CN117225891A - 一种黑麦草联合芽孢杆菌修复重金属污染土壤的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种黑麦草联合芽孢杆菌修复重金属污染土壤的方法，属于污染土壤修复领域，发明人首次发现将黑麦草与芽孢杆菌联合修复镉污染土壤，能够有效降低土壤中有效态的镉含量，抑制了土壤中重金属的生物有效性，对土壤中镉具有良好的钝化效果，降低重金属对植物的毒性，减轻了镉污染造成的土壤质量、肥力和微生态环境的破坏，同时也降低了黑麦草中镉的含量，避免因为黑麦草中镉含量过高，增加黑麦草处理时的难度。
Description
技术领域
本发明属于污染土壤修复领域，具体涉及一种黑麦草联合芽孢杆菌修复重金属污染土壤的方法。
背景技术
土壤重金属污染已经成为严重制约农业发展、危害农产品安全的环境问题。传统的土壤重金属污染修复技术主要包括客土法、钝化法、电动法、淋洗法、植物和微生物修复法。
植物稳定修复技术是利用植物的吸收、螯合、络合、沉淀、分解以及氧化还原等多种过程，将土壤中的重金属污染物进行钝化或固定，以降低其生物有效性及迁移性，将其转化为相对环境友好的形态，从而防止其进入食物链和地下水，避免或减轻污染物对生物和环境的危害。但是，修复植物生长缓慢、生物量低、耐受量差等问题限制了该技术大规模应用和推广。黑麦草是一种生长快、产量大、营养丰富、具有景观和畜牧价值的草本植物，对土壤中重金属有一定的耐受性，可作为修复植物改善重金属污染(Nie M.,Tang Y.,Hu C.,Cao J.,Zhao X.,Wu C.,Shi G.,Wang X.2023.Selenium and bacillus proteolyticusSES synergistically enhanced ryegrass to remediate Cu-Cd-Cr contaminatedsoil.Environmental Pollution,323,121272-121272)，但单纯的黑麦草对重金属污染土壤的修复效率不高。
植物促生细菌是在植物根际系统定殖、能够明显促进植物生长的一类有益细菌的总称。芽孢杆菌是较常见的植物促生细菌，具有防治病虫害、提高植物品质的作用，但是目前黑麦草联合芽孢杆菌对镉污染土壤的修复效果及机制尚不清楚。
中国文献《外源添加霍氏肠杆菌对草坪草镉胁迫下生理和代谢的影响》(凌宇，扬州大学，2022年)该文献利用多年生黑麦草和霍氏肠杆菌联合修复镉污染土壤，在重金属镉胁迫下，外源添加霍氏肠杆菌可以帮助根部的重金属离子转移到地上部分，促进多年生黑麦草对金属离子的转运，增强植物对镉的富集能力。目前研究比较多的是将植物与微生物菌种联合修复镉污染土壤，通过增强植物对镉的富集能力修复镉污染土壤，但是该方法增加了镉富集植物的后续处理难度；现有技术中对于将植物与微生物菌种联合钝化镉污染土壤的研究极少。
发明内容
针对现有技术的不足，本发明提供了一种黑麦草联合芽孢杆菌修复重金属污染土壤的方法。
本发明的技术方案如下：
一种黑麦草联合芽孢杆菌修复重金属污染土壤的方法，包括如下步骤：
将黑麦草种植在有重金属污染的土壤中，施用芽孢杆菌菌剂，然后进行常规栽培管理至黑麦草收获。
根据本发明优选的，所述方法，包括如下步骤：
将重金属污染土壤翻整后播种黑麦草种子，黑麦草种子发芽后在其根际土壤中接种芽孢杆菌菌剂，黑麦草生长60～90天后，收获植物地上部分和地下部分，集中处置，再进行新一轮的黑麦草播种和芽孢杆菌接种，直至污染土壤中重金属含量符合土壤环境质量标准。
根据本发明优选的，所述芽孢杆菌菌剂利用固体废弃物基质发酵制得，所述固体废弃物包括生活污泥、粉煤灰、蚯蚓粪、鸡粪之一或二者以上；所述固体废弃物是处理后作为基质，具体为：将固体废弃物研磨过筛(2mm)，按不同比例混合，保持含水率65-70％，有氧发酵30-60天，灭菌后作为发酵基质。
根据本发明优选的，所述芽孢杆菌菌剂的浓度为(1～9)×109CFU/mL。
根据本发明优选的，所述重金属污染物为镉污染。
根据本发明优选的，所述芽孢杆菌为枯草芽孢杆菌。
进一步优选的，所述芽孢杆菌为枯草芽孢杆菌TTL1、枯草芽孢杆菌HBS2、枯草芽孢杆菌TBG3。
更优选的，所述芽孢杆菌为枯草芽孢杆菌TTL1。
根据本发明优选的，所述方法，包括如下步骤：
黑麦草种子在重金属污染的土壤中播种密度为每平方米3500～8500株，播种后定期浇水以保持土壤含水量在最大田间持水量的50％～80％，芽孢杆菌菌剂稀释至活菌浓度为(1～4)×108CFU/mL，接种比例为每次每平方米600～800mL，自黑麦草种子发芽后2～4周时间内，每周接种1～3次，黑麦草收获前不再施用菌剂，然后进行常规栽培管理至黑麦草收获。
本发明的有益效果
1、发明人首次发现将黑麦草与芽孢杆菌联合修复镉污染土壤，能够有效降低土壤中有效态的镉含量，抑制了土壤中重金属的生物有效性，对土壤中镉具有良好的钝化效果，降低重金属对植物的毒性，减轻了镉污染造成的土壤质量、肥力和微生态环境的破坏，同时也降低了黑麦草中镉的含量，避免因为黑麦草中镉含量过高，增加黑麦草处理时的难度。
2、本发明提供的方法对镉污染土壤治理效果好，运行成本低廉，操作方式简便，具有很好的理论和应用价值。
3、本发明采用固体废弃物作为芽孢杆菌的生长基质，既节省了微生物生长所需化学培养基的成本，又可提高土壤肥力，改善土壤结构，有利于植物生长，并实现固体废弃物资源化利用。
附图说明
图1为实施例1中接种TTL1芽孢杆菌实验组与黑麦草对照组生长的黑麦草植株照片。
具体实施方式
下面结合实例对本发明进一步详细说明，但保护范围不限于此。
实施例中未详加说明的均按本领域现有技术。
枯草芽孢杆菌TTL1，来自山东省科学院生态研究所微生物保藏库，可由此购买获得，保藏号为Z206D4。
枯草芽孢杆菌HBS2，来自山东省科学院生态研究所微生物保藏库，可由此购买获得，保藏号为Z209B3。
枯草芽孢杆菌TBG3，来自山东省科学院生态研究所微生物保藏库，可由此购买获得，保藏号为Z210C2。
实施例1
一种黑麦草联合芽孢杆菌修复重金属污染土壤的方法。
负载镉土壤的制备：取山东省科学院东区设施菜地表层土壤，自然风干，过2mm筛，按水土比1mL:1.2g加入氯化镉溶液，平衡60天，最终土壤中总镉浓度为3.80mg/kg，土壤中有效态镉浓度为2.31mg/kg。
固体废弃物基质的制备：生活污泥与蚯蚓粪分别晾干、研磨、过2mm筛，按3:1质量比混合，浇水使基质含水率按质量分数计保持在70％，有氧发酵40天。枯草芽孢杆菌TTL1菌体悬浮液的制备：Luria-Bertani液体培养基在121℃下灭菌30min，接入体积比例1％的芽孢杆菌液体菌种，在35℃，150rpm下活化培养2天，然后将此菌液按固液比例1g:10mL(即固体基质：菌液)接入高压蒸汽灭菌后的固体废弃物基质中，在35℃，150rpm下扩大培养7天。
所述芽孢杆菌菌体最终发酵液为半固体状态，其中枯草芽孢杆菌TTL1的活菌浓度为1.0×109CFU/mL。
枯草芽孢杆菌HBS2菌体发酵液的制备方法同上，最终获得发酵液为半固体状态，其中枯草芽孢杆菌HBS2的活菌浓度为4.7×109CFU/mL。
枯草芽孢杆菌TBG3菌体发酵液的制备方法同上，最终获得发酵液为半固体状态，其中枯草芽孢杆菌TBG3的活菌浓度为5.3×109CFU/mL。
称取1.5kg负载镉土壤于塑料盆(直径16.5cm×高度17.5cm)中，施磷酸二氢钾0.33g、尿素0.35g，每盆均匀撒播200粒经5％过氧化氢溶液消毒处理后的黑麦草种子，表面覆盖薄土层，定期浇水以保持土壤含水量在最大田间持水量的60％，黑麦草种子发芽后4周时间内，在实验组根际土壤中每周周一添加1次15mL稀释10倍的菌体发酵液，黑麦草对照组根际土壤中每周周一添加1次15mL经高压灭菌后的稀释10倍的菌体发酵液，每个组设置三次重复。此外，设置不种植植物也不接种微生物的空白组，且重复三次。黑麦草继续生长56天后，收获植物，分为地上和地下部分，分别测定干重及重金属含量，并测定土壤中总镉含量，采用DTPA(二乙三胺五乙酸)提取法测定土壤有效态镉含量，实验结果见表1。
镉钝化率＝(处理前土壤中生物可利用态镉含量-处理后土壤中生物可利用态镉含量)/处理前土壤中生物可利用态镉含量×100％。
由表1的实验结果可以看出，将黑麦草与芽孢杆菌联合使用，能够有效降低镉污染土壤中有效态镉含量，土壤镉钝化明显，黑麦草与TTL1芽孢杆菌联合使用时，土壤镉钝化效果更显著，降低了重金属镉对植物的毒性。
由表1的实验结果还可以看出，将黑麦草与芽孢杆菌联合使用，虽然促进了黑麦草的生长，但是抑制了黑麦草对镉的吸收，黑麦草中的镉含量降低了，该作用效果可以降低黑麦草处理时的难度，黑麦草与TTL1芽孢杆菌联合使用时，黑麦草中的镉含量降低的更明显。
由图1可以看出，与芽孢杆菌联合后，黑麦草植株更高、根系更发达、长势更好。
表1
实施例2
一种黑麦草联合芽孢杆菌修复重金属污染土壤的方法。
负载镉土壤的制备：取山东省科学院东区设施菜地表层土壤，自然风干，过2mm筛，按水土比1mL:1.5g加入氯化镉溶液，平衡60天，最终土壤中总镉浓度为5.50mg/kg，土壤中有效态镉浓度为2.63mg/kg。
固体废弃物基质的制备：粉煤灰与鸡粪分别研磨后过2mm筛，按4:1质量比混合，浇水使质量含水率保持在65％，有氧发酵50天。
枯草芽孢杆菌HBS2菌体悬浮液的制备：Luria-Bertani液体培养基在121℃下灭菌30min，接入体积比例1％的芽孢杆菌液体菌种，在35℃，150rpm下活化培养2天，然后将此菌液按固液比例1g:10mL(即固体基质：菌液)接入高压蒸汽灭菌后的固体废弃物基质中，在35℃，150rpm下扩大培养7天。
所述芽孢杆菌菌体最终发酵液为半固体状态，其中枯草芽孢杆菌HBS2的活菌浓度为5.2×109CFU/mL。
枯草芽孢杆菌TTL1菌体发酵液的制备方法同上，最终获得发酵液为半固体状态，其中枯草芽孢杆菌TTL1的活菌浓度为2.3×109CFU/mL。
枯草芽孢杆菌TBG3菌体发酵液的制备方法同上，最终获得发酵液为半固体状态，其中枯草芽孢杆菌TBG3的活菌浓度为5.4×109CFU/mL。
称取1.5kg负载镉土壤于塑料盆(直径16.5cm×高度17.5cm)中，施磷酸二氢钾0.33g、尿素0.35g，每盆均匀撒播200粒经5％过氧化氢溶液消毒处理后的黑麦草种子，表面覆盖薄土层，定期浇水以保持土壤含水量在最大田间持水量的65％，黑麦草种子发芽后3周时间内，在实验组根际土壤中每周周一和周四分别添加1次15mL稀释10倍的菌体发酵液，黑麦草对照组根际土壤中每周周一和周四添加1次15mL经高压灭菌后的稀释10倍的菌体发酵液，每个组重复三次，黑麦草继续生长49天后，收获整株植物。此外，设置不种植植物也不接种微生物的空白组，且重复三次。实验结束后测定植物鲜样中过氧化物酶(POD)、超氧化物歧化酶(SOD)酶活性和新鲜土壤中脲酶、碱性磷酸酶(ALP)活性。
POD和SOD是植物体内两种重要的抗氧化酶，可以通过调节植物体内活性氧水平维持细胞内的氧化-还原平衡和细胞活性，提高植物抗逆性。土壤脲酶是对尿素转化起关键作用的酶，其酶促反应产物是可供植物利用的氮源，其活性可表示土壤供氮能力。碱性磷酸酶主要作用于土壤中的有机磷，将其水解为磷酸盐，供植物吸收利用。
相比黑麦草对照，播种黑麦草后接种TTL1芽孢杆菌发酵液使得植物POD和SOD活性、土壤脲酶和ALP活性以及土壤镉钝化率分别增加1.0、7.0、0.9、1.1、2.4倍；播种黑麦草后接种HBS2芽孢杆菌发酵液使得植物POD和SOD活性、土壤脲酶和ALP活性以及土壤镉钝化率分别增加0.9、6.4、0.8、1.0、2.0倍；播种黑麦草后接种TBG3芽孢杆菌发酵液使得植物POD和SOD活性、土壤脲酶和ALP活性以及土壤镉钝化率分别增加0.8、6.3、0.7、0.8、1.8倍(表2)，说明接种芽孢杆菌不仅显著降低了土壤中重金属的生物有效性，减少了植物对重金属的积累，减轻重金属对植物的毒害作用，降低重金属积累植物后续的处理成本，而且提高了土壤酶活性和土壤肥力，提高了植物酶活性和抗过氧化能力，加强了土壤修复的整体效果，其有益效果有一定的菌种特异性，TTL1芽孢杆菌的促进效果更显著。
表2
采用Illumina HiSeq高通量测序技术对土壤中细菌的16S rDNA的V3-V4区PCR扩增产物进行测序，并对测序数据进行微生物Alpha多样性分析，统计各土壤样品在97％相似度水平下的Ace及Shannon指数，其中ACE指数用于衡量物种丰度即物种数量的多少，Shannon指数用于衡量物种多样性。
相比黑麦草对照，播种黑麦草后接种TTL1芽孢杆菌发酵液使得土壤微生物丰富度指数降低23％、多样性指数降低60％，土壤优势细菌门Proteobacteria丰度增加109％，Bacteroidetes和Firmicutes丰度分别降低79％和69％；播种黑麦草后接种HBS2芽孢杆菌发酵液使得土壤微生物丰富度指数降低20％、多样性指数降低55％，土壤优势细菌门Proteobacteria丰度增加87％，Bacteroidetes和Firmicutes丰度分别降低65％和76％；播种黑麦草后接种TBG3芽孢杆菌发酵液使得土壤微生物丰富度指数降低18％、多样性指数降低49％，土壤优势细菌门Proteobacteria丰度增加98％，Bacteroidetes和Firmicutes丰度分别降低70％和71％(表3)，说明黑麦草与芽孢杆菌联合使用，虽然降低了土壤微生物结构和功能多样性，但是能够调控土壤优势细菌群落组成，有利于改善土壤的微生态环境，黑麦草与TTL1芽孢杆菌联合使用效果更明显。
表3
实施例3
一种黑麦草联合芽孢杆菌修复重金属污染土壤的方法。
负载镉土壤的制备：取山东省科学院东区设施菜地表层土壤，自然风干，过2mm筛，按水土比1mL:2g加入硝酸镉溶液，平衡60天，最终土壤中总镉浓度为4.0mg/kg，土壤中有效态镉浓度为2.17mg/kg。
枯草芽孢杆菌TBG3菌体悬浮液的制备：Luria-Bertani液体培养基在121℃下灭菌30min，接入体积比例1％的芽孢杆菌液体菌种，在35℃，150rpm下活化培养2天，然后将此菌液按体积比1％再接入高压蒸汽灭菌后的固体废弃物基质中，在35℃，150rpm下扩大培养7天。
所述芽孢杆菌菌体最终发酵液为半固体状态，其中枯草芽孢杆菌TBG3的活菌浓度为6.9×109CFU/mL。
枯草芽孢杆菌TTL1菌体发酵液的制备方法同上，最终获得发酵液为半固体状态，其中枯草芽孢杆菌TTL1的活菌浓度为3.7×109CFU/mL。
称取1.5kg负载镉土壤置于塑料盆(直径16.5cm×高度17.5cm)中，施磷酸二氢钾0.33g、尿素0.35g，每盆均匀撒播0.5g(干重)经5％过氧化氢溶液消毒处理后的黑麦草或紫花苜蓿种子，表面覆盖薄土层，定期浇水以保持土壤含水量在最大田间持水量的60％，种子发芽后4周时间内，在黑麦草和紫花苜蓿实验组根际土壤中每周一、周三和周五分别添加1次15mL稀释10倍的菌体发酵液，黑麦草和紫花苜蓿对照组根际土壤中每周一、周三和周五分别添加1次15mL经高压灭菌后的稀释10倍的菌体发酵液，每个组重复三次。此外，设置不种植植物、添加灭菌微生物的空白组和不种植植物、接种微生物的芽孢杆菌对照组，每组重复三次。黑麦草继续生长46天、苜蓿继续生长75天后，收获整株植物，测定整株植物镉含量，采用抖根法抖掉根部多余土壤，收集用于测定土壤总镉及有效态镉含量，粘在根部的剩余土壤采集为根际土壤，用于提取并测定代谢物，实验结果见表4、表5。
由表4可以看出，只在土壤中接种芽孢杆菌，土壤中有效态镉含量增加了；而将黑麦草与芽孢杆菌联合使用的实验组中，土壤中有效态镉含量降低明显，而且黑麦草中的镉含量与只种植黑麦草对照组相比降低了，土壤中有效态镉含量显著低于黑麦草对照组，说明黑麦草与芽孢杆菌联合使用能够有效钝化土壤中有效态镉；尤其是黑麦草与TTL1芽孢杆菌联合使用的作用效果更优。进一步的，黑麦草与芽孢杆菌联合使用抑制了黑麦草对镉的吸收，黑麦草中的镉含量降低了，该作用效果可以降低黑麦草处理时的难度。
由表4还可以看出，将苜蓿与芽孢杆菌联合使用的实验组中土壤有效态镉含量要高于黑麦草与芽孢杆菌联合使用的实验组中土壤有效态镉含量；并且实验组苜蓿中的镉含量与只种植苜蓿对照组相比镉含量升高了，苜蓿与芽孢杆菌联合使用促进了苜蓿对镉的吸收。
因此可以得出，黑麦草和芽孢杆菌联合与苜蓿和芽孢杆菌联合相比，对于钝化土壤有效态镉更有效，能够明显降低土壤中镉的生物有效性。
表4
对于接种TTL1的黑麦草实验组与黑麦草对照组的根际土壤代谢物，采用超高效液相色谱串联质谱(UHPLC-MS/MS)进行非靶标代谢组学分析，采用正交偏最小二乘法-判别分析(OPLS-DA)模型筛选出具有统计学差异的有机酸和氨基酸代谢物，筛选标准为含量差异倍数>1.5，显著性水平p值<0.05，并且用于检测OPLS-DA模型可靠度的指标VIP(变量投影重要度)值>1。
相比黑麦草对照组，实验组中接种芽孢杆菌显著影响了黑麦草根际土壤代谢物中6-磷酸葡糖酸、邻阿魏酰半乳糖酸、三磷酸尿苷、十六烷酸等有机酸，二十二烷酸甘油三酯、氯霉素琥珀酸酯、亚油酸甘油三酯、单油酸甘油三酯、甘油二酯等脂类，环状二磷酸腺苷核糖、蔗糖、2'-脱氧-D-核糖等糖类，以及磷脂酰乙醇胺、sn-甘油-3-磷酸乙醇胺等胺类化合物的含量，其中十六烷酸和甘油二酯含量下调，其它化合物含量上调(表5)，说明在黑麦草根部接种芽孢杆菌主要通过调控有机酸、脂类、糖类和胺类物质代谢途径促进镉的钝化与稳定、降低镉的生物可利用性、并减弱黑麦草对镉的吸收与转运。
以往影响土壤中重金属形态和迁移的根系分泌物研究多集中于柠檬酸、草酸、苹果酸等几种常见的确定的小分子有机酸(Montiel-Rozas M.M.,Madejón E.,Madejón P.,2016.Effect of heavy metals and organic matter on root exudates(low molecularweight organic acids)of herbaceous species:An assessment in sand and soilconditions under different levels of contamination.Environmental Pollution216,273-281)，而且多采用水培试验(Luo Q.,Sun L.N.,Hu X.M.,2015.Metabonomicsstudy on root exudates of cadmium hyperaccumulator Sedum Alfredii.ChineseJournal of Analytical Chemistry,43(1):7-12)，与实际农田情况相差较远，本发明采用盆栽试验，采集根际土壤代谢物(包括根系分泌物和微生物代谢物)，筛选出不同于以往报道的有显著差异的4种有机酸、5种脂类、3种糖类和2种胺类化合物，分析相应的代谢途径可理论指导植物-微生物联合修复重金属污染土壤的机制揭示和策略制定。
表5
本发明通过黑麦草联合芽孢杆菌修复重金属污染土壤，尤其是镉污染的土壤，通过对土壤中有效态镉的钝化，能够显著降低土壤中重金属的生物有效性，并改善了土壤的微生态环境，尤其是黑麦草联合枯草芽孢杆菌TTL1修复重金属污染土壤作用效果更优；本发明提供的方法运行成本低廉，操作方式简便，具有很好的理论和应用价值。
Claims (9)
1.一种黑麦草联合芽孢杆菌修复重金属污染土壤的方法，其特征在于，包括如下步骤：
将黑麦草种植在有重金属污染的土壤中，施用芽孢杆菌菌剂，然后进行常规栽培管理至黑麦草收获。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，包括如下步骤：
将重金属污染土壤翻整后播种黑麦草种子，黑麦草种子发芽后在其根际土壤中接种芽孢杆菌菌剂，黑麦草生长60～90天后，收获植物地上部分和地下部分，集中处置，再进行新一轮的黑麦草播种和芽孢杆菌接种，直至污染土壤中重金属含量符合土壤环境质量标准。
3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述芽孢杆菌菌剂利用固体废弃物基质发酵制得，所述固体废弃物包括生活污泥、粉煤灰、蚯蚓粪、鸡粪之一或二者以上；所述固体废弃物是处理后作为基质，具体为：将固体废弃物研磨过筛，按不同比例混合，保持含水率65-70％，有氧发酵30-60天，灭菌后作为发酵基质。
4.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述芽孢杆菌菌剂的浓度为(1～9)×109CFU/mL。
5.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述重金属污染物为镉污染。
6.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述芽孢杆菌为枯草芽孢杆菌。
7.如权利要求6所述的方法，其特征在于，所述芽孢杆菌为枯草芽孢杆菌TTL1、枯草芽孢杆菌HBS2、枯草芽孢杆菌TBG3。
8.如权利要求7所述的方法，其特征在于，所述芽孢杆菌为枯草芽孢杆菌TTL1。
9.如权利要求1所述的方法，其特征在于，包括如下步骤：
黑麦草种子在重金属污染的土壤中播种密度为每平方米3500～8500株，播种后定期浇水以保持土壤含水量在最大田间持水量的50％～80％，芽孢杆菌菌剂稀释至活菌浓度为(1～4)×108CFU/mL，接种比例为每次每平方米600～800mL，自黑麦草种子发芽后2～4周时间内，每周接种1～3次，黑麦草收获前不再施用菌剂，然后进行常规栽培管理至黑麦草收获。
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