 미생물을 촉매로서 이용하는 방법,

(iv) L-세린데아미나아제 활성을 갖는 효소를 함유하는 미생물을 반응액 중에 첨가하는 방법.

(12) 유기용매가 포름알데히드, 벤즈알데히드, 디클롤로에탄 및 이소프로필알코올로부터 선택되는 1종 이상의 것인 상기 (11)에 기재된 제조방법.

(13) 유기용매처리 및/또는 가열처리를 2가의 금속이온의 존재하에서 행하는 상기 (11) 또는 (12)에 기재된 제조방법.

(14) 2가의 금속이 마그네슘, 망간, 아연, 니켈, 코발트 및 철로부터 선택되는 1종 이상의 금속인 상기(13)에 기재된 제조방법.

(15) 글리신과 포름알데히드로부터 D-세린을 합성하는 활성을 갖는 미생물이 상기 (5) 또는 (6)에 기재된 형질전환체인 상기 (11)에 기재된 제조방법.

1. 포름알데히드와 글리신으로부터 D-세린을 합성하는 활성을 갖는 신규한 효소를 코드하는 DNA의 유전자 취득

서열목록의 서열번호 4, 6, 8의 어느 하나에 기재된 아미노산 서열을 포함하고, 또한, 글리신과 포름알데히드로부터 D-세린을 합성하는 활성을 갖는 효소(이하, 글리신과 포름알데히드로부터 D-세린을 합성하는 활성을 갖는 효소를 「DSA」라 약기한다.)를 코드하는 DNA는, 예컨대, 12301 Parklawn Drive, Rockville, Maryland 20852, U.S.A.의 American Type Culture Collection으로부터 입수가능한 아크로모박터ㆍ크실로속시던스(Achromobacter xylosoxidans)(ATCC9220), 독립행정법인 제품평가기술기반기구(National Institute of Technology and Evaluation)의 생물유전자원부문(NITE Biological Resource Center)(일본국 치바현 키사라즈시 카즈사카마타리 2-5-8)로부터 입수가능한 아크로모박터ㆍ크실로속시던스(NBRC13495) 및 아크로모박터ㆍ데니트리피칸스(Achromobacter denitrificans)(Synonym:Achromobacter xylosoxidans subsp. denitrificans)(NBRC15125)로부터 염색체 DNA를 추출하고, 서열목록의 서열번호 1 및 2에 나타난 염기서열을 갖는 프라이머를 이용하여 PCR를 실시하는 것에 의해 얻을 수 있다.

PCR을 실시할 때에 있어서, 약간의 미스매치를 갖는 유전자도 증폭할 수 있도록 증폭시의 조건을 개량하는 것이 유효하다. 예컨대, 어닐링 온도를 낮게 억제하는 방법, PCR 반응액 중에 디메틸설폭시드를 5% 정도 첨가하는 방법, 또는 GC 리치 유전자를 증폭하기 쉽도록 연구된 PCR키트(예컨대 GC-RICH PCR System(Roche사제))를 사용하는 방법, 더욱이 상기의 방법을 조합시키는 방법 등에 의해 증폭이 곤란한 유전자를 증폭할 수 있는 것이 있다.

DSA를 코드하는 DNA의 구체적인 예로서 아크로모박터ㆍ크실로속시던스(ATCC9220)유래 DTA유전자의 DNA염기서열을 서열번호 3으로, 상기 염기서열로부터 번역되는 아미노산 서열을 서열번호 4로 예시할 수 있다. 아크로모박터ㆍ크실로속시던스(NBRC13495)유래 DTA유전자의 DNA염기서열을 서열번호 5로, 상기 염기서열로부터 번역되는 아미노산 서열을 서열번호 6으로 예시할 수 있다. 아크로모박터ㆍ데니트리피칸스(NBRC15125)유래 DTA유전자의 DNA염기서열을 서열번호 7로, 상기 염기서열로부터 번역되는 아미노산 서열을 서열번호 8로 예시할 수 있다.

DSA를 코드하는 DNA로서는 상기한 것 이외에, 서열목록의 서열번호 3, 5, 7의 어느 하나에 기재된 염기서열 또는 그들의 상보서열 중의 적어도 20염기의 연속한 DNA서열을 포함하는 DNA단편과 엄격한 조건하에서 하이브리다이즈하고, 또한 DSA활성을 갖는 단백질을 코드하는 DNA이면 어떤 생물유래이어도 상관 없다. 예컨대, 그 생물 중에서 기능을 갖지 않는 사일런트한 DNA이어도 단리한 DNA를 적당한 발현 벡터에 연결함으로써 DSA를 산생할 수 있으면 그것이라도 상관 없다.

더욱이 생물을 특정하지 않아도, 토양 등을 직접, 주형 DNA로서 서열목록의 서열번호 1 및 2의 염기서열을 갖는 프라이머를 이용한 PCR에 붙이는 것으로 DSA를 코드하는 DNA를 얻는 것도 가능하다.

DSA를 코드하는 DNA의 구체적인 취득방법으로서, 예컨대 D-세린을 함유하는 배지에서 생육하는 미생물의 염색체 DNA를 주형으로 하고, 서열목록의 서열번호 1 및 2에 기재된 염기서열을 갖는 프라이머를 이용하여 PCR를 행하여 증폭한 DNA를 예시할 수 있다.

또한, 서열목록의 서열번호 3, 5, 7의 어느 하나에 기재된 염기서열 또는 상보서열이 엄격한 조건하에서 하이브리다이즈할 수 있는 범위내에서, 또한 코드되는 효소의 활성에 영향을 미치지 않는 범위내에서 부위특이적 변이도입법 (Nucleic Acid Res., 10, pp.6487(1982); Nucleic Acid Res., 13, pp. 4431(1985); Methos in Enzymol., 100, pp. 448(1983); Molecular Cloning 2ndEdt., Cold Spring Harbor Laboratory Press(1989); PCR A Practical Approach IRL Press pp.200 (1991); Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley &; Sons(1987~1997); Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 79, pp. 6409(1982); Gene, 34, 315(1985); Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 82, pp. 488(1985)) 등을 이용하여, 적당히 결실, 치환, 삽입, 및/또는 부가변이를 도입하는 것에 의해, 서열번호 4, 6, 8의 어느 하나에 기재된 아미노산 서열에 있어서 1 또는 수 개의 아미노산이 결실, 치환, 삽입 또는 부가된 아미노산 서열을 포함하고, 또한 DSA활성을 갖는 단백질을 코드하는 DNA를 얻는 것도 가능하다.

본 명세서 중의, 아미노산의 결실, 치환, 삽입 또는 부가는, 상기의 출원전 주지기술인 부위특이적 변이도입법에 의해 실시할 수 있고, 또한, 1 또는 수 개의 아미노산은, 부위특이적 변이도입법에 의해 결실, 치환, 삽입 또는 부가할 수 있는 정도의 수, 예컨대 1∼5개의 아미노산, 바람직하게는 1∼3개의 아미노산을 의미한다.

하이브리다이제이션을 위한 조건으로는, 특정 하이브리다이제이션 시그널을 검출하기 위하여 당업자가 일반적으로 이용하고 있는 조건을 예시할 수 있다. 바람직하게는, 엄격한 하이브리다이제이션 조건과 엄격한 세정 조건을 의미한다. 구체적으로는, 예컨대, 6×SSC(1×SSC의 조성=0.15M NaCl, 0.015M 시트르산나트륨, pH7.0), 0.5% SDS, 5×덴하트 및 100mg/ml 청어 정자 DNA를 포함하는 용액중 프로브와 함께 55℃에서 밤새 보온한다는 조건 등을 들 수 있다. 그 다음에 필터를 0.2×SSC 중 42℃에서 세정하는 등을 예시할 수 있다. 엄격한 조건으로서는, 필터의 세정 공정에 있어서 0.1×SSC, 50℃의 조건이며, 더욱 엄격한 조건으로서는, 동일 공정에 있어서 0.1×SSC, 65℃의 조건을 들 수 있다.

본 명세서중에서 이용하는 「서열번호 3, 5, 7의 어느 하나에 기재된 염기서열 또는 그들의 상보서열 중의 적어도 20염기의 연속한 DNA서열을 포함하는 DNA단편」으로는, 서열목록의 서열번호 3, 5, 7의 어느 하나에 기재된 또는 그들의 상보서열 중의 임의의 적어도 20염기, 바람직하게는 적어도 30염기, 예컨대 40, 60 또는 100염기의 연속한 서열을 1개 또는 복수 선택한 DNA의 단편이다.

2. 상기 단백질의 유전자를 갖는 재조합 DNA의 제작

상기의 DSA를 코드하는 DNA를 벡터에 삽입하는 것에 의해 재조합 DNA를 얻을 수 있다.

클로닝할 때의 벡터로서는, 숙주 미생물 내에서 자율적으로 증식할 수 있는 파지(phage) 또는 플라스미드로부터 유전자 재조합용으로서 구축된 것이 적합하다. 파지로서는, 예컨대 Escherichia coli를 숙주 미생물로 하는 경우에는 Lambda gt10, Lambda gt11 등을 예시할 수 있다. 또한, 플라스미드로서는, 예컨대 Eschenchia coli를 숙주 미생물로 하는 경우에는, pBTrp2, pBTac1, pBTac2(어느 것이나 Boehringer Mannheim사제), pKK233-2(Pharmacia사제), pSE280(Invitrogen사제), pGEMEX-1(Promega사제), pQE-8(QIAGEN사제), pQE-30(QIAGEN사제), pBluescriptII SK+, pBluescriptII SK(-)(Stratagene사제), pET-3(Novagen사제), pUC18(다까라슈조사제), pSTV28(다까라슈조사제), pSTV29(다까라슈조사제), pUC118(다까라슈조사제) 등을 예시할 수 있다.

프로모터로서는, 숙주세포중에서 발현할 수 있는 것이면 어떠한 것이라도 좋다. 예컨대, trp프로모터(P_trp), 1ac프로모터(P_lac), P_L프로모터, P_H프로모터, P_SE프로모터 등의, Escherichia coli나 파지 등에 유래하는 프로모터를 들 수 있다. 또한 tac프로모터, lacT7프로모터와 같이 인위적으로 설계 개변된 프로모터 등도 이용할 수 있다. 더욱이 바실러스속 세균 중에서 발현시키기 위하여 Np프로모터(일본국특공평 8-24586호 공보) 등도 이용할 수 있다.

리보솜 결합 서열로서는, 숙주세포 중에서 발현할 수 있는 것이면 어떠한 것이라도 좋지만, 샤인-달가노(Shine-Dalgarno) 서열과 개시코돈과의 사이를 적당한 거리(예컨대 6∼18염기)로 조절한 플라스미드를 이용하는 것이 바람직하다.

전사ㆍ번역을 효율적으로 행하기 위하여, 상기 단백질 활성을 갖는 단백질의 N말단 또는 그 일부를 결실한 단백질과 발현 벡터의 코드하는 단백질의 N말단부분을 융합시킨 단백질을 발현시켜도 좋다.

목적으로 하는 단백질의 발현에는 전사 종결 서열은 반드시 필요하지는 않지만, 구조유전자 바로 아래에 전사 종결 서열을 배치하는 것이 바람직하다.

클로닝할 때에, 상기와 같은 벡터를, 상술한 DSA를 코드하는 DNA의 절단에 사용한 제한효소로 절단하여 벡터 단편을 얻을 수 있지만, 반드시 상기 DNA의 절단에 사용한 제한효소와 동일한 제한효소를 이용할 필요는 없다. 상기 DNA단편과 벡터DNA 단편을 결합시키는 방법은, 공지의 DNA리가아제를 이용하는 방법이면 좋고, 예컨대 상기 DNA단편의 부착 말단과 벡터 단편의 부착 말단과의 어닐링 후, 적당한 DNA리가아제의 사용에 의해 상기 DNA단편과 벡터DNA 단편과의 재조합 벡터를 제작한다. 필요에 따라서, 어닐링 후, 미생물 등의 숙주에 이입하여 생체내의 DNA리가아제를 이용하여 재조합 벡터를 제작할 수도 있다.

3. DSA를 코드하는 DNA를 벡터에 삽입하여 이루어지는 재조합 DNA에 의한 형질전환체의 제작

상기의 재조합 DNA를 숙주세포에 도입하는 것에 의해, 상기의 재조합 DNA로 형질전환된 형질전환체를 얻을 수 있다.

숙주세포로서는, 재조합 벡터가 안정하고, 또한 자율증식 가능하여 외래성 유전자의 형질발현이 가능한 것이면 특별히 제한되지 않는다. 숙주세포로서는, 미생물, 예컨대 세균을 들 수 있고, 그와 같은 것으로서 Escherichia coli DH5α, XL-1Blue 등의 Escherichia coli가 예시된다. 또한, 숙주세포로서 그 밖의 효모 등의 미생물이나 곤충세포를 이용하는 것도 가능하다.

미생물에 재조합 DNA를 이입하는 방법으로서는, 예컨대 미생물이 Escherichia coli의 경우에는, 칼슘처리에 의한 컴피턴트셀법이나 일렉트로포레이션법 등을 이용할 수 있다.

숙주세포로서, 생성물인 D-세린의 분해를 억제하는 목적에서 D-세린데아미나아제 활성의 낮은 미생물 또는 D-세린데아미나아제 활성의 결손한 미생물을 이용할 수 있다. D-세린데아미나아제 활성이 결손한 미생물의 구체적인 예로서, 예컨대 실시예 6에 기재된 D-세린데아미나아제 유전자를 재조합한 Escherichia coli 등을 들 수 있다.

또한, D-세린 합성반응에 있어서의 L-세린의 생성을 억제하는 목적에서, L-세린데아미나아제 활성이 높은 미생물을 이용하는 것에 의해 생성한 L-세린을 분해하는 것도 가능하다. L-세린데아미나아제 활성이 높은 미생물로서 실시예 15에 기재된 L-세린데아미나아제 유전자를 재조합한 Escherichia coli 등을 이용할 수도 있다.

미생물로서, 알라닌 라세마아제, 세린 히드록시메틸트랜스퍼라제, L-트레오닌 알도라제 등의 L-세린의 합성에 관여하는 효소활성이 낮은 미생물 또는 이들의 효소활성이 결손한 미생물을 이용하는 것은, L-세린이 생성하지 않기 때문에 적당하다.

더욱 바람직하게는, 이들 효소가 모두 결손한 미생물을 숙주세포로서 이용하는 것이 바람직하다.

4. DSA의 생산

상기의 형질전환체를 배양하고, 다음에 얻어진 DSA를 채취하는 것에 의해, DSA를 제조할 수 있다.

형질전환체의 배양은, 숙주세포의 배양에 이용되는 통상의 방법에 따라서 행할 수 있다. 형질전환체가 Escherichia coli 등의 원핵미생물, 효모균 등의 진핵미생물일 경우, 이들 미생물을 배양하는 배지는, 상기 미생물이 자화할 수 있는 탄소원, 질소원, 무기염류 등을 함유하고, 형질전환체의 배양을 효율적으로 행할 수 있는 배지이면 천연배지, 합성배지의 어느 것이라도 좋다.

탄소원으로서는, 형질전환체가 자화할 수 있는 것이면 좋고, 글루코오스, 프룩토스, 슈크로스, 이들을 함유하는 당밀, 전분 또는 전분 가수분해물 등의 탄수화물, 아세트산, 프로피온산 등의 유기산, 에탄올, 프로판올 등의 알코올류가 이용된다.

질소원으로서는, 암모니아, 염화암모늄, 황산암모늄, 아세트산암모늄, 인산암모늄 등의 각종 무기산이나 유기산의 암모늄염, 그 밖의 질소함유 화합물, 및, 펩톤, 육류 엑기스, 효모 엑기스, 콘 스팁 리커(corn steep liquor), 카제인 가수분해물, 대두박(大豆粕), 대두박 가수분해물, 각종 발효 균체 및 그 소화물 등이 이용된다.

무기염으로서는, 인산제일칼륨, 인산제이칼륨, 인산마그네슘, 황산마그네슘, 염화나트륨, 황산제일철, 황산망간, 황산구리, 탄산칼슘 등이 이용된다.

배양은, 진탕배양 또는 심부통기교반배양 등의 호기적 조건하에서 행한다. 배양 온도는 15∼50℃가 좋고, 배양시간은, 통상 16시간∼5일간이다. 배양중 pH는, 3.0∼9.0으로 유지한다. pH의 조정은, 무기 또는 유기의 산, 알칼리 용액, 요소, 탄산칼슘, 암모니아 등을 이용하여 행한다. 또한 배양중 필요에 따라서, 앰피실린이나 테트라사이클린 등의 항생 물질을 배지에 첨가해도 좋다.

프로모터로서 유도성의 프로모터를 이용한 발현 벡터로 형질전환한 미생물을 배양할 때에는, 필요에 따라서 인듀서를 배지에 첨가해도 좋다. 예컨대, 1ac프로모터를 이용한 발현 벡터로 형질전환한 미생물을 배양할 때에는 이소프로필-β-D-티오갈락토피라노사이드(IPTG) 등을, trp프로모터를 이용한 발현 벡터로 형질전환한 미생물을 배양할 때에는 인돌 아세트산(IAA) 등을 각각 배지에 첨가해도 좋다.

형질전환체는, 이것을 포함하는 배양액을 원심분리, 여과 등의 수단을 이용하여 분리하여 회수할 수 있다.

형질전환체 처리물은, 세포의 파괴를 목적으로 하여, 형질전환체를 기계적 파괴, 초음파 처리, 동결융해 처리, 건조 처리, 가압 또는 감압 처리, 침투압 처리, 자기소화, 계면활성제 처리, 효소 처리한 것, 및 이들의 처리에 의해 얻어지는 DSA를 포함하는 분획의 고정화물, 형질전환체의 고정화물로서 얻을 수 있다.

또, 본 발명에 있어서 미생물의 처리물도 상기 형질전환체 처리물과 동일한 처리를 한 것을 가리킨다.

이와 같은 형질전환체 또는 형질전환체 처리물로부터 DSA를 정제하기 위하여는, 형질전환 세포를 파쇄하여 세포파쇄액을 이온교환수지나 겔여과 등의 크로마토그래피에 의한 분획이나 황산암모늄 등에 의한 염석 등를 조합시키므로써 정제 효소를 얻을 수 있다.

5. D-세린의 제조방법

상기의 형질전환체 또는 그 형질전환체 처리물의 존재하에서 글리신과 포름알데히드를 반응시키는 것에 의해 D-세린을 제조할 수 있다.

D-세린의 제조는, pH6.0∼9.0, 온도 20∼60℃에서 진탕, 또는 교반조건하에서 행하는 것이 바람직하다.

형질전환체 또는 그 형질전환체 처리물의 사용량은, 포름알데히드와 글리신과의 반응이 충분히 진행하면 특별히 제한되지 않지만, 통상 글리신 1g에 대하여 적어도 10unit, 바람직하게는 50unit 이상의 DSA활성으로 되는 양을 첨가하는 것이 바람직하다. 형질전환체 또는 그 형질전환체 처리물의 첨가방법은 반응 개시시에 일괄하여 첨가해도 상관 없고, 반응중에 분할하여 또는 연속하여 첨가해도 상관 없다.

DSA 활성은, 1μ몰의 D-세린을 1분간에 합성할 수 있는 능력을 1unit로 정의한다.

DSA 활성은, 100mM 글리신, 0.1mM 피리독살인산, 10mM 염화마그네슘, 5mM 포름알데히드를 포함하는 pH8.0의 200mM의 트리스 염산완충액 중에 효소액을 가하여 30℃에서 보온하고, D-세린의 생성량을 측정하여 산출한다.

반응액 중의 글리신의 농도는, 100mM 이상이며, 바람직하게는 1M 이상 5M 이하이다. 글리신의 첨가방법에 관하여는 반응 개시시에 일괄 첨가해도, 반응의 진행 에 따라 분할하여 또는 연속하여 첨가해도 좋다.

포름알데히드는, 그 기체를 반응액 중에 공급할 수 있지만, 수용액 또는 알코올 용액으로서 공급할 수도 있다. 또한, 포름알데히드의 공급원으로서 파라포름알데히드를 사용할 수도 있지만, 37% 정도의 포름알데히드의 수용액의 사용이 적당하다.

포름알데히드의 첨가방법으로서는, 일괄 첨가 또는 반응의 진행에 따라 분할 또는 연속적으로 첨가하는 방법으로 행할 수 있지만, 반응액 중의 포름알데히드 농도는 DSA활성을 저해하지 않을 정도의 농도로 제어하는 것이 바람직하다. DSA 활성을 저해하지 않을 정도의 농도로는 통상 5M 이하, 바람직하게는 2M 이하, 더욱 바람직하게는 500mM 이하, 특히 바람직하게는 300mM 이하이다.

반응액 중의 포름알데히드 농도를 제어하는 방법으로서 (1) 반응액에 일정 속도로 첨가하는 방법, (2) 포름알데히드 농도를 정량하고, 효소활성이 실활하지 않을 정도의 농도가 되고나서 분할 첨가하는 방법, (3) 파라포름알데히드를 첨가하고, 파라포름알데히드가 포름알데히드에 유리하는 속도 이상의 효소량을 반응계에 첨가해 둠으로써 실질적으로 포름알데히드에 의한 저해를 회피하는 방법, (4) 반응의 진행에 따라 반응액 중에 생성물의 D-세린이 축적하고, 원료의 글리신이 감소한다. D-세린과 글리신의 등전점이 각각, 5.68과 5 .97이므로, 반응의 진행에 따라 반응액의 pH의 저하가 일어난다. 반응액의 pH의 저하를 보정하는 양 이상의 알칼리를 반응액에 첨가하고, 그 pH 상승분을 보정할 수 있는 양의 포름알데히드를 첨가한다는 방법으로 포름알데히드를 첨가하는 것도 가능하다.

반응액 중의 DSA량을 미리 설정한 알칼리의 첨가속도, 즉 D-세린의 합성속도이상으로 해 두면, 포름알데히드의 농도를 측정하는 등의 번잡한 조작을 이용하지 않더라도 반응액 중의 포름알데히드 농도를 제어하는 것이 가능하게 된다.

반응액에 첨가하는 알칼리로서는, 수산화리튬, 수산화나트륨, 수산화칼륨 등의 알칼리금속 수산화물 이외에, 수산화암모늄, 수산화칼슘, 인산이칼륨, 인산이나트륨, 피로인산칼륨, 암모니아 등 물에 용해하여, 액성을 염기성으로 하는 것이면 좋다.

반응액의 매체로서는, 물 또는 수성매체, 유기용매 또는 물 또는 수성매체와 유기용매의 혼합액이 이용된다. 수성매체로서는, 예컨대 인산완충액, HEPES(N-2-히드록시에틸피페라진-N-에탄설폰산)완충액, 트리스[트리스(히드록시메틸)아미노메탄]염산완충액 등의 완충액이 이용된다. 유기용매로서는 반응을 저해하지 않는 것이면 어떠한 것이라도 좋고, 예컨대 아세톤, 아세트산에틸, 디메틸설폭시드, 크실렌, 메탄올, 에탄올, 부탄올 등이 이용된다.

상술한 반응에 있어서, 2가의 금속이온을 갖는 화합물, 2-메르캅토에탄올, 디티오슬레이톨, 아황산수소나트륨 등의 환원제나 부효소인 피리독살인산, 암모늄 염 등을 첨가하는 것에 의해 반응수율이 향상하는 경우가 있다.

2가의 금속이온을 갖는 화합물로서는, 예컨대 염화마그네슘, 염화망간, 아세트산코발트, 황산제일철, 염화칼슘 등을 들 수 있다.

이들 화합물의 반응액 중의 농도로서는 통상 0.1mM로부터 100mM, 바람직하게는 0.1mM로부터 10mM이다.

6. 반응액 중의 D-세린의 광학순도를 높이는 방법

상기의 형질전환체 또는 그 형질전환체 처리물을 가열처리하여 얻어지는 처리물, 또는 상기의 형질전환체 또는 그 형질전환체 처리물을 유기용매로 처리하여 얻어지는 처리물의 존재하에서, 글리신과 포름알데히드를 반응시키는 것에 의해, L-세린의 부생을 억제할 수 있다.

가열처리의 조건으로서는 가열에 의해 대폭 DSA활성을 저감시키지 않고, L-세린을 생성하는 활성을 저감 또는 소실시키는 것이 가능하다면 어떤 조건에서도 상관 없다. 구체적인 예로서, 예컨대 pH6.0으로부터 9.0, 온도 40℃로부터 70℃에서 10분간으로부터 6시간정도 교반하는 방법을 들 수 있다.

또한, 유기용매처리와 가열처리를 조합시켜서 행하는 것도 가능하다.

유기용매처리의 조건으로서는 대폭 DSA활성을 저감시키지 않고, L-세린을 생성하는 활성을 저감 또는 소실시키는 것이 가능하다면 어떤 조건에서도 상관 없다. 유기용매처리의 조건으로서는, 유기용매의 농도는 통상 20mM 이상 2M 이하, 바람직하게는 20mM 이상 1M 이하, 더욱 바람직하게는 50mM로부터 1000mM, 특히 바람직하게는 50mM로부터 300mM 정도이다. 유기용매는 DSA활성을 대폭 저감시키지 않는 것이면 제한은 없지만, 포름알데히드, 아세트알데히드, 벤즈알데히드 등의 알데히드류, 메탄올, 에탄올, 이소프로필알코올 등의 알코올류, 아세톤 등의 케톤류, 디클롤로에탄 등의 할로겐화 탄화수소류 등의 유기용매를 이용하는 것이 바람직하다. 그 중에서도 포름알데히드는 효소반응의 기질이기 때문에, 가장 적당하다. D-세린을 첨가함으로써 상기 효소반응에 의해 포름알데히드가 생성하기 위하여, 포름알데히드의 변화에 D-세린을 첨가하는 방법으로도 상관 없다. D-세린의 첨가 농도로서는 100mM로부터 5M 정도가 바람직하다.

유기용매처리의 온도는 10℃로부터 50℃의 범위이고, pH는 6.0으로부터 9.0 의 범위가 바람직하다. 유기용매처리 중에는, 처리액의 pH나 유기용매 농도가 균일하게 되도록 교반하는 것이 바람직하다.

또한, D-세린 제조의 반응 개시시에 포름알데히드 농도를 높임으로써 L-세린의 생성 활성을 저감 또는 실활시키는 것도 가능하다. 이 경우, 반응중의 포름알데히드 농도를 0.1%로부터 5% 정도에서 30분간으로부터 3시간 정도 유지한 후, 통상의 반응을 행하면 좋다.

상술의 처리를 행할 때에, 2가의 금속이온을 갖는 화합물, 2-메르캅토에탄올, 디티오슬레이톨, 아황산수소나트륨 등의 환원제나 부효소인 피리독살인산, 암모늄염 등을 첨가하는 것에 의해 효소활성이 더욱 안정화하는 경우가 있다.

2가의 금속이온을 갖는 화합물로서는, 예컨대, 염화마그네슘, 염화망간, 아세트산코발트, 황산제일철, 염화칼슘 등을 들 수 있다.

이들 화합물의 처리액중의 농도로서는 통상 0.1mM로부터 100mM, 바람직하게는 0.1mM로부터 10mM이다.

D-세린 합성반응 종료후의 반응액에 L-세린세아미나아제 생산균을 가하고, 생성한 L-세린을 분해시키는 것에 의해 최종제품인 D-세린의 광학순도를 높일 수도 있다. L-세린데아미나아제 생산균으로서는 D-세린데아미나아제를 결손한 미생물을 이용하는 것이 바람직하다.

7. D-세린의 채취방법

반응액으로부터의 D-세린의 채취는, 통상의 유기합성 화학에서 이용되는 방법, 예컨대, 유기용매에 의한 추출, 결정화, 박층 크로마토그래피, 고속액체 크로마토그래피 등에 의해 행할 수 있다.

본 발명에 의하면, 공지의 DTA를 이용한 D-세린의 제조방법에 비하여, 글리신과 포름알데히드로부터 D-세린을 수율 좋게 제조할 수 있다.

도 1은, 형질전환체로부터 얻은 파쇄액을 SDS-폴리아크릴 아미드 전기영동에 의해 분석한 결과를 나타내는 도면이다.

도 2는, 정제된 DSA의 SDS-폴리아크릴아미드 전기영동사진이다.

본 명세서는, 본원의 우선권의 기초인 일본국특원 2004-298344호의 명세서 및/또는 도면에 기재된 내용을 포함한다.

이하에 본 발명의 실시예를 나타내지만, 본 발명은 이들의 실시예에 한정되는 것은 아니다. 또, D-세린, L-세린 및 글리신은 고속액체크로마토그래피에 의해 정량했다. 이들의 분석조건 및, 효소(DSA 및 DTA)활성의 측정방법은 다음과 같다.

(1) D-세린 및 L-세린의 분석조건

컬럼 ; TSK-GEL ENANTIO L1 4.6x250(토소주식회사)

컬럼 온도 ; 45℃

펌프 유속; 0.8ml/mln.

검출 ; UV 254nm, 용리액 ; 0.25mM 황산구리:메탄올=9:1(V/V)

(2) 세린 및 글리신의 분석조건

컬럼 ; Shodex RSpak NN-814 8x250(쇼와전공주식회사)

컬럼 온도 ; 40℃

용리액 ; 10mM 인산칼륨(pH3.0)

펌프 유속 ; 0.8ml/mln

검출은 오르토프탈알데히드(OPA)를 이용한 포스트 컬럼 유도체화법[J.Chromatogr., 83, 353~355(1973)]을 이용했다.

(3) 효소활성의 측정방법

100mM 글리신, 0.1mM 피리독살인산, 10mM 염화마그네슘, 5mM 포름알데히드를 포함하는 pH8.0의 200mM의 트리스염산 완충액 0.9mL에 균체 현탁액을 초음파 파쇄한 효소액을 적당히 희석하여 0.1mL를 가하고, 30℃에서 15분간 반응했다.

생성한 D-세린을 HPLC에서 분석하여 활성을 측정했다. 활성의 단위는 1분간에 1μmol의 D-세린을 생성하는 활성을 1unit으로 했다.

[실시예 1]

(DSA를 코드하는 유전자의 취득)

아크로모박터ㆍ크실로속시던스(ATCC9220), 아크로모박터ㆍ데니트리피칸스(NBRC15125), 아크로모박터ㆍ크실로속시던스(NBRC13495)를 50ml의 LB배지에 접종했다. 30℃에서 하룻밤 배양한 후, 집균하고, 리소자임 1mg/ml를 포함하는 용균액으로 용균했다. 용균액을 페놀처리한 후, 통상의 방법에 의해 에탄올 침전에 의해 DNA를 침전시켰다. 생성된 DNA의 침전은, 유리 막대에 둘러 감아서 회수한 후, 세정하고, PCR에 이용했다.

PCR용의 프라이머에는, 공지의 DTA유전자에 근거하여 설계한 서열번호 1 및 2에 나타내는 염기서열을 갖는 올리고 뉴클레오타이드(홋카이도시스템ㆍ사이언스 주식회사에 위탁하여 합성했다)를 이용했다. 이들의 프라이머는, 5'말단부근 및 3'말단부근에, 각각 KpnI 및 HindIII의 제한효소 인식서열을 갖는다.

상기 미생물의 염색체 DNA 6ng/μl 및 프라이머 각 3μM을 포함하는 0.025ml의 PCR반응액을 이용하여, 변성:96℃, 1분간, 어닐링:55℃, 30초간, 신장반응:68℃, 1분 15초간으로 이루어지는 반응 사이클을, 35사이클의 조건에서 PCR을 행하였 다.

PCR 반응산물 및 플라스미드 pUC18(다까라슈조(주))을, KpnI 및 HindIII에서 소화하고, 라이게이션ㆍ하이(토요보(주))를 이용하여 연결한 후, 얻어진 재조합 플라스미드를 이용하여, Escherichia coli DH5α를 형질전환했다. 형질전환주를, 앰피실린(Am) 50μg/ml 및 X-Gal(5-브로모-4-클로로-3-인도릴-β-D-갈락토시드)를 포함하는 LB 한천배지에서 배양하고, Am 내성이고 또한 백색 콜로니로 된 형질전환주를 얻었다. 이와 같이 하여 얻어진 형질전환주로부터 플라스미드를 추출했다. 플라스미드에 도입된 DNA단편의 염기서열을 통상의 염기서열의 결정법에 따라 염기서열을 확인했다.

얻어진 DSA를 코드하는 DNA로부터 예상되는 아미노산 서열의 분자량은 어느쪽도 거의 40kDa이었다.

얻어진 아크로모박터ㆍ크실로속시던스(ATCC9220) 유래의 DSA를 코드하는 DNA를 갖는 플라스미드를 pAcDTA1이라 명명했다.

아크로모박터ㆍ크실로속시던스(NBRC13495) 유래의 DSA를 코드하는 DNA를 갖는 플라스미드를 pAcDTA2과 명명했다. 아크로모박터ㆍ데니트리피칸스(NBRC15125) 유래의 DSA를 코드하는 DNA를 갖는 플라스미드를 pAcDTA3이라 명명했다.

(형질전환체의 제작)

pAcDTA1, pAcDTA2, pAcDTA3을 이용하여 Escherichia coli DH5α를 통상의 방법으로 형질전환하고, 얻어진 형질전환체를 MT-11015, MT-11016, MT-11017이라 명명했다.

각각의 재조합 미생물을 500mL의 배플 부착 삼각 플라스크에 Am 50μg/ml를 포함하는 LB배지 100mL에 접종하고, 30℃에서 OD660이 0.6으로 될 때까지 배양하고, IPTG(이소프로필-β-티오갈락토피라노사이드)가 1mM로 되도록 첨가하고, 16시간 더 진탕배양했다. 배양액을 13000rpm에서 10분간 원심분리하고, 얻어진 균체를 5mL의 1mM 염화마그네슘을 포함하는 100mM 트리스염산 완충액(pH8.0)에 현탁하고, 120℃에서 동결 보존했다.

[실시예 2]

(DSA의 제조법)

실시예 1에서 제작한 형질전환체의 현탁액 0.5mL를 바이오럽터(올림푸스사제)를 이용하여, 빙수 중에서 5분간 파쇄했다. 형질전환체의 파쇄액을 원심분리하고, 파쇄액을 조제했다. 파쇄액을 SDS-폴리아크릴아미드 전기영동에 의해 분석한 결과를 도 1에 나타냈다.

침전물에 100mM 트리스염산 완충액(pH8.O)을 0.5mL 가하여 세포잔사로서 동일하게 분석했다.

어느 형질전환체도 가용성 분획에 약 40kDa의 위치에 발현되는 단백질이 발견되고, 불용성 분획에서는 발견되지 않았다. 이 분자량은 각각의 유전자로부터 추측되는 아미노산 서열의 분자량과 거의 일치했다.

[실시예 3]

(DSA의 정제와 정제 DSA에 의한 D-세린의 합성)

실시예 2와 동일한 방법으로 제작한 MT-11015의 파쇄액 10mL를 10000rpm에서 20분간 원심분리하고, 세포잔사를 제거한 효소액을 조제했다. 효소액을 음이온교환수지(HiTrap Q-XL, 아멀샴사제)에 흡착시켜, 10mM 염화마그네슘 및 50mM 염화나트륨을 포함하는 100mM 트리스염산 완충액(pH8.0)으로부터 10mM 염화마그네슘 및 500mM 염화나트륨을 포함하는 100mM 트리스염산 완충액(pH8.0)으로의 리니어-그래디언트로 용출시켰다. 활성분획을 소수크로마토수지(HiTrap Phenyl FF, 아멀샴사제)에 흡착시키고, 황산암모늄에서 포화시킨 10mM 염화마그네슘을 포함하는 100mM트리스염산 완충액(pH8.0)으로부터 10mM의 염화마그네슘을 포함하는 100mM 트리스염산 완충액(pH8.0)으로의 리니어 그래디언트로 용출시켰다. 또, 이상의 조작은, 약 10℃에서 조작했다.

초음파 파쇄액, 이온교환 크로마토그래피 처리한 후의 활성분획 및 소수 크로마토그래피 처리한 후의 활성분획을 SDS-폴리아크릴아미드 전기영동에 의해 분석한 결과를 도 2에 나타냈다. 정제 DSA의 모노머의 분자량은 40000±5000이었다.

100mM 포름알데히드, 100mM 글리신, 0.1mM PLP, 10mM 염화마그네슘, 200mM 트리스염산 완충액(pH8.0) 100mL로 이루어지는 기질용액에 정제 DSA효소액 150unit를 가해 30℃에서 20시간 반응시켰다.

D-세린의 반응수율은 95%이었다.

[실시예 4]

(D-세린 합성 능력과 D-트레오닌 합성 능력의 비교)

알데히드원으로서, 100mM의 포름알데히드 또는 아세트알데히드를 포함하고, 100mM 글리신, 0.1mM PLP, 10mM 염화마그네슘, 200mM 트리스염산 완충액(pH8.0) 100mL로 이루어지는 기질용액에 실시예 1에서 제작한 MT-11015주의 초음파 파쇄 효소액 150unit를 가하여 30℃에서 20시간 반응시켰다.

알데히드원으로서 포름알데히드는 이용했을 때에는, 수율 90%이었지만 아세트알데히드를 이용했을 때에는 10%이었다.

[실시예 5]

(포름알데히드 100mM농도에서의 D-세린 합성반응)

포름알데히드 100mM, 글리신 100mM, 0.1mM PLP, 10mM 염화마그네슘을 포함하는 pH8.0의 200mM 트리스염산 완충액 100mL로 이루어지는 기질용액에 실시예 1에서 제작한 재조합 미생물의 초음파 파쇄 효소액 150unit를 가하여 30℃에서 20시간 반응시켰다. 결과를 표 1에 나타냈다.

[실시예 6]

(D-세린데아미나아제 결손 Escherichia coli의 제작)

Escherichia coli의 게놈 DNA의 전체 염기서열은 공지이며 (GenBanak accessio nnumber UOOO96), Escherichia coli의 D-세린데아미나아제의 아미노산 서열과 유전자(이하, dsdA라 약기하는 경우가 있다)의 염기서열도 이미 보고되어 있다(GenBank accession number JO1603). Escherichia coli W3110주의 게놈 DNA의 dsdA 근방영역의 유전자정보에 근거하여 제작된, 서열번호 9 및 10, 서열번호 11 및 12에 나타나는 염기서열을 갖는 올리고 뉴클레오타이드를 이용하여 Escherichia coli W3110주(ATCC27325)의 게놈 DNA를 템플레이트로서 PCR를 행하였다. 얻어진 DNA프래그먼트를 각각, 제한효소 PstI와 XbaI, XbaI와 KpnI에서 소화하는 것에 의해, 각각 약 900bp, 800bp의 프래그먼트를 얻었다. 이 DNA프래그먼트를 온도감수성 클로닝 벡터 pTH18cs1(GenBank accession number ABO19610)[Hashimoto-Gotoh, T., Gene, 241, 185-191(2000)]을 PstI, KpnI에서 소화하여 얻어지는 프래그먼트와 혼합하고, 리가아제를 이용하여 결합한 후, DH5α주에 30℃에서 형질전환하고, 클로람페니콜 10μg/ml를 포함하는 LB한천 플레이트에 생육하는 형질전환체를 얻었다. 얻어진 콜로니를 클로람페니콜 10μg/ml를 포함하는 LB액체배지에서 30℃에서 하룻밤 배양하고, 얻어진 균체로부터 플라스미드를 회수했다. 회수한 플라스미드를 XbaI에서 소화하고, T4DNA 폴리머라아제로 평활 말단처리를 행한 후, pUC4K플라스미드(Pharmacia) 유래의 카나마이신 내성유전자와 연결했다.

이와 같이 하여 얻어진 플라스미드를 Escherichia coli W3110주(ATCC27325)에 30℃에서 형질전환하고, 클로람페니콜 10μg/ml와 카나마이신 50μg/ml를 포함하는 LB한천 플레이트에 30℃에서 하룻밤 배양하여, 형질전환체를 얻었다. 얻어진 형질전환체를 카나마이신 50μg/ml를 포함하는 LB액체배지에 접종하고, 30℃에서 하룻밤 배양했다. 다음에 이들의 배양 균체를 얻도록 카나마이신 50μg/ml를 포함하는 LB한천 플레이트에 도포하고, 42℃에서 생육하는 콜로니를 얻었다. 얻어진 콜로니를 카나마이신 50μg/ml를 포함하는 LB액체배지에서 30℃에서 하룻밤 배양하고, 카나마이신 50μg/ml를 더 포함하는 LB한천 플레이트에 도포하여 42℃에서 생육하는 콜로니를 얻었다.

출현한 콜로니 중에서 무작위로 100콜로니를 픽업하여 각각을 카나마이신 50μg/ml를 포함하는 LB한천 플레이트와 클로람페니콜 10μg/ml를 포함하는 LB한천 플레이트에 생육시켜, 카나마이신을 포함하는 LB한천 플레이트에만 생육하는 클로람페니콜 감수성의 클론을 선택했다. 더욱이 이들의 목적 클론의 염색체 DNA로부터 PCR에 의해 dsdA 근방영역의 약 3.Okb 단편을 증폭시켜, dsdA가 카나마이신 내성유전자로 치환되어 있는 주를 선발하고, 얻어진 주를 W3110dsdA 결실주(이하 ΔdsdA라 약기하는 경우가 있다)라 명명했다. 실시예 1에서 제작한 플라스미드를 이용하여 형질전환하고, 상기와 동일하게 동결보존한 균체를 제작하고, 동일한 반응을 행한 바 D-세린의 분해는 거의 확인할 수 없었다.

[실시예 7]

(형질전환체 MT-11016을 사용한 D-세린의 제조:Mg무첨가에 의한 제조)

7.5g의 글리신과 9.4g의 0.026중량%의 피리독살인산에 증류수 53.1g을 가하고, 수산화나트륨으로 pH를 8.0으로 조정했다. 실시예 1에서 얻은 MT-11016의 균체 현탁액(활성으로서 1500unit 상당)을 가했다. 반응온도 30℃에서 20중량%의 포름알데히드 20.8g을 반응액 중의 포름알데히드 농도를 AHMT법(위생화학(1976), Vol22, P39)으로 정량하고, 50mM로부터 300mM로 되도록 첨가했다. 반응액의 pH는 수산화나트륨으로 pH8.0으로 조정했다. 72시간 후의 반응수율은 85%에 달하고 있었다.

[실시예 8]

(형질전환체 MT-11017을 사용한 D-세린의 제조:Mg무첨가에 의한 제조)

7.5g의 글리신과 9.4g의 0.026중량%의 피리독살인산에 증류수 53.1g을 가하고, 수산화나트륨으로 pH를 8.0으로 조정했다. 실시예 1에서 얻은 MT-11017 균체 현탁액(활성으로서 1500unit 상당)을 가했다. 반응온도 30℃에서 20중량%의 포름알데히드 20.8g을 0.8g/15분의 속도로 15분간 첨가하고, 포름알데히드의 첨가를 45분간 정지한다는 사이클을 반복하여 반응액에 첨가했다. 반응액의 pH는 반응중 수산화나트륨으로 pH8.0으로 조정했다. 24시간 후의 D-세린의 반응수율은 95%에 달하고 있었다.

한편, 포름알데히드를 일괄하여 첨가하여 반응시킨 바 반응수율은 20%이었다.

[실시예 9]

(포름알데히드 처리한 형질전환체에 의한 D-세린의 제조:Mg무첨가에 의한 제조)

실시예 1에서 제작한 MT-11015의 동결 균체의 용해액에 포름알데히드를 100mM로 되도록 첨가하고, 30℃에서 1시간 완만하게 교반했다. 교반 중에는 pH를 8.0으로 수산화나트륨으로 조정했다. 상기 균체험 탁액을 이용하여 실시예 8과 동일한 반응을 행하였다. 포름알데히드 처리를 행하지 않았을 경우는 L-세린이 2몰%생성했지만, 포름알데히드 처리를 행한 경우는 L-세린을 검출할 수 없었다.

상기의 반응액에 6N-염산을 가하여 pH를 4.1로 조정했다. 활성탄(50% 수분 함유율) 0.97g을 가하고, 60℃에서 1시간 교반하고, 여과에 의해 활성탄과 균체 성분을 제거했다. 이어서, 여액을 30g까지 농축하고, 이소프로필알코올 13g을 서서히 가하여 얼음 중에서 1시간 완만하게 교반하면서 D-세린을 석출시켰다. 결정이 석출된 용액을 여과하고, 결정을 냉각한 40% 이소프로필알코올 13mL로 세정하여 건조시켰다. 회수율은 60%로 백색의 D-세린 결정이 얻어지고, 원료인 글리신은 검출되지 않았다. 결정의 광학순도는 99.8%ee이었다.

[실시예 10]

[10-1](크산토모나스의 DTA 클로닝과 벡터 구축)

동경대학 분자세포생물학연구소로부터 입수가능한 크산토모나스ㆍ오리제(IAml657)를 50ml의 LB배지에 접종했다. 30℃에서 하룻밤 배양한 후, 집균하고, 리소자임 1mg/ml를 포함하는 용균액에서 용균했다. 용균액을 페놀 처리한 후, 통상의 방법에 의해 에탄올 침전에 의해 DNA를 침전시켰다. 생성된 DNA의 침전은, 유리 막대에 감아서 회수한 후, 세정하고, PCR에 이용했다.

PCR용 프라이머에는, 공지의 크산토모나스ㆍ오리제의 DTA유전자(GenBanak accession number EO5055)에 근거하여 설계한 서열번호 13 및 14에 나타낸 염기서열을 갖는 올리고 뉴클레오타이드(홋카이도 시스템ㆍ사이언스 주식회사에 위탁하여 합성했다)를 이용했다. 이들의 프라이머는, 5'말단 부근 및 3'말단 부근에, 각각 KpnI 및 HindIII의 제한효소 인식서열을 갖는다.

상기 미생물의 염색체 DNA 6ng/μl 및 프라이머 각 3μM을 포함하는 0.025ml의 PCR반응액을 이용하여, 변성:96℃, 1분간, 어닐링:55℃, 30초간, 신장 반응:68℃, 1분 15초간으로 이루어지는 반응 사이클을, 35사이클의 조건에서 PCR을 행하였다.

PCR 반응산물 및 플라스미드 pUC18(다까라슈조(주))을, KpnI 및 HindIII에서 소화하고, 라이게이션ㆍ하이(토요보(주))를 이용하여 연결한 후, 얻어진 재조합 플라스미드를 이용하여, Escherichia coli DH5α를 형질전환했다. 형질전환주를, 앰피실린(Am) 50μg/ml 및 X-Gal(5-브로모-4-클로로-3-인도릴-β-D-갈락토시드)을 포함하는 LB한천배지에서 배양하고, Am 내성이고 또한 백색 콜로니로 된 형질전환주를 얻었다. 이와 같이 하여 얻어진 형질전환주로부터 플라스미드를 추출했다. 플라스미드에 도입된 DNA단편의 염기서열을 통상의 염기서열의 결정법에 따라, 공지의 크산토모나스ㆍ오리제의 DTA와 동일한 서열인 것을 확인했다. 얻어진 발현 플라스미드를 pXDTA1이라 명명했다.

[10-2](크산토모나스속의 DTA발현 Escherichia coli의 취득)

pXDTA1을 이용하여 Escherichia coli W3110ΔdsdA를 통상의 방법으로 형질전환하고, 얻어진 형질전환체를 MT-11028이라 명명했다.

또한, 실시예 1에서 제작한 pAcDTA1, pAcDTA2, pAcDTA3을 이용하여 Escherichia coli W3110ΔdsdA를 통상의 방법으로 형질전환하고, 얻어진 형질전환체를 MT-11015W, MT-11016W, MT-11017W라 명명했다.

[10-3](Jar배양에 의한 균체의 취득)

MT-11015W, MT-11016W, MT-11017W, MT-11028의 재조합 Escherichia coli를 500mL의 배플 부착 삼각 플라스크에 Am 50μg/ml를 포함하는 LB배지 100mL에 접종하고, 30℃에서 OD660이 1.0으로 될 때까지 배양했다.

이어서 10L 용량의 BMS10(에이블사제)로 배양을 행하였다. 배양의 조건은, 교반:700rpm, 온도:30℃, pH(NH₃에서 유지):7.2, 통풍:1vvm, 용량:5L, 배양시간:48시간의 조건에서 조작했다. 배지는, 특기하지 않는 한, 물 1L에 대하여 폴리펩톤(다이니뽄제약) 7g, 황산제일철ㆍ7수화물 0.09g, 황산암모늄 1.5g, 황산마그네슘ㆍ6수화물 2g, 인산수소1칼륨 2g, 인산수소2칼륨 2g, 아데칸올LG126(아사히덴카공업) 0.6g의 배지조성을 이용했다.

접종 전에, 20g/L의 농도로 되도록 글루코오스를 첨가하고, 상기의 배플 부착 삼각 플라스크의 배양액 50ml를 접종했다. 상기의 조건에서 최초의 글루코오스가 완전히 고갈한 후, 나머지 시간을 0.1g/L 미만으로 되도록 한 가변속도에서 글루코오스를 전량으로 200g을 공급했다. 배양액으로부터 원심분리에 의해 균체를 모아서 120℃에서 동결했다.

[10-4](유기용매 처리한 미생물의 L-세린 부생 억제)

[L-세린 부생 효소활성의 측정방법]

MT-11028의 동결 균체 60g(고형분율 약 10%)에 염화마그네슘ㆍ6수화물을 1.Og 가하여 각종 유기용매를 소정 농도로 되도록 가하고, 35℃에서 1시간 교반했다.

상기의 처리 균체액으로부터 건조 균체로서 0.22g분말을 측정하여 취하고, 효소활성 측정액 9g을 가하여 35℃에서 20시간 교반하고, 생성한 L-세린과 잔존하는 D-세린의 비율을 측정했다. 결과를 표 2에 정리하여 나타냈다.

(L-세린 생성 활성 측정액)

D-세린 10.84g, PLP 6mg을 pH7.0의 0.5M 인산칼륨 완충액에서 100g에 용해했다.

[실시예 11]

(유기용매처리한 미생물에 의한 D-세린 합성)

실시예 10에서 얻은 습균체 83.4g(고정분율 약 10%)에 염화마그네슘ㆍ6수화물 1.85g과 37중량%의 포름알데히드 1.2g을 가하고, 물을 가하여 포름알데히드 농도 0.5%로 조정하고, 35℃에서 1시간 교반했다.

물 280g에 글리신 80g과 35중량%의 염화마그네슘6수화물 4g, 37중량%의 포름알데히드 3.1g을 가하고, 수산화나트륨에서 pH를 7.5로 조정했다.

O.38중량%의 PLP용액을 3.2g 첨가하고, 상기의 유기용매 처리 균체를 습균체로 하여 30g을 가하여 반응을 개시했다. 반응중에 pH가 7.3을 상회하면 포름알데히드를 첨가하고, pH를 7.3으로 제어했다. 반응중의 포름알데히드 농도는, 첨가한 포름알데히드로부터 HPLC에서 정량한 D-세린의 생성량을 빼는 것으로 구했다. 반응액 중의 포름알데히드 농도는, 약 80mM로부터 100mM로 제어되어 있었다. 반응 종료후의 세린을 HPLC에서 분석한 결과, 대 Gly 수율 95몰%에서, 광학순도는 99.9%ee이었다.

[실시예 12]

(고포름알데히드 농도의 반응 실시예)

물 280g에 글리신 80g, 35중량%의 염화마그네슘6수화물을 4g 가하여 용해시켰다. 포름알데히드를 각 농도로 되도록 첨가하고, 수산화나트륨으로 pH를 7.5로 조절했다. 0.38중량%의 PLP를 3.2g 가하고, 실시예 10에서 얻은 동결 균체를 30g 가하여 반응을 개시했다. 반응중의 pH가 7.3 이상으로 되면 포름알데히드를 첨가하고, pH르 7.3으로 제어했다. 결과를 표 3에 정리하여 나타냈다.

[실시예 13]

[13-1](glyA 유전자파괴 Escherichia coli의 작출과 DSA 생산균의 제작)

Escherichia coli의 게놈 DNA의 전체 염기서열은 공지이며(GenBanak accession number UOOO96), Escherichia coli의 세린히드록시메틸트랜스퍼라제의 아미노산 서열과 유전자(이하, glyA라 약기하는 경우가 있다)의 염기서열도 이미 보고되어 있다(GenBank accession number JO1620). Escherichia coli W3110주의 게놈 DNA의 glyA 근방영역의 유전자정보에 근거하여 제작된, 서열번호 15 및 16, 서열번호 17 및 18에 나타난 염기서열을 갖는 올리고 뉴클레오타이드를 이용하여 Escherichia coli W3110주(ATCC27325)의 게놈 DNA를 템플레이트로 하여 PCR을 행하였다. 얻어진 DNA프래그먼트를 각각, 제한효소 BamHI과 PstI, PstI과 HindIII에서 소화하는 것에 의해, 각각 약 850bp, 750bp의 프래그먼트를 얻었다. 이 DNA프래그먼트를 온도감수성 클로닝 벡터 pTH18cs1(GenBank accession number ABO19610) [Hashimoto-Gotoh, T., Gene, 241, 185-191(2000)]을 BamHI, HindIII에서 소화하여 얻어지는 프래그먼트와 혼합하고, 리가아제를 이용하여 결합한 후, DH5α주에 30℃에서 형질전환하고, 클로람페니콜 10μg/ml를 포함하는 LB한천 플레이트에 생육하는 형질전환체를 얻었다. 얻어진 콜로니를 클로람페니콜 10μg/ml를 포함하는 LB액체 배지에서 30℃에서 하룻밤 배양하고, 얻어진 균체로부터 플라스미드를 회수했다. 회수한 플라스미드를 PstI에서 소화하고, T4DNA 폴리머라아제에서 평활 말단처리를 행한 후, 트랜스포존 Tn10 유래의 테트라사이클린 내성유전자와 연결했다.

이와 같이 하여 얻어진 플라스미드를 Escherichia coli W3110dsdA 결실주로 30℃에서 형질전환하고, 클로람페니콜 10μg/ml와 테트라사이클린 50μg/ml를 포함하는 LB한천 플레이트에 30℃에서 하룻밤 배양하여, 형질전환체를 얻었다. 얻어진 형질전환체를 테트라사이클린 50μg/ml를 포함하는 LB액체배지에 접종하고, 30℃에서 하룻밤 배양했다. 다음에 이들의 배양 균체가 얻어지도록 테트라사이클린 50μg/ml를 포함하는 LB한천 플레이트에 도포하고, 42℃에서 생육하는 콜로니를 얻었다. 얻어진 콜로니를 테트라사이클린 50μg/ml를 포함하는 LB액체배지에서 30℃에서 하룻밤 배양하고, 테트라사이클린 50μg/ml를 더 포함하는 LB한천 플레이트에 도포하여 42℃에서 생육하는 콜로니를 얻었다.

출현한 콜로니 중에서 무작위로 100콜로니를 픽업하여 각각을 테트라사이클린 50μg/ml를 포함하는 LB한천 플레이트와 클로람페니콜 10μg/ml를 포함하는 LB한천 플레이트에 생육시켜, 테트라사이클린을 포함하는 LB한천 플레이트에만 생육하는 클로람페니콜 감수성의 클론을 선택하였다. 더욱이 이들의 목적 클론의 염색체 DNA로부터 PCR에 의해 glyA 근방영역의 약 3.6kbp의 단편을 증폭시켜, glyA가 테트라사이클린 내성유전자로 치환되어 있는 주를 선발하여, 얻어진 주를 W3110dsdAㆍglyA 결실주라 명명했다.

[13-2](glyA 유전자 파괴 Escherichia coli의 효과)

이 Escherichia coli를 플라스미드 pXDTA1로 형질전환하고, 실시예 10과 동일한 방법으로 배양했다. 다만, 플라스크 배양에서는 글리신을 20mg/L 첨가하고, 배양조에서의 배양에서는, 글리신을 2g/L 첨가하고, 배양의 도중에 글리신을 분할 첨가한 것을 이용했다.

실시예 9와 동일한 방법으로 L-세린의 생성 활성을 조사한 바 D-세린의 광학순도는 97%이었다.

[실시예 14]

(금속염류의 효과)

실시예 10에서 얻은 MT-11028의 동결 균체 100g에 300mM의 EDTA(pH7.5) 3.5g을 첨가하고, 4℃에서 1시간 교반했다. 현탁액 10g을 염화망간, 황산아연, 염화코발트, 염화니켈, 염화칼슘, 염화제일철을 각각 20mM 포함하는 pH7.0의 0.5M 인산칼륨 완충액 10g에 현탁하고, 4℃에서 1시간 교반했다.

이어서 상기 현탁액에, 포름알데히드를 0.5%로 되도록 가하고, 35℃에서 1시간 교반했다. 상기의 처리 균체액으로부터 건조 균체로서 0.22g분을 측정하여 취하고, 실시예 10에 기재의 효소활성 측정액 9g을 가하여 35℃에서 20시간 교반하고, 생성한 L-세린과 잔존하는 D-세린의 비율을 측정했다.

어느 금속염을 이용한 경우도 D-세린의 광학순도는 96% 이상이었다. 또한, 포름알데히드와 글리신으로부터 D-세린을 합성하는 효소활성은 어느 금속염에서도 유기용매 처리전의 활성에 대하여 50% 이상 유지하고 있었다.

[실시예 15]

(L-세린데아미나아제 발현 Escherichia coli에 의한 광학순도를 높이는 방법)

Escherichia coli K-12주를 50ml의 LB배지에 접종했다. 30℃에서 하룻밤 배양한 후, 집균하고, 리소자임 1mg/ml를 포함하는 용균액에서 용균했다. 용균액을 페놀처리한 후, 통상의 방법에 의해 에탄올 침전에 의해 DNA를 침전시켰다. 생성된 DNA의 침전은, 유리 막대에 감아서 회수한 후, 세정하고, PCR에 이용했다.

PCR용 프라이머에는, 공지의 Escherichia coli의 L-세린데아미나아제 유전자(GenBanak accession number M28695)에 근거하여 설계한 서열번호 19 및 20에 나타내는 염기서열을 갖는 올리고 뉴클레오타이드(홋카이도 시스템ㆍ사이언스주식회사에 위탁하여 합성했다)를 이용했다. 이들의 프라이머는, 5'말단 부근 및 3'말단 부근에, 각각 EcoRI 및 HindIII의 제한효소 인식서열을 갖는다.

상기 미생물의 염색체 DNA 6ng/μl 및 프라이머 각 3μM을 포함하는 0.025ml의 PCR반응액을 이용하여, 변성:96℃, 1분간, 어닐링:55℃, 30초간, 신장 반응:68℃, 1분 30초간으로 이루어지는 반응 사이클을, 35사이클의 조건에서 PCR을 행하였다.

PCR 반응산물 및 플라스미드 pUC18(다까라슈조(주))을, EcoRI 및 HindIII에서 소화하고, 라이게이션ㆍ하이(토요보(주))를 이용하여 연결한 후, 얻어진 재조합 플라스미드를 이용하여, Escherichia coli DH5α를 형질전환했다. 형질전환주를, 앰피실린(Am) 50μg/ml 및 X-Gal(5-브로모-4-클로로-3-인도릴-β-D-갈락토시드)을 포함하는 LB한천배지에서 배양하고, Am 내성이고 또한 백색 콜로니로 된 형질전환주를 얻었다. 이와 같이 하여 얻어진 형질전환주로부터 플라스미드를 추출했다. 플라스미드에 도입된 DNA단편의 염기서열을 통상의 염기서열의 결정법에 따라, 공지의 Escherichia coli의 L-세린데아미나아제와 동일한 서열인 것을 확인했다. 얻어진 발현 플라스미드를 pSDA1라 명명했다.

pSDA1을 이용하여 Escherichia coli W3110dsdAㆍglyA 결실주를 통상의 방법으로 형질전환하고, 얻어진 형질전환체를 실시예 13과 동일한 방법으로 배양조에 의한 배양을 행하였다.

실시예 12의 비교예에서 행한 반응과 동일한 방법으로, 반응액에 상기의 균체를 10g 가하여 반응을 행하였다. 반응액을 HPLC에서 분석한 바, 반응액 중의 D-세린의 광학순도는 99.9%이었다.

본 명세서중에서 인용한 모든 간행물, 특허 및 특허출원을 그대로 참고로서 본 명세서 중에 삽입되는 것으로 한다.

본 발명은, 글리신과 포름알데히드로부터 D-세린을 제조하는 방법으로서 유용하다. 또한, 본 발명의 제조방법에 의해 얻어지는 D-세린은 결핵약으로서 유용한 D-사이클로세린의 원료 등의 의약중간체로서 유용하다.

<110> MITSUI CHEMICALS, INC. <120> DNA encoding a novel enzyme having activity to synthesize D-serine, Method for producing the enzyme, and method for manufacturing D-serine using the enzyme. <130> PH-2605-PCT <150> JP 2004-298344 <151> 2004-10-13 <160> 17 <170> PatentIn version 3.3 <210> 1 <211> 43 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Oligonucleotide to act as a PCR primer for cloning of a novel DSA. <220> <221> misc_feature <222> (43) <223> n is a, c, g, or t <400> 1 gtggtaccac aaaaaggata aaacaatgtc ccaggaagtc atn 43 <210> 2 <211> 31 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Oligonucleotide to act as a PCR primer for cloning of a novel DSA. <400> 2 tcgaagcttt tagcgcgaga agccgcgcgc c 31 <210> 3 <211> 1140 <212> DNA <213> Achromobacter xylosoxidans ATCC9220 <400> 3 atgtcccagg aagtcatgcg cggcattgtg ctgcccccgc ccgcccaggc cggcgatccc 60 ctggccagcg tcgacacgcc cagcctggtg ctggacctgg ccgcgttcga ggccaacctg 120 cgcgccatgc aggcctgggc cgaccgccac gaggtcgcgc tgcggccgca cgccaaggcc 180 cacaagtgcc ccgagatcgc gcgccgccag ctggcgctgg gcgcgcgcgg aatctgttgc 240 cagaaggtca gcgaggccgt gcccttcgtg gccgccggca tcaccgacat ccacatcagc 300 aacgaagtgg tcggcccggc caagctgcgc ctcttggccc agctggcgcg cgccgccaag 360 ctcagcgtct gtgtcgacaa cgccgccaac ctggcgcgga tctcgcaggc catggccgcg 420 gccggcgccg agatcgacgt gctggtggaa gtggacgtgg gccagggccg ctgcggcgtg 480 tccgacgacg ccaccgtgct ggcgctggcg cagcaggcgc gcgacctgcc gggcgtgacc 540 ttcgtcggcc tgcaggccta tcacggctcg gtgcagcact tgcgcacccg ggacgaacgc 600 gccgccgtct gccgccaggc cgcgcgcatc gccgcgtcgt atcaactgct gctgcgcgag 660 agcggcatcg cctgcgacat catcaccggc ggcggcaccg gcagcgccga attcgacgcc 720 gccagcggcg tctacaccga actgcaggcc ggttcctacg ccttcatgga cggcgactac 780 ggcgccaacg aatgggacgg cgcgctcgcc ttccagaaca gcctgttcgt gctgtccacc 840 gtgatgagca ccccggcgcc cgatcgcgtc atcctcgacg ccggcctgaa gtccaccacc 900 gccgaatgcg gcccgcccgc gatccacggc gcccagggcc tgcaatacgc cgccatcaac 960 gacgaacacg gcgtggtgcg cgtggcgccc gacgcgcagc cgccggcgct gggcgacacg 1020 ctgctgctgg 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cgtgcgacat catcacagga ggcggcacgg gcagcgcgga gttcgacgcg 720 gcaagcggcg tctacaccga attgcaggcg ggttcatacg cgttcatgga tggcgactac 780 ggcgccaacg aatgggacgg cccgctcacg ttccagaaca gcctgttcgt gttgtccacg 840 gtgatgagcg tgcccgccgc cgaccgcgtg atcctggatg cgggcttgaa atcgactacc 900 gccgaatgcg gcccgcctgc cgtctttgat gctgaagggc tgacctatgc cgccatcaac 960 gacgagcacg gcgtggtgcg cgtggcgcct ggcgccaccg cacccgcgtt gggtgatgtg 1020 ctgcgcctgg tgccgtcgca cgtggacccc accttcaact tgcatgacgg gctggtcgtg 1080 gtgcgggacg gcgtggtgca agacatctgg gagatcgcgg cgcgcggctt ttcgcgctaa 1140 1140 <210> 5 <211> 1140 <212> DNA <213> Achromobacter denitrificans NBRC15125 <400> 5 atgtcccagg aagtcatacg cggcatagcg ctgcccccgg cggcccagcc gggcgatccc 60 ttgtcccgga tcgacacgcc cagcctggtg ctggacctgc cggccttcga ggcgaatctg 120 cgcgccatgc aggcctgggc cgaccggcac gaggtggccc tgcggcccca cgccaaggcg 180 cacaagtgcc cggaaatcgc cttgcgccag ctggccctgg gcgcgcgcgg catctgctgc 240 cagaaggtca gcgaagccct gcccttcgtg gccgccggca tccgcgacat ccacatcagc 300 aacgaagtgg 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DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:primer <400> 6 aactgcagtt gccattccgc tatgtacc 28 <210> 7 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:primer <400> 7 ggtctagaaa tgacagcagg aatgtgc 27 <210> 8 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:primer <400> 8 agtctagaac gcagcatcgc aatcc 25 <210> 9 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:primer <400> 9 atggtacctt actctggagc gatcgtcc 28 <210> 10 <211> 48 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Oligonucleotide to act as a PCR primer for cloning of DAT of Xanthomonas oryzae IAM1657. <400> 10 ggggtaccac aaaaaggata aaacaatgtc ccaggaagtc atacgcgg 48 <210> 11 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Oligonucleotide to act as a PCR primer for cloning of DTA of Xanthomonas oryzae IAM1657. <400> 11 tcgaagcttt tagcgcgaaa agccgcgcgc cgcga 35 <210> 12 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:primer <400> 12 taggatcctc tgctggaaga gaagctcgg 29 <210> 13 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:primer <400> 13 atctgcagca atgtgctcgt tgttcatgcc 30 <210> 14 <211> 31 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:primer <400> 14 atctgcagtt ggcctttata ggcggtcctg t 31 <210> 15 <211> 32 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:primer <400> 15 atgtaagctt tcgcgagtac cttcccaacc ac 32 <210> 16 <211> 50 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Oligonucleotide to act as a PCR primer for cloning of sdaA of Escherichia coli K12. <400> 16 gtgaattcac aaaaaggata aaacaatgat tagtctattc gacatgttta 50 <210> 17 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Oligonucleotide to act as a PCR primer for cloning of sdaA of Escherichia coli K12. <400> 17 tcgaagcttt tagtcacact ggactttgat tgc 33

Claims

이하의 (a) 또는 (b)의 단백질을 코드하는 DNA.

(a) 서열번호 4, 6, 8 중 어느 하나에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 단백질

(b) (a)의 아미노산 서열에 있어서 1 또는 수 개의 아미노산이 결실, 치환, 삽입 또는 부가된 아미노산 서열을 포함하고, 또한 글리신과 포름알데히드로부터 D-세린을 합성하는 효소활성을 갖는 단백질
이하의 (a) 또는 (b)의 DNA.

(a) 서열목록의 서열번호 3, 5, 7 중 어느 하나에 기재된 염기서열 또는 그들의 상보서열로 이루어지는 DNA

(b) 서열목록의 서열번호 3, 5, 7 중 어느 하나에 기재된 염기서열 또는 그들의 상보서열 중의 적어도 20염기의 연속한 DNA서열을 포함하는 DNA단편과 엄격한 조건하에서 하이브리다이즈하고, 또한 글리신과 포름알데히드로부터 D-세린을 합성하는 활성을 갖는 효소를 코드하는 DNA
제 1항 또는 제 2항에 기재된 DNA를 벡터에 삽입하여 이루어지는 재조합 DNA.
제 3항에 기재된 재조합 DNA를 이용하여 숙주세포를 형질전환하여 얻어진 형질전환체.
제 4항에 있어서, 형질전환되는 숙주세포가 미생물인 형질전환체.
제 5항에 있어서, 형질전환되는 미생물이 D-세린데아미나아제가 결손한 미생물인 형질전환체.
이하의 (a) 또는 (b)의 단백질.

(a) 서열번호 4, 6, 8 중 어느 하나에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 단백질

(b) (a)의 아미노산 서열에 있어서 1 또는 수 개의 아미노산이 결실, 치환, 삽입 또는 부가된 아미노산 서열을 포함하고, 또한 글리신과 포름알데히드로부터 D-세린을 합성하는 효소활성을 갖는 단백질
제 4항 내지 제 6항 중 어느 한 항에 기재된 형질전환체를 배양하고, 얻어진 배양물로부터 글리신과 포름알데히드로부터 D-세린을 합성하는 효소활성을 갖는 단백질을 채취하는 것을 특징으로 하는, 글리신과 포름알데히드로부터 D-세린을 합성하는 활성을 갖는 효소의 제조방법.
제 4항 내지 제 6항 중 어느 한 항에 기재된 형질전환체 또는 그 처리물의 존재하에서 글리신과 포름알데히드를 반응시키는 것을 포함하는 D-세린의 제조방법.
제 7항에 기재된 단백질의 존재하에서 글리신과 포름알데히드를 반응시키는 것을 포함하는 D-세린의 제조방법.
글리신과 포름알데히드로부터 D-세린을 합성하는 활성을 갖는 미생물 또는 그 처리물의 존재하에서, 글리신과 포름알데히드를 반응시켜 D-세린을 합성하는 D-세린의 제조방법으로서, 상기 반응의 반응액 중의 L-세린의 부생을 D-세린에 대하여 1.5몰% 이하로 억제시키는 이하의 (1)∼(4) 중 하나 이상의 수단을 갖는 D-세린의 제조방법.

(1) 글리신과 포름알데히드로부터 D-세린을 합성하는 활성을 갖는 미생물을 유기용매처리 및/또는 가열처리하는 방법,

(2) 반응액 중의 포름알데히드 농도를, a) 상기 (1)의 방법에 의해 유기용매처리 및/또는 가열처리를 실시하는 경우에는 2M 이하로 제어하고, b) 유기용매처리 및/또는 가열처리를 실시하지 않는 경우에는, 150mM 이상 2M 이하로 제어하는 방법,

(3) 글리신과 포름알데히드로부터 D-세린을 합성하는 활성을 갖는 효소를 함유하고, 또한, L-세린 합성 효소유전자가 결실되어 있는 미생물을 촉매로서 이용하 는 방법,

(4) L-세린데아미나아제 활성을 갖는 효소를 함유하는 미생물을 반응액 중에 첨가하는 방법.
제 11항에 있어서, 유기용매가 포름알데히드, 벤즈알데히드, 디클롤로에탄 및 이소프로필알코올로부터 선택되는 1종 이상의 것인 제조방법.
제 11항 또는 제 12항에 있어서, 유기용매처리 및/또는 가열처리를 2가의 금속이온의 존재하에서 행하는 제조방법.
제 13항에 있어서, 2가의 금속이 마그네슘, 망간, 아연, 니켈, 코발트 및 철로부터 선택되는 1종 이상의 금속인 제조방법.
제 11항에 있어서, 글리신과 포름알데히드로부터 D-세린을 합성하는 활성을 갖는 미생물이 제 5항 또는 제 6항에 기재된 형질전환체인 제조방법.