CN103642782A - 一种能够抑制土传病害的秸秆腐熟剂的制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种能够抑制土传病害的秸秆腐熟剂的制备方法，其特征在于用具有纤维素分解功能的构巢曲霉、米曲霉、枯草芽孢杆菌、酵母菌和具有生物防治功能短小芽孢杆菌固体复合制备。该制品能够有效地加速还田秸秆的腐烂速度，同时能够抑制水稻纹枯病、水稻稻瘟病、小麦纹枯病等病原菌的生长。田间施用该腐熟剂后秸秆分解速度加快，其中秸秆失重率显著增加、秸秆拉力显著降低；土壤病原菌拮抗芽孢杆菌数量显著增加，病原性微生物数量显著降低。

Description

一种能够抑制土传病害的秸秆腐熟剂的制备方法

技术领域

本发明专利涉及一种能够抑制土传病害的秸秆腐熟剂及其制备方法，属于农业微生物应用技术领域。

背景技术

我国秸秆年产量约10亿吨，秸秆主要成分为纤维素类多糖，其次还含有氮、磷、钾等植物所需的元素。秸秆腐烂之后能增加土壤有机质和土壤不同粒级团聚体数量，从而增加土壤通透性和持水能力，减少土壤板结；纤维素分解可以为微生物繁殖提供能源，从而增加土壤微生物数量及多样性，增加土壤有机物转化、能量转移的能力，提升土壤质量。

随着农村劳动力向城市的大量转移和农业机械化程度的提高，水稻和小麦等主要农作物的机械收割比例越来越高，机械收割之后有大量秸秆滞留农田。秸秆滞留农田，严重影响当季作物的种植，如麦杆影响下一季水稻苗的定植，即使栽种下水稻苗也容易“漂秧”，使水稻秧苗集中于田间部分位置，造成田间秧苗密度分布不均，影响水稻产量。同样，水稻或者麦子的秸秆容易缠绕翻地旋耕机械，影响土壤耕作，同时秸秆容易造成表层土壤空隙过大，土壤极易失水，影响麦子出苗。秸秆是很多病原菌的附着体和病害传播的媒介，尤其土传类病害，如引起水稻和小麦纹枯病的立枯丝核菌能够形成菌核附着在秸秆残体上长期存活，一旦条件成熟就能够萌发感染植株。

农村处理秸杆问题的常见方法多采用原地焚烧，这种处理方式不仅造成大量的资源浪费，而且引起很严重的空气污染。采用秸秆腐熟剂加速秸秆腐烂，有效的遏制焚烧现象。但很多腐熟剂不能够抑制病原菌，种植户因担心病害的传播，会将秸秆从农田搬出堆置在田头，秸秆腐烂后大量的污水随着农田排水和自然降水进入自然水体造成水体污染。

针对以上问题，本发明采用具有高效降解秸秆能力的微生物菌株和高效抑制土传病害的生物防治菌株制作秸秆腐熟剂，该腐熟剂在分解秸秆的过程中可以繁殖大量的生物防治菌株，有效的抑制土传病原菌的萌发。

发明内容

本发明专利的目的在于提供一种抑制土传病害秸秆腐熟剂的制备方法，包括如下步骤：

步骤一，构巢曲霉固体吸附菌剂的制备，

首先制备PDA培养液，以配制1L培养基计，用200g土豆削皮后切成小块放到水里煮，沸腾后煮30min，用纱布过滤后，滤液加20g普通蔗糖，定容至1000ml，121℃灭菌20min既得。

将构巢曲霉接种到PDA培养液中，进行液体发酵生产，其发酵生产的条件为：初始pH自然，培养温度为25℃，溶氧，所述溶氧的通气量范围为30～100％，170rpm，发酵中后期形成菌丝片段，发酵液菌株的菌落形成单位≥1×10⁷cfu ml^-1。构巢曲霉的发酵液按照40％(v：w)加入麦麸，最后采用真空干燥机干燥至含水量低于5％，粉碎机粉碎成菌种粉，制得构巢曲霉固体吸附菌剂，低温保存备用。

步骤二，米曲霉固体吸附菌剂的制备，

首先PDA培养液配制，以配制1L培养基计，用200g土豆削皮后切成小块放到水里煮，沸腾后煮30min，用纱布过滤后，滤液加20g普通蔗糖，定容至1000ml，121℃灭菌20min，既得。

将米曲霉接种到PDA培养液中，进行液体发酵生产，其发酵生产的条件为：培养温度28℃，溶氧，所述溶氧的通气量范围为40～90％，120-180rpm，发酵中后期形成菌丝片段，发酵液菌株的菌落形成单位≥1×10⁷cfu ml^-1。米曲霉发酵液按照40％(v：w)加入麦麸，真空干燥机干燥至含水量低于5％，粉碎机粉碎成菌种粉，制得米曲霉固体吸附菌剂，低温保存备用。

步骤三，枯草芽孢杆菌固体吸附菌剂的制备

首先液体种子培养基和液体发酵培养基采用牛肉膏蛋白胨培养基，其配方为，以配置1L培养基计：采用牛肉膏3g，蛋白胨10g，NaCl10g，自来水1000ml，混合，121℃灭菌20min既得。

将枯草芽孢杆菌接种到液体种子培养基培养，所述的培养条件为：培养温度37℃，摇床转速150rpm，培养时间24小时，种子含菌量大于1×10⁹cfu ml^-1，制得种子，

将种子按照5％比例接种到液体发酵培养基进行液体发酵生产，其发酵生产的条件为：初始pH范围为7.0～7.5，培养温度28～37℃，溶氧通气量范围为30～100％，150-220rpm，发酵后期发酵液该菌株的菌落形成单位≥1×10⁹cfu ml^-1。枯草芽孢杆菌发酵液按照50％(v：w)加入麦麸，真空干燥机干燥至含水量低于5％，粉碎机粉碎成菌种粉，制得枯草芽孢杆菌固体吸附菌剂，低温保存备用。

步骤四，酵母菌固体吸附菌剂的制备

首先种子培养和发酵用的用豆芽汁培养基的制备，以1L培养基计：称新鲜黄豆芽100g，葡萄糖35g，加入1000ml水，混合后煮沸30min，纱布过滤，滤液加35g葡萄糖，115℃灭菌30min，既得。

将酵母菌接种到种子培养基培养，培养条件为：培养温度30℃，摇床转速130～160rpm，培养时间36小时，种子含菌量大于1×10⁸cfuml^-1，种子按照8％比例接种到发酵罐进行液体发酵生产，其发酵生产的条件为：初始pH自然，培养温度28～32℃，溶氧通气量范围为30～100％，120～190rpm，发酵液该菌株的菌落形成单位≥1×10⁸cfuml^-1，发酵液浓度变稠；酵母菌发酵液按照40％(v：w)加入麦麸，真空干燥机干燥至含水量低于5％，粉碎机粉碎成菌种粉，制得酵母菌固体吸附菌剂，低温保存备用。

步骤五，短小芽孢杆菌固体吸附菌剂的制备

首先种子培养和发酵培养所用的牛肉膏蛋白胨液体培养基的制备，以1L培养基计：将牛肉膏3g，蛋白胨10g，NaCl10g和自来水1000ml混合，于121℃灭菌20min既得。

将短小芽孢杆菌接种到种子培养基培养，培养条件为：培养温度37℃，摇床转速130～160rpm，培养时间24小时，种子含菌量大于1×10⁹cfu ml^-1，种子按照7％比例接种到发酵罐进行液体发酵生产，其发酵生产的条件为：初始pH范围为7.0～7.5，培养温度28～35℃，溶氧通气量范围为30～100％，120～160rpm，发酵后期部分菌株形成芽孢，发酵液该菌株的菌落形成单位≥1×10⁹cfu ml^-1，发酵液浓度变稠；短小芽孢杆菌发酵液按照40％(v：w)加入麦麸，真空干燥机干燥至含水量低于5％，粉碎机粉碎成菌种粉，短小芽孢杆菌固体吸附菌剂，低温保存备用。

步骤六

将构巢曲霉固体吸附菌剂、米曲霉固体吸附菌剂、枯草芽孢杆菌固体吸附菌剂、酵母菌固体吸附菌剂和短小芽孢杆菌固体吸附菌剂按照质量比1：1.5：1：1.5：2在无菌条件下复合搅拌，在无菌条件下包装，成品即为一种能够抑制土传病害的秸秆腐熟剂。

其特征在于所制得的抑制土传病害秸秆腐熟剂，对水稻和小麦纹枯病病原菌-立枯丝核菌的抑制率分别为97％和95％，对水稻稻瘟病病原菌稻梨孢抑制率90％。

其特征在于，所制得的抑制土传病害秸秆腐熟剂中构巢曲霉含量大于0.2×10⁸cfu g^-1、米曲霉含量大于0.2×10⁸cfu g^-1、枯草芽孢杆菌大于0.8×10⁸cfu g^-1、酵母菌大于0.2×10⁸cfu g^-1、短小芽孢杆菌大于1.0×10⁸cfu g^-1，有机质质量比含量高于50％，含水率低于15％

有益效果

该秸秆腐熟剂可用于纤维素含量较高的作物秸秆的分解，在秸秆分解过程中形成大量的抑制土传病害的生物防治菌株，能够有效的杀灭附着在植株秸秆上的病原菌，本发明产品与市场产品比较具有以下优点：

施用后土壤中立枯丝核菌数量、尖孢镰刀菌数量较施用常规市售腐熟剂处理低80％左右。

施用该腐熟剂后，土壤中抑制立枯丝核菌数量、尖孢镰刀菌芽孢杆菌数量较施用常规腐熟剂处理增加80～100倍。

附图说明

下面结合附图及实施方式对本发明作进一步详细的说明：

图1为不同处理秸秆拉力变化；

图2为不同处理秸秆失重率变化；

图3为不同处理麦田土壤微生物数量变化；

图4为不同处理田间水稻秧苗漂秧率；

图5为不同处理稻田土壤微生物数量变化。

具体实施方式

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。

菌剂生产通过以下实例来实现

1.将构巢曲霉接种到PDA培养液中，进行液体发酵生产，其发酵生产的条件为：初始pH自然，培养温度25℃，溶氧：通气量范围为30～100％，170rpm，发酵中后期形成菌丝片段，发酵液菌株的菌落形成单位≥1×10⁷cfu ml^-1；所用PDA培养液配制方法为(以配制1L培养基为例)：用200g土豆削皮后切成小块放到水里煮，沸腾后煮30min，用纱布过滤后，滤液加20g普通蔗糖，定容至1000ml，121℃灭菌20min。构巢曲霉的发酵液按照40％(v：w)加入麦麸，真空干燥机干燥至含水量低于5％，粉碎机粉碎成菌种粉，低温保存备用。

2.将米曲霉接种到PDA培养液中，进行液体发酵生产，其发酵生产的条件为：培养温度28℃，溶氧：通气量范围为40～90％，120-180rpm，发酵中后期形成菌丝片段，发酵液菌株的菌落形成单位≥1×10⁷cfu ml^-1；所用PDA培养液配制方法为(以配制1L培养基为例)：用200g土豆削皮后切成小块放到水里煮，沸腾后煮30min，用纱布过滤后，滤液加20g普通蔗糖，定容至1000ml，121℃灭菌20min。米曲霉发酵液按照40％(v：w)加入麦麸，真空干燥机干燥至含水量低于5％，粉碎机粉碎成菌种粉，低温保存备用。

3.将枯草芽孢杆菌接种到液体种子培养基培养，培养条件为：培养温度37℃，摇床转速150rpm，培养时间24小时，种子含菌量大于1×10⁹cfu ml^-1，种子按照5％比例接种到发酵罐进行液体发酵生产，其发酵生产的条件为：初始pH范围为7.0～7.5，培养温度28～37℃，溶氧通气量范围为30～100％，150-220rpm，发酵后期发酵液该菌株的菌落形成单位≥1×10⁹cfu ml^-1。所用的液体的种子培养基和液体发酵培养基的配方均为，按照1L培养基配制：牛肉膏3g，蛋白胨10g，NaCl10g，自来水1000ml，121℃灭菌20min。枯草芽孢杆菌发酵液按照50％(v：w)加入麦麸，真空干燥机干燥至含水量低于5％，粉碎机粉碎成菌种粉，低温保存备用。

4.将酵母菌接种到豆芽汁种子培养基培养，培养条件为：培养温度30℃，摇床转速130～160rpm，培养时间36小时，种子含菌量大于1×10⁸cfu ml^-1，种子按照8％比例接种到发酵罐进行液体发酵生产，其发酵生产的条件为：初始pH自然，培养温度28～32℃，溶氧通气量范围为30～100％，120～190rpm，发酵液该菌株的菌落形成单位≥1×10⁸cfu ml^-1，发酵液浓度变稠；所用的液体的种子培养基和发酵培养基的配方为，按照1L培养基配制：称新鲜黄豆芽100g，葡萄糖35g，加入1000ml水，煮沸30min，纱布过滤，滤液加35g葡萄糖，115℃灭菌30min。酵母菌发酵液按照40％(v：w)加入麦麸，真空干燥机干燥至含水量低于5％，粉碎机粉碎成菌种粉，低温保存备用。

5.将短小芽孢杆菌接种到液体种子培养基培养，培养条件为：培养温度37℃，摇床转速130～160rpm，培养时间24小时，种子含菌量大于1×10⁹cfu ml^-1，种子按照7％比例接种到发酵罐进行液体发酵生产，其发酵生产的条件为：初始pH范围为7.0～7.5，培养温度28～35℃，溶氧通气量范围为30～100％，120～160rpm，发酵后期部分菌株形成芽孢，发酵液该菌株的菌落形成单位≥1×10⁹cfu ml^-1，发酵液浓度变稠；所用的液体的种子培养基和发酵培养基的配方为，按照1L培养基配制：牛肉膏3g，蛋白胨10g，NaCl10g，自来水1000ml，121℃灭菌20min。短小芽孢杆菌发酵液按照40％(v：w)加入麦麸，真空干燥机干燥至含水量低于5％，粉碎机粉碎成菌种粉，低温保存备用。

6.构巢曲霉固体吸附菌剂、米曲霉固体吸附菌剂、枯草芽孢杆菌固体吸附菌剂、酵母菌固体吸附菌剂和短小芽孢杆菌固体吸附菌剂按照质量比1：1.5：1：1.5：2在无菌条件下复合搅拌，在无菌条件下包装，成品即为抑制土传病害的秸秆腐熟剂。

腐熟剂应用试验1秸秆腐熟剂加速水稻秸秆腐熟和抑制土传病害效果验证：

供试土壤为黏质土，供试秸秆为水稻秸杆，下一季作物为小麦。设置如下处理：处理1.对照，土壤不施用任何腐熟剂；处理2.施用市场上销售腐熟剂2kg/亩；处理3.施用本发明腐熟剂2kg/亩。每处理小区面积1m×1m，12个重复。三个处理添加秸秆产量按照水稻经济系数为0.5计算，为每小区施用1.0kg秸秆。每小区施用3g秸秆腐熟剂。实验测定小麦种植以及生长过程中秸秆拉力和失重率的变化，土壤尖孢镰刀菌(容易引起植物枯萎土传性病原真菌)和立枯丝核菌(可以引起水稻和小麦纹枯病)数量，土壤中抑制尖孢镰刀菌和立枯丝核菌芽孢杆菌数量。

实验结果表明，实验开始后第15天、35天和60天，相较于对照处理，施用本发明秸秆腐熟剂的处理秸秆拉力显著降低；而且施用本发明秸秆腐熟剂处理的秸秆拉力比市售秸秆腐熟剂处理秸秆的拉力降低10％-38％(图1)。秸秆的失重率测定显示，施用本发明秸秆腐熟剂处理的秸秆失重率显著高于对照处理，秸秆失重率增加1.7-2.2倍；本发明处理秸秆失重率也高于市售腐熟剂处理的秸秆(图2)。麦子收割后土壤微生物测定显示，施用本发明处理土壤中尖孢镰刀菌和立枯丝核菌数量显著地低于对照处理，分别只有对照处理的11％和20％；本发明处理土壤尖孢镰刀菌和立枯丝核菌数量也显著地低于市售秸秆腐熟剂处理，分别只有对照处理的20％和22％，市售秸秆腐熟剂对土壤病原性真菌没有很好的抑制效果。土壤中可以抑制病原菌的芽孢杆菌数量测定显示，市售秸秆腐熟剂处理和对照处理没有显著差别，但是本发明处理土壤抑制病原菌的芽孢杆菌数量比对照处理高约100倍(图3)。

腐熟剂应用试验2秸秆腐熟剂加速小麦秸秆腐熟和抑制土传病害效果验证：

供试土壤为黏质土，供试秸秆为小麦秸杆，下一季作物为水稻。设置如下处理：处理1.对照，土壤不施用任何腐熟剂；处理2.施用市场上销售腐熟剂2kg/亩；处理3.施用本发明腐熟剂2kg/亩。每处理在秸秆全量还田大田中选取面积10m×10m面积作为测定的面积，每个处理选取3个重复。实验测定水稻移栽后2～3天内降雨造成的“漂秧”数量，土壤中尖孢镰刀菌(容易引起植物枯萎土传性病原真菌)和立枯丝核菌(可以引起水稻和小麦纹枯病)数量，土壤中抑制尖孢镰刀菌和立枯丝核菌芽孢杆菌数量。

实验结果表明，水稻秧苗移栽后2～3天内，由于降雨造成的“漂秧”，施用本发明处理显著低于对照和市售腐熟剂处理(图4)，施用本发明处理秸秆手捏硬度比对照和市售腐熟剂处理秸秆的硬度低。水稻收割后土壤微生物测定显示，施用本发明处理土壤中尖孢镰刀菌和立枯丝核菌数量比对照处理分别降低了78％和88％；市售秸秆腐熟剂对土壤病原性真菌没有很好的抑制效果。土壤中可以抑制病原菌的芽孢杆菌数量测定显示，市售秸秆腐熟剂处理和对照处理没有显著差别，但是本发明处理土壤抑制病原菌的芽孢杆菌数量比对照处理高约85倍(图5)。

应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。此外应理解，在阅读了本发明讲授的内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

Claims (3)

1.一种抑制土传病害秸秆腐熟剂的制备方法，包括如下步骤：

步骤一，构巢曲霉固体吸附菌剂的制备，

首先制备PDA培养液，以配制1L培养基计，用200g土豆削皮后切成小块放到水里煮，沸腾后煮30min，用纱布过滤后，滤液加20g普通蔗糖，定容至1000ml，121℃灭菌20min既得；

将构巢曲霉接种到PDA培养液中，进行液体发酵生产，其发酵生产的条件为：初始pH自然，培养温度为25℃，溶氧，所述溶氧的通气量范围为30～100％，170rpm，发酵中后期形成菌丝片段，发酵液菌株的菌落形成单位≥1×10⁷cfu ml^-1；构巢曲霉的发酵液按照40％(v：w)加入麦麸，最后采用真空干燥机干燥至含水量低于5％，粉碎机粉碎成菌种粉，制得构巢曲霉固体吸附菌剂，低温保存备用；

步骤二，米曲霉固体吸附菌剂的制备，

首先PDA培养液配制，以配制1L培养基计，用200g土豆削皮后切成小块放到水里煮，沸腾后煮30min，用纱布过滤后，滤液加20g普通蔗糖，定容至1000ml，121℃灭菌20min，既得；

将米曲霉接种到PDA培养液中，进行液体发酵生产，其发酵生产的条件为：培养温度28℃，溶氧，所述溶氧的通气量范围为40～90％，120-180rpm，发酵中后期形成菌丝片段，发酵液菌株的菌落形成单位≥1×10⁷cfu ml^-1；米曲霉发酵液按照40％(v：w)加入麦麸，真空干燥机干燥至含水量低于5％，粉碎机粉碎成菌种粉，制得米曲霉固体吸附菌剂，低温保存备用；

步骤三，枯草芽孢杆菌固体吸附菌剂的制备

首先液体种子培养基和液体发酵培养基，所述液体种子培养基和液体发酵培养基为相同的培养基，均采用牛肉膏蛋白胨培养基，配方为，以配置1L培养基计：采用牛肉膏3g，蛋白胨10g，NaCl10g，自来水1000ml，混合，121℃灭菌20min既得；

将枯草芽孢杆菌接种到液体种子培养基培养，所述的培养条件为：培养温度37℃，摇床转速150rpm，培养时间24小时，种子含菌量大于1×10⁹cfu ml^-1，制得种子；

将种子按照5％比例接种到液体发酵培养基进行液体发酵生产，其发酵生产的条件为：初始pH范围为7.0～7.5，培养温度28～37℃，溶氧通气量范围为30～100％，150-220rpm，发酵后期发酵液该菌株的菌落形成单位≥1×10⁹cfu ml^-1；枯草芽孢杆菌发酵液按照50％(v：w)加入麦麸，真空干燥机干燥至含水量低于5％，粉碎机粉碎成菌种粉，制得枯草芽孢杆菌固体吸附菌剂，低温保存备用；

步骤四，酵母菌固体吸附菌剂的制备

首先液体的种子培养基和发酵培养基采用豆芽汁培养基为相同的培养基，其配方为，以1L培养基计：称新鲜黄豆芽100g，葡萄糖35g，加入1000ml水，混合后煮沸30min，纱布过滤，滤液加35g葡萄糖，115℃灭菌30min，既得；

将酵母菌接种到豆芽汁种子培养基培养，培养条件为：培养温度30℃，摇床转速130～160rpm，培养时间36小时，种子含菌量大于1×10⁸cfu ml^-1，种子按照8％比例接种到发酵罐进行液体发酵生产，其发酵生产的条件为：初始pH自然，培养温度28～32℃，溶氧通气量范围为30～100％，120～190rpm，发酵液该菌株的菌落形成单位≥1×10⁸cfu ml^-1，发酵液浓度变稠；酵母菌发酵液按照40％(v：w)加入麦麸，真空干燥机干燥至含水量低于5％，粉碎机粉碎成菌种粉，制得酵母菌固体吸附菌剂，低温保存备用；

步骤五，短小芽孢杆菌固体吸附菌剂的制备

首先液体种子培养基和发酵培养基，所述发酵培养基采用牛肉膏蛋白胨培养基为相同的培养基，其配方为，以1L培养基计：将牛肉膏3g，蛋白胨10g，NaCl10g和自来水1000ml混合，于121℃灭菌20min既得；

将短小芽孢杆菌接种到液体种子培养基培养，培养条件为：培养温度37℃，摇床转速130～160rpm，培养时间24小时，种子含菌量大于1×10⁹cfu ml^-1，种子按照7％比例接种到发酵罐进行液体发酵生产，其发酵生产的条件为：初始pH范围为7.0～7.5，培养温度28～35℃，溶氧通气量范围为30～100％，120～160rpm，发酵后期部分菌株形成芽孢，发酵液该菌株的菌落形成单位≥1×10⁹cfu ml^-1，发酵液浓度变稠；短小芽孢杆菌发酵液按照40％(v：w)加入麦麸，真空干燥机干燥至含水量低于5％，粉碎机粉碎成菌种粉，短小芽孢杆菌固体吸附菌剂，低温保存备用；

步骤六

将构巢曲霉固体吸附菌剂、米曲霉固体吸附菌剂、枯草芽孢杆菌固体吸附菌剂、酵母菌固体吸附菌剂和短小芽孢杆菌固体吸附菌剂按照质量比1：1.5：1：1.5：2在无菌条件下复合搅拌，在无菌条件下包装，成品即为一种能够抑制土传病害的秸秆腐熟剂。

2.如权利要求1所述的一种抑制土传病害秸秆腐熟剂的制备方法，其特征在于所制得的抑制土传病害秸秆腐熟剂，对水稻和小麦纹枯病病原菌一立枯丝核菌的抑制率分别为97％和95％，对水稻稻瘟病病原菌稻梨孢抑制率90％。

3.如权利要求1所述的一种抑制土传病害秸秆腐熟剂的制备方法，其特征在于，所制得的抑制土传病害秸秆腐熟剂中构巢曲霉含量大于0.2×10⁸cfu g^-1、米曲霉含量大于0.2×10⁸cfu g^-1、枯草芽孢杆菌大于0.8×10⁸cfu g^-1、酵母菌大于0.2×10⁸cfu g^-1、短小芽孢杆菌大于1.0×10⁸cfu g^-1，有机质质量比含量高于50％，含水率低于15％。

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