CN105925631A - 一种提高ε-聚赖氨酸产量的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种提高ε‑聚赖氨酸产量的方法，属于生物技术领域。本发明通过在链霉菌发酵培养基中添加外源物质，包括葡萄糖酸钙，天冬氨酸，赖氨酸，提高ε‑聚赖氨酸产量。本发明的方法能够缩短发酵时间至46h，促进了菌体的生长及ε‑聚赖氨酸的合成，使链霉菌在全合成培养基中菌体量由14.48g·L‑1增加到16.24g·L‑1，ε‑聚赖氨酸产量由3.27g·L‑1提高到5.12g·L‑1，提高了单位菌体的合成能力。

Description

一种提高ε-聚赖氨酸产量的方法
技术领域
本发明涉及一种提高ε-聚赖氨酸产量的方法，属于生物技术领域。
背景技术
ε-聚赖氨酸是由L-赖氨酸单体经α-COOH和ε-NH2脱水缩合而成的聚合物，具有广谱抑制微生物的特性。ε-聚赖氨酸作为一种安全、高效的食品添加剂在美国、日本、韩国、欧盟等地已被广泛使用。2014年，我国批准ε-聚赖氨酸作为食品添加剂新品种。然而，作为微生物发酵产物，产量低，发酵周期长成为限制ε-聚赖氨酸使用的主要因素。现有技术中利用北里孢菌Kitasatospora sp.PL6-3生产ε-聚赖氨酸，摇瓶产量为0.41g·L-1；利用链霉菌Streptomyces albulus B-215生产ε-聚赖氨酸，摇瓶产量为0.65g·L-1；链霉菌Streptomyces albulusZ-18，摇瓶产量为0.20g·L-1。以往的研究者还通过菌种改良来提高ε-聚赖氨酸产量。有研究者以Streptomyces albulus B-215作为出发菌株，采用紫外诱变，获得一株高产菌株BU-215，ε-PL产量为0.75g·L-1，以Streptomyces albulus C1作为出发菌株，采用紫外诱变，获得一株高产菌株C1-6，ε-PL产量为0.59g·L-1；以Streptomyces albulus 9-5作为出发菌株，采用紫外诱变，获得一株高产菌株UV3-9，ε-PL产量为1.08g·L-1。由于诱变育种存在不定向性及诱变菌传代不稳定性等缺陷，ε-聚赖氨酸的发酵优化控制成为突破现有技术瓶颈问题的新的途径。
发明内容
本发明的第一个目的是提供一种提高ε-聚赖氨酸产量的方法，所述方法为：在发酵培养基中添加外源物质，接种链霉菌进行发酵；所述外源物质为葡萄糖酸钙，或天冬氨酸，或赖氨酸；所述发酵培养基为全合成培养基，含有葡萄糖50g·L-1，(NH4)2SO410g·L-1，K2HPO42g·L-1，MgSO4·7H2O 1g·L-1，调节pH至6.9。
在本发明的一个实施方式中，所述葡萄糖酸钙含量为1～5g/L。
在本发明的一个实施方式中，所述葡萄糖酸钙含量为2g/L。
在本发明的一个实施方式中，所述葡萄糖酸钙含量为4g/L。
在本发明的一个实施方式中，所述天冬氨酸含量为0.1～6g/L。
在本发明的一个实施方式中，所述天冬氨酸含量为2g/L。
在本发明的一个实施方式中，所述天冬氨酸含量为4g/L。
在本发明的一个实施方式中，所述天冬氨酸含量为6g/L。
在本发明的一个实施方式中，所述赖氨酸含量为0.1～6g/L。
在本发明的一个实施方式中，所述赖氨酸含量为2g/L。
在本发明的一个实施方式中，所述赖氨酸含量为4g/L。
在本发明的一个实施方式中，所述赖氨酸含量为6g/L。
在本发明的一个实施方式中，所述链霉菌为Streptomyces sp.
在本发明的一个实施方式中，所述发酵以分批发酵的方式，将菌液接种至3L发酵罐，初始通风量2L·min-1，初始搅拌转速200r·min-1，温度30℃。
在本发明的一个实施方式中，所述发酵过程中控制溶氧维持在20-30％。
在本发明的一个实施方式中，所述发酵过程中控制pH保持在4.0。
在本发明的一个实施方式中，所述菌液为种子培养获得的种子液；所述种子培养为：将所述链霉菌孢子接种至含有40mL种子培养基的250mL摇瓶中，30℃，200r·min-1培养24-28h；所述种子培养基为：葡萄糖50g·L-1，酵母粉8g·L-1，(NH4)2SO45g·L-1，K2HPO42g·L-1，MgSO4·7H2O 1g·L-1，ZnSO4·7H2O 0.04g·L-1，FeSO4·7H2O 0.03g·L-1，调节pH至7.5。
在本发明的一个实施方式中，所述种子培养前还进行了菌种活化，所述活化在平板培养基上进行：用接种环挑取少量链霉菌孢子接种于平板培养基上，30℃，培养10-14d；所述平板培养基为：葡萄糖10g·L-1，鱼粉蛋白胨2g·L-1，酵母粉1g·L-1，琼脂18g·L-1，调节pH至7.5。
在本发明的一个实施方式中，所述发酵包括如下步骤：
(1)菌种活化：用接种环挑取少量孢子接种于平板上，放入培养箱中，30℃，培养10-14d；(2)种子培养：将孢子(两环)接种至含有40mL种子培养基的250mL摇瓶中，30℃，200r·min-1培养24-28h；(3)分批发酵：将80mL种子液接入3L发酵罐，罐中预装已灭菌的发酵培养基2.3L，以3％的接种量接种链霉菌，控制初始通风量2L·min-1，初始搅拌转速200r·min-1，温度30℃，pH电极实时监测发酵液中的pH，溶氧电极实时监测发酵液中的溶氧(DO)。当溶氧自然下降至30％后，采用溶氧-转速联动方法使其维持在20-30％。当pH值从6.9自然下降到4.0时，生物反应器通过在线监测发酵菌液pH值，反馈式自动补加碱液使pH值保持在4.0。
本发明的第二个目的是一种提高ε-聚赖氨酸产量的全合成培养基，其特征在于，配方为：葡萄糖50g·L-1，(NH4)2SO410g·L-1，K2HPO42g·L-1，MgSO4·7H2O 1g·L-1，葡萄糖酸钙1～5g·L-1，2mL微量元素溶液，调节pH至6.9。
在本发明的一个实施方式中，所述调节pH至6.9是用50％(v·v-1)氨水调节pH至6.9。
有益效果：采用本发明的方法可以使链霉菌在全合成培养基中发酵生产ε-聚赖氨酸，在分批发酵中菌体量增加12％，ε-聚赖氨酸产量提高57％，发酵时间缩短6小时。本发明提供的全合成培养基还具有成本低廉、配制方法简便的优点，适用于大规模工业化生产。
具体实施方式
培养基：
平板培养基(g·L-1)：葡萄糖10，鱼粉蛋白胨2，酵母粉1，琼脂18，用1mol·L-1NaOH调pH至7.5，115℃，15min灭菌。
种子培养基(g·L-1)：葡萄糖50，酵母粉8，(NH4)2SO45，K2HPO42，MgSO4·7H2O 1，ZnSO4·7H2O 0.04，FeSO4·7H2O 0.03，用1mol·L-1NaOH调pH至7.5，115℃，15min灭菌。
微量元素溶液(mg·L-1)：FeCl3·6H2O 200，ZnCl240，Na2B4O7·10H2O 10，MnCl2·4H2O 10，CaCl2·2H2O 10和(NH4)6Mo7O24·4H2O 10。
实施例1
菌种活化：用接种环挑取少量孢子接种于平板上，放入培养箱中，30℃，培养10-14d。
种子培养：将孢子(两环)接种至含有40mL种子培养基的250mL摇瓶中，30℃，200r·min-1培养24-28h。
摇瓶发酵培养基：甘油50，酵母粉8，(NH4)2SO45，MgSO4·7H2O 0.8，ZnSO4·7H2O 0.04，FeSO4·7H2O 0.03，用1mol·L-1NaOH调pH至7.5，115℃灭菌15min。
摇瓶发酵：将3mL种子转接至含有40mL摇瓶发酵培养基的250mL摇瓶中，30℃，200r·min-1培养3d。取上清测定ε-聚赖氨酸含量。
分批发酵培养基(g·L-1)：葡萄糖50，(NH4)2SO410，K2HPO42，MgSO4·7H2O 1，2mL微量元素溶液，调节pH至6.9。
分批发酵：将80mL种子液接入3L发酵罐，罐中预装已灭菌的发酵培养基2.3L，以3％的接种量接种链霉菌，控制初始通风量2L·min-1，初始搅拌转速200r·min-1，温度30℃，pH电极实时监测发酵液中的pH，溶氧电极实时监测发酵液中的溶氧(DO)。当溶氧自然下降至30％后，采用溶氧-转速联动方法使其维持在20-30％。当pH值从6.9自然下降到4.0时，生物反应器通过在线监测发酵菌液pH值，反馈式自动补加碱液使pH值保持在4.0，直至葡萄糖耗尽，取上清测定ε-聚赖氨酸含量。
实施例2
摇瓶发酵培养基：葡萄糖50，酵母粉8，(NH4)2SO45，K2HPO42，MgSO4·7H2O 1，ZnSO4·7H2O 0.04，FeSO4·7H2O 0.03，用1mol·L-1NaOH调pH至7.5，115℃，15min灭菌。
菌种活化、种子培养和摇瓶发酵步骤与实施例1相同。
实施例3
摇瓶发酵培养基(g·L-1)：葡萄糖50，酵母粉8，(NH4)2SO45，K2HPO42，MgSO4·7H2O 1，ZnSO4·7H2O 0.04，FeSO4·7H2O 0.03，葡萄糖酸钙2，用1mol·L-1NaOH调pH至7.5，115℃，15min灭菌。
菌种活化、种子培养和摇瓶发酵步骤与实施例1相同。
实施例4
摇瓶发酵培养基(g·L-1)：葡萄糖50，酵母粉8，(NH4)2SO45，K2HPO42，MgSO4·7H2O 1，ZnSO4·7H2O 0.04，FeSO4·7H2O 0.03，葡萄糖酸钙4，用1mol·L-1NaOH调pH至7.5，115℃，15min灭菌。
菌种活化、种子培养和摇瓶发酵步骤与实施例1相同。
实施例5
摇瓶发酵培养基(g·L-1)：葡萄糖50，酵母粉8，(NH4)2SO45，K2HPO42，MgSO4·7H2O 1，ZnSO4·7H2O 0.04，FeSO4·7H2O 0.03，葡萄糖酸钙6，用1mol·L-1NaOH调pH至7.5，115℃，15min灭菌。
菌种活化、种子培养和摇瓶发酵步骤与实施例1相同。
实施例6
摇瓶发酵培养基(g·L-1)：葡萄糖50，酵母粉8，(NH4)2SO45，K2HPO42，MgSO4·7H2O 1，ZnSO4·7H2O 0.04，FeSO4·7H2O 0.03，天冬氨酸2，用1mol·L-1NaOH调pH至7.5，115℃，15min灭菌。
菌种活化、种子培养和摇瓶发酵步骤与实施例1相同。
实施例7
摇瓶发酵培养基(g·L-1)：葡萄糖50，酵母粉8，(NH4)2SO45，K2HPO42，MgSO4·7H2O 1，ZnSO4·7H2O 0.04，FeSO4·7H2O 0.03，天冬氨酸6，用1mol·L-1NaOH调pH至7.5，115℃，15min灭菌。
菌种活化、种子培养和摇瓶发酵步骤与实施例1相同。
实施例8
摇瓶发酵培养基(g·L-1)：葡萄糖50，酵母粉8，(NH4)2SO45，K2HPO42，MgSO4·7H2O 1，ZnSO4·7H2O 0.04，FeSO4·7H2O 0.03，赖氨酸2，用1mol·L-1NaOH调pH至7.5，115℃，15min灭菌。
菌种活化、种子培养和摇瓶发酵步骤与实施例1相同。
实施例9
摇瓶发酵培养基(g·L-1)：葡萄糖50，酵母粉8，(NH4)2SO45，K2HPO42，MgSO4·7H2O 1，ZnSO4·7H2O 0.04，FeSO4·7H2O 0.03，赖氨酸6，用1mol·L-1NaOH调pH至7.5，115℃，15min灭菌。
菌种活化、种子培养和摇瓶发酵步骤与实施例1相同。
表1不同实施方式下摇瓶发酵效果比较
实施例10
分批发酵培养基(g·L-1)：葡萄糖50，(NH4)2SO410，K2HPO42，MgSO4·7H2O 1，2mL微量元素溶液，葡萄糖酸钙4，调节pH至6.9。
菌种活化、种子培养和分批发酵步骤与实施例1相同。
结果表明，采用实施例1的分批发酵培养基，发酵结束时菌体量为14.48g·L-1、ε-PL产量为3.27g·L-1、发酵时间为52h，采用实施例10的分批发酵培养基，发酵结束时菌体量为16.24g·L-1、ε-PL产量为5.12g·L-1、发酵时间为46h。
虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。

Claims (10)

1.一种提高ε-聚赖氨酸产量的方法，其特征在于，在发酵培养基中添加外源物质，接种链霉菌进行发酵；所述外源物质为葡萄糖酸钙，或天冬氨酸，或赖氨酸；所述发酵培养基含有葡萄糖50g·L-1，(NH4)2SO410g·L-1，K2HPO42g·L-1，MgSO4·7H2O 1g·L-1，调节pH至6.9。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述葡萄糖酸钙含量为1～5g/L。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述天冬氨酸含量为0.1～6g/L。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述赖氨酸含量为0.1～6g/L。
5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述发酵以分批发酵的方式，将菌液接种至3L发酵罐，初始通风量2L·min-1，初始搅拌转速200r·min-1，温度30℃。
6.根据权利要求1或5所述的方法，其特征在于，所述发酵过程中控制溶氧维持在20-30％。
7.根据权利要求1或5所述的方法，其特征在于，所述发酵过程中控制pH保持在4.0。
8.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述菌液为种子培养获得的种子液；所述种子培养为：将所述链霉菌孢子接种至含有40mL种子培养基的250mL摇瓶中，30℃，200r·min-1培养24-28h；所述种子培养基为：葡萄糖50g·L-1，酵母粉8g·L-1，(NH4)2SO45g·L-1，K2HPO42g·L-1，MgSO4·7H2O 1g·L-1，ZnSO4·7H2O 0.04g·L-1，FeSO4·7H2O 0.03g·L-1，调节pH至7.5。
9.根据权利要求8所述的方法，所述种子培养前还进行了菌种活化，所述活化在平板培养基上进行：用接种环挑取少量链霉菌孢子接种于平板培养基上，30℃，培养10-14d；所述平板培养基为：葡萄糖10g·L-1，鱼粉蛋白胨2g·L-1，酵母粉1g·L-1，琼脂18g·L-1，调节pH至7.5。
10.一种全合成培养基，其特征在于，配方为：葡萄糖50g·L-1，(NH4)2SO410g·L-1，K2HPO42g·L-1，MgSO4·7H2O 1g·L-1，葡萄糖酸钙1～5g·L-1，2mL微量元素溶液，调节pH至6.9；所述微量元素溶液配方为：FeCl3·6H2O 200g·L-1，ZnCl240g·L-1，Na2B4O7·10H2O 10g·L-1，MnCl2·4H2O 10g·L-1，CaCl2·2H2O 10g·L-1和(NH4)6Mo7O24·4H2O 10g·L-1。
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