CN112375715B - 一种改善黄颡鱼高糖饲料利用的罗伊氏乳杆菌菌剂及其制备方法 - Google Patents

一种改善黄颡鱼高糖饲料利用的罗伊氏乳杆菌菌剂及其制备方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种改善黄颡鱼高糖饲料利用的罗伊氏乳杆菌菌剂及其制备方法。本发明的高含量罗伊氏菌素的罗伊氏乳杆菌菌剂，其含有高含量的罗伊氏菌素，高含量罗伊氏菌素+罗伊氏乳杆菌的组合，相比于常规的罗伊氏乳杆菌菌剂(不含高含量的罗伊氏菌素)，其更能提高黄颡鱼生长性能及饲料利用率，显著提高糖脂代谢能力和免疫力，降低疾病的发生。因此，本发明通过高糖饲粮中外源添加本发明的高含量罗伊氏菌素的罗伊氏乳杆菌菌剂，可提高饲料利用，有效促进黄颡鱼糖脂代谢，减少腹腔脂肪蓄积，降低脂肪肝的发生，提高黄颡鱼非特异性免疫力，减少疾病的发生。

Description

一种改善黄颡鱼高糖饲料利用的罗伊氏乳杆菌菌剂及其制备 方法
技术领域：
本发明属于水产养殖领域，具体涉及一种改善黄颡鱼高糖饲料利用的罗伊氏乳杆菌菌剂及其制备方法。
背景技术：
糖类是饲料中最廉价的能量物质，其适量添加，可以节约蛋白，促进鱼类生长，降低饲料成本，减少氮排放对环境造成的污染。然而鱼类对糖类的利用率相对较低，饲料过高的糖水平对鱼类健康会产生很大的影响，如生长抑制、饲料利用下降、肝脏肿大病变，引发持续高血糖等，限制了糖类在配合饲料中的广泛应用。肠道微生物与机体形成了宿主-微生物代谢轴，对动物机体营养物质代谢和免疫稳态起重要作用。饲粮对宿主代谢的改变，常伴随有肠道微生物区系的变化，肠道微生物的代谢又能调节宿主很多生理功能。肠道菌群可通过与胆汁酸相互作用，调节糖脂及能量代谢。罗伊氏乳杆菌(Lactobacillus reuteri)是我国农业部允许作为饲料添加剂的乳酸杆菌之一，对肠黏膜具有很强的黏附能力，能产生一种被称为“罗伊氏菌素(Reuterin)”的非蛋白质类广谱抗菌物质，可改善肠道菌群分布，抑制有害菌定植，调节糖脂代谢，促进动物营养物质的消化吸收、提高饲料转化率和防病中起到重要作用。
黄颡鱼是我国重要的淡水养殖名特优品种，肉质鲜美，营养价值高，目前以精养为主，由于饲料配方不合理(脂肪和糖类比例)等原因，导致黄颡鱼糖脂代谢紊乱，腹腔脂肪蓄积、肝脏肿大，严重的影响了黄颡鱼肉质品质及商品价值。
发明内容：
本发明的目的是提供一种改善黄颡鱼高糖饲料利用的罗伊氏乳杆菌菌剂及其制备方法。
本发明通过实验发现，高含量罗伊氏菌素的罗伊氏乳杆菌菌剂能调控肠道微生物菌群结构，改善肠道菌群分布，抑制有害菌定植，同时调节糖脂代谢，改善黄颡鱼对饲料中糖的利用率和营养物质的消化吸收，提高饲料转化率，增强机体免疫能力，减少疾病发生，提高商品鱼经济和市场价值。
本发明的改善黄颡鱼高糖饲料利用的罗伊氏乳杆菌菌剂的制备方法，包括以下步骤：
将罗伊氏乳杆菌液接种到产甘油脱水酶的发酵培养基中进行发酵，发酵至罗伊氏乳杆菌活菌数9.0×108cfu/mL～5.0×109cfu/mL，获得发酵液，再将发酵液浓缩90-100倍，再以变速流加的方式流加甘油溶液到浓缩菌液中进行培养，由此制备得到高含量罗伊氏菌素的罗伊氏乳杆菌浓缩液，将高含量罗伊氏菌素的罗伊氏乳杆菌浓缩液与载体吸附混合，制得高含量罗伊氏菌素的罗伊氏乳杆菌菌剂；
所述的产甘油脱水酶的发酵培养基为：每升含有糖蜜20-50g、牛肉膏3-5g、酵母粉2-6g、玉米浆粉20-50g、柠檬酸氢二胺1-3g、磷酸氢二钾1-3g、硫酸镁0.1-0.4g、硫酸锰0.08-0.2g，余量为水，pH 5.5-7，115℃灭菌30min。
优选为：
将罗伊氏乳杆菌液以体积比3-8％的接种量转接到产甘油脱水酶的发酵培养基中进行发酵，发酵罐装液量为50-60％，发酵温度28-32℃，微氧培养，转速80-120rpm，用6mol/LNaOH调节pH,控制整个发酵液pH 5.5-7.0，发酵时间16-28h，至发酵液中罗伊氏乳杆菌活菌数9.0×108cfu/mL～5.0×109cfu/mL，浓缩发酵液，将发酵液离心浓缩90-100倍，其浓缩菌液浓度2-10g/L；
再以变速流加的方式流加已灭菌冷却的150-450mmol/L甘油溶液到浓缩菌液中，甘油溶液和浓缩菌液体积比：1-5∶99-95，酶转化温度：28-32℃，时间1-5h，由此制备得到高含量罗伊氏菌素的罗伊氏乳杆菌浓缩液；
将高含量罗伊氏菌素的罗伊氏乳杆菌浓缩液与玉米芯粉按照质量比0.5-1∶9.5-9逐级吸附混合，混合时间10-15min，混合后制剂水分控制在10％以下，由此制备得到高含量罗伊氏菌素的罗伊氏乳杆菌菌剂。经罗伊氏菌素含量和罗伊氏乳杆菌活菌数检测，此高含量罗伊氏菌素的罗伊氏乳杆菌菌剂，其罗伊氏菌素含量10-41mmol/g，罗伊氏乳杆菌活菌数7.5×108cfu/g～3.5×109cfu/g。
所述的将罗伊氏乳杆菌液接种到产甘油脱水酶的发酵培养基中进行发酵，其罗伊氏乳杆菌液是通过以下方法制备：
将罗伊氏乳杆菌划线接种到MRS琼脂试管斜面，37±1℃培养18-28小时，然后转接到MRS液体培养基中，37±1℃静置培养18h-30h，形成种子液，其浓度为5.0×108cfu/mL～2.0×109cfu/mL；
或者继续将种子液以3-6％的接种量转接到含有一级发酵培养基的发酵罐中，发酵罐装液量为70-80％，发酵温度37±1℃，密闭静置培养，发酵时间为20-24小时，制成一级种子液，其浓度为5.0×108cfu/mL～2.0×109cfu/mL；
所述的MRS液体培养基，一级种子培养基均为：每升含有蛋白胨10g、酵母粉5g、牛肉膏10g、乙酸钠5g、柠檬酸氢二胺2g、磷酸氢二钾2g、硫酸镁0.2g、硫酸锰0.05g、吐温801mL、碳酸钙10g，余量为水，pH6.8，所述的MRS琼脂试管斜面是在MRS液体培养基加入琼脂，如含质量分数1.4％的琼脂。
所述的罗伊氏乳杆菌优选为罗伊氏乳杆菌GIM1.614，其保藏于广东省微生物菌种保藏中心，菌株编号：GIM1.614。
本发明的高含量罗伊氏菌素的罗伊氏乳杆菌菌剂，其含有高含量的罗伊氏菌素，高含量罗伊氏菌素+罗伊氏乳杆菌的组合，相比于常规的罗伊氏乳杆菌菌剂(不含高含量的罗伊氏菌素)，其更能提高黄颡鱼生长性能及饲料利用率，显著提高糖脂代谢能力。因此，本发明通过高糖饲粮中外源添加本发明的高含量罗伊氏菌素的罗伊氏乳杆菌菌剂，可提高饲料利用，有效促进黄颡鱼糖脂代谢，减少腹腔脂肪蓄积，降低脂肪肝的发生。同时本发明的高含量罗伊氏菌素的罗伊氏乳杆菌菌剂能调控肠道微生物菌群结构，改善肠道菌群分布，抑制有害菌定植，改善摄食高糖饲料导致的糖脂代谢紊乱，修复肝肠损伤，改善黄颡鱼对饲料中糖的利用率和营养的消化吸收，提高动物的饲料转化率，改善养殖水环境，增强机体免疫能力，减少疾病发生，提高存活率和商品鱼经济和市场价值。
附图说明：
图1是实施例1的结果图；
图2是实施例2的结果图；
图3是实施例3的结果图。
具体实施方式：
以下实施例是对本发明的进一步说明，而不是本发明的限制。
实施例1
1菌种活化
首先制菌种，无菌开启冻干保藏菌种罗伊氏乳杆菌(来自广东省微生物菌种保藏中心，菌株编号：GIM1.614)，划线接种到MRS琼脂试管斜面，37±1℃培养18小时；然后转接到MRS液体培养基中，37±1℃静置培养18h，形成一级种子液，其浓度为8.3×108cfu/mL。
2培养发酵
将一级种子液以体积比3％的接种量转接到产甘油脱水酶的发酵培养基中进行发酵，发酵罐装液量为50％，发酵温度28℃，微氧培养，转速80rpm，用6mol/LNaOH调节pH,控制发酵液pH 5.5，发酵时间16h，发酵液中含罗伊氏乳杆菌活菌数9.6×108cfu/mL。
3离心浓缩：浓缩发酵液，将发酵液离心浓缩90倍，其浓缩菌液浓度2.6g/L。
4半酶转化：以变速流加的方式流加已灭菌冷却的甘油(甘油浓度150mmol/L)到浓缩菌液中，甘油溶液和浓缩菌液体积比：1∶99，酶转化温度：28℃，时间1h。由此制备得到高含量罗伊氏菌素的罗伊氏乳杆菌浓缩液，经罗伊氏菌素含量和罗伊氏乳杆菌活菌数检测，罗伊氏菌素含量232mmol/L，罗伊氏乳杆菌活菌数1.2×1010cfu/mL。
5吸附混合
将高含量罗伊氏菌素的罗伊氏乳杆菌浓缩液按0.5∶9.5质量比例与玉米芯粉逐级吸附混合，混合时间10min，混合后制剂水分6.63％。由此制备得到高含量罗伊氏菌素的罗伊氏乳杆菌菌剂，经罗伊氏菌素含量和罗伊氏乳杆菌活菌数检测，罗伊氏菌素含量10.2mmol/g，罗伊氏乳杆菌活菌数7.6×108cfu/g。
6、常规发酵生产的罗伊氏乳杆菌
将步骤1的一级种子液以体积比3％的接种量转接到MRS液体培养基中进行发酵，发酵罐装液量为80％，发酵温度37℃，厌氧培养，发酵时间16h，发酵液中含罗伊氏乳杆菌活菌数1×109cfu/mL，浓缩发酵液，使得发酵液中含罗伊氏乳杆菌活菌数1.2×1010cfu/mL，然后再按照步骤5的方式进行吸附混合，得到罗伊氏乳杆菌活菌数7.3×108cfu/g，得到常规发酵生产的罗伊氏乳杆菌菌剂(罗伊氏菌素含量忽略不计，没有检测出)。
7培养基
所述的MRS液体培养基为：在1L体系中，将蛋白胨10g、酵母粉5g、牛肉膏10g、乙酸钠5g、柠檬酸氢二胺2g、磷酸氢二钾2g、硫酸镁0.2g、硫酸锰0.05g、吐温801mL、碳酸钙10g，加入到水中，水定容至1000mL，pH6.8；115℃灭菌30min。MRS琼脂试管斜面是在MRS液体培养基中加入常量的琼脂。
所述的产甘油脱水酶的发酵培养基为：在1L体系中，将糖蜜20g、牛肉膏3g、酵母粉2g，玉米浆粉20g、柠檬酸氢二胺1g、磷酸氢二钾1g、硫酸镁0.1g、硫酸锰0.08g加入到水中，水定容至1000mL，pH 5.5，115℃灭菌30min。
将上述所得的高含量罗伊氏菌素的罗伊氏乳杆菌菌剂按0.1％的质量比例添加到黄颡鱼高糖饲料中(饲料中罗伊氏乳杆菌活菌数约105cfu/g)，记为处理组Ⅰ。常规发酵生产的罗伊氏乳杆菌菌剂按0.1％的质量比例添加到黄颡鱼高糖饲料中(罗伊氏乳杆菌活菌数约105cfu/g)，记为处理组Ⅱ。以市场黄颡鱼饲料(佛山市顺德区海皇实业有限公司)为正对照，以黄颡鱼高糖饲料为负对照。
所述的黄颡鱼高糖饲料是在市场黄颡鱼饲料配方的的基础上，增加α-淀粉用量，使得可溶性碳水化合物含量为35％。
实验设4个处理组，每个处理设3个重复，每个重复40尾5克左右的黄颡鱼，每天投喂2次(09:00和16:00)，日投喂量为缸鱼体总重的5％。采用饱食投喂方式，以确保投到缸中的饲料被完全摄食，整个实验周期水温的变化范围为28℃-31℃，水体pH变化范围为7.0-7.5，溶氧>6.0mg/L，氨氮小于0.2mg/L。实验采用人工光照(12h光照，12h黑暗)，每天光照时间为8:00～20:00。56天实验结束后，禁食24h后，各缸鱼整体称重，统计黄颡鱼生长及饲料利用的数据，并进行统计分析。具体结果如图1所示。
试验结果显示，处理组Ⅰ黄颡鱼增重率和特定生长率分别比负对照组提高了31.25％和18.52％，显著高于负对照组(P＜0.05)，比处理组Ⅱ提高了11.89％和10.34％；处理组Ⅰ饲料系数比负对照组降低了21.13％，显著低于负对照组(P＜0.05)，比处理组Ⅱ降低了10.64％。处理组Ⅰ黄颡鱼增重率、特定生长率和饲料系数与正对照组无显著差异(P＞0.05)。处理组Ⅰ黄颡鱼饲料脂肪和总糖表观消化率分别比负对照组提高了17.76％和10.64％，显著高于负对照组(P＜0.05)，与正对照组无显著差异(P＞0.05)，比处理组Ⅱ提高了10.98％。结果显示，在高糖饲料中添加本发明制备的高含量罗伊氏菌素的罗伊氏乳杆菌菌剂，可显著提高黄颡鱼生长性能及饲料利用，其效果优于常规发酵生产制得罗伊氏乳杆菌菌剂。
实施例2
1菌种活化
首先制菌种，无菌开启冻干保藏菌种罗伊氏乳杆菌(来自广东省微生物菌种保藏中心，菌株编号：GIM1.614)，划线接种到MRS琼脂试管斜面，37±1℃培养23小时；然后转接到MRS液体培养基中，37±1℃静置培养24h，形成种子液，其浓度为1.1×109cfu/mL。
2培养发酵
2.1一级种子液制备
以体积比4％的接种量将种子液转接到含有一级发酵培养基的发酵罐中，发酵罐装液量为70％，发酵温度37±1℃，密闭静置培养，发酵时间20h，制成一级种子液，其浓度为1.2×109cfu/mL。
2.2培养发酵
将一级种子液以体积比5％的接种量转接到产甘油脱水酶的发酵培养基中进行发酵，发酵罐装液量为55％，发酵温度30℃，微氧培养，转速100rpm，用6mol/LNaOH调节pH，控制发酵液pH 6.3，发酵时间22h，其罗伊氏乳杆菌活菌数2.7×109cfu/mL。
3离心浓缩：浓缩发酵液，将发酵液离心浓缩95倍，其浓缩菌液浓度5.3g/L。
4半酶转化：以变速流加的方式流加已灭菌冷却的甘油(甘油浓度300mmol/L)到浓缩菌液中，甘油溶液和浓缩菌液体积比：3∶97，酶转化温度：30℃，时间2.5h。由此制备得到高含量罗伊氏菌素的罗伊氏乳杆菌浓缩液，经罗伊氏菌素含量和罗伊氏乳杆菌活菌数检测，罗伊氏菌素含量346mmol/L，罗伊氏乳杆菌活菌数2.3×1010cfu/mL。
3吸附混合
将高含量罗伊氏菌素的罗伊氏乳杆菌浓缩液按0.75∶9.25质量比例与玉米芯粉逐级吸附混合，混合时间12min，混合后制剂水分7.17％。由此制备得到高含量罗伊氏菌素的罗伊氏乳杆菌菌剂，经罗伊氏菌素含量和罗伊氏乳杆菌活菌数检测，罗伊氏菌素含量23.8mmol/g，罗伊氏乳杆菌活菌数1.6×109cfu/g，得到高含量罗伊氏菌素的罗伊氏乳杆菌菌剂。
4培养基
4.1所述的MRS液体培养基，一级发酵培养基均为：在1L体系中，将蛋白胨10g、酵母粉5g、牛肉膏10g、乙酸钠5g、柠檬酸氢二胺2g、磷酸氢二钾2g、硫酸镁0.2g、硫酸锰0.05g、吐温801mL、碳酸钙10g、加入水中，水定容至1000mL，pH6.8；115℃灭菌30min。
4.2所述的产甘油脱水酶的发酵培养基为：在1L体系中，将糖蜜35g、牛肉膏4g、酵母粉4g，玉米浆粉35g、柠檬酸氢二胺2g、磷酸氢二钾2g、硫酸镁0.25g、硫酸锰0.14g加入到水中，水定容至1000mL，pH 6.3，115℃灭菌30min。
将上述所得的高含量罗伊氏菌素的罗伊氏乳杆菌菌剂添加到黄颡鱼高糖饲料中，使其在饲料中的活菌数为1×106cfu/g，记为处理组Ⅰ。实施例1中制备的常规发酵生产的罗伊氏乳杆菌菌剂添加到黄颡鱼高糖饲料中，使其在饲料中的活菌数为1×106cfu/g，记为处理组Ⅱ。以市场黄颡鱼饲料为正对照，以黄颡鱼高糖饲料为负对照。
实验设4个处理组，每个处理设3个重复，每个重复30尾20克左右的黄颡鱼，每天投喂2次(09:00和16:00)，日投喂量为缸鱼体总重的3％。采用饱食投喂方式，以确保投到缸中的饲料被完全摄食，整个实验周期水温的变化范围为28℃-31℃，水体pH变化范围为7.0-7.5，溶氧>6.0mg/L，氨氮小于0.2mg/L。实验采用人工光照(12h光照，12h黑暗)，每天光照时间为8:00～20:00。56天实验结束后，禁食24h后，各缸鱼整体称重，每缸随机取10尾鱼，用干净纱布擦干鱼体表面，尾静脉采血，在3000rpm 4℃离心10min，分离血清，液氮速冻后，-80℃超低温冰箱保存用于血清生理生化指标分析；另在冰盘上解剖取肝脏放入冷冻管中，液氮速冻后，-80℃超低温冰箱保存用于肝脏酶活的测定。
具体结果如图2所示。试验结果显示，处理组Ⅰ黄颡鱼血清甘油三脂、总胆固醇和游离脂肪酸含量含量分别比负对照组提高了31.10％、22.78％和19.97％，显著高于负对照组(P＜0.05)，与正对照组无显著差异(P＞0.05)，比处理组Ⅱ提高了14.45％、11.82％和12.62％。处理组Ⅰ黄颡鱼肝脏丙酮酸激酶和葡糖糖激酶比负对照组降低了26.44％和23.53％，显著低于负对照组(P＜0.05)，与正对照组无显著差异(P＞0.05)，比处理组Ⅱ降低了16.07％和13.33％。结果显示，在高糖饲料中添加本发明制备的高含量罗伊氏菌素的罗伊氏乳杆菌菌剂，可显著提高黄颡鱼糖脂代谢能力，其代谢能力优于常规发酵生产制得罗伊氏乳杆菌菌剂。
实施例3
1菌种活化
首先制菌种，无菌开启冻干保藏菌种罗伊氏乳杆菌(来自广东省微生物菌种保藏中心，菌株编号：GIM1.614)，划线接种到MRS琼脂试管斜面，37±1℃培养28小时；然后转接到MRS液体培养基中，37±1℃静置培养30h，形成种子液，其浓度为1.7×109cfu/mL。
2培养发酵
2.1一级种子液制备
以体积比6％的接种量将种子液转接到含有一级发酵培养基的发酵罐中，发酵罐装液量为80％，发酵温度37±1℃，密闭静置培养，发酵时间24h，制成一级种子液，其浓度为1.3×109cfu/mL。
2.2培养发酵
将一级种子液以体积比8％的接种量转接到产甘油脱水酶的发酵培养基中进行发酵，发酵罐装液量为60％，发酵温度32℃，微氧培养，转速120rpm，用6mol/LNaOH调节pH，控制发酵液pH 7，发酵时间28h，其罗伊氏乳杆菌活菌数4.1×109cfu/mL。
3离心浓缩：浓缩发酵液，将发酵液离心浓缩100倍，其浓缩菌液浓度9.1g/L。
4半酶转化：以变速流加的方式流加已灭菌冷却的甘油(甘油浓度450mmol/L)到浓缩菌液中，甘油溶液和浓缩菌液体积比：5∶95，酶转化温度：32℃，时间5h。由此制备得到高含量罗伊氏菌素的罗伊氏乳杆菌浓缩液，经罗伊氏菌素含量和罗伊氏乳杆菌活菌数检测，罗伊氏菌素含量418mmol/L，罗伊氏乳杆菌活菌数4.1×1010cfu/mL。
3吸附混合
将高含量罗伊氏菌素的罗伊氏乳杆菌浓缩液按1∶9质量比例与玉米芯粉逐级吸附混合，混合时间15min，混合后制剂水分8.49％。由此制备得到高含量罗伊氏菌素的罗伊氏乳杆菌菌剂，经罗伊氏菌素含量和罗伊氏乳杆菌活菌数检测，罗伊氏菌素含量40.1mmol/g，罗伊氏乳杆菌活菌数3.3×109cfu/g。
4培养基
4.1所述的MRS液体培养基，一级发酵培养基均为：在1L的体系里面，将蛋白胨10g、酵母粉5g、牛肉膏10g、乙酸钠5g、柠檬酸氢二胺2g、磷酸氢二钾2g、硫酸镁0.2g、硫酸锰0.05g、吐温801mL、碳酸钙10g加入到水中，然后用水定容至1000mL，pH6.8；115℃灭菌30min。
4.2所述的产甘油脱水酶的发酵培养基为：在1L的体系里面，糖蜜50g、牛肉膏5g、酵母粉6g，玉米浆粉50g、柠檬酸氢二胺3g、磷酸氢二钾3g、硫酸镁0.4g、硫酸锰0.2g加水至1000ml，混匀调pH7，115℃灭菌30min。
将上述所得的高含量罗伊氏菌素的罗伊氏乳杆菌菌剂按0.1％的质量比例添加到黄颡鱼高糖饲料中，饲料中罗伊氏乳杆菌活菌数达106cfu/g，记为处理组。以市场黄颡鱼饲料为正对照，以黄颡鱼高糖饲料为负对照。
实验设3个处理组，每个处理设3个重复，每个重复30尾90克左右的黄颡鱼，每天投喂2次(09:00和16:00)，日投喂量为缸鱼体总重的3％。采用饱食投喂方式，以确保投到缸中的饲料被完全摄食，整个实验周期水温的变化范围为28℃-31℃，水体pH变化范围为7.0-7.5，溶氧>6.0mg/L，氨氮小于0.2mg/L。实验采用人工光照(12h光照，12h黑暗)，每天光照时间为8:00～20:00。56天实验结束后，禁食24h后，各缸鱼整体称重，每缸随机取10尾鱼，用干净纱布擦干鱼体表面，尾静脉采血，在3000rpm 4℃离心10min，分离血清，液氮速冻后，-80℃超低温冰箱保存用于非特异性免疫及肝功能指标分析。
具体结果如图3所示，试验结果显示，处理组黄颡鱼血清谷草转氨酶和谷丙转氨酶活性比负对照组降低了35.20％和32.13％，显著低于负对照组(P＜0.05)，与正对照组无显著差异(P＞0.05)。血清溶菌酶、超氧化物歧化酶和碱性磷酸酶活性与负对照组相比，提高了23.63％、25.06％和16.44％，显著高于负对照组(P＜0.05)，与正对照组无显著差异(P＞0.05)。处理组黄颡鱼成活率比负对照组提高了12.38％，显著高于负对照组(P＜0.05)，与正对照组无显著差异(P＞0.05)。结果显示，在高糖饲料中添加本发明高含量罗伊氏菌素的罗伊氏乳杆菌菌剂，可提高黄颡鱼非特异免疫力，提高其成活率，降低疾病的发生。

Claims (5)

1.一种改善黄颡鱼高糖饲料利用的罗伊氏乳杆菌（Lactobacillus reuteri）菌剂的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
将罗伊氏乳杆菌液以体积比3-8%的接种量转接到产甘油脱水酶的发酵培养基中进行发酵，发酵罐装液量为50-60%，发酵温度28-32℃，微氧培养，转速80-120rpm，用6mol/LNaOH调节pH，控制整个发酵液pH 5.5-7.0，发酵时间16-28h，至发酵液中罗伊氏乳杆菌活菌数9.0×108cfu/mL～5.0×109cfu/mL，浓缩发酵液，将发酵液离心浓缩90-100倍，其浓缩菌液浓度2-10g/L；
再以变速流加的方式流加已灭菌冷却的150-450mmol/L甘油溶液到浓缩菌液中，甘油溶液和浓缩菌液体积比：1-5∶99-95，酶转化温度：28-32℃，时间1-5h，由此制备得到高含量罗伊氏菌素的罗伊氏乳杆菌浓缩液；
将高含量罗伊氏菌素的罗伊氏乳杆菌浓缩液与玉米芯粉按照质量比0.5-1∶9.5-9逐级吸附混合，混合时间10-15min，混合后制剂水分控制在10%以下，由此制备得到高含量罗伊氏菌素的罗伊氏乳杆菌菌剂；
所述的产甘油脱水酶的发酵培养基为：每升含有糖蜜 20-50g、牛肉膏 3-5g、酵母粉2-6g、玉米浆粉20-50g、柠檬酸氢二胺 1-3g、磷酸氢二钾 1-3g、硫酸镁 0.1-0.4g、硫酸锰0.08- 0.2g，余量为水，pH 5.5-7，115℃灭菌30min。
2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，具体步骤为：
将罗伊氏乳杆菌液以体积比3-8%的接种量转接到产甘油脱水酶的发酵培养基中进行发酵，发酵罐装液量为50-60%，发酵温度28-32℃，微氧培养，转速80-120rpm，用6mol/LNaOH调节pH，控制整个发酵液pH 5.5-7.0，发酵时间16-28h，至发酵液中罗伊氏乳杆菌活菌数9.0×108cfu/mL～5.0×109cfu/mL，浓缩发酵液，将发酵液离心浓缩90-100倍，其浓缩菌液浓度2-10g/L；
再以变速流加的方式流加已灭菌冷却的150-450mmol/L甘油溶液到浓缩菌液中，甘油溶液和浓缩菌液体积比：1-5∶99-95，酶转化温度：28-32℃，时间1-5h，由此制备得到高含量罗伊氏菌素的罗伊氏乳杆菌浓缩液；
将高含量罗伊氏菌素的罗伊氏乳杆菌浓缩液与玉米芯粉按照质量比0.5-1∶9.5-9逐级吸附混合，混合时间10-15min，混合后制剂水分控制在10%以下，由此制备得到高含量罗伊氏菌素的罗伊氏乳杆菌菌剂。
3.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述的将罗伊氏乳杆菌液接种到产甘油脱水酶的发酵培养基中进行发酵，其罗伊氏乳杆菌液是通过以下方法制备：
将罗伊氏乳杆菌划线接种到MRS琼脂试管斜面，37±1℃培养18-28小时，然后转接到MRS液体培养基中，37±1℃静置培养18h-30h，形成种子液作为罗伊氏乳杆菌液；
或者继续将种子液以3-6%的接种量转接到含有一级发酵培养基的发酵罐中，发酵罐装液量为70-80%，发酵温度37±1℃，密闭静置培养，发酵时间为20-24小时，制成一级种子液作为罗伊氏乳杆菌液；
所述的MRS液体培养基，一级种子培养基均为：每升含有蛋白胨 10g、酵母粉 5g、牛肉膏 10g、乙酸钠 5g、柠檬酸氢二胺 2g、磷酸氢二钾 2g、硫酸镁 0.2g、硫酸锰 0.05g、吐温80 1mL、碳酸钙 10g，余量为水，pH6.8，115℃灭菌30min。
4. 根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述的罗伊氏乳杆菌为罗伊氏乳杆菌 GIM1.614，其保藏于广东省微生物菌种保藏中心，菌株编号：GIM1.614。
5.一种按照权利要求1、2、3或4所述的制备方法制备得到的高含量罗伊氏菌素的罗伊氏乳杆菌菌剂。
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