CN109174907A - 一种复合真菌快速降解水稻秸秆的方法 - Google Patents
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Abstract
一种复合真菌快速降解水稻秸秆的方法，包括以下步骤：马铃薯葡萄糖琼脂培养基的配制，真菌的接种培养和复合真菌配置，以及水稻秸秆降解处理。本发明根据水稻秸秆的成分构成、降解特性及降解时间等对水稻秸秆降解的影响来选取合适的微生物，木霉、曲霉、橘青霉属于真菌，对木质素具有良好的降解效果；选用的马铃薯葡萄糖琼脂培养基具有高效、廉价、简单的特点，能在实际应用中得到广泛的推广；在秸秆降解前期加入适量的尿素和砂糖是为真菌的生长繁殖提供充足氮源和碳源，能有效提高降解效率，降低降解时间。本发明使用复合真菌处理水稻秸秆，具有廉价、高效等特点，为水稻秸秆的继续降解及规模化处理奠定了良好的基础。
Description
技术领域
本发明属于微生物降解污染物领域，具体涉及一种复合真菌快速降解水稻秸秆的方法。
背景技术
水稻(Oryza sativa)是草本稻属的一种，也是作为粮食中的最主要、最悠久的一种稻属。水稻是中国主要粮食作物，2004年以来，水稻种植面积和总产量分别占粮食作物面积和总产的27.4％和36.1％。水稻秸秆是农业秸秆的重要组成部分，我国2008年水稻秸秆产量为22208.34万吨，占农业秸秆总产量的26.37％。秸秆主要是由纤维素、半纤维素和木质素三种成分组成。水稻秸秆中的纤维素、半纤维素属于多糖，可以被分解二糖和单糖结构，具有很高的利用价值，而木质素是由三种苯丙烷单元通过醚键和碳碳键相互连接形成的具有三维网状结构的生物高分子，不易被分解。水稻秸秆中这三种成分通过不同程度结合在一起，使得水稻秸秆变得坚固，由于其坚固的结构使其降解难度增加。
目前秸秆预处理的方法主要包括物理、化学、生物方法，其中物理方法有粉碎研磨法、蒸汽爆破法；化学方法包括酸处理、碱处理、氧化剂及离子液体；生物处理法包括微生物降解、微生物分解。与物理、化学方法相比，微生物处理方法具有反应条件温和、成本低廉、环境影响小等优点，已成为目前秸秆降解及其应用领域的热点，利用能降解纤维素、半纤维素及木质素的真菌微生物或其产生的生物酶来降解水稻秸秆具有重要的应用价值和广阔的应用前景。单一真菌降解水稻秸秆的效率低、周期长，不利于在实际工厂生产中应用，因此，开发高效、快速的降解水稻秸秆的方法显得尤为重要。
发明内容
本发明的目的是克服现有技术的不足，提供一种复合真菌快速降解水稻秸秆的方法。
本发明的技术方案概述如下：
一种复合真菌快速降解水稻秸秆的方法，包括以下步骤：
(1)马铃薯葡萄糖琼脂培养基的配制
将马铃薯先洗净去皮切成小块,用水煮烂(如称取200g土豆，加500mL约煮沸40分钟)至土豆泥状态，用医用包扎纱布过滤，静置(5分钟)取上清液(250mL)，按体积质量比上清液：琼脂＝250mL：(15～20)g加入琼脂，继续加热搅拌混匀，待琼脂溶解后，按体积质量比上清液：葡萄糖＝250mL：(15～20)g加入葡萄糖，搅拌均匀，稍冷却后再补足水分至1000mL，即得马铃薯固体培养基，分装至锥形瓶，用锡箔纸包裹后放入高温灭菌锅，115℃灭菌20～30min。
(2)真菌的接种培养和复合真菌配置
在无菌操作台内将灭菌好的马铃薯葡萄糖琼脂培养基分装至培养皿中，待培养基凝固后，使用平板划线法将绿色木霉、黑曲霉、橘青霉分别接种到上述培养皿上，将培养皿放于恒温培养箱中30～40℃恒温培养36～48h。将三种真菌分别接种至马铃薯固体培养基中扩大培养至OD600为0.5，然后将扩大培养的绿色木霉、黑曲霉、橘青霉分别溶于5mL水中，并按照1.5:1:1体积比进行混合，得到复合真菌。
(3)水稻秸秆降解处理
将水稻秸秆粉碎，尿素:糖:水:秸秆按照(18～22):(0.9～1.5):(800～1200):5000的质量比例加到降解桶内，并加入秸秆质量的0.1％～0.5％步骤(2)得到的复合真菌，在恒温培养箱中26～40℃恒温培养7～14d，得到降解处理的水稻秸秆。
本发明的优点和有益效果：
本发明根据水稻秸秆的成分构成、降解特性及降解时间等对水稻秸秆降解的影响来选取合适的微生物，绿色木霉、黑曲霉、橘青霉属于真菌，对木质素具有良好的降解效果；选用的马铃薯葡萄糖琼脂培养基具有高效、廉价、简单的特点，能在实际应用中能得到广泛的推广；在秸秆降解前期加入适量的尿素和砂糖是为真菌的生长繁殖提供充足氮源和碳源，能有效提高降解效率，降低降解时间。本发明使用混复合真菌处理水稻秸秆，具有廉价、高效等特点，为水稻秸秆的继续降解及规模化处理奠定了良好的基础。
具体实施方式
下面结合实例对本发明进一步说明。
以下的实施例是为了本领域技术人员便于更好地理解本发明，但对对本发明不做任何限定。
各实施例中选用的马铃薯、砂糖均采用市售的马铃薯和砂糖。
绿色木霉(Trichodermaviride Persoon:Fries)，保藏编号为BNCC336353，于2017年3月购自北纳生物(www.bnbio.com)，地址：北京朝阳区双惠苑甲5号楼。
黑曲霉(Aspergillus niger)，保藏编号为BNCC186380，于2017年3月购自北纳生物(www.bnbio.com)，地址：北京朝阳区双惠苑甲5号楼。
橘青霉(Penicillium citrinum)，保藏编号为BNCC185806，于2017年3月购自北纳生物(www.bnbio.com)，地址：北京朝阳区双惠苑甲5号楼。
尿素和葡萄糖，于2017年3月购自天津市江天化工技术有限公司，地址：天津市南开区鞍山西道天大科贸楼313。
水稻秸秆为实验室收集的水稻秸秆，其中纤维素含量为36.69％、半纤维素含量为24.81％、木质素含量为25.22％。
实施例1
(1)马铃薯葡萄糖琼脂培养基的配制：
将马铃薯先洗净去皮切成小块,称取200g，加500mL水煮烂(约煮沸40分钟)至土豆泥状态，用医用包扎纱布过滤，静置5分钟取上清液250mL，加入20g琼脂，继续加热搅拌混匀，待琼脂溶解后，加入20g葡萄糖，搅拌均匀，稍冷却后再补足水分至1000mL，即得马铃薯固体培养基，分装至锥形瓶，用锡箔纸包裹后放入高温灭菌锅，115℃灭菌20min。
(2)菌的接种培养和复合真菌配置
在无菌操作台内将灭菌好的马铃薯葡萄糖琼脂培养基分装至培养皿中，待培养基凝固后，使用平板划线法将绿色木霉、黑曲霉、橘青霉分别接种到培养皿上，将培养皿放于恒温培养箱中37℃恒温培养48h。将三种真菌分别接种至马铃薯液体培养基中扩大培养至OD600为0.5，然后将扩大培养的绿色木霉、黑曲霉、橘青霉分别溶于5mL水中，并按照1.5:1:1比例进行混合，得到复合菌。
(3)水稻秸秆降解处理
将水稻秸秆粉碎，尿素、砂糖、水、秸秆按照20:1:1000：5000的质量比例加到降解桶内，并加入秸秆质量的0.1％复合菌在恒温培养箱中35℃恒温培养7d，得到预处理的水稻秸秆，其中纤维素含量降至18.15％、半纤维素含量降至11.51％、木质素含量降至12.02％。
实施例2
(1)马铃薯葡萄糖琼脂培养基的配制：
将马铃薯先洗净去皮切成小块,称取200g，加500mL水煮烂(约煮沸40分钟)至土豆泥状态，用医用包扎纱布过滤，静置5分钟取上清液250mL，加入18g琼脂，继续加热搅拌混匀，待琼脂溶解后，加入20g葡萄糖，搅拌均匀，稍冷却后再补足水分至1000mL，即得马铃薯固体培养基，分装至锥形瓶，用锡箔纸包裹后放入高温灭菌锅，115℃灭菌25min。
(2)菌的接种培养和复合真菌配置
在无菌操作台内将灭菌好的马铃薯葡萄糖琼脂培养基分装至培养皿中，待培养基凝固后，使用平板划线法将绿色木霉、黑曲霉、橘青霉分别接种到培养皿上，将培养皿放于恒温培养箱中35℃恒温培养48h。将三种真菌分别接种至马铃薯液体培养基中扩大培养至OD600为0.5，然后将扩大培养的绿色木霉、黑曲霉、橘青霉分别溶于5mL水中，并按照1.5:1:1体积比例进行混合，得到复合真菌。
(3)水稻秸秆降解处理
将水稻秸秆粉碎，尿素、砂糖、水、秸秆按照18:1.1:900：5000的质量比例加到降解桶内，并加入秸秆质量的0.2％复合菌在恒温培养箱中35℃恒温培养10d，得到预处理的水稻秸秆，其中纤维素含量降至12.55％、半纤维素含量降至9.72％、木质素含量降至10.23％。
实施例3
(1)马铃薯葡萄糖琼脂培养基的配制：
将马铃薯先洗净去皮切成小块,称取200g，加500mL水煮烂(约煮沸40分钟)至土豆泥状态，用医用包扎纱布过滤，静置5分钟取上清液250mL，加入15g琼脂，继续加热搅拌混匀，待琼脂溶解后，加入15g葡萄糖，搅拌均匀，稍冷却后再补足水分至1000mL，即得马铃薯固体培养基，分装至锥形瓶，用锡箔纸包裹后放入高温灭菌锅，115℃灭菌30min。
(2)菌的接种培养和复合真菌配置
在无菌操作台内将灭菌好的马铃薯葡萄糖琼脂培养基分装至培养皿中，待培养基凝固后，使用平板划线法将绿色木霉、黑曲霉、橘青霉分别接种到培养皿上，将培养皿放于恒温培养箱中37℃恒温培养48h。将三种真菌分别接种至马铃薯液体培养基中扩大培养至OD600为0.5，然后将扩大培养的绿色木霉、黑曲霉、橘青霉分别溶于5mL水中，并按照1.5:1:1体积比例进行混合，得到复合真菌。
(3)水稻秸秆降解处理
将水稻秸秆粉碎，尿素、砂糖、水、秸秆按照21:0.9:1200：5000的质量比例加到降解桶内，并加入秸秆质量的0.1％复合菌在恒温培养箱中38℃恒温培养7d，得到预处理的水稻秸秆，其中纤维素含量降至15.35％、半纤维素含量降至10.52％、木质素含量降至9.78％。
实施例4
(1)马铃薯葡萄糖琼脂培养基的配制：
将马铃薯先洗净去皮切成小块,称取200g，加500mL水煮烂(约煮沸40分钟)至土豆泥状态，用医用包扎纱布过滤，静置5分钟取上清液250mL，加入20g琼脂，继续加热搅拌混匀，待琼脂溶解后，加入15g葡萄糖，搅拌均匀，稍冷却后再补足水分至1000mL，即得马铃薯固体培养基，分装至锥形瓶，用锡箔纸包裹后放入高温灭菌锅，115℃灭菌20min。
(2)菌的接种培养和复合真菌配置
在无菌操作台内将灭菌好的马铃薯葡萄糖琼脂培养基分装至培养皿中，待培养基凝固后，使用平板划线法将绿色木霉、黑曲霉、橘青霉分别接种到培养皿上，将培养皿放于恒温培养箱中35℃恒温培养40h。将三种真菌分别接种至马铃薯液体培养基中扩大培养至OD600为0.5，然后将扩大培养的绿色木霉、黑曲霉、橘青霉分别溶于5mL水中，并按照1.5:1:1体积比例进行混合，得到复合真菌。
(3)水稻秸秆降解处理
将水稻秸秆粉碎，尿素、砂糖、水、秸秆按照21:1.5:1100：5000的质量比例加到降解桶内，并加入秸秆质量的0.5％复合菌在恒温培养箱中30℃恒温培养7d，得到预处理的水稻秸秆，其中纤维素含量降至13.25％、半纤维素含量降至10.09％、木质素含量降至9.79％。
各个实例的降解率见表1-1。
表1-1
根据现有的单菌对水稻秸秆的降解率为30％左右，根据实例可以得出，本发明的复合真菌对水稻秸秆的处理效果能达到50％～70％，较单菌的处理效率提高了67％～133％。
Claims (1)
1.一种复合真菌快速降解水稻秸秆的方法，包括以下步骤：
(1)马铃薯葡萄糖琼脂培养基的配制：
将马铃薯先洗净去皮切成小块,用水煮烂至土豆泥状态，用医用包扎纱布过滤，静置，取上清液，按体积质量比上清液：琼脂＝250mL：(15～20)g加入琼脂，继续加热搅拌混匀，待琼脂溶解后，按体积质量比上清液：葡萄糖＝250mL：(15～20)g加入葡萄糖，搅拌均匀，稍冷却后再补足水分至1000mL，即得马铃薯固体培养基，分装至锥形瓶，用锡箔纸包裹后放入高温灭菌锅，115℃灭菌20～30min；
(2)真菌的接种培养和复合真菌配置
在无菌操作台内将灭菌好的马铃薯葡萄糖琼脂培养基分装至培养皿中，待培养基凝固后，使用平板划线法将绿色木霉、黑曲霉、橘青霉分别接种到上述培养皿上，将培养皿放于恒温培养箱中30～40℃恒温培养36～48h；将三种真菌分别接种至马铃薯固体培养基中扩大培养至OD600为0.5，然后将扩大培养的绿色木霉、黑曲霉、橘青霉分别溶于5mL水中，并按照1.5:1:1体积比例进行混合，得到复合真菌；
(3)水稻秸秆降解处理
将水稻秸秆粉碎，按照尿素：糖：水：秸秆＝(18～22):(0.9～1.5):(800～1200):5000的质量比例加到降解桶内，并加入秸秆质量的0.1％～0.5％步骤(2)得到的复合真菌，在恒温培养箱中26～40℃恒温培养7～14d，得到降解处理的水稻秸秆。
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- 2018-08-31 CN CN201811014231.2A patent/CN109174907A/zh active Pending
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