CN111670178A - 通过连续色谱制备天然l-半胱氨酸盐酸盐水合物晶体的方法 - Google Patents

通过连续色谱制备天然l-半胱氨酸盐酸盐水合物晶体的方法 Download PDF

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Abstract

本公开涉及制备L‑半胱氨酸盐酸盐水合物晶体的方法，以及通过该方法制备的L‑半胱氨酸盐酸盐水合物晶体。通过本公开的制备L‑半胱氨酸盐酸盐水合物晶体的方法，可以从天然L‑半胱氨酸发酵液中无需化学反应或使用人工合成的化合物以高回收率和/或纯度获得L‑半胱氨酸盐酸盐水合物晶体。

Description

通过连续色谱制备天然L-半胱氨酸盐酸盐水合物晶体的方法
技术领域
本公开涉及一种制备L-半胱氨酸盐酸盐水合物晶体的方法，以及通过该方法制备的L-半胱氨酸盐酸盐水合物晶体。
背景技术
L-半胱氨酸通常通过电化学还原反应分解动物来源的L-胱氨酸或发酵来源的L-胱氨酸成为L-半胱氨酸生产，所述动物来源的L-胱氨酸使用鸭毛或人发作为源材料，所述发酵来源的L-胱氨酸使用微生物代谢液作为源材料。相比之下，作为使用微生物生产L-半胱氨酸的方法，已公开了通过在含有硫化物的培养基中使用具有修饰的O-乙酰基转移酶的菌株通过发酵生产天然L-半胱氨酸的方法(US8802399B、US6946268B)，以及通过将微生物培养方法生产的O-磷酸高丝氨酸与硫化物混合并使用O-磷酸丝氨酸硫化氢解酶诱导酶催化反应来生产天然L-半胱氨酸的方法(WO2013/089478、WO2012/053794)。
尽管已经公开了可以通过离子交换和其他已知方法分离通过微生物培养方法生产的L-半胱氨酸，但是未给出关于具体程序、产率、纯度等的信息(EP1645623A1、EP1298200B1、US20050221453A1、EP1234874A1、EP1571223A2和EP1650296A)。
同时，已知使用离子交换从L-半胱氨酸发酵液生产L-半胱氨酸盐酸盐一水合物的方法。例如，已经公开了以90％或以上的产率纯化L-半胱氨酸的方法，这通过将含有L-半胱氨酸的发酵液的pH降低至5或更低的pH，然后使其与酸性溶液或强酸性阳离子交换剂接触使L-半胱氨酸与离子交换剂结合，并用盐酸水溶液洗脱结合的L-半胱氨酸。因此，可以使用L-半胱氨酸盐酸盐洗脱液来生产L-半胱氨酸盐酸盐一水合物(US8088949B)。
另外，已经公开了以85％或更高的产率纯化L-半胱氨酸的方法，这通过使pH为6至9的含L-半胱氨酸的发酵液与碱性阴离子交换剂接触使L-半胱氨酸与阴离子交换剂结合，用盐酸水溶液洗脱结合的L-半胱氨酸，然后使洗脱物与pH为4或更低的酸性阳离子交换剂接触使L-半胱氨酸与阳离子交换剂结合，并用盐酸水溶液洗脱结合的L-半胱氨酸。同样，可以使用L-半胱氨酸盐酸盐洗脱液生产L-半胱氨酸盐酸盐一水合物(US9120729B)。
然而，上述方法因为涉及化学反应而具有劣势，因为所述化学反应通过重复离子交换步骤来执行，由于大量的洗脱液被重复用作离子吸附过程的后续步骤它们需要大量的过程用水，并且必须执行额外的纯化步骤。因此，持续需要具有较高产率和纯度的分离L-半胱氨酸并生产L-半胱氨酸盐酸盐水合物的方法。
在这种情况下，本发明人为提高L-半胱氨酸盐酸盐水合物的纯度和产率做出了巨大的努力，并且完成了生产L-半胱氨酸盐酸盐水合物的方法，其包括具有提高的有效生产率和减少的水消耗以及具有高产率和纯度的优点。
公开内容
技术问题
本公开的一个目的是提供制备L-半胱氨酸盐酸盐水合物晶体的方法。
本公开的另一个目的是提供通过制备L-半胱氨酸盐酸盐水合物晶体的方法制备的L-半胱氨酸盐酸盐水合物晶体。
解决方案
在下文中，将详细描述本公开。
同时，本文公开的每个解释和示例性实施方式可以适用于其他解释和示例性实施方式。即，本文公开的各种因素的所有组合均属于本公开的范围。此外，本公开的范围不应由下文提供的具体公开限制。
另外，本领域技术人员仅使用常规实验就可以识别和鉴定本文公开的本发明的特定实施方式的许多等同物，并且所有这些等同物都被认为在本发明的范围内。
在本公开的一个方面，为了克服上述目的，提供了一种制备L-半胱氨酸盐酸盐水合物晶体的方法，包括：
(a)在将含有L-半胱氨酸的pH范围为3.0至9.0的发酵液引入具有以强酸性阳离子交换树脂作为固定相的连续色谱装置中之后，获得分离的液体；
(b)向分离的液体中加入盐酸，使得盐酸与L-半胱氨酸的当量比([HCl]/[L-半胱氨酸])为0.9至3.0；
(c)浓缩向其加入盐酸的分离的液体；和
(d)从浓缩液中回收L-半胱氨酸盐酸盐水合物晶体。
如本文所用，术语“L-半胱氨酸”是组成氨基酸之一，并且是L-氨基酸中仅有的具有硫氢基(R-SH)的含硫氨基酸。L-半胱氨酸可以通过化学合成或通过微生物发酵的生物合成等获得，但不限于此。具体地，在本公开中，L-半胱氨酸可以是通过微生物发酵生物学生产的L-半胱氨酸，或者可以是通过诱导O-磷酸高丝氨酸在磷酸丝氨酸硫化氢解酶存在下与硫化物的酶催化反应而获得的天然L-半胱氨酸，所述O-磷酸高丝氨酸是通过微生物发酵制备的前体。就制备方法而言，天然L-半胱氨酸可以是未经化学反应、化学吸附或洗脱而获得的L-半胱氨酸。
如本文所用，术语“天然”表示一些物质不依赖于化学反应。根据EU FlavoringsRegulation1334/2008，仅将通过物理、酶促或微生物方法获得的物质定义为“天然”调味剂。从以上观点，无论其是源自动物还是微生物发酵，都不能将通过L-胱氨酸的电化学还原反应生产的L-半胱氨酸称为完全天然的。
如本文所用，术语“发酵液”是指通过培养产L-半胱氨酸的微生物获得的培养基、含有与该培养基一起培养的微生物的培养物或含有能够产生L-半胱氨酸的前体和酶的酶转化溶液。具体地，含有L-半胱氨酸的发酵液可以是含有天然L-半胱氨酸的培养基或酶转化溶液。更具体地，它可以是通过发酵具有产L-半胱氨酸能力的微生物而生物学制备的L-半胱氨酸培养物或培养基，或者是通过诱导O-磷酸高丝氨酸在磷酸丝氨酸硫化氢解酶存在下与硫化物的酶催化反应而获得的天然L-半胱氨酸酶转化溶液，所述O-磷酸高丝氨酸是通过微生物发酵制备的前体。通过使用发酵液作为源液体制备的L-半胱氨酸盐酸盐水合物晶体不依赖于化学反应，因而可以暗示为源自天然。
在本公开中，发酵液可用作连续色谱法的源液体。即，可以将其引入步骤(a)的连续色谱装置中。
引入到连续色谱装置中的发酵液的pH可以根据制备方法而变化，但是可以在2.5至9.5、2.5至9.0、3.0至9.0、3.5至8.5、3.5至7.5、4.5至7.0或5.0-6.0的范围内。发酵液本身可以用作连续色谱的源液体，并且可以进一步包括将含有L-半胱氨酸的发酵液调节至2.5至9.5、2.5至9.0或3.0至9.0，具体地3.5至8.5或3.5至7.5，更具体地4.5至7.0或5.0至6.0的pH的步骤。例如，可以通过添加酸例如硫酸或盐酸，或碱例如氢氧化钠(苛性钠)、氨、氢氧化锂或氢氧化钾等来调节pH，但不限于此。pH调节剂可以被本领域技术人员适当地选择和使用，只要可以获得L-半胱氨酸盐酸盐水合物的晶体而不影响L-半胱氨酸的结构。
随着L-半胱氨酸的发酵液的pH降低，L-半胱氨酸具有强烈的阳离子化趋势。由于本文使用的连续色谱的固定相是强酸性阳离子交换树脂，因此它倾向于吸附阳离子，因此当L-半胱氨酸被阳离子化时，它可能会部分吸附到固定相上，从而降低连续色谱法的回收率。另外，L-半胱氨酸在较高的pH值下具有强烈趋势被氧化和转化为L-胱氨酸，这可能会降低连续色谱法的回收率。因此，含有L-半胱氨酸的发酵液可能是具有2.5至9.5，具体是3.0至9.0，更具体是3.5至8.5，甚至更具体是3.5至7.5、4.5至7.0或5.0至6.0的pH的发酵液。
然而，由于连续色谱法的回收率可能受到多种工艺参数的影响，例如连续色谱法的树脂塔之间的流速、工艺温度、流动相的组成、连续色谱顺序等等，连续色谱法的回收率不是仅受连续色谱的源液体的pH限制的因素。
在本公开中，该方法可以进一步包括在步骤(a)之前稀释或浓缩含L-半胱氨酸的发酵液的步骤。该步骤可以在上述调节pH的步骤之前或之后进行。
浓缩可以在常规的蒸发器(例如，强制循环蒸发器、薄膜蒸发器或旋转蒸发器等)中进行。
稀释或浓缩发酵液中L-半胱氨酸的浓度可以调整为10g/L至180g/L、具体是10g/L至150g/L，但这不是大大影响连续色谱法的回收率和通过连续色谱法获得的分离的液体的质量(具体地，L-半胱氨酸的固体含量，其排除分离的液体中的水分)的重要因素。因此，调节用作连续色谱法的源液体的包含L-半胱氨酸的发酵液的浓度不是分离和纯化L-半胱氨酸的必要过程。然而，当将浓度调节为180g/L或更高时，L-半胱氨酸的浓度高于L-半胱氨酸的溶解度，从而产生了不足以回收的低质量L-半胱氨酸晶体，导致连续色谱法的回收率的劣化。当连续色谱法的源液体浓度较高时，相对于用于处理的L-半胱氨酸的量，连续色谱法中使用的水量可能减少。在通过L-半胱氨酸的最大吸附量和离子交换树脂决定使用的水量的离子交换过程中，不能见到这样的特征。
如本文所用，术语“连续色谱”是指如此工艺，通过其连续地进行常规分批色谱法。具体地，可以将固相和液相连续地供给至色谱装置，并且固相和液相彼此在相反的方向上移动以产生逆流接触，从而能够更有效地分离物质。在本公开中，可以在连续色谱包括真实移动床(TMB)色谱和模拟移动床色谱(SMB)的意义上使用连续色谱。另外，由于真实移动床色谱和模拟移动床色谱采用相同的原则，本领域技术人员可以考虑生产率和其他事项来适当地选择和使用它们。
当在本公开中采用连续色谱法时，不需要吸附/洗脱过程，因而，具有与离子交换法相比高的每小时生产率和减少该方法中使用的水量的优点。另外，为了以高产率从通过离子交换法或普通色谱法得到的含有L-半胱氨酸的过程液体中得到L-半胱氨酸粉末产物，在浓缩结晶法中需要大量的能量。就这一点而言，根据本公开的方法可以降低能量成本。
在本公开的实施方式中，可以使用SMB色谱装置，并且在图2中示出了SMB色谱设备的示意图。工艺参数如树脂塔的数量、树脂塔的体积、树脂的填充能力、各部分的流速、缓冲罐装置的存在与否、树脂塔的移动时间等等可以变化，并且不限于上述指定的固定条件。
连续色谱装置的固定相可以是离子交换树脂，具体地，其可以是强酸性阳离子交换树脂。强酸性阳离子交换树脂的官能团可以是硫酸根，但不限于此。另外，本文中使用的强酸性阳离子交换树脂的母体化合物不受限制，只要可以将强酸性官能团附接至其。例如，可以使用衍生自苯乙烯-二乙烯基苯共聚物的那些，但不限于此。在具体实例中，强酸性阳离子交换树脂可以是苯乙烯-二乙烯基苯硫酸共聚物，但不限于此。
当不具有官能团的苯乙烯-二乙烯基苯共聚物，不具有官能团的交换树脂，如不具有官能团的甲基丙烯酸酯聚合物；强碱性阴离子交换树脂，例如三甲胺苯乙烯-二乙烯基苯共聚物；弱碱性阴离子交换树脂，例如叔胺苯乙烯-二乙烯基苯共聚物；弱碱性阳离子交换树脂，例如羧基甲基丙烯酸酯聚合物等，在本公开中使用时——作为本领域中氨基酸分离和纯化中常用的其他类型的固定相，难以以50％(w/w)或更高的固体含量纯化L-半胱氨酸，其排除通过连续色谱法获得的分离的液体中的水分。同时，当使用强酸性阳离子交换树脂如苯乙烯-二乙烯基苯硫酸共聚物时，能够以80％(w/w)或更高的固体含量纯化L-半胱氨酸，其排除通过连续色谱法获得的分离的液体中的水分，具体是90％(w/w)或更高。
在色谱装置中，无化合物(例如甲醇、异丙醇、乙腈等有机溶剂)添加的水、苛性钠稀释液、硫酸稀释液、磷酸稀释液、盐酸稀释液、氢氧化钾稀释液或其混合物可以用作流动相，但不限于此。在具体实例中，水可以用作连续色谱的流动相。当使用含有化合物的流动相时，该化合物可能保留在最终产品中，因此可能无法销售该产品，因为该产品可能已超出该化合物的标准残留限，或者可能无法将产品作为天然产品分销。另外，由于没有添加除水以外的其他化学物质，因此可以期待节省生产成本的效果。在离子交换法中，为了洗脱结合的L-半胱氨酸，基本上使用溶剂例如盐酸或硫酸作为洗脱液，因此，其使用不可避免地伴随着与化学物质的使用和处置相关的产品成本增加。
当在步骤(a)中将含有L-半胱氨酸的发酵液引入连续色谱装置中时，由于根据连续色谱分离L-半胱氨酸，因此可以获得含有L-半胱氨酸的分离的液体。在本公开中，含有分离的L-半胱氨酸的分离的液体可以简称为“分离的液体”、“色谱分离的液体”或“过程液体”。
分离的液体的质量可以通过固体中L-半胱氨酸的含量(排除分离的液体中的水分)来评估。本公开的分离的液体可以具有80％(w/w)、具体是85％(w/w)、更具体是90％(w/w)或更高的L-半胱氨酸(排除水分)的固体含量。实验证实，当分离的液体中的排除水分的L-半胱氨酸的固体含量为80％或更高时，可以制备纯度为98％或更高的L-半胱氨酸盐酸盐水合物晶体。然而，因为L-半胱氨酸盐酸盐水合物晶体的纯度可能受到其他工艺条件的影响，例如浓缩、结晶、晶体分离等，因此L-半胱氨酸盐酸盐水合物晶体的纯度不是仅受由连续色谱产生的过程液体中排除水分的L-半胱氨酸固体含量限制的因素。
在本公开中，步骤(a)可以被称为“连续色谱法”。术语“连续色谱法的回收率”是指相对于步骤(a)中引入的发酵液，在所获得的分离的液体中的L-胱氨酸的回收率，并且用于评估该方法的效率。本公开中连续色谱的回收率可以是50％(w/w)、具体是60％(w/w)、更具体地是70％(w/w)，并且更具体是80％(w/w)或更高，但不限于此。
为了将本公开的分离的液体中包含的L-半胱氨酸转化为L-半胱氨酸盐酸盐，可以在步骤(b)中向分离的液体中加入盐酸。具体地，可以添加盐酸以使分离的液体中包含的盐酸与L-半胱氨酸的当量比([HCl]/[L-半胱氨酸])大于0.85且小于或等于3.5、大于1.0且小于3.0、0.9至3.0，具体是1.5至2.5，更具体是2.0。当当量比为0.9至3.0时，结晶过程的回收率可以为40％或更高，并且预期在当量比大于1.0且小于3.0时，结晶过程的回收率为50％或更高，而且在当量比为1.5至2.5下，结晶过程的回收率可以为60％或更高。
步骤(c)是浓缩向其加入盐酸的分离的液体进行结晶的步骤。在步骤(c)中，可以通过浓缩向其加入盐酸的分离的液体来获得浓缩物。浓缩可以由本领域技术人员通过适当的选择在常规蒸发器(例如强制循环蒸发器、薄膜蒸发器或旋转蒸发器等)中进行。步骤(c)的浓缩物中L-半胱氨酸的浓度可以在100g/L至900g/L的范围内，具体是200g/L至小于900g/L、300g/L至小于900g/L、400g/L至小于900g/L，更具体是小于500g/L至900g/L。
当浓缩物中的L-半胱氨酸的浓度较低时，由于缺乏成核和晶体生长所需的过饱和而在浓缩期间不会发生结晶，而结晶可以在冷却期间实现，或者可以通过另外的过程进行结晶。然而，回收率可能较低，或者结晶时间可能会延长。当浓缩物中L-半胱氨酸的浓度为300g/L或更高时，在浓缩过程期间可能形成L-半胱氨酸盐酸盐水合物的晶核。另外地，当冷却浓缩至300g/L或更高的L-半胱氨酸盐酸盐水合物浆液时，L-半胱氨酸盐酸盐水合物的结晶过程的回收率可能会提高。当浓缩物中L-半胱氨酸盐酸盐水合物的浓度为900g/L时，由于大量晶体颗粒的形成而可能发生固化，因而，晶体浆液的搅拌和晶体分离可能是不可能的。因此，浓缩向其加入盐酸的分离的液体的步骤，以使L-半胱氨酸的浓度为200g/L至小于900g/L、具体是300g/L至小于900g/L、更具体是500g/L至小于900g/L。
在根据步骤(c)的浓缩期间，L-半胱氨酸盐酸盐水合物的结晶可能发生。如本文中所使用的，术语“结晶”是指无定形态的液体或固体形成晶体的现象，并且伴随着称为成核和晶体生长的两种现象。
浓缩物可以在回收之前通过冷却和/或老化形成和/或生长晶核。进一步，即使当L-半胱氨酸盐酸盐水合物晶体没有从浓缩物中析出时，也可能在浓缩物的冷却或老化期间形成晶体。
冷却步骤可以具体地指在2小时至6小时的时间段内冷却至-10℃至55℃的温度，具体是在2小时的时间段内冷却至0℃至45℃的温度，更具体的冷却至0℃至30℃的温度，并且甚至更具体地，在2小时至6小时的时间内冷却至0℃至15℃的温度。老化步骤可以指允许不改变温度而静置。在本公开中，它可以指恒定保持冷却的温度，或者甚至当浓缩物没有被冷却，它可以指恒定保持浓缩物的温度。具体地，可以在1小时至3小时的时间段内实现老化。
本公开中的一系列步骤(c)可以被称为“结晶过程”。“结晶过程的回收率”是指相对于在根据连续色谱法的分离的液体中的L-半胱氨酸，获得的L-半胱氨酸盐酸盐水合物晶体的L-半胱氨酸回收率，且用于评价结晶过程的效率。连续色谱法回收的回收率可以是40％(w/w)、具体是50％(w/w)、更具体是60％(w/w)、甚至更具体是70％(w/w)。
在步骤(d)中，可以回收从浓缩物中析出的L-半胱氨酸盐酸盐水合物晶体，具体地，通过对浓缩物进行固液分离可以从浆液中回收L-半胱氨酸盐酸盐水合物晶体。使用诸如减压膜过滤装置、压力膜过滤装置、离心分离装置等的固液分离器进行，但不限于此。浆液和/或析出的半胱氨酸晶体可以进行额外的洗涤或干燥。
在本公开中，通过在步骤(d)中回收晶体获得的滤液是具有残余L-半胱氨酸的母液，并且可以全部或部分地添加到步骤(a)的发酵液、步骤(b)的分离的液体、或步骤(c)的向其加入盐酸的分离的液体中，以便提高L-半胱氨酸最终纯化期间的回收率，但不限于此。
根据本公开的制备方法制备的L-半胱氨酸盐酸盐水合物可以是一水合物。根据本公开的制备方法制备的L-半胱氨酸盐酸盐水合物晶体的纯度可以是95％(w/w)或更高、具体是98％(w/w)、更具体是99％(w/w)。
在本公开的另一方面中，为了克服上述目的，提供了通过上述制备L-半胱氨酸盐酸盐水合物晶体的方法制备的L-半胱氨酸盐酸盐水合物晶体。
L-半胱氨酸盐酸盐水合物的晶体及其制备方法如上所述。
发明的有利效果
本公开的制备L-半胱氨酸盐酸盐水合物晶体的方法能够分离和纯化处于天然状态的L-半胱氨酸发酵液，而无需化学反应或使用人工合成化合物，并同时以高回收率和/或纯度获得L-半胱氨酸盐酸盐水合物晶体。另外，本公开的制备方法显示有效的生产率，并且特别地，可以显著减少水消耗。
附图简述
图1示出了用于通过连续色谱从发酵液中含有的天然L-半胱氨酸制备L-半胱氨酸盐酸盐水合物晶体的方法的代表性图解。
图2示出了在本公开的一个实施方式中使用的SMB色谱的每一部分的树脂塔布置和流速。
具体实施方式
在下文中，将通过实施例更详细地描述本公开。然而，仅出于说明性目的给出这些实施例，并且本发明的范围并不旨在由这些实施例限制。
测试方法
本公开的实施例中使用的常用分析方法如下：
(1)用于定量分析L-半胱氨酸盐酸盐一水合物的HPLC
本公开中用于分析L-半胱氨酸盐酸盐一水合物的纯度和浓度的HPLC分析的条件如下：
装置：HPLC 1260Infinity系统(Agilent Technology Inc)
柱：HP C18(150mm×3.9mm；5μm)
流动相：乙腈/水/七氟丁酸(8/92/0.1)
流速：0.425mL/min
温度：30℃
检测：220nm处的UV
引入的样品体积：2μL
(2)用于测量L-半胱氨酸盐酸盐一水合物晶体的纯度的方法
在本公开中，基于L-半胱氨酸盐酸盐一水合物的纯度评估L-半胱氨酸盐酸盐一水合物晶体的质量，其程序如下：
(a)通过将L-半胱氨酸盐酸盐一水合物晶体在20mmHg或以下的真空中于含有硅胶的真空干燥器中放置24小时以除去残留水分并冷却L-半胱氨酸盐酸盐无水晶体的温度至室温，制备L-半胱氨酸盐酸盐无水晶体；
(b)通过定量测量冷却至室温的0.5000g的L-半胱氨酸盐酸盐无水晶体，将其放入1L容量瓶中并用三倍蒸馏水稀释，制备0.5000g/L的样品；
(c)在与步骤(a)中相同的方式处理L-半胱氨酸盐酸盐一水合物标准晶体(Sigma，＝99.0％)后，通过定量测量0.5000g的L-半胱氨酸盐酸盐无水晶体，将其放入1L容量瓶中并用三倍蒸馏水稀释，制备0.5000g/L的样品，随后，通过标准试剂制造商的证书确定标准产品的纯度，然后将样品中无水L-半胱氨酸盐酸盐的浓度换算(换算的[无水L-半胱氨酸盐酸盐浓度]为0.5000g/L×[标准产品的纯度])；和
(d)通过使用步骤(c)中制备的样品作为外部标准品并通过HPLC分析步骤(b)中制备的样品来分析步骤(a)中使用的L-半胱氨酸盐酸盐无水晶体的纯度(所分析的L-半胱氨酸盐酸盐无水晶体的纯度与L-半胱氨酸盐酸盐一水合物晶体的纯度相同)。
(3)基于根据色谱法的发酵液或分离的液体中的固体分析L-半胱氨酸含量的方法
在本公开中，基于通过从溶液中去除水分而获得的固体中的L-半胱氨酸含量来评估根据色谱法的发酵液或分离的液体的质量，且其程序如下：
(a)用约5克海砂(10至20目；Daejung Chemicals)对瓷器容器进行除臭，然后通过将其放入105℃下的强制循环烘箱中3小时去除残留水分，然后通过将其放入含有硅胶的真空干燥器中1小时将其冷却至室温；
(b)将待分析溶液添加到步骤(a)的容器中，并使用添加之前和之后的重量差来量化[溶液的质量]；
(c)通过将容器放入105℃下的强制循环烘箱中3小时去除残留水分，然后将其放入含有硅胶的真空干燥器中1小时将其冷却至室温，随后，使用重量差定量去除的水分的量，并使用相同([按质量计的固体含量]是([溶液的质量]-[去除的水分的质量]/[溶液的质量])换算按质量计的待测量溶液的固体含量；
(d)使用比重分析仪测量待分析溶液的密度；
(e)通过HPLC测量待分析溶液中L-半胱氨酸的浓度；和
(f)使用按溶液的质量计的固体含量、密度和L-半胱氨酸的浓度([排除溶液中水分的固体中的L-半胱氨酸含量]是[L-半胱氨酸的浓度]/[溶液的密度]/[按溶液的质量计的固体含量])换算待分析的排除溶液中水分的固体中的L-半胱氨酸含量。
制备实施例
(1)制备含L-半胱氨酸的发酵液
通过在发酵培养基中培养能够产生O-磷酸丝氨酸的微生物获得O-磷酸丝氨酸发酵液之后，使用O-磷酸丝氨酸硫化氢解酶(sulfhydrase)(OPS硫化氢解酶)使该发酵液与硫化物进行酶转化反应，从而获得含有L-半胱氨酸的发酵液。
具体地，KCCM 11103P(CA07-0022/pCL-prmf-serA*(G336V)-serC；韩国专利号10-1381048)菌株，其是改良的大肠杆菌W3110菌株，其中缺失了serB并引入突变体serA*以具有产OPS能力，在MMYE琼脂平板上于33℃下培养24小时，并从一个平板上刮下平板上1/10的细胞并接种到在三角烧瓶(baffle flask)中的烧瓶种子培养基中(10g/L葡萄糖、0.5g/L硫酸镁、3g/L磷酸二氢钾、10g/L酵母提取物、0.5g/L氯化钠、1.5g/L氯化铵、12.8g/L焦磷酸钠、1g/L甘氨酸)，以200rpm在30℃下进行6小时的种子培养。完成种子培养后，将对应于主培养基体积16％的体积的种子培养基接种到装有300mL主培养基的1L小型发酵罐中，并且在33℃、pH 7.0下进行培养以获得OPS发酵液。50mM OPS发酵液在100mM Na2S和0.2mM吡哆醛5′-磷酸酯(PLP)条件下与源自结核分枝杆菌H37Rv的50mg/mL Msm-T酶反应以获得含有L-半胱氨酸的发酵液(韩国专利号10-1381048)。
L-半胱氨酸发酵液的pH为9.3并且L-半胱氨酸的浓度为26g/L。L-半胱氨酸的固体含量(排除L-半胱氨酸发酵液中的水分)为26.7％。使用98％的硫酸将pH降至5.5来调节发酵液的pH。使用薄膜蒸发器浓缩发酵液，以制备具有L-半胱氨酸浓度为120g/L的L-半胱氨酸发酵液，作为SMB色谱的源液体。浓缩条件如下：
内压：80mmHg
蒸汽压力：2巴
最大注射量：100L
过程液体的强制循环流速：10L/min
蒸发速度：约25L/hr
(2)使用连续色谱装置获得分离L-半胱氨酸的分离的液体
为了获得分离L-半胱氨酸的分离的液体，使用SMB色谱装置。SMB色谱装置的示意图在图2中示出。
具体地，如图2中所示，该装置由总计15个树脂塔组成。每个塔的体积为1.5L，并且树脂填充至塔体积的95％。将SMB源液体以15mL/min的流速引入树脂塔8中。将流动相以95mL/min的流速引入树脂塔1中。从树脂塔3以50mL/min的流速排出SMB生产过程液体(分离的液体)。从树脂塔12以60mL/min的流速排出SMB过程废液。从树脂塔15排出的液体以65mL/min的流速与流动相混合，然后将混合物以160mL/min的总流速引入树脂塔1中。在树脂塔7和8之间安装一个1L缓冲罐，以通过控制水位来实现自动控制，以使用于SMB色谱的源液体可以恒定的流速流入树脂塔。树脂塔每8分钟以数字减少的方向移动，但以循环方式驱动，以使树脂塔1移至树脂塔15。
在制备实施例中，将具有强酸硫酸根作为官能团的苯乙烯-二乙烯基苯共聚物树脂
Figure BDA0002611550980000091
MCK32L、
Figure BDA0002611550980000092
PCR642或
Figure BDA0002611550980000093
UBK555树脂的每种装载入色谱装置的树脂塔中，并向其中引入用于SMB色谱的0.1kL或更多的源液体。然后，操作该装置以获得SMB生产过程液体(分离的液体)。分离的液体的pH分别为6.1、6.3和5.9，并且L-半胱氨酸的浓度分别为35.1g/L、34.8g/L和33.9g/L。
(3)盐酸加成反应及浓缩
向上述分离的液体加入36％的盐酸以使[HCl]/[L-半胱氨酸]当量比为2，并通过线性连接薄膜浓缩管和强制循环式浓缩管来浓缩液体，直到L-半胱氨酸的浓度达到700g/L。浓缩期间，L-半胱氨酸盐酸盐一水合物晶体析出，而就在浓缩后L-半胱氨酸盐酸盐一水合物晶体浆液的温度为55℃。浓缩条件如下：
内压：80mmHg
蒸汽压力：2巴
最大注射量：100L
过程液体的强制循环流速：10L/min
蒸发速度：约10L/hr
(4)L-半胱氨酸盐酸盐晶体的冷却和回收
将L-半胱氨酸盐酸盐一水合物晶体浆液在夹套罐(jacket tank)中在搅拌的同时以恒定的冷却速率冷却至15℃，持续4小时，并在与冷却完成时的温度相同的温度下搅拌2小时。此后，使用篮式离心分离器从L-半胱氨酸盐酸盐一水合物晶体浆液中固液分离L-半胱氨酸盐酸盐一水合物晶体。篮式分离器的分离条件如下：
设备：4.5L篮式分离器(H-122；Kokusan)
洗涤液：三重蒸馏水
过滤器类型：聚酰胺复丝纤维过滤织物
过滤器透气度：250L/m2/s(在2毫巴下)
碗转速：3,000rpm
碗旋转时间：20分钟
在分离期间，向洗涤液加入10％体积的L-半胱氨酸盐酸盐一水合物晶体浆液。分离后，使用流化床干燥器将所得物在35℃下干燥2小时或更长，以将残留水分降低至12.0％或以下，最后制备L-半胱氨酸盐酸盐一水合物晶体。
因此，测量了SMB色谱法的产率、通过SMB色谱法获得的分离的液体中L-半胱氨酸的固体含量(％)以及L-半胱氨酸盐酸盐一水合物晶体的纯度。将SMB色谱法的回收率计算为与引入SMB色谱装置的发酵液相比，分离的液体中L-半胱氨酸的回收率。结果与在制备实施例中获得的结果一起示于表1中。当将具有硫酸根作为官能团的苯乙烯-二乙烯基苯共聚物树脂用作固定相时，所有实验结果均显示，SMB色谱法的产率超过90％，通过SMB色谱法得到的分离的液体中排除水分的L-半胱氨酸的固体含量是92.5％或更高，L-半胱氨酸盐酸盐一水合物晶体的纯度是99.5％或更高。
基于此，可以证实，当通过使用具有强酸性官能团的固定相树脂进行连续色谱时，可以以更高的产率和纯度获得L-半胱氨酸盐酸盐一水合物晶体。
实验实施例1-根据离子交换树脂类型进行评估
在制备实施例中，通过仅改变装载入SMB色谱装置中的固定相树脂来制备L-半胱氨酸盐酸盐水合物晶体。作为用作固定相的树脂，选择可以无难度地在工业上使用并且可以大量生产的那些树脂。基于官能团选择树脂，使得它们含有弱酸性羧基、强碱性三甲胺基、弱碱性叔胺基和无官能团。
因此，测量了SMB色谱法的产率、通过SMB色谱法获得的分离的液体中的L-半胱氨酸的固体含量(％)以及最终回收的L-半胱氨酸盐酸盐一水合物晶体的纯度。将SMB色谱法的回收率计算为与引入SMB色谱装置中的发酵液相比，分离的液体中的L-半胱氨酸的回收率。该结果与制备实施例中获得的结果一起示于表1中。
[表1]
Figure BDA0002611550980000101
Figure BDA0002611550980000111
当将具有硫酸根作为官能团的苯乙烯-二乙烯基苯共聚物树脂用作固定相时，所有实验结果表明，SMB色谱法的产率超过90％，L-半胱氨酸的含量为92.5％或更高，且L-半胱氨酸盐酸盐一水合物晶体的纯度为99.5％或更高。相反，当通过使用具有弱酸性羧基、强碱性三甲胺基、弱碱性叔胺基或无官能团的树脂获得晶体时，SMB色谱法的产率为13.5％至25.8％，而L-半胱氨酸的含量为31.8％至44.5％。即，与使用强酸性官能团作为固定相时获得的产率和产量相比，该产率和含量降低50％或更多。
基于此，确认了在当通过连续色谱分离和结晶L-半胱氨酸的发酵液时将具有强酸性官能团的树脂用作固定相的情况下，可以以高产率、高浓度和高纯度获得L-半胱氨酸盐酸盐一水合物晶体。
实验实施例2-根据pH评估含有L-半胱氨酸的发酵液
在制备实施例中(使用
Figure BDA0002611550980000112
MCK32L)，通过仅改变含有L-半胱氨酸的发酵液的pH，制备L-半胱氨酸盐酸盐水合物晶体。具体地，以与制备实施例中相同的方式获得含有L-半胱氨酸的发酵液后，使用98％的硫酸或50％的苛性钠溶液将发酵液的pH从2.5改变至9.5。
因此，测量了SMB色谱法的产率、通过SMB色谱法获得的分离的液体中的L-半胱氨酸的固体含量(％)以及最终回收的L-半胱氨酸盐酸盐一水合物晶体的纯度。将SMB色谱法的回收率计算为与引入SMB色谱装置的发酵液相比，分离的液体中的L-半胱氨酸的回收率。结果示于表2中。
[表2]
Figure BDA0002611550980000113
Figure BDA0002611550980000121
发现SMB色谱法的产率在3.0至9.0的pH范围内为50％或更高、在4.5至7.0的pH范围内为85％或更高、在5.0至6.0的pH下为90％。通过SMB色谱法获得的分离的液体中的排除水分的L-半胱氨酸的固体含量在3.0至9.0的pH范围内为85％或更高，在3.5至7.5的pH范围内为90％或更高。
另外，发现L-半胱氨酸盐酸盐一水合物晶体的纯度在2.5至9.0的pH范围内为98％或更高，在3.5至8.5的pH范围内为99％或更高。即，证实了当采用本公开的方法时，在没有大大地影响pH范围的情况下，可以以非常高的纯度获得L-半胱氨酸盐酸盐一水合物晶体。
实验实施例3–根据添加的盐酸的量进行评估
在制备实施例中(使用TRILITEMCK32L)，通过仅在0.80、0.85、0.90、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0和3.5的范围内改变所添加的盐酸的[HCl]/[L-半胱氨酸]当量比，制备L-半胱氨酸盐酸盐水合物晶体。
因此，测量了SMB色谱的产率和最终回收的L-半胱氨酸盐酸盐一水合物晶体的纯度。计算结晶过程的回收率为相对于根据SMB色谱法的分离的液体中的L-半胱氨酸，最终回收的L-半胱氨酸盐酸盐一水合物晶体中所含有的L-半胱氨酸的回收率。结果示于表3中。
[表3]
Figure BDA0002611550980000122
Figure BDA0002611550980000131
在浓缩过程中所有晶体均析出，但当[HCl]/[L-半胱氨酸]当量比为0.85或更少时，L-半胱氨酸晶体析出，并且当当量比为0.9或更高时，L-半胱氨酸盐酸盐一水合物晶体析出。即，可以解释为当当量比大于0.85时，L-半胱氨酸盐酸盐一水合物晶体析出。
不论[HCl]/[L-半胱氨酸]当量比如何，当形成L-半胱氨酸盐酸盐一水合物时，L-半胱氨酸盐酸盐一水合物晶体的纯度均达到98％或更高。发现L-半胱氨酸盐酸盐一水合物的结晶过程的回收率在[HCl]/[L-半胱氨酸]当量比为0.9至3.0时为40％或更高，并且当当量比大于1.0且小于3.0时，预期该回收率大于50％。另外，发现当当量比为1.5至2.5时，纯度为60％或更高，并且预期在当量比为1.5至2.5时可能存在达到最高回收率的最佳条件。
实验实施例4–根据浓缩物浓度进行评估
在制备实施例(使用
Figure BDA0002611550980000132
MCK32L)中，通过仅改变浓缩物的浓度，制备L-半胱氨酸盐酸盐水合物晶体，该浓缩物通过将向其加入盐酸的分离的液体从100g/L浓缩至900g/L获得。
因此，测量了成核发生的时间、最终回收L-半胱氨酸盐酸盐一水合物晶体的纯度以及结晶过程的回收率。将结晶过程的回收率计算为相对于根据SMB色谱法的分离的液体中的L-半胱氨酸，最终回收的L-半胱氨酸盐酸盐一水合物晶体中所含有的L-半胱氨酸的回收率。结果示于表4中。
[表4]
Figure BDA0002611550980000133
Figure BDA0002611550980000141
当浓度为200g/L或更高时，L-半胱氨酸盐酸盐一水合物发生成核，而浓度为300g/L或更高时，在浓缩期间发生成核，并可以进行快速结晶。
在所有形成晶体的情况下，L-半胱氨酸盐酸盐一水合物晶体的纯度为99％或更高。即，证实了当使用本公开的方法获得晶体时，无论分离的液体的浓度如何，都可以以非常高的纯度获得L-半胱氨酸盐酸盐一水合物晶体。结晶过程的回收率与浓度成比例增加。然而，当浓度为800g/L时，可获得高纯度和高回收率的L-半胱氨酸晶体，而当浓度为900g/L时，L-半胱氨酸盐酸盐一水合物晶体浆液发生固化，因此不能搅拌和分离晶体。因此，预期可以在小于900g/L的浓度下获得高纯度和高回收率的L-半胱氨酸晶体。
基于这些结果，确认了当用于SMB色谱的分离的液体的浓度为200g/L至小于900g/L时，容易获得L-半胱氨酸晶体。特别地，证实了当浓度在300g/L至800g/L的范围内时，可以以更快的结晶过程、高纯度和高回收率获得晶体。
实验实施例5–根据低浓度下冷却条件的变化进行评估
在实施例4中的用于SMB色谱的分离的液体的浓度为100g/L时，即使冷却至15℃也未形成L-半胱氨酸盐酸盐一水合物晶体的浓缩物在恒定冷却速率下在夹套罐中冷却至-10℃持续2小时30分钟，同时搅拌，然后在与冷却完成时的温度相同的温度下搅拌12小时。结果，形成了L-半胱氨酸盐酸盐一水合物晶体。使用减压膜过滤装置对晶体进行固液分离，添加100mL洗涤液，并在35℃的烘箱干燥机中干燥12小时，以将残留水分降低至12.0％或更少。最后，制备了L-半胱氨酸盐酸盐一水合物晶体。L-半胱氨酸盐酸盐一水合物晶体的纯度为99.8％，而结晶过程的回收率为9.7％。
基于此，证实了即使当用于SMB色谱的分离的液体的浓度小于200g/L时，通过控制冷却温度也可以获得L-半胱氨酸盐酸盐一水合物晶体。然而，结晶过程的回收率太低而无法工业上应用。另外，该方法存在缺点，因为即使在低于零的苛刻温度条件下也必须进行冷却结晶过程，并且结晶时间长。
实验实施例6–根据冷却温度进行评估
在制备实施例中，通过仅改变L-半胱氨酸盐酸盐一水合物晶体浆液的冷却温度，制备L-半胱氨酸盐酸盐一水合物晶体。具体地，总共进行了5次结晶实验，包括在55℃下将L-半胱氨酸盐酸盐一水合物晶体浆液在不冷却的情况下搅拌2小时，和将L-半胱氨酸盐酸盐一水合物晶体浆液以10℃/h的冷却速率冷却至0℃至45℃的各种温度范围，同时搅拌。每个实验中使用的L-半胱氨酸盐酸盐一水合物浆液的初始体积为1L。
因此，L-半胱氨酸盐酸盐一水合物晶体的纯度和结晶过程的回收率示于表5中。将结晶过程的回收率计算为相对于根据SMB色谱法的分离的液体中的L-半胱氨酸，最终回收的L-半胱氨酸盐酸盐一水合物晶体中含有的L-半胱氨酸的回收率。结果示于表5中。
[表5]
冷却温度(℃) L-半胱氨酸盐酸盐一水合物晶体的纯度(％) 结晶过程的回收率(％)
0 99.5 83.5
15 99.7 79.1
30 99.7 74.2
45 99.8 68.9
55(无结晶) 99.8 64.3
在所有情况下，L-半胱氨酸盐酸盐一水合物晶体的纯度均为99.5％或更高。此外，甚至当未进行冷却时，结晶过程的回收率为64％或更高，且结晶过程的回收率随着冷却温度的降低而提高。发现在低于45℃的温度下所述过程的回收率为70％或更高，并且预期在30℃或更低的温度下所述过程的回收率为74％或更高。
实验实施例7–根据用作SMB色谱源材料的含有L-半胱氨酸的发酵液的浓度进行评估
在制备实施例中，通过仅改变用作SMB色谱源材料的含有L-半胱氨酸的发酵液(pH5.5)的浓度，制备L-半胱氨酸盐酸盐水合物晶体。具体地，总共进行了6个实验，包括使用制备实施例中获得的浓度为26g/L的L-半胱氨酸的发酵液作为SMB色谱的源液体，使用通过用水稀释L-半胱氨酸浓度为10g/L的发酵液作为SMB色谱的源液体，并使用通过使用薄膜蒸发器浓缩L-半胱氨酸浓度为60g/L至150g/L的发酵液作为SMB色谱的源液体。当L-半胱氨酸的浓度增加到180g/L时，由于L-半胱氨酸晶体析出而没有进行SMB色谱法。
每个实验中使用的源液体的体积为0.1kL或更大。SMB色谱法的产率和通过SMB色谱产生的过程液体中不包括水分的L-半胱氨酸的固体含量如表6中所示。
[表6]
Figure BDA0002611550980000151
在所有部分中，SMB色谱法的产率均为90％或更高，并且在通过SMB色谱生产的过程液体中排除水分的L-半胱氨酸的固体含量在所有部分均为90％或更高。根据以上结果，可以解释不管源液体中L-半胱氨酸的浓度如何，本公开的通过SMB色谱纯化L-半胱氨酸的方法对于纯化和结晶含有L-半胱氨酸的发酵液非常有效。
尽管已经参考特定的说明性实施方式描述了本公开，本公开所属领域的技术人员将理解，在不脱离本公开的技术精神或基本特征的情况下，本公开可以以其他特定形式来体现。因此，上述实施方式在所有方面都被认为是说明性的而不是限制性的。此外，本公开的范围由所附权利要求而不是详细描述来限定，并且应当理解，从本公开的含义和范围及其等同物得出的所有修改或变化都包括在本公开所附权利要求的范围内。

Claims (16)

1.一种制备L-半胱氨酸盐酸盐水合物晶体的方法，包括：
(a)在将含有L-半胱氨酸的pH范围为3.0至9.0的发酵液引入具有以强酸性阳离子交换树脂作为固定相的连续色谱装置中之后，获得分离的液体；
(b)向所述分离的液体中加入盐酸，使盐酸与L-半胱氨酸的当量比([HCl]/[L-半胱氨酸])为0.9至3.0；
(c)浓缩向其加入盐酸的所述分离的液体；和
(d)从所述浓缩物中回收L-半胱氨酸盐酸盐水合物晶体。
2.根据权利要求1所述的方法，进一步包括在步骤(a)之前将含有L-半胱氨酸的所述发酵液调节至3.5至7.5的pH。
3.根据权利要求1或2所述的方法，进一步包括在步骤(a)之前将含有L-半胱氨酸的pH范围为3.0至9.0的所述发酵液浓缩。
4.根据权利要求1至3中任一项所述的方法，其中步骤(a)中的所述强酸性阳离子交换树脂具有硫酸官能团。
5.根据权利要求1至4中任一项所述的方法，其中步骤(a)中的所述强酸性阳离子交换树脂为苯乙烯-二乙烯基苯共聚物。
6.根据权利要求1至5中任一项所述的方法，其中步骤(a)中的所述连续色谱装置是模拟移动床(SMB)色谱装置。
7.根据权利要求1至6中任一项所述的方法，其中步骤(a)中的所述分离的液体具有85％(w/w)或更高的排除水分的L-半胱氨酸的固体含量。
8.根据权利要求1至7中任一项所述的方法，其中步骤(a)中的所述连续色谱法的回收率为获得的所述分离的液体中的L-半胱氨酸相对于引入的所述发酵液的比率，其为50％(w/w)。
9.根据权利要求1至8中任一项所述的方法，其中步骤(b)中的所述盐酸与L-半胱氨酸的当量比([HCl]/[L-半胱氨酸])为1.5至2.5。
10.根据权利要求1至9中任一项所述的方法，其中进行步骤(c)使得向其加入盐酸的所述分离的液体中的L-半胱氨酸的浓度为200g/L至小于900g/L。
11.根据权利要求1至10中任一项所述的方法，其中进行步骤(c)使得向其加入盐酸的所述分离的液体中的L-半胱氨酸的浓度为500g/L至小于900g/L。
12.根据权利要求1至11中任一项所述的方法，进一步包括在步骤(d)之前冷却所述浓缩物。
13.根据权利要求12所述的方法，其中将所述浓缩物冷却至0℃至30℃的温度。
14.根据权利要求1至13中任一项所述的方法，包括将通过在步骤(d)中回收所述晶体而获得的滤液添加到步骤(a)的所述发酵液、步骤(b)的所述分离的液体或向其加入盐酸的所述分离的液体中。
15.根据权利要求1至14中任一项所述的方法，其中所制备的L-半胱氨酸盐酸盐水合物晶体的纯度为98％(w/w)或更高。
16.L-半胱氨酸盐酸盐水合物晶体，其根据权利要求1至15中任一项所述的制备方法制备。
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