KR102282385B1 - 연속식 크로마토그래피 공정을 이용한 천연 l-시스테인 염산염 수화물 결정의 제조 방법 - Google Patents

연속식 크로마토그래피 공정을 이용한 천연 l-시스테인 염산염 수화물 결정의 제조 방법 Download PDF

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Abstract

본원은 L-시스테인 염산염 수화물 결정의 제조방법 및 상기 방법으로 제조된 L-시스테인 염산염 수화물 결정에 관한 것이다. 본원의 L-시스테인 염산염 수화물 결정의 제조방법을 통해, 화학 반응이나 인공적인 합성 화합물의 사용 없이, 천연의 L-시스테인 발효액으로부터 높은 회수율 및/또는 순도로 L-시스테인 염산염 수화물 결정을 수득할 수 있다.

Description

연속식 크로마토그래피 공정을 이용한 천연 L-시스테인 염산염 수화물 결정의 제조 방법{Method for Preparing Natural L-cysteine Hydrochloride Hydrate Crystals by Continuous Chromatography}
본원은 L-시스테인 염산염 수화물 결정의 제조방법 및 상기 방법으로 제조된 L-시스테인 염산염 수화물 결정에 관한 것이다.
L-시스테인은 일반적으로 오리털이나 인간 머리카락 따위를 원료로 하는 동물 유래 L-시스틴 또는 미생물 대사액을 원료로 하는 발효 유래 L-시스틴을 전기화학적 환원 반응을 이용하여 L-시스테인으로 분해하여 제조되고 있다. 이와 달리, 미생물을 이용한 L-시스테인 제조방법으로는 황화물이 함유된 배지에서 O-아세틸 전이효소가 수정된 균주를 이용하여 천연 L-시스테인을 생산하는 발효 공정(US8802399B, US6946268B), 미생물 배양방법으로 제조된 O-포스포호모세린을 황화물과 혼합하고 O-포스포세린 설피드릴라제를 이용하여 효소 촉매 반응을 유도하여 천연 L-시스테인을 제조하는 공정(WO2013/089478, WO2012/053794)이 공지되어 있다.
미생물 배양방법으로 제조된 L-시스테인은 이온 교환 및 기타 알려진 방법을 통해 분리할 수 있다고 언급하고 있으나 구체적인 방법, 수율, 순도 등과 같은 정보가 전혀 기재되어 있지 않다 (EP1645623A1, EP1298200B1, US20050221453A1, EP1234874A1, EP1571223A2, 및 EP1650296A).
한편, 이온교환기를 이용하는 방법을 통해 L-시스테인 발효액으로부터 L-시스테인 염산염 1수화물을 제조하는 방법이 알려져있다. 예를 들어, L-시스테인이 함유된 발효액의 pH를 5 이하로 하향 조정한 후 산성 양이온 교환기 또는 강산성 양이온 교환기에 접촉시켜 L-시스테인을 이온 교환기에 흡착시키고, 흡착된 L-시스테인을 염산 수용액에 용리시켜 90% 이상의 수율로 정제하는 공법이 공지된 바 있다. 상기의 L-시스테인 염산 용리액을 이용하여 L-시스테인 염산염 1수화물을 제조할 수 있다(US8088949B).
또한 pH가 6 내지 9인 L-시스테인이 함유된 발효액을 염기성 음이온 교환기와 접촉시켜 L-시스테인을 이온 교환기에 흡착시키고, 흡착된 L-시스테인을 염산 수용액에 용리시킨 후, 상기의 공정액을 pH 4이하에서 산성 양이온 교환기와 접촉시켜 L-시스테인을 이온 교환기에 흡착시키고, 흡착된 L-시스테인을 염산 수용액에 용리시켜 85% 이상의 수율로 정제하는 공법이 공지된 바 있다. 또한 상기의 L-시스테인 염산 용리액을 이용하여 L-시스테인 염산염 1수화물을 제조할 수 있다(US9120729B).
그러나, 상기의 방법들은 반복적인 이온교환 단계를 거침으로서 화학 반응을 진행하게 되고, 이온흡착공정의 후속 공정으로써 다량의 용리액을 반복적으로 사용하여야 하므로 많은 공정 용수량이 요구되며, 또한 추가적인 정제단계를 수행하여야 하는 단점이 있다. 이에 보다 높은 수율 및 순도로 L-시스테인을 분리하고, L-시스테인 염산염 수화물을 제조하는 방법에 대한 필요성이 지속적으로 요구되고 있다.
이러한 배경하에, 본 발명자들은 L-시스테인 염산염 수화물의 순도 및 수율을 증가시키기 위해 예의 노력한 결과, 높은 수율 및 순도뿐만 아니라, 효율적인 생산성 제고 및 적은 용수 사용량을 장점으로 갖는 L-시스테인 염산염 수화물 제조방법을 완성하였다.
본 발명의 하나의 목적은 L-시스테인 염산염 수화물 결정의 제조방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 상기 L-시스테인 염산염 수화물 결정의 제조방법에 따라 제조된, L-시스테인 염산염 수화물 결정을 제공하는 것이다.
이하에서는, 본 발명을 더욱 상세히 설명한다.
한편, 본원에서 개시되는 각각의 설명 및 실시형태는 각각의 다른 설명 및 실시 형태에도 적용될 수 있다. 즉, 본원에서 개시된 다양한 요소들의 모든 조합이 본 발명의 범주에 속한다. 또한, 하기 기술되는 구체적인 서술에 의하여 본 발명의 범주가 제한된다고 할 수 없다.
또한, 당해 기술분야의 통상의 지식을 가진 자는 통상의 실험만을 사용하여 본원에 기재된 본 발명의 특정 양태에 대한 다수의 등가물을 인지하거나 확인할 수 있다. 또한, 이러한 등가물은 본 발명에 포함되는 것으로 의도된다.
상기 과제를 해결하기 위한 본원의 하나의 양태는 (a) 강산성 양이온 교환 수지를 고정상으로 하는 연속식 크로마토그래피 장치에, L-시스테인을 포함하는 pH 3.0 내지 9.0의 발효액을 주입한 후 분리액을 수득하는 단계;
(b) 상기 분리액에 L-시스테인 대비 염산의 당량비([HCl]/[L-시스테인])가 0.9 내지 3.0 이 되도록 염산을 첨가하는 단계;
(c) 상기 염산이 첨가된 분리액을 농축하는 단계; 및
(d) 상기 농축액으로부터 L-시스테인 염산염 수화물 결정을 회수하는 단계를 포함하는, L-시스테인 염산염 수화물 결정의 제조 방법이다.
본원에서 "L-시스테인"은 구성하는 아미노산 중에 하나이며, L-아미노산 중에서도 유일하게 티올기(R-SH)를 갖는 황 함유 아미노산이다. L-시스테인은 화학적으로 합성되거나 미생물 발효 등을 통해 생물학적으로 합성되어 수득한 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 구체적으로, 본원에서 L-시스테인은 미생물 발효를 통해 생물학적으로 제조된 L-시스테인일 수 있으며, 미생물 발효를 통해 제조된 전구체인 O-포스포호모세린과 황화물을 포스포세린 설피드릴라제 존재하 효소 촉매 반응을 유도하여 수득된 천연 L-시스테인일 수 있다. 상기 천연 L-시스테인은 제조 공정상 화학 반응, 화학적 흡착 또는 용리 단계를 거치지 않은 L-시스테인일 수 있다.
본원에서 사용된 용어, "천연"은 화학적 반응에 의하지 않은 것을 의미한다. 유럽 연합 착향료 관리 규정 (EU Flavorings Regulation) 1334/2008에 공시된 바에 따르면 물리, 효소 또는 미생물 공정으로 얻어진 물질만이 "천연" 착향료로 정의된다. 상기의 관점에서, 동물 유래 및 미생물 발효 유래와는 상관 없이, L-시스틴의 전기화학적 환원 반응으로 제조된 L-시스테인은 모두 천연이라 칭할 수 없다.
본원에서 "발효액"은 L-시스테인을 생산하는 미생물을 배양하여 수득한 배지, 상기 배지와 함께 배양한 미생물을 포함하는 배양물, 또는 L-시스테인을 생산할 수 있는 전구체와 효소가 함유된 효소 전환액을 의미한다. 구체적으로, L-시스테인을 포함하는 발효액은 천연의 L-시스테인을 포함하는 배양액 또는 효소 전환액일 수 있다. 보다 구체적으로, L-시스테인 생성능을 갖는 미생물 발효를 통해 생물학적으로 제조된 L-시스테인 배양물 또는 배양액일 수 있으며, 또는 미생물 발효를 통해 제조된 전구체인 O-포스포호모세린과 황화물을 포스포세린 설피드릴라제 존재 하에 효소 촉매 반응을 유도하여 수득된 천연 L-시스테인의 효소 전환액일 수 있다. 상기 발효액을 원료액으로 하여 제조한 L-시스테인 염산염 수화물 결정은 화학적 반응에 의하지 않은 것으로 천연에서 유래된 것이라 할 수 있다.
본원에서 상기 발효액은 연속식 크로마토그래피 공정의 원료액으로 사용 될 수 있다. 즉, 상기 (a) 단계의 연속식 크로마토그래피 장치에 주입될 수 있다.
상기 연속식 크로마토그래피 장치에 주입되는 발효액의 pH는 제조방법에 따라 상이할 수 있으나, 2.5 내지 9.5, 2.5 내지 9.0, 3.0 내지 9.0, 3.5 내지 8.5, 3.5 내지 7.5, 4.5 내지 7.0, 또는 5.0 내지 6.0의 pH일 수 있다. 상기 발효액 그 자체로도 연속식 크로마토그래피 공정의 원료액으로 사용될 수 있으며, (a) 단계 이전에 L-시스테인을 포함하는 발효액이 pH2.5내지 9.5, 2.5 내지 9.0, 또는 3.0 내지 9.0, 구체적으로 3.5 내지 8.5, 또는 3.5 내지 7.5, 보다 구체적으로 4.5 내지 7.0, 또는 5.0 내지 6.0의 pH가 되도록 조절하는 단계를 추가로 포함할 수 있다. 예컨대, 황산 또는 염산과 같은 산이나, 수산화나트륨(가성소다), 암모니아, 수산화리튬, 또는 수산화칼륨 등의 염기를 첨가하여 조절할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 상기 pH 조절제는 L-시스테인의 구조에 영향을 미치지 않고 최종적으로 L-시스테인 염산염 수화물의 결정을 수득할 수 있는 한, 당업자에 의해 적절히 선택되어 사용될 수 있다.
L-시스테인의 발효액의 pH가 낮아질수록 L-시스테인은 양이온화되는 경향이 강해진다. 본원에서 사용하는 연속식 크로마토그래피의 고정상은 강산성 양이온 교환수지이기 때문에 양이온을 흡착하는 경향이 있으므로, L-시스테인이 양이온화 되면 고정상에 일부 흡착되어 연속식 크로마토그래피 공정 회수율이 감소할 수 있다. 또한 L-시스테인은 pH가 높을수록 산화되어 L-시스틴으로 전환되는 경향이 강해진다. 그로 인해 연속식 크로마토그래피 공정 회수율이 감소되는 경향이 나타날 수 있다. 따라서 상기 L-시스테인을 포함하는 발효액은 pH 2.5 내지 9.5, 구체적으로는 3.0 내지 9.0, 보다 구체적으로 3.5 내지 8.5, 보다 더욱 구체적으로는 3.5 내지 7.5, 4.5 내지 7.0, 또는 5.0 내지 6.0의 발효액일 수 있다.
단, 연속식 크로마토그래피 공정의 회수율은 연속식 크로마토그래피 공정의 수지탑 구간 간의 유속, 공정 온도, 이동상의 조성, 연속식 크로마토그래피 시퀀스 등 다양한 공정 변수에 영향을 받으므로, 연속식 크로마토그래피 공정의 회수율은 연속식 크로마토그래피 원료액의 pH만으로 한정되는 인자는 아니다.
본원에서 (a) 단계 이전에, L-시스테인을 포함하는 발효액을 희석하거나 농축하는 단계를 추가로 포함할 수 있다. 이 단계는 전술한 pH를 조절하는 단계 이전에 수행하거나 이후에 수행할 수 있다.
상기 농축은 통상의 농축기(예컨대, 강제순환농축기, 박막농축기, 또는 로타리 농축기 등) 내에서 수행될 수 있다.
상기 희석 또는 농축된 발효액의 L-시스테인 농도는, 10 내지 180g/L, 구체적으로, 10 내지 150 g/L로 조절될 수 있지만, 연속식 크로마토그래피 공정의 회수율 및 연속식 크로마토그래피 공정을 통해 수득한 분리액의 품질(구체적으로, 분리액에서 수분을 제외한 고형분의 L-시스테인 함량)에는 크게 영향을 주는 인자가 아니므로, 연속식 크로마토그래피 공정 원료로 사용되는 L-시스테인을 포함하는 발효액의 농도를 조절하는 것은 L-시스테인을 분리 및 정제하는데 필수적인 과정은 아니다. 단, 농도가 180 g/L 이상으로 조절될 경우, L-시스테인의 농도가 L-시스테인의 용해도보다 높아서, 회수하기 부적합한 저품질의L-시스테인 결정이 발생하여 연속식 크로마토그래피 공정 회수율 저하를 유발할 수 있다. 연속식 크로마토그래피 공정 원료액의 농도가 높으면, L-시스테인 처리량 대비 연속식 크로마토그래피 공정에 사용되는 용수량을 절감할 수 있다. 이와 같은 특징은 L-시스테인과 이온교환수지의 최대 흡착량에 의해 용수 사용량이 결정되는 이온교환 공정에서는 찾아볼 수 없다.
본원에서 사용된 용어 "연속식 크로마토그래피"(Continuous Chromatography)는 기존 회분식 크로마토그래피 공정을 연속식으로 발전시킨 공정을 의미한다. 구체적으로, 크로마토그래피 장치 내에 고상과 액상이 연속적으로 공급될 수 있고, 고상과 액상이 서로 반대방향으로 움직여 향류 접촉을 일으키므로 보다 효율적으로 물질의 분리를 가능하게 한다. 본원에서는 진정 이동층 (TMB, True Moving Bed) 크로마토그래피와 유사 이동층 (SMB, Simulated Moving Bed) 크로마토그래피를 포함하는 개념으로 사용될 수 있다. 또한 상기 두 진정 이동층 크로마토그래피와 유사 이동층 크로마토그래피는 원리가 같으므로, 생산성 및 기타사항을 고려하여 당업자가 적절히 선택하여 사용할 수 있다.
본원에서 연속식 크로마토그래피 공정을 사용하면 흡착/용리 과정이 필요하지 않으므로, 이온 교환 공정에 비해 시간당 생산성이 높고, 공정 용수 사용량을 줄일 수 있는 장점이 있다. 또한, 이온 교환공정이나 일반 크로마토그래피 공정으로 수득한 L-시스테인이 포함된 공정액으로부터 L-시스테인 분말 제품을 높은 수율로 획득하기 위해서는 농축 결정화 공정에 많은 에너지가 필요한데, 본원의 방법에 따르면 에너지 비용을 감소시킬 수 있다.
본원의 일 구현예로서 SMB 크로마토그래피 장치가 사용될 수 있으며, SMB 크로마토그래피 장치의 모식도를 도 2에 나타내었다. 수지탑 개수, 수지탑 부피, 수지 충진량, 각 구간의 유속, 버퍼 탱크의 설치 유무, 수지탑 이동 시간 등의 공정 변수는 변경할 수 있으며, 상기에 명시된 고정 조건으로 제한되지는 않는다.
상기 연속식 크로마토그래피 장치의 고정상은 이온교환수지가 사용될 수 있으며, 구체적으로는
강산성 양이온 교환수지일 수 있다. 상기 강산성 양이온 교환수지의 작용기는 황산기일 수 있으나 이에 제한되지 않는다. 또한, 본원에서 사용되는 강산성 양이온 교환수지의 모핵 소재는 강산성 작용기가 부착될 수 있는 것이라면 제한되지 않는다. 예를 들어, 스티렌-디비닐벤젠 공중합체로부터 유도된 것이 사용될 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 구체적인 예를 들어, 상기 강산성 양이온 교환수지는 황산 스티렌-디비닐벤젠 공중합체일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
당업계에서 아미노산 분리정제에 자주 사용되는 다른 유형의 고정상으로서 작용기가 없는 스티렌-디비닐벤젠 공중합체, 작용기가 없는 메타크릴레이트 중합체와 같은 작용기가 없는 교환수지; 트리메틸아민 스티렌-디비닐벤젠 공중합체와 같은 강염기성 음이온 교환수지; 3차 아민 스티렌-디비닐벤젠 공중합체와 같은 약염기성 음이온 교환수지; 카르복실 메타크릴레이트 중합체와 같은 약염기성 양이온 교환수지 등은 연속식 크로마토그래피 공정을 통해 수득한 분리액에서 고형분의 L-시스테인 함량을 50%(w/w) 이상으로 정제하기 어렵다. 반면, 황산 스티렌-디비닐벤젠 공중합체와 같은 강산성 양이온 교환수지를 사용하였을 경우 연속식 크로마토그래피 공정을 통해 수득한 분리액에서 수분을 제외한 고형분의 L-시스테인 함량을 80% (w/w)이상, 구체적으로는 90%(w/w)이상으로 정제할 수 있다.
상기 크로마토그래피 장치에는 이동상으로 화학적 합성물(이를테면 메탄올, 이소프로필 알코올, 아세트니트릴 등의 유기용매 등)이 미첨가된 물, 가성소다 희석액, 황산 희석액, 인산 희석액, 염산 희석액, 수산화칼륨 희석액 또는 이들의 혼합물을 사용할 수 있으나, 이에 한정되지 않는다. 구체적인 예를 들어, 연속식 크로마토그래피의 이동상으로 물을 사용할 수 있다. 화학적 합성물을 포함한 이동상을 사용 시 해당 화학적 합성물이 최종 제품에 잔류할 수 있으며, 이로 인해 화학적 합성물에 대한 잔류 기준치를 초과하여 제품 판매가 불가능하거나, 천연 제품으로 유통이 불가능할 수 있다. 또한 공정 용수에 물 이외의 화학물질을 첨가하지 않음에 따라 제품 원가 절감효과가 기대될 수 있다. 이온 교환 공정에서는 흡착된 L-시스테인을 용리하기 위하여, 용리액으로서 염산 또는 황산과 같은 용매가 필수적으로 사용되어야 하므로, 해당 화학물질의 사용 및 폐기 처리와 관련된 제품 원가 증가가 필연적으로 수반된다.
상기 (a) 단계에서 L-시스테인을 포함하는 발효액은 연속식 크로마토그래피 장치에 주입되면, 연속식 크로마토그래피 공정에 따라 L-시스테인이 분리되어 포함된 분리액을 수득할 수 있다. 본원에서는 상기 L-시스테인이 분리되어 포함된 분리액을 간략히 "분리액", "크로마토그래피 분리액", 또는 "공정액"으로 표현될 수 있다.
상기 분리액의 품질은 분리액에서 수분을 제외한 고형분 중 L-시스테인의 함량으로 평가될 수 있다. 본원의 분리액은 수분을 제외한 고형분의 L-시스테인 함량이 80%(w/w), 구체적으로 85%(w/w), 보다 구체적으로 90%(w/w) 이상일 수 있다. 분리액에서 수분을 제외한 고형분의 L-시스테인 함량이 80% 이상이었을 때, 순도 98% 이상의 L-시스테인 염산염 수화물 결정을 제조할 수 있음을 실험적으로 확인하였다. 단, L-시스테인 염산염 수화물 결정의 순도는 농축, 결정화, 결정 분리 등 다른 공정 세부조건에도 영향을 받으므로, L-시스테인 염산염 수화물 결정의 순도는 연속식 크로마토그래피로 생산된 공정액에서 수분을 제외한 고형분의 L-시스테인 함량만으로 한정되는 인자는 아니다.
본원에서, (a) 단계는 "연속식 크로마토그래피 공정"이라고 표현될 수 있다. "연속식 크로마토그래피 공정 회수율"이란 (a) 단계에서 주입되는 발효액 대비 수득되는 분리액의 L-시스테인 회수율을 의미하여, 해당 공정의 효율을 평가하는데 사용된다. 본원에서 연속식 크로마토그래피 공정 회수율은 50%(w/w), 구체적으로 60%(w/w), 보다 구체적으로 70%(w/w), 보다 구체적으로 80%(w/w)이상일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본원의 분리액에 포함된 L-시스테인을 L-시스테인 염산염으로 변화시키기 위하여, (b) 단계에서 분리액에 염산을 첨가할 수 있다. 구체적으로, 분리액에 포함되어 있는 L-시스테인 대비 염산의 당량비([HCl]/[L-시스테인])가 0.85 초과 3.5 이하, 1.0 초과 내지 3.0 미만, 0.9 내지 3.0, 구체적으로 1.5 내지 2.5, 보다 구체적으로 2.0이 되도록 염산을 첨가할 수 있다. 상기 당량비가 0.9 내지 3.0일 경우 결정화 공정 회수율이 40% 이상일 수 있고, 1.0 초과 내지 3.0 미만인 구간에서 50%이상일 것으로 예상되며, 1.5 내지 2.5일 경우 결정화 공정 회수율이 60% 이상일 수 있다.
상기 (c) 단계는 결정화를 위해 염산이 첨가된 분리액을 농축하는 단계이다. (c) 단계에서는 상기 염산이 첨가된 분리액을 농축하여 농축액을 얻을 수 있다. 상기의 농축은 당업자의 적의 선택에 의하여 통상의 농축기(예컨대, 강제순환농축기, 박막농축기, 또는 로타리 농축기 등) 내에서 수행될 수 있다. (c) 단계 농축액의 L-시스테인의 농도는 100 내지 900g/L, 구체적으로는 200 내지 900g/L미만, 300 내지 900g/L미만, 400 내지 900g/L미만일 수 있으며, 보다 구체적으로 500 내지 900g/L미만일 수 있다.
농축액 중 L-시스테인의 농도가 낮으면 결정핵 생성 및 결정 성장에 필요한 과포화도의 부족으로 인해 농축중에는 결정화가 유발되지 않고, 냉각중에 결정화가 이루어지거나, 추가적인 공정을 통해 결정화를 진행할 수 있다. 그러나 회수율이 낮거나 결정화 시간이 길어질 수 있다. 농축액의 L-시스테인의 농도가 300 g/L 이상인 경우, 농축 과정 중 L-시스테인 염산염 수화물 결정핵이 생성될 수 있다. 추가적으로, 상기의 300 g/L 이상으로 농축된 L-시스테인 염산염 수화물 슬러리를 냉각하면 L-시스테인 염산염 수화물 결정화 공정 회수율을 증가시킬 수 있다. 농축액의 L-시스테인 염산염 수화물 농도가 900 g/L인 경우, 결정 입자의 다량 발생으로 인한 고화 현상이 발생할 수 있으며, 그로 인해 결정 슬러리의 교반 및 결정 분리가 불가능할 수 있다. 따라서 염산이 첨가된 분리액을 농축하는 단계는 L-시스테인의 농도가 200g/L 내지 900g/L 미만, 구체적으로는 300 내지 900g/L미만, 보다 구체적으로 500 내지 900g/L미만이 되도록 농축하는 것일 수 있다.
상기 (c) 단계에 따른 농축 중에 L-시스테인 염산염 수화물 결정화가 일어날 수 있다. 본원에서 용어, “결정화”는 액체 또는 비결정 상태의 고체가 결정을 형성하는 현상을 말하며, 결정핵의 발생과 결정핵의 성장이라는 두 현상이 수반하여 일어난다.
상기 농축액은 회수하기 이전에 냉각 및/또는 숙성하는 단계를 통해 결정핵을 형성 및/또는 성장시킬 수 있다. 또한, L-시스테인 염산염 수화물 결정이 농축액에 석출되지 않더라도, 농축액을 냉각 및/또는 숙성할 경우, 결정이 형성될 수 있다.
상기 냉각하는 단계는 구체적으로, 2시간 내지 6시간에 걸쳐, -10 내지 55℃의 온도까지 냉각하는 것을 의미할 수 있으며, 구체적으로 2시간 내지 6시간에 걸쳐 0 내지 45℃, 보다 구체적으로는 0 내지 30℃의 온도까지 냉각하는 것을 의미할 수 있으며, 보다 더욱 구체적으로 2시간 내지 6시간에 걸쳐 0 내지 15℃의 온도까지 냉각하는 것을 의미할 수 있다. 상기 숙성하는 단계는, 온도 변화 없이 방치하는 것을 의미할 수 있다. 본원에서는 상기 냉각된 온도를 일정하게 유지하는 것을 의미할 수도 있으며, 냉각을 하지 않을 경우라도 농축액의 온도를 일정하게 유지하는 것을 의미할 수 있다. 구체적으로 1 내지 3시간에 걸쳐 숙성할 수 있다.
본원에서 일련의 (c) 단계는 "결정화 공정"이라고 표현될 수 있다. "결정화 공정 회수율"이란 연속식 크로마토그래피 공정에 따른 분리액의 L-시스테인 대비 수득되는 L-시스테인 염산염 수화물 결정의 L-시스테인 회수율을 의미하여, 결정화 공정의 효율을 평가하는데 사용된다. 본원에서 연속식 크로마토그래피 공정 회수율은 40%(w/w), 구체적으로 50%(w/w), 보다 구체적으로 60%(w/w), 보다 더욱 구체적으로 70%(w/w) 이상일 수 있다.
상기 (d) 단계는 상기 농축액으로부터 석출된 L-시스테인 염산염 수화물 결정을 회수할 수 있다. 구체적으로는 상기 농축액을 고액 분리하여 슬러리로부터 L-시스테인 염산염 수화물 결정을 회수할 수 있다. 이는, 감압 막여과 장치, 가압 막여과 장치, 원심분리 장치 등의 고액분리기를 이용하여 진행할 수 있으나, 이에 제한되지는 않는다. 상기 슬러리 및 또는 석출된 시스테인 결정은 추가적으로 세척 또는 건조하는 단계를 거칠 수 있다.
본원에서 상기 (d)단계에서 결정을 회수하고 얻어진 여과액은 L-시스테인이 잔류된 모액으로서 L-시스테인의 최종 정제 회수율 향상을 위하여, (a) 단계의 발효액, (b)단계의 분리액 또는 (c) 단계의 염산이 첨가된 분리액에 전체 또는 일부를 첨가할 수 있으나, 이에 제한되지는 않는다.
본원의 제조방법에 따라 제조된 L-시스테인 염산염 수화물은 1수화물일 수 있다. 본원의 제조방법에 따라 제조된 L-시스테인 염산염 수화물 결정의 순도는 95%(w/w)이상, 구체적으로 98%(w/w), 보다 구체적으로 99%(w/w)일 수 있다.
상기 과제를 해결하기 위한 본 발명의 다른 하나의 양태는 상술한 L-시스테인 염산염 수화물 결정의 제조방법에 따라 제조된 L-시스테인 염산염 수화물의 결정을 제공하는 것이다.
L-시스테인 염산염 수화물의 결정 및 이의 제조방법은 상술한 바와 같다.
본원의 L-시스테인 염산염 수화물 결정의 제조방법은 화학 반응이나 인공적인 합성 화합물의 사용 없이, L-시스테인 발효액의 천연 상태 그대로 분리 및 정제하며, 동시에 L-시스테인 염산염 수화물 결정을 높은 회수율 및/또는 순도로 수득할 수 있다. 뿐만 아니라, 본원의 제조방법은 효율적인 생산성을 나타내며, 특히 용수 사용량이 현저히 감소될 수 있다.
도 1은 발효액에 포함된 천연 상태의 L-시스테인으로부터 연속식 크로마토그래피 공정을 이용하여 L-시스테인 염산염 수화물 결정을 제조하는 공정의 대표적인 예시를 나타낸 것이다.
도 2는 본원의 일 구현예에서 사용한 SMB 크로마토그래피 공정의 수지탑 배치 및 각 구간별 유속을 나타낸 것이다.
이하, 하기 실시예에 의하여 본 발명을 보다 상세하게 설명한다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하기 위한 것일 뿐 본 발명의 범위가 이들로 한정되는 것은 아니다.
시험방법
본원 실시예에서 사용되는 공통적인 분석 방법은 다음과 같다.
(1) L-시스테인 염산염 1수화물의 정량분석을 위한 HPLC 방법
본원에서 L-시스테인 염산염 1수화물의 순도 및 농도를 분석하기 위한 HPLC 분석 조건은 하기와 같다:
장비: HPLC 1260 Infinity System (Agilent Technology Inc.)
컬럼: HP C18 (150 mm × 3.9 mm; 5 μm)
이동상: Acetonitrile/Water/Heptafluorobutyric acid (8/92/0.1)
유속: 0.425 mL/min
온도: 30 도
검출: UV at 220 nm
시료 주입 부피: 2 uL
(2) L-시스테인 염산염 1수화물 결정의 순도 측정 방법
본원에서 L-시스테인 염산염 1수화물 결정의 품질은 L-시스테인 염산염 1수화물의 순도를 기준으로 평가하며, 그 방법은 하기의 순서를 따른다:
(a) L-시스테인 염산염 1수화물 결정을 실리카겔이 들어가있는 진공 건조기에 20 mmHg 이하의 진공도에서 24시간 동안 두어 잔류 수분을 제거하여, L-시스테인 염산염 무수물 결정을 준비하고, L-시스테인 염산염 무수물 결정의 온도를 상온까지 냉각시키는 단계;
(b) 상온까지 냉각된 L-시스테인 염산염 무수물 결정을 0.5000 g 정량하여 1 L 정량 플라스크에 넣고 3차 증류수로 희석하여, 0.5000 g/L의 샘플을 준비하는 단계;
(c) L-시스테인 염산염 1수화물 스탠다드 결정 (Sigma, ≥99.0%)을 (a) 단계와 동일한 방법으로 처리한 후, 0.5000 g 정량하여 1 L 정량 플라스크에 넣고 3차 증류수로 희석하여, 0.5000 g/L의 샘플을 준비하고, 스탠다드 시약 제조사의 증명서를 통해 스탠다드 제품의 순도를 확인한 후, 샘플 내의 L-시스테인 염산염 무수물의 농도를 환산하는 단계(환산된 [L-시스테인 염산염 무수물의 농도]는 0.5000 g/L × [스탠다드 제품의 순도]); 및
(d) (c) 단계에서 준비한 샘플은 외부 스탠다드로 하고 HPLC로 (b) 단계에서 준비한 샘플을 분석하여 (a) 단계에서 사용한 L-시스테인 염산염 무수물 결정의 순도를 분석하는 단계(분석된 L-시스테인 염산염 무수물 결정의 순도는 L-시스테인 염산염 1수화물 결정의 순도와 동일함).
(3) 발효액 또는 크로마토그래피 공정에 따른 분리액 내의 고형분 기준 L-시스테인의 함량 분석 방법
본원에서 발효액 또는 크로마토그래피 공정에 따른 분리액의 품질은 용액에서 수분을 제거하여 얻은 고형분에서 L-시스테인의 함량을 기준으로 평가하며, 그 방법은 하기의 순서를 따른다:
(a) 도자기 용기에 해사(10내지20mesh; 대정화금)를 5 g 가량 소취하여 넣고, 105 ℃의 강제 순환 오븐에 3시간 동안 두어 잔류 수분을 제거한 후, 실리카겔이 들어가 있는 진공 건조기에 1시간 동안 두어 온도를 상온까지 냉각시키는 단계;
(b) (a) 단계의 용기에 분석하려는 용액을 넣고, 넣기 전과 후의 무게 차이를 이용하여 넣은 [용액의 질량]을 정량하는 단계;
(c) (b) 단계의 용기를 105 ℃의 강제 순환 오븐에 3시간 동안 두어 잔류 수분을 제거한 후, 실리카겔이 들어가 있는 진공 건조기에 1시간 동안 두어 온도를 상온까지 냉각하고, 무게 차이를 이용하여 제거된 수분량을 정량하고, 이를 이용하여 측정하려는 용액의 고형분 질량 기준 함량을 환산하는 단계 ([고형분의 질량 기준 함량]은 ([용액의 질량] - [제거된 수분의 질량]) / [용액의 질량]);
(d) 분석하려는 용액의 밀도를 비중부액계를 이용하여 측정하는 단계;
(e) 분석하려는 용액의 L-시스테인의 농도를 HPLC를 이용하여 측정하는 단계; 및
(f) 분석하려는 용액에서 수분이 제거된 고형분에서 L-시스테인의 함량을 용액의 고형분 질량 기준 함량, 밀도, L-시스테인 농도를 이용하여 환산하는 단계([용액에서 수분이 제거된 고형분에서 L-시스테인의 함량]은 [L-시스테인의 농도] / [용액의 밀도] / [용액의 고형분의 질량 기준 함량])
제조예
(1) L-시스테인을 포함하는 발효액의 제조
발효 배지에서 O-포스포세린을 생산할 수 있는 미생물을 배양하여 O-포스포세린 발효액을 수득한 후, 상기 발효액을 O-포스포세린 설피드릴라제(OPS sulfhydrase)를 이용하여 황화물과 효소 전환 반응을 진행시켜, L-시스테인을 포함하는 발효액을 수득하였다.
구체적으로, 대장균 W3110 균주에 serB가 결손되고, 변이형 serA*가 도입되어 OPS 생산능을 가지는 KCCM 11103P(CA07-0022/pCL-prmf-serA*(G336V)-serC ; 대한민국 등록특허 제10-1381048호) 균주를 MMYE 한천 배지 플레이트 상에서 33℃, 24시간 배양하고, 플레이트 상의 1/10의 세포를 하나의 플레이트로부터 긁어내어 배플(baffle) 플라스크 중에 플라스크 씨드 (seed) 배지 (10 g/L의 글루코스, 0.5 g/L의 황산마그네슘, 3 g/L의 인산이수소칼륨, 10 g/L의 효모추출물, 0.5 g/L의 염화나트륨, 1.5 g/L의 염화암모늄, 12.8 g/L의 피로인산나트륨, 1 g/L의 글리신) 에 접종시켜 30℃에서 200rpm으로 6시간 동안 씨드 배양하였다. 씨드 배양이 완료된 후 본 배양 배지 용적의 16%에 상응하는 용적의 씨드 배양 배지를 300ml의 본배양 배지로 채워진 1L 소형 발효기에 접종하고, 배양을 33℃에서 pH 7.0에서 수행하여 OPS 발효액을 수득하였다. 100 mM의 Na2S, 0.2 mM의 인산피리독살 (pyridoxal 5′-phosphate, PLP)이 있는 조건에서 상기 50mM의 OPS 발효액과 Mycobacterium tuberculosis H37Rv 유래의 50mg/ml Msm-T 효소를 반응시켜 L-시스테인을 포함하는 발효액을 수득하였다(대한민국 등록특허 제10-1381048호).
상기 L-시스테인 발효액의 pH는 9.3이었고, L-시스테인의 농도는 26 g/L였다. 상기 L-시스테인 발효액에서 수분을 제거한 고형분의 L-시스테인 함량은 26.7%였다. 해당 발효액의 pH를 98% 황산을 이용하여 pH 5.5까지 하향 조정하였다. 이를 박막 농축기로 농축하여 L-시스테인의 농도가 120 g/L인 L-시스테인 발효액을 하기의 SMB 크로마토그래피 원료액으로 준비하였다. 농축 조건은 하기와 같다:
내부 압력: 80 mmHg
스팀 압력: 2 bar
최대 주입량: 100 L
공정액 강제 순환 유속: 10 L/min
증발 속도: 약 25 L/hr
(2) 연속식 크로마토그래피 장치를 이용하여 L-시스테인이 분리된 분리액을 수득
L-시스테인이 분리된 분리액을 수득하기 위해, SMB 크로마토그래피 장치를 이용하였다. SMB 크로마토그래피 장치의 모식도는 도 2에 나타내었다.
구체적으로, 도 2에서 보는 바와 같이 총 15개의 수지탑으로 구성되어 있으며, 각 탑의 부피는 1.5 L이며, 수지는 탑 부피 대비 95%로 충진되었다. SMB 원료액은 15 ml/min의 유량으로 8번 수지탑으로 주입된다. 이동상은 95 ml/min의 유량으로 1번 수지탑으로 주입된다. SMB 생산 공정액(분리액)은 50 ml/min의 유량으로 3번 수지탑에서 배출된다. SMB 공정 폐액은 60 ml/min의 유량으로 12번 수지탑에서 배출된다. 15번 수지탑에서 배출된 액은 65 ml/min의 유량으로 이동상과 혼합되어 총 160 ml/min의 유량으로 1번 수지탑에 주입된다. 7번 수지탑과 8번 수지탑 사이에는 1L의 버퍼 탱크를 설치하여 일정한 수위 조절을 통한 자동화 제어를 실시하여 일정한 유량으로 SMB 크로마토그래피 원료액이 수지탑 내에 유입될 수 있도록 하였다. 수지탑은 번호가 감소하는 방향으로 8분마다 이동하지만, 1번 수지탑은 15번 수지탑으로 이동하여 순환하는 방식으로 구동되었다.
제조예에서는 강한 산성인 황산기를 작용기로 가지는 스티렌-디비넬벤젠 공중합체 수지인 TRILITE® MCK32L, PUROLITE® PCR642, 또는 DIAION® UBK555 수지를 각각 상기 크로마토그래피 장치의 수지탑에 탑재하여, SMB 크로마토그래피 원료액을 0.1 kl 이상 주입한 후, 장치를 작동시켜 SMB 생산 공정액(분리액)을 수득하였다. 상기 분리액의 pH는 각각 6.1, 6.3, 및 5.9이었으며, L-시스테인의 농도는 각각 35.1, 34.8, 및 33.9 g/L이었다.
(3) 염산 첨가반응 및 농축
상기의 분리액들에 [HCl]/[L-시스테인] 당량비가 2가 되도록 36% 염산을 첨가하고, L-시스테인 농도가 700 g/L가 될 때까지 박막 농축관과 강제 순환식 농축관을 직렬로 연결하여 농축하였다. 농축 도중 L-시스테인 염산염 1수화물 결정이 석출되었으며, 농축이 끝난 직후의 L-시스테인 염산염 1수화물 결정 슬러리의 온도는 55 ℃였다. 농축 조건은 하기와 같다:
내부 압력: 80 mmHg
스팀 압력: 2 bar
최대 주입량: 100 L
공정액 강제 순환 유속: 10 L/min
증발 속도: 약 10 L/hr
(4) 냉각 및 L-시스테인 염산염 결정의 회수
해당 L-시스테인 염산염 1수화물 결정 슬러리를 교반과 함께 자켓 탱크에서 15 ℃까지 4시간 동안 일정한 냉각 속도로 냉각하고, 냉각 완료 온도와 동일한 온도에서 2시간 동안 교반하였다. 이후, L-시스테인 염산염 1수화물 결정을 L-시스테인 염산염 1수화물 결정 슬러리로부터 바스켓 원심 분리기를 이용하여 고액 분리하였다. 상기 바스켓 분리기의 분리 조건은 하기와 같다:
장비: 4.5 L 바스켓 분리기 (H-122;Kokusan)
세척액: 3차 증류수
필터 종류: Polyamide multifilament fiber filter fabric
필터 공기투과도: 250 L/m2/s (at 2 mbar)
Bowl 회전속도: 3,000 rpm
Bowl 회전시간: 20 min
분리 도중 L-시스테인 염산염 1수화물 결정 슬러리 부피 대비 10%의 세척수를 투입하였다. 분리 후 35 ℃에서 유동층 건조기를 이용하여 2시간 이상 건조를 진행하여 잔류 수분을 12.0% 이하로 낮추고, 최종적으로 L-시스테인 염산염 1수화물 결정을 제조하였다.
이에 따른 SMB 크로마토그래피 공정의 수율, SMB 크로마토그래피 공정을 통해 수득한 분리액에서 고형분의 L-시스테인 함량 (%), L-시스테인 염산염 1수화물 결정의 순도를 측정하였다. SMB 크로마토그래피 공정의 회수율은 SMB 크로마토그래피 장치에 주입되는 발효액과 비교하여 분리액의 L-시스테인 회수율로 계산되었다. 해당 결과는 상기 제조예의 결과와 함께 하기의 표 1에 나타내었다. 황산기를 작용기로 가지는 스티렌-디비닐벤젠 공중합체 수지를 고정상으로 사용하였을 때, 모든 실험결과는 SMB 크로마토그래피 공정의 수율이 90% 이상이었고, SMB 크로마토그래피 공정을 통해 수득한 분리액에서 수분을 제외한 고형분의 L-시스테인 함량이 92.5% 이상이었으며, L-시스테인 염산염 1수화물 결정의 순도는 99.5%이상이었다.
이로부터 강한 산성의 작용기를 갖는 고정상 수지를 이용한 연속식 크로마토그래피를 이용하는 경우 L-시스테인 염산염 1수화물 결정을 보다 높은 수율과 순도로 수득할 수 있음을 확인할 수 있다.
실험예 1 - 이온 교환 수지의 종류에 따른 평가
상기 제조예에서 SMB 크로마토그래피 장치에 탑재된 고정상 수지만을 달리하여 L-시스테인 염산염 수화물 결정을 제조하였다. 고정상으로 사용된 수지는 산업적으로 이용하는데 무리가 없는 대량 생산이 가능한 것을 필수조건으로 선정하였으며, 작용기를 기준으로 약한 산성인 카르복실기, 강한 염기성인 트리메틸아민기, 약한 염기성인 3차 아민기, 작용기가 없는 것이 포함되도록 선정하였다.
이에 따른 SMB 크로마토그래피 공정의 수율, SMB 크로마토그래피 공정을 통해 수득한 분리액에서 고형분의 L-시스테인 함량 (%) 및 최종 회수된 L-시스테인 염산염 1수화물의 결정의 순도를 측정하였다. SMB 크로마토그래피 공정의 회수율은 SMB 크로마토그래피 장치에 주입되는 발효액과 비교하여 분리액의 L-시스테인 회수율로 계산되었다. 해당 결과는 상기 제조예의 결과와 함께 하기의 표 1에 나타내었다.
고정상 종류 구성 물질 작용기 SMB 크로마토그래피 공정 수율 (%) L-시스테인 함량 (%) L-시스테인 염산염 1수화물 결정 순도 ( % )
TRILITE® MCK32L 스티렌-디비닐벤젠 공중합체 황산기 92.4 93.2 99.7
PUROLITE® PCR642 스티렌-디비닐벤젠 공중합체 황산기 90.8 92.9 99.5
DIAION® UBK555 스티렌-디비닐벤젠 공중합체 황산기 91.4 92.5 99.6
DIAION® SP850 스티렌-디비닐벤젠 공중합체 없음 22.6 37.5 결정화
미진행
MACRONET®MN202 스티렌-디비닐벤젠 공중합체 없음 25.4 44.5 결정화
미진행
AMBERLITE®XA1600 스티렌-디비닐벤젠 공중합체 없음 25.8 31.8 결정화
미진행
DIAION® HP2MGL 메타크릴레이트 중합체 없음 16.2 39.1 결정화
미진행
DIAION® WK10 메타크릴레이트-디비닐벤젠 공중합체 카르복실기 15.4 32.7 결정화
미진행
TRILITE® AMP16 스티렌-디비닐벤젠 공중합체 트리메틸아민기 13.5 38.9 결정화
미진행
TRILITE® AW90 스티렌-디비닐벤젠 공중합체 3차 아민기 14.2 32.2 결정화
미진행
황산기를 작용기로 가지는 스티렌-디비닐벤젠 공중합체 수지를 고정상으로 사용하였을 때, 모든 실험 결과는 SMB 크로마토그래피 공정의 수율이 90% 이상이었고, L-시스테인 함량이 92.5% 이상이었으며, L-시스테인 염산염 1수화물 결정의 순도는 99.5%이상이었다. 반면, 약한 산성인 카르복실기, 강한 염기성인 트리메틸아민기, 약한 염기성인 3차 아민기, 작용기가 없는 수지를 사용하여 결정을 수득하는 경우, SMB 크로마토그래피 공정의 수율은 13.5 내지 25.8%이고, L-시스테인 함량은 31.8 내지 44.5%였다. 이는 강한 산성의 작용기를 가지는 수지를 고정상으로 사용한 경우의 수율 및 함량의 절반 이하의 수준이었다.
이로부터, 연속식 크로마토그래피를 이용하여 L-시스테인의 발효액을 분리하여 결정화할 때, 강한 산성의 작용기를 가지는 수지를 고정상으로 하는 경우, 높은 수율, 농도 및 순도로 L-시스테인 염산염 1수화물 결정을 수득할 수 있음을 확인할 수 있다.
실험예 2 - L-시스테인을 포함하는 발효액의 pH에 따른 평가
상기 제조예(TRILITE® MCK32L 사용)에서 L-시스테인을 포함하는 발효액의 pH만을 달리하여 L-시스테인 염산염 수화물 결정을 제조하였다. 구체적으로, 제조예와 동일하게 L-시스테인을 포함하는 발효액을 수득한 후, 해당 발효액의 pH를 2.5 내지 9.5로 98% 황산 또는 50% 가성소다 용액을 이용하여 다양하게 조절하였다.
이에 따른 SMB 크로마토그래피 공정의 회수율, SMB 크로마토그래피 공정을 통해 수득한 분리액에서 고형분의 L-시스테인 함량 (%), 및 최종 회수된 L-시스테인 염산염 1수화물의 결정의 순도를 측정하였다. SMB 크로마토그래피 공정의 회수율은 SMB 크로마토그래피 장치에 주입되는 발효액과 비교하여 분리액의 L-시스테인 회수율로 계산되었다. 해당 결과를 하기의 표 2에 나타내었다.
발효액의 pH SMB 크로마토그래피 공정 회수율 ( % ) L-시스테인 함량 ( % ) L-시스테인 염산염 1수화물 결정 순도 ( % )
2.5 30.1 81.3 98.2
3.0 59.4 85.4 98.9
3.5 68.2 90.1 99.6
4.0 76.5 91.2 99.5
4.5 88.2 93.7 99.6
5.0 90.2 94.5 99.7
5.5 92.4 93.2 99.7
6.0 91.8 92.1 99.5
6.5 89.4 92.7 99.4
7.0 86.1 92.2 99.5
7.5 69.2 90.3 99.3
8.0 60.3 88.4 99.0
8.5 58.2 87.9 99.1
9.0 50.4 85.7 98.7
9.5 22.7 58.2 75.6
SMB 크로마토그래피 공정 수율은 pH 3.0 내지 9.0 구간에서 50% 이상, pH 4.5 내지 7.0 구간에서 85% 이상, pH 5.0 내지 6.0 구간에서 90%인 것으로 나타났다. SMB 크로마토그래피 공정을 통해 수득한 분리액에서 수분을 제외한 고형분의 L-시스테인 함량은 pH 3.0 내지 9.0 구간에서 85% 이상, pH 3.5 내지 7.5 구간에서 90% 이상인 것으로 나타났다.
또한, L-시스테인 염산염 1수화물 결정의 순도는 pH 2.5 내지 9.0 구간에서 98% 이상, pH 3.5 내지 8.5 구간에서 99%이상인 것으로 나타났다. 즉, 본원의 방법을 이용하는 경우, pH범위에 크게 영향 없이 매우 높은 순도로 L-시스테인 염산염 1수화물 결정을 수득할 수 있음을 확인하였다.
실험예 3 - 염산 첨가량에 따른 평가
상기 제조예(TRILITE® MCK32L 사용)에서, 첨가되는 염산의 [HCl]/[L-시스테인] 당량비만을 0.80, 0.85, 0.90, 1.0, 1.5, 2.0, 2.5, 3.0, 및 3.5로 달리하여 L-시스테인 염산염 수화물 결정을 제조하였다.
이에 따른 결정화 공정의 회수율 및 최종 회수된 L-시스테인 염산염 1수화물의 결정의 순도를 측정하였다. 결정화 공정의 회수율은 SMB 크로마토그래피 공정에 따른 분리액의 L-시스테인 대비 최종 회수된 L-시스테인 염산염 1수화물 결정에 포함된 L-시스테인 회수율로 계산되었다. 해당 결과를 표 3에 나타내었다.
[HCl]/[L-시스테인] 당량비 결정 종류 L-시스테인 염산염 1수화물 결정 순도 ( % ) 결정화 공정 회수율 (%)
0.80 L-시스테인 - -
0.85 L-시스테인 - -
0.90 L-시스테인 염산염 1수화물 99.5 43.7
1.0 L-시스테인 염산염 1수화물 99.7 46.1
1.5 L-시스테인 염산염 1수화물 99.5 60.2
2.0 L-시스테인 염산염 1수화물 99.7 79.1
2.5 L-시스테인 염산염 1수화물 99.6 64.9
3.0 L-시스테인 염산염 1수화물 99.6 44.9
3.5 L-시스테인 염산염 1수화물 99.7 24.8
농축 도중 모두 결정이 석출되었으나, [HCl]/[L-시스테인] 당량비가 0.85 이하일 때는 L-시스테인 결정이 석출되었고, 당량비가 0.9 이상일 때는 L-시스테인 염산염 1수화물 결정이 석출되었다. 즉, 당량비가 0.85 초과일 때 L-시스테인 염산염 1수화물 결정이 석출될 것으로 해석할 수 있다.
L-시스테인 염산염 1수화물 결정의 순도는 [HCl]/[L-시스테인] 당량비와는 상관없이 L-시스테인 염산염 1수화물이 형성되었을 시, 모두 98% 이상인 것으로 나타났다. L-시스테인 염산염 1수화물의 결정화 공정 회수율은 [HCl]/[L-시스테인] 당량비가 0.9 내지 3.0인 구간에서 40% 이상이었으며, 1.0 초과 내지 3.0미만인 구간에서 50%이상일 것으로 예상되며, 당량비가 1.5 내지 2.5인 구간 60% 이상이었으며, [HCl]/[L-시스테인] 당량비가 1.5 내지 2.5인 구간에서 가장 회수율이 높은 최적화 조건이 있을 것으로 추측된다.
실험예 4 - 농축액 농도에 따른 평가
상기 제조예(TRILITE® MCK32L 사용)에서 염산이 첨가된 분리액을 농축시킨 농축액의 농도만을 100 내지 900g/L으로 달리하여, L-시스테인 염산염 수화물 결정을 제조하였다.
이에 따른 결정핵 생성시점, 최종 회수된 L-시스테인 염산염 1수화물의 결정의 순도, 및 결정화 공정의 회수율을 측정하였다. 결정화 공정의 회수율은 SMB 크로마토그래피 공정에 따른 분리액의 L-시스테인 대비 최종 회수된 L-시스테인 염산염 1수화물 결정에 포함된 L-시스테인 회수율로 계산되었다. 해당 결과를 표 4에 나타내었다.
농축 농도 (g/L) 결정핵 생성 시점 L-시스테인 염산염 1수화물 결정 순도 ( % ) 결정화 공정 회수율 (%)
100 결정 미생성 결정 미생성 0
200 냉각중 99.8 28.3
300 농축중 99.7 50.7
400 농축중 99.5 62.1
500 농축중 99.7 70.6
600 농축중 99.6 73.4
700 농축중 99.7 79.1
800 농축중 99.1 83.2
900 농축중 고화 발생으로 결정 분리 불가 고화 발생으로 결정 분리 불가
L-시스테인 염산염 1수화물의 결정핵 생성은 농도 200g/L이상이면 생성이 되나, 농도 300g/L이상에서 농축 중 결정핵이 생성되어 빠른 결정화를 진행할 수 있었다.
L-시스테인 염산염 1수화물 결정의 순도는 결정이 형성된 경우 모두 99% 이상이었다. 즉, 본원의 방법을 이용하여 결정을 수득하는 경우, 분리액의 농축 농도에 상관 없이 매우 높은 순도로 L-시스테인 염산염 1수화물 결정을 수득할 수 있음을 확인하였다. 결정화 공정 회수율은 농축 농도에 비례하여 증가하였다. 단, 농축 농도가 800g/L이었을 때는 고순도 및 고회수율로 L-시스테인 결정을 수득할 수 있으나 900 g/L이었을 때는 L-시스테인 염산염 1수화물 결정 슬러리의 고화가 발생하여 교반 및 결정 분리가 불가능하였다. 이로 보아, 900 g/L미만에서는 고순도 및 고회수율로 L-시스테인 결정을 수득할 수 있을 것으로 예상된다.
이로부터 SMB 크로마토그래피 분리액의 농도가 200 내지 900 g/L미만인 경우, L-시스테인 결정을 수득하기 용이할 것으로 확인되었다. 특히, 농도 300 내지 800g/L인 경우는 보다 빠른 결정화 진행, 고순도, 고회수율로 결정을 수득할 수 있음을 확인하였다.
실험예 5 - 농축 농도가 낮을 경우 냉각 조건의 변화에 따른 평가
실시예 4에서 SMB 크로마토그래피 분리액의 농축 농도가 100 g/L였을 때, 15 ºC까지 냉각을 하여도 L-시스테인 염산염 1수화물 결정이 생성되지 않았던 농축액을 교반과 함께 자켓 탱크에서 -10 ºC까지 2시간 30분 동안 일정한 냉각 속도로 냉각한 후, 냉각 완료 온도와 동일한 온도에서 12시간 동안 교반하였다. 그 결과 L-시스테인 염산염 1수화물 결정이 생성 되었다. 이를 감압 막여과 장치를 이용하여 고액 분리하였고, 100 ml의 세척수를 투입하고, 35 ºC에서 오븐 건조기로 12시간 건조 하여 잔류 수분을 12.0% 이하로 낮추고, 최종적으로 L-시스테인 염산염 1수화물 결정을 제조하였다. L-시스테인 염산염 1수화물 결정의 순도는 99.8%, 결정화 공정 회수율은 9.7%였다.
이로부터 SMB 크로마토그래피 분리액의 농도가 200g/L 미만이어도 냉각 온도 조절을 통해 L-시스테인 염산염 1수화물 결정 수득이 가능함을 확인하였다, 그러나, 산업적으로 활용하기에는 결정화 공정 회수율이 매우 낮았다. 또한 영하의 가혹조건까지 냉각 결정화 공정이 진행되어야 하고, 결정화 시간도 길어지는 단점이 있었다.
실험예 6 - 냉각 온도에 따른 평가
상기 제조예에서, L-시스테인 염산염 1수화물 결정 슬러리의 냉각 온도만을 달리하여, L-시스테인 염산염 수화물 결정을 제조하였다. 구체적으로, 해당 L-시스테인 염산염 1수화물 결정 슬러리의 냉각을 진행하지 않고 55 ºC에서 2시간동안 교반을 진행한 것, 그리고 해당 L-시스테인 염산염 1수화물 결정 슬러리를 교반하면서 10 ºC/h의 냉각 속도로 0 에서 45 ºC까지 다양하게 냉각을 진행한 것을 포함하여 총 5회의 결정화 실험을 진행하였다. 각각의 실험에 사용된 L-시스테인 염산염 1수화물 슬러리의 초기 부피는 1L였다.
이에 따른 L-시스테인 염산염 1수화물 결정의 순도, 결정화 공정의 회수율을 표 5에 나타내었다. 결정화 공정의 회수율은 SMB 크로마토그래피 공정에 따른 분리액의 L-시스테인 대비 최종 회수된 L-시스테인 염산염 1수화물 결정에 포함된 L-시스테인 회수율로 계산되었다. 해당 결과를 표 5에 나타내었다.
냉각 온도 (ºC) L-시스테인 염산염 1수화물 결정 순도 ( % ) 결정화 공정 회수율 ( % )
0 99.5 83.5
15 99.7 79.1
30 99.7 74.2
45 99.8 68.9
55 (냉각 미진행) 99.8 64.3
L-시스테인 염산염 1수화물 결정 순도는 모든 경우에 99.5% 이상이었다. 또한, 결정화 공정 회수율은 냉각을 하지 않은 경우에도 64%이상이었으며, , 냉각 온도가 낮을수록 결정화 공정 회수율이 높았다. 45도 미만에서 70%이상의 공정회수율을 확인하였으며, 30도 이하에서 74%이상의 공정회수율을 예상할 수 있다
실험예 7 - SMB 크로마토그래피의 원료로 사용되는 L-시스테인을 포함하는 발효액의 농도에 따른 평가
상기 제조예에서, SMB 크로마토그래피의 원료로 사용되는 L-시스테인을 포함하는 발효액(pH5.5)의 농도만을 달리하여, L-시스테인 염산염 수화물 결정을 제조하였다. 구체적으로, 상기 제조예에서 수득한 농도 26 g/L의 L-시스테인 발효액을 그대로 SMB 크로마토그래피 원료액으로 사용하는 것, 물로 희석하여 L-시스테인 농도 10 g/L로 SMB 크로마토그래피 원료액으로 사용하는 것, 박막 농축기로 농축하여 L-시스테인 농도 60 g/L에서 150 g/L로 SMB 크로마토그래피 원료액으로 사용하는 것을 포함하여, 총 6건의 실험을 진행하였다. L-시스테인의 농도를 180 g/L까지 농축하였을 때는 L-시스테인 결정이 석출되어 SMB 크로마토그래피 공정을 진행하지 않았다.
각각의 실험에 사용된 원료액의 부피는 최소 0.1 kl 이상이었으며, SMB 크로마토그래피 공정 수율 및 SMB 크로마토그래피로 생산된 공정액에서 수분을 제외한 고형분의 L-시스테인 함량을 표 6에 나타내었다.
SMB 크로마토그래피 원료액 L-시스테인 농도 (g/L) SMB 크로마토그래피 공정 수율 ( % ) 분리액 중 고형분의 L-시스테인 함량 ( % )
10 90.3 94.2
26 91.5 93.0
60 90.9 93.4
90 91.8 92.8
120 92.4 93.2
150 92.0 93.2
SMB 크로마토그래피 공정 수율은 모든 구간에서 90% 이상이었으며, SMB 크로마토그래피로 생산된 공정액에서 수분을 제외한 고형분의 L-시스테인 함량도 모든 구간에서 90% 이상이었다. 상기 결과에 따라, 본원의 SMB 크로마토그래피를 이용한 L-시스테인의 정제방법은, 원료액의 L-시스테인 농도에 관계 없이 L-시스테인을 포함하는 발효액의 정제 및 결정화에 아주 효과적인 방법으로 해석할 수 있다.
이상의 설명으로부터, 본 발명이 속하는 기술분야의 당업자는 본 발명이 그 기술적 사상이나 필수적 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 실시될 수 있다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 이와 관련하여, 이상에서 기술한 실시 예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적인 것이 아닌 것으로서 이해해야만 한다. 본 발명의 범위는 상기 상세한 설명보다는 후술하는 특허 청구범위의 의미 및 범위 그리고 그 등가 개념으로부터 도출되는 모든 변경 또는 변형된 형태가 본 발명의 범위에 포함되는 것으로 해석되어야 한다.

Claims (15)

  1. (a) 강산성 양이온 교환 수지를 고정상으로 하는 연속식 크로마토그래피 장치에, L-시스테인을 포함하는 pH 3.0 내지 9.0의 발효액을 주입한 후 분리액을 수득하는 단계;
    (b) 상기 분리액에 L-시스테인 대비 염산의 당량비([HCl]/[L-시스테인])가 0.9 내지 3.0이 되도록 염산을 첨가하는 단계;
    (c) 상기 염산이 첨가된 분리액을 농축하는 단계; 및
    (d) 상기 농축액으로부터 L-시스테인 염산염 수화물 결정을 회수하는 단계를 포함하고,
    상기 (a) 단계의 연속식 크로마토그래피는 L-시스테인의 흡착 및 용리 공정을 포함하지 않고,
    상기 (a) 단계의 분리액은 수분을 제외한 고형분의 L-시스테인 함량이 85%(w/w) 이상인 것인, L-시스테인 염산염 수화물 결정의 제조 방법.
  2. 제1항에 있어서, (a) 단계 이전에 L-시스테인을 포함하는 발효액을 pH 3.5 내지 7.5가 되도록 조절하는 단계를 추가로 포함하는 것인, L-시스테인 염산염 수화물 결정의 제조 방법.
  3. 제1항에 있어서, (a) 단계 이전에 L-시스테인을 포함하는 pH 3.0 내지 9.0의 발효액을 농축하는 단계를 추가로 포함하는 것인, L-시스테인 염산염 수화물 결정의 제조 방법.
  4. 제1항에 있어서, 상기 (a) 단계의 상기 강산성 양이온 교환 수지는 황산 작용기를 갖는 것인, L-시스테인 염산염 수화물 결정의 제조 방법.
  5. 제1항에 있어서, 상기 (a) 단계의 강산성 양이온 교환 수지는 스티렌-디비닐벤젠 공중합체인, L-시스테인 염산염 수화물 결정의 제조 방법.
  6. 제1항에 있어서, 상기 (a) 단계의 연속식 크로마토그래피 장치는 유사 이동층(simulated moving bed, SMB) 크로마토그래피 장치인 것인, L-시스테인 염산염 수화물 결정의 제조 방법.
  7. 제1항에 있어서, 상기 (a) 단계의 연속식 크로마토그래피 공정 회수율은, 주입되는 발효액 대비 수득되는 분리액의 L-시스테인 비율로서 50%(w/w) 이상인 것인, L-시스테인 염산염 수화물 결정의 제조 방법.
  8. 제1항에 있어서, 상기 (b) 단계에서 L-시스테인 대비 염산의 당량비([HCl]/[L-시스테인])는 1.5 내지 2.5인 것인, L-시스테인 염산염 수화물 결정의 제조방법.
  9. 제1항에 있어서, 상기 (c) 단계는 염산이 첨가된 분리액의 L-시스테인의 농도가 200 내지 900g/L미만이 되도록 농축하는 것인, L-시스테인 염산염 수화물 결정의 제조방법.
  10. 제1항에 있어서, 상기 (c) 단계는 염산이 첨가된 분리액의 L-시스테인의 농도가 500 내지 900g/L미만이 되도록 농축하는 것인, L-시스테인 염산염 수화물 결정의 제조방법.
  11. 제1항에 있어서, 상기 (d) 단계 이전에 상기 농축액을 냉각하는 단계를 추가로 포함하는 것인, L-시스테인 염산염 수화물 결정의 제조방법.
  12. 제11항에 있어서, 상기 농축액은 0 내지 30℃의 온도까지 냉각되는 것인, L-시스테인 염산염 수화물 결정의 제조방법.
  13. 제1항에 있어서, 상기 (d) 단계에서 결정을 회수하고 얻어진 여과액을 (a) 단계의 발효액, (b)단계의 분리액 또는 (c) 단계의 염산이 첨가된 분리액에 첨가하는 단계를 포함하는 것인, L-시스테인 염산염 수화물 결정의 제조방법.
  14. 제1항에 있어서, 제조된 L-시스테인 염산염 수화물 결정의 순도는 98%(w/w)이상인 것인, L-시스테인 염산염 수화물 결정의 제조방법.
  15. 삭제
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