CN114350567A - 一种农用芽孢杆菌固体菌剂的制备方法及铅镉污染土壤的治理方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种农用芽孢杆菌固体菌剂的制备方法及铅镉污染土壤的治理方法，所述制备方法包括如下步骤：(1)菌种活化：取农用芽孢杆菌菌种在LB固体培养基上划线培养24h，挑取单菌落接种于LB液体培养基中振荡培养24h，再扩大培养；(2)菌剂制备：将扩大培养的菌液进行接种发酵，以菌液体积为基准加入经灭菌处理的麦饭石粉，往菌液加入经灭菌处理的麦饭石粉，培养得到发酵液，往发酵液中加入喷雾干燥保护剂，振荡摇匀，得到芽孢杆菌菌剂悬浮液；(3)对芽孢杆菌菌剂悬浮液进行喷雾干燥，得到固体颗粒菌剂。该制备方法既能有效减少喷雾干燥过程中农用芽孢杆菌的活性损失，提高菌剂的活菌率，且能固定化菌群进行铅镉污染土壤修复。
Description
技术领域
本发明涉及一种农用芽孢杆菌固体菌剂的制备方法及铅镉污染土壤的治理方法，属于农用微生物菌剂技术领域。
背景技术
本部分的描述仅提供与本说明书公开相关的背景信息，而不构成现有技术。
改革开发以来，农业生产迅速发展，对化肥的过度依赖导致了重金属富集、土壤板结、水土流失等严重环境问题，相较于其他污染问题，重金属污染尤为严重。重金属一旦通过环境介质转移进入食物链，进而会对人类健康构成严重的危害。随着人们对生态环境、食品安全的重视，微生物肥料得到广泛关注。
芽孢杆菌因其良好的存活率与修复效果，在微生物肥料领域有着广泛应用。地衣芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌、蜡样芽孢杆菌等是生产微生物肥料的重要菌种。喷雾干燥是生产微生物肥料的重要手段，喷雾干燥是经前期处理的物料通过喷嘴雾化成微米级液滴，经除湿与加热的空气将物料进行快速干燥的一种方法。干燥过程中雾化液滴迅速蒸发，形成干颗粒。喷雾干燥技术制备微生物菌剂，不仅可以使得菌体与外界不良环境隔离，较好的保存菌体的活性，还能使菌剂形成近似球体的固体微颗粒，便于运输、储存与添加利用。
利用喷雾干燥技术制备高活性高质量的微生物菌剂，选择合适的抗热保护剂尤为重要。保护剂能有效的提高喷雾干燥过程中微生物的存活率与其在储藏过程中的活性。目前得到实际应用的抗热保护剂种类繁多，保护机理也各不相同，如天然乳清蛋白分子的疏水基团与菌体表面存在疏水作用，使得蛋白质分子形成致密网络结构，保护内部菌体。海藻糖能在菌体受高温胁迫脱水时替代水分子，从而保护菌体生物大分子结构不因脱水而剧变。然而单一保护剂的效果有限，为了提高菌体存活率，利用复合保护剂效果更好，复合保护剂中各种材料能发挥其各自作用，能在喷雾干燥中达到最佳保护效果。
应该注意，上面对技术背景的介绍只是为了方便对本说明书的技术方案进行清楚、完整的说明，并方便本领域技术人员的理解而阐述的。不能仅仅因为这些方案在本说明书的背景技术部分进行了阐述而认为上述技术方案为本领域技术人员所公知。
发明内容
本发明要解决的技术问题，就是针对现有技术所存在的不足，而提供一种农用芽孢杆菌固体菌剂的制备方法及铅镉污染土壤的治理方法，该农用芽孢杆菌固体菌剂的制备方法既能有效减少喷雾干燥过程中农用芽孢杆菌的活性损失，有效的将菌群进行固定化，提高菌剂的活菌率，又能提高菌剂保藏存活率，同时该农用芽孢杆菌固体菌剂的制备方法制备的固体菌剂又能作为铅镉重金属污染土壤钝化剂。
本方案是通过如下技术措施来实现的：一种农用芽孢杆菌固体菌剂的制备方法，它包括如下步骤：
(1)菌种的活化：取甘油冷冻保藏的农用芽孢杆菌菌种，在LB固体培养基上进行划线培养24h，挑取单菌落接种于LB液体培养基中，在常压、好氧条件下置于110r/min、32℃-35℃的摇床中振荡培养24h，再以3％接种量扩大培养24h；
(2)菌剂制备：将扩大培养的菌液按5％的接种量进行接种发酵，以菌液体积为基准加入经灭菌处理的麦饭石粉，所述麦饭石粉的体积质量浓度为 0.1-20％，单位kg/L，33℃培养48h得到发酵液，往发酵液中加入喷雾干燥保护剂，振荡摇匀5min，得到芽孢杆菌菌剂悬浮液；
(3)对步骤(2)中的芽孢杆菌菌剂悬浮液进行喷雾干燥，得到固体颗粒菌剂。
优选的，所述喷雾干燥保护剂包括如下组分：
海藻糖，以农用芽孢杆菌菌液体积为基准，所述海藻糖的体积质量浓度为0.1-20％，单位kg/L；
脱脂乳，以农用芽孢杆菌菌液体积为基准，所述脱脂乳的体积质量浓度为0.1-10％，单位kg/L；
优选的，所述麦饭石粉的目数级别为800目。
优选的，所述农用芽孢杆菌为地衣芽孢杆菌、蜡样芽孢杆菌或枯草芽孢杆菌中的一种或两种以上。
优选的，所述LB固体培养基按照质量百分含量包括如下组分：胰蛋白胨 1％，酵母提取物0.5％，氯化钠1％，琼脂2％，其余为水，pH为7.2-7.4。
优选的，所述LB液体培养基按照质量百分含量包括如下组分：胰蛋白胨 1％，酵母提取物0.5％，氯化钠1％，其余为水，pH为7.2-7.4。
优选的，所述步骤(3)中的喷雾干燥条件为：风机的流量为20-30m3/h，进风温度为110℃-130℃，出风温度为70℃-90℃，进样速度为5-10ml/min。
优选的，所述步骤(2)中：
将地衣芽孢杆菌菌液加入7.5％(kg/L)的麦饭石粉发酵至芽孢形成期，往发酵液中加入9％(kg/L)的海藻糖、4％(kg/L)的脱脂乳；设置对照组，对照组发酵时不添加麦饭石粉，对照组的发酵液中只加入9％(kg/L)海藻糖和4％(kg/L)脱脂乳；振荡摇匀5min，得到芽孢杆菌菌剂悬浮液；
或者将蜡样芽孢杆菌菌液加入5％(kg/L)的麦饭石粉经液体发酵至芽孢形成期，往发酵液中加入10.5％(kg/L)的海藻糖、6％(kg/L)的脱脂乳；设置对照组，对照组发酵时不添加麦饭石粉，对照组的发酵液中只加入10.5％(kg/L)的海藻糖和6％(kg/L)脱脂乳；振荡摇匀5min，得到芽孢杆菌菌剂悬浮液；
或者将枯草芽孢杆菌菌液加入7％(kg/L)的麦饭石粉发酵至芽孢形成期，往发酵液中加入11％(kg/L)的海藻糖、5％(kg/L)的脱脂乳和7％的麦饭石粉；设置对照组，对照组发酵时不添加麦饭石粉，对照组的发酵液中只加入 11％(kg/L)的海藻糖和5％(kg/L)的脱脂乳；振荡摇匀5min，得到芽孢杆菌菌剂悬浮液。
本发明还提供了一种铅镉污染土壤的治理方法，它包括如下步骤：
(1)取上述农用芽孢杆菌固体菌剂的制备方法所制得的农用芽孢杆菌固体菌剂10g按照1：50的比例溶解于清水，备用；
(2)将铅镉污染土壤经过筛选、研磨和除杂的前期处理，备用；
(3)将步骤(1)中溶解的菌剂分别与500g铅镉污染土壤充分混合搅拌，并设置对照组，对照组为等量清水与500g铅镉污染土壤充分混合搅拌；
(4)30d后，分别取步骤(3)中应用农用芽孢杆菌固体菌剂的土样和对照组土样进行有效态铅和有效态镉的检测，经检测，农用芽孢杆菌固体菌剂对有效态铅的钝化率为30％以上，对有效态镉的钝化率为25％以上，对照组对有效态铅的钝化率为0.03％，对有效态镉的钝化率为0.04％。
本发明的有益效果：
本发明中的农用芽孢杆菌固体菌剂的制备方法能够有效的减少菌体在喷雾干燥过程中的活性损失，提高活菌率，又能提高菌剂保藏存活率。采用本发明中的农用芽孢杆菌固体菌剂的制备方法制备的农用芽孢杆菌固体菌剂活菌存活率可达70％以上，活菌数在9×109个/g以上，满足生产微生物菌剂的要求。经4℃低温存放3个月，菌剂活菌存活率仍可达百分60％以上。
本发明的铅镉污染土壤的治理方法中，含有麦饭石粉的农用芽孢杆菌固体菌剂施入土壤后，可降低重金属污染物的生物有效性和可迁移性，对铅镉污染土壤有较好的修复效果，对有效态铅的钝化率可达30％以上，对有效态镉的钝化率可达25％以上。
由此可见，本发明与现有技术相比，具有突出的实质性特点和显著的进步，其实施的有益效果也是显而易见的。
具体实施方式
为能清楚说明本方案的技术特点，下面通过具体实施方式，对本方案进行阐述。
实施例1
一种农用芽孢杆菌固体菌剂的制备方法，它包括如下步骤：
(1)菌种的活化：取甘油冷冻保藏的农用芽孢杆菌菌种，所述农用芽孢杆菌为地衣芽孢杆菌，在LB固体培养基上进行划线培养24h，挑取单菌落接种于LB液体培养基中，在常压、好氧条件下置于110r/min、33℃的摇床中振荡培养24h，再以3％接种量扩大培养24h；其中，所述LB固体培养基按照质量百分含量包括如下组分：胰蛋白胨1％，酵母提取物0.5％，氯化钠1％，琼脂2％，其余为水，pH为7.3；所述LB液体培养基按照质量百分含量包括如下组分：胰蛋白胨1％，酵母提取物0.5％，氯化钠1％，其余为水，pH为7.3；
(2)菌剂制备：将扩大培养的菌液按5％的接种量进行接种发酵，以菌液体积为基准加入经灭菌处理的麦饭石粉，优选麦饭石粉的目数级别为800目，所述麦饭石粉的体积质量浓度为7.5％，单位kg/L，33℃培养48h得到发酵液，此时地衣芽孢杆菌经液体发酵至芽孢形成期，往发酵液中加入喷雾干燥保护剂，振荡摇匀5min，得到芽孢杆菌菌剂悬浮液；其中，所述喷雾干燥保护剂包括如下组分：
海藻糖，以农用芽孢杆菌菌液体积为基准，所述海藻糖的体积质量浓度为9％，单位kg/L；
脱脂乳，以农用芽孢杆菌菌液体积为基准，所述脱脂乳的体积质量浓度为4％，单位kg/L；
设置对照组，对照组发酵时不添加麦饭石粉，发酵液中只加入9％(kg/L) 海藻糖和4％(kg/L)脱脂乳；振荡摇匀5min，得到芽孢杆菌菌剂悬浮液；
(3)对步骤(2)中的芽孢杆菌菌剂悬浮液进行喷雾干燥，得到固体颗粒菌剂，其中该步骤中的喷雾干燥条件为：风机的流量为25m3/h，进风温度为 125℃，出风温度为60℃，进样速度为7ml/min。
实施例2
本实施例与实施例1的区别在于，农用芽孢杆菌采用蜡样芽孢杆菌，发酵时加入5％(kg/L)的麦饭石粉，将蜡样芽孢杆菌经液体发酵至芽孢形成期后，往发酵液中加入10.5％(kg/L)的海藻糖、6％(kg/L)的脱脂乳；设置对照组，对照组发酵时不添加麦饭石粉，对照组的发酵液中只加入10.5％(kg/L) 的海藻糖和6％(kg/L)脱脂乳；振荡摇匀5min，得到芽孢杆菌菌剂悬浮液。
实施例3
本实施例与实施例1的区别在于，农用芽孢杆菌采用枯草芽孢杆菌，发酵时加入7％(kg/L)的麦饭石粉，将枯草芽孢杆菌经液体发酵至芽孢形成期，往发酵液中加入11％(kg/L)的海藻糖、5％(kg/L)的脱脂乳；设置对照组，对照组发酵时不添加麦饭石粉，对照组的发酵液中只加入11％(kg/L)的海藻糖和5％(kg/L)的脱脂乳；振荡摇匀5min，得到芽孢杆菌菌剂悬浮液。
实施例1-3制备的三种农用芽孢杆菌固体菌剂活菌率的实验结果如表1 所示。
表1：实施例1-3制备的三种农用芽孢杆菌固体菌剂活菌率的实验结果
从表1可以看出，本发明的农用芽孢杆菌固体菌剂的制备方法中，喷雾干燥载体与保护剂用于农用芽孢杆菌喷雾干燥时，活菌得率在70％以上，活菌数在1×1010CFU/g以上，满足生产微生物肥料的要求。
将实例1-3与其对照组所制得农用芽孢杆菌固体菌剂于4℃的温度条件下密封保存，90天后利用平板菌落计数法测试其活菌率，共计90天，实验结果如表2所示。
表2：实施例1-3制备的三种农用芽孢杆菌固体菌剂活菌率随时间变化表
从表2可以看出，本发明中农用芽孢杆菌固体菌剂的制备方法制得的农用芽孢杆菌固体菌剂能有效提高菌剂的保存时间与活菌率。经过90天保存，活菌率保持在63％以上，能大大提高固体菌剂的保存期。
本发明还提供了一种铅镉污染土壤的治理方法，下面以取自福建南平顺昌重金属严格管控区的铅镉污染土壤为例说明该治理方法的具体步骤：
(1)取上述农用芽孢杆菌固体菌剂的制备方法所制得的农用芽孢杆菌固体菌剂10g按照1：50的比例溶解于清水，备用；
(2)将取自福建南平顺昌重金属严格管控区的铅镉污染土壤经过筛选、研磨和除杂的前期处理，备用；
(3)将步骤(1)中溶解的菌剂分别与500g铅镉污染土壤充分混合搅拌，并设置对照组，对照组为等量清水与500g铅镉污染土壤充分混合搅拌；
(4)30d后，分别取步骤(3)中应用农用芽孢杆菌固体菌剂的土样和对照组土样进行有效态铅(Pb)和有效态镉(Cd)的检测，经检测，农用芽孢杆菌固体菌剂对有效态铅的钝化率为30％以上，对有效态镉的钝化率为25％以上，对照组对有效态铅的钝化率为0.03％，对有效态镉的钝化率为0.04％，具体结果如表3所示。
表3：土样进行有效态铅(Pb)和有效态镉(Cd)检测的检测结果
由表3分析可得，本发明中农用芽孢杆菌固体菌剂的制备方法制得的农用芽孢杆菌固体菌剂对铅镉污染土壤有较好的修复效果，对有效态铅的钝化率可达30％以上，对有效态镉的钝化率可达25％以上。
本发明中未经描述的技术特征可以通过现有技术实现，在此不再赘述。本发明并不仅限于上述具体实施方式，本领域普通技术人员在本发明的实质范围内做出的变化、改型、添加或替换，也应属于本发明的保护范围。
Claims (9)
1.一种农用芽孢杆菌固体菌剂的制备方法，其特征是：它包括如下步骤：
(1)菌种的活化：取甘油冷冻保藏的农用芽孢杆菌菌种，在LB固体培养基上进行划线培养24h，挑取单菌落接种于LB液体培养基中，在常压、好氧条件下置于110r/min、32℃-35℃的摇床中振荡培养24h，再以3％接种量扩大培养24h；
(2)菌剂制备：将扩大培养的菌液按5％的接种量进行接种发酵，往发酵液中加入喷雾干燥保护剂，振荡摇匀5min，得到芽孢杆菌菌剂悬浮液；
(3)对步骤(2)中的芽孢杆菌菌剂悬浮液进行喷雾干燥，得到固体颗粒菌剂。
2.根据权利要求1所述的农用芽孢杆菌固体菌剂的制备方法，其特征是：所述喷雾干燥保护剂包括如下组分：
海藻糖，以农用芽孢杆菌菌液体积为基准，所述海藻糖的体积质量浓度为0.1-20％，单位kg/L；
脱脂乳，以农用芽孢杆菌菌液体积为基准，所述脱脂乳的体积质量浓度为0.1-10％，单位kg/L。
3.根据权利要求2所述的农用芽孢杆菌固体菌剂的制备方法，其特征是：所述麦饭石粉的目数级别为800目。
4.根据权利要求3所述的农用芽孢杆菌固体菌剂的制备方法，其特征是：所述农用芽孢杆菌为地衣芽孢杆菌、蜡样芽孢杆菌或枯草芽孢杆菌中的一种或两种以上。
5.根据权利要求4所述的农用芽孢杆菌固体菌剂的制备方法，其特征是：所述LB固体培养基按照质量百分含量包括如下组分：胰蛋白胨1％，酵母提取物0.5％，氯化钠1％，琼脂2％，其余为水，pH为7.2-7.4。
6.根据权利要求5所述的农用芽孢杆菌固体菌剂的制备方法，其特征是：所述LB液体培养基按照质量百分含量包括如下组分：胰蛋白胨1％，酵母提取物0.5％，氯化钠1％，其余为水，pH为7.2-7.4。
7.根据权利要求6所述的农用芽孢杆菌固体菌剂的制备方法，其特征是：所述步骤(3)中的喷雾干燥条件为：风机的流量为20-30m3/h，进风温度为110℃-130℃，出风温度为70℃-90℃，进样速度为5-10ml/min。
8.根据权利要求7所述的农用芽孢杆菌固体菌剂的制备方法，其特征是：所述步骤(2)中：
将地衣芽孢杆菌菌液加入7.5％(kg/L)的麦饭石粉发酵至芽孢形成期，往发酵液中加入9％(kg/L)的海藻糖、4％(kg/L)的脱脂乳；设置对照组，对照组发酵时不添加麦饭石粉，对照组的发酵液中只加入9％(kg/L)海藻糖和4％(kg/L)脱脂乳；振荡摇匀5min，得到芽孢杆菌菌剂悬浮液；
或者将蜡样芽孢杆菌菌液加入5％(kg/L)的麦饭石粉经液体发酵至芽孢形成期，往发酵液中加入10.5％(kg/L)的海藻糖、6％(kg/L)的脱脂乳；设置对照组，对照组发酵时不添加麦饭石粉，对照组的发酵液中只加入10.5％(kg/L)的海藻糖和6％(kg/L)脱脂乳；振荡摇匀5min，得到芽孢杆菌菌剂悬浮液；
或者将枯草芽孢杆菌菌液加入7％(kg/L)的麦饭石粉发酵至芽孢形成期，往发酵液中加入11％(kg/L)的海藻糖、5％(kg/L)的脱脂乳和7％的麦饭石粉；设置对照组，对照组发酵时不添加麦饭石粉，对照组的发酵液中只加入11％(kg/L)的海藻糖和5％(kg/L)的脱脂乳；振荡摇匀5min，得到芽孢杆菌菌剂悬浮液。
9.一种铅镉污染土壤的治理方法，其特征是：它包括如下步骤：
(1)取权利要求1-8任一权利要求所制得的农用芽孢杆菌固体菌剂10g按照1：50的比例溶解于清水，备用；
(2)将铅镉污染土壤经过筛选、研磨和除杂的前期处理，备用；
(3)将步骤(1)中溶解的菌剂分别与500g铅镉污染土壤充分混合搅拌，并设置对照组，对照组为等量清水与500g铅镉污染土壤充分混合搅拌；
(4)30d后，分别取步骤(3)中应用农用芽孢杆菌固体菌剂的土样和对照组土样进行有效态铅和有效态镉的检测，经检测，农用芽孢杆菌固体菌剂对有效态铅的钝化率为30％以上，对有效态镉的钝化率为25％以上，对照组对有效态铅的钝化率为0.03％，对有效态镉的钝化率为0.04％。
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Cited By (1)
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| CN117225891A (zh) * | 2023-11-01 | 2023-12-15 | 山东省科学院生态研究所(山东省科学院中日友好生物技术研究中心) | 一种黑麦草联合芽孢杆菌修复重金属污染土壤的方法 |
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| CN104593352A (zh) * | 2015-01-08 | 2015-05-06 | 国家海洋局第三海洋研究所 | 促进水产动物肠道健康的复合微生物菌剂及其制备方法 |
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