BR112020013688B1

BR112020013688B1 - Método para preparar cristais de cloridrato de lcisteína hidratado

Info

Publication number: BR112020013688B1
Application number: BR112020013688-3A
Authority: BR
Inventors: Jun-Woo Kim; Jung Min Lee; Se-Hee Jo; Il Chul Kim; In Sung Lee; Jun Young Jung
Original assignee: Cj Cheiljedang Corporation
Priority date: 2018-01-31
Filing date: 2019-01-30
Publication date: 2022-05-17
Also published as: EP3720841B1; PH12020551048A1; US20200407313A1; JP7083907B2; KR20190092950A; CN111670178B; JP2021510519A; CA3087860C; AU2019216084A1; CA3087860A1; MX2020007517A; US11427537B2; MY194470A; WO2019151769A1; AU2019216084B2; CN111670178A; EP3720841A4; EP3720841A1; BR112020013688A2

Abstract

A presente revelação refere-se a um método para preparar cristais de cloridrato de L-cisteína hidratado e a cristais de cloridrato de L-cisteína hidratado preparados pelo método. Através do método para preparar cristais de cloridrato de L-cisteína hidratado da presente revelação, os cristais de cloridrato de L-cisteína hidratado podem ser obtidos a partir de um caldo de fermentação de L-cisteína natural com uma taxa de recuperação alta e/ou de pureza sem uma reação química ou o uso de um composto sintético artificial.

Description

[CAMPO DA TÉCNICA]

[001] A presente revelação refere-se a um método para preparar cristais de cloridrato de L-cisteína hidratado e a cristais de cloridrato de L- cisteína hidratado preparados pelo método. [ANTECEDENTES DA TÉCNICA]

[002] L-cisteína é geralmente produzido através da decomposição de L-cistina derivada de animais, que usa penas de pato ou cabelo humano como uma fonte material, ou L-cistina derivado de fermentação, que usa um líquido de metabolismo microbiano como uma fonte material, em L-cisteína através de uma reação de redução eletroquímica. Em oposição, embora métodos para produzir L-cisteína usem microrganismos, revelou-se um processo para produzir L-cisteína natural através da fermentação usando-se uma cepa com uma O-acetil transferase modificada em um meio com sulfeto (documentos n° US8802399B, n° US6946268B), e um processo para produzir L-cisteína natural misturando-se O-fosfohomoserina produzida através de um método de cultura microbiana com sulfeto e através da indução de uma reação de enzima catalítica usando O-fosfoserina sulfidrilase (documentos n° WO2013/089478, n° WO2012/053794).

[003] Embora tenha sido relevado que L-cisteína produzida pelo método de cultura microbiana pode ser separada por troca iônica e outros métodos conhecidos, nenhuma informação é dada quanto ao procedimento específico, ao rendimento, à pureza, etc. (documentos n° EP1645623A1, n° EP1298200B1, n° US20050221453A1, n° EP1234874A1, n° EP1571223A2 e n° EP1650296A).

[004] Entretanto, um método para produzir cloridrato de L-cisteína monoidratado a partir de um caldo de fermentação de L-cisteína usando a troca iônica é conhecido. Por exemplo, revelou-se que um processo para purificar L-cisteína com um rendimento de 90% ou mais reduzindo-se o pH de um caldo de fermentação que contém L-cisteína a um pH de 5 ou inferior, e então proporcionando o contato com um ácido ou um trocador de cátion fortemente ácido, de tal modo que L-cisteína se ligue ao trocador de íon e que ocorra a eluição de L-cisteína ligado com uma solução de ácido clorídrico aquosa. Consequentemente, o cloridrato de L-cisteína monoidratado pode ser produzido usando o eluente de cloridrato de L-cisteína (documento n° US8088949B).

[005] Além disso, revelou-se um processo para purificar L-cisteína com um rendimento de 85% ou mais, proporcionando-se um caldo de fermentação que contém L-cisteína com um pH de 6 a 9 em contato com um trocador de ânion básico, de tal modo que L-cisteína se ligue ao trocador de ânion, que ocorra a eluição de L-cisteína ligado com uma solução de ácido clorídrico aquosa, então fazendo com que o eluato contate um trocador de cátion ácido a um pH de 4 ou inferior, de tal modo que L-cisteína se ligue ao trocador de cátion e que ocorra a eluição de L-cisteína ligado com uma solução de ácido clorídrico aquosa. Além disso, o cloridrato de L-cisteína monoidratado pode ser produzido usando o eluente de cloridrato de L-cisteína (documento n° US9120729B).

[006] Entretanto, os processos descritos acima têm suas desvantagens, visto que eles envolvem uma reação química conforme eles são realizados através das etapas de troca iônica repetidas, visto que eles necessitam uma grande quantidade de processo aquoso, já que uma grande quantidade de eluente é repetidamente usada como uma etapa subsequente do processo de adsorção de íon, e visto que uma etapa de purificação adicional precisa ser realizada. Portanto, há uma necessidade constante de um método para isolar L-cisteína com um maior rendimento e pureza e para produzir cloridrato de L-cisteína hidratado.

[007] Sob essas circunstâncias, os presentes inventores fizeram grandes esforços para aumentar a pureza e o rendimento de cloridrato de L- cisteína hidratado, e completaram um método para produzir cloridrato de L- cisteína hidratado que inclui as vantagens de ter produtividade efetiva aumentada e consumo de água reduzido, assim como pureza e rendimento altos.

[REVELAÇÃO] [PROBLEMA DA TÉCNICA]

[008] Um objetivo da presente revelação é de fornecer um método para preparar cristais de cloridrato de L-cisteína hidratado.

[009] Outro objetivo da presente revelação é de fornecer cristais de cloridrato de L-cisteína hidratado preparados pelo método para preparar cristais de cloridrato de L-cisteína hidratado.

[SOLUÇÃO DA TÉCNICA]

[0010] Doravante, a presente revelação será descrita em detalhes.

[0011] Entretanto, cada uma das explicações e modalidades exemplificativas reveladas no presente documento pode ser aplicada a outras explicações e modalidades exemplificativas. Ou seja, todas as combinações de vários fatores revelados no presente documento pertencem ao escopo da presente revelação. Além disso, o escopo da presente revelação não deve ser limitado pela revelação específica fornecida doravante.

[0012] Além disso, pessoas versadas na técnica podem reconhecer e identificar vários equivalentes para as modalidades específicas da invenção revelada no presente documento que usa não mais do que uma experimentação de rotina, e acredita-se que todos esses tais equivalentes estão abrangidos pelo escopo da invenção.

[0013] Em um aspecto da presente revelação, a fim de superar os objetivos acima, fornece-se um método para preparar cristais de cloridrato de L-cisteína hidratado que compreende: (a) obter um líquido separado após introduzir um caldo de fermentação a uma faixa de pH de 3,0 a 9,0 que contém L-cisteína em um aparelho de cromatografia contínua com uma resina de troca catiônica fortemente ácida como uma fase estacionária; (b) adicionar ácido clorídrico ao líquido separado de tal modo que a razão de equivalência ([HCl]/[L-cisteína]) de ácido clorídrico a L- cisteína seja de a partir de 0,9 a 3,0; (c) concentrar o líquido separado no qual o ácido clorídrico é adicionado; e (d) recuperar os cristais de cloridrato de L-cisteína hidratado do líquido concentrado.

[0014] Conforme usado no presente documento, o termo “L-cisteína” é um dentre o constituinte de aminoácidos e é o único aminoácido que contém enxofre com um grupo tiol (R-SH) dentre os L-aminoácidos. L-cisteína pode ser obtido por síntese química, ou síntese biológica através da fermentação microbiana etc., porém sem limitações. Especificamente, na presente revelação, L-cisteína pode ser L-cisteína biologicamente produzido através da fermentação microbiana, ou pode ser L-cisteína natural obtido através da indução de uma reação de enzima catalítica de O-fosfohomoserina, que é uma precursora preparada pela fermentação microbiana com um sulfeto na presença de fosfoserina sulfidrilase. Em termos do processo de preparação, o L-cisteína natural pode ser L-cisteína obtido sem passar por uma reação química, adsorção química ou eluição.

[0015] Conforme é usado no presente documento, o termo “natural” indica que algo não depende de uma reação química. De acordo com a Regulação de Aromatizantes EU 1334/2008, apenas substâncias obtidas através de um processo físico, enzimático ou microbiano são definidas como flavorizantes “naturais”. A partir do ponto de vista acima, independentemente de ser derivado de um animal ou de fermentação microbiana, o L-cisteína produzido através de uma reação de redução eletroquímica de L-cistina não pode ser denominado de totalmente natural.

[0016] Conforme é usado no presente documento, o termo “caldo de fermentação” refere-se a um meio de cultura obtido pelo cultivo de microrganismos que produzem L-cisteína, uma cultura que contém os microrganismos cultivados junto com o meio de cultura, ou uma solução de conversão de enzima que contém um precursor capaz de produzir L-cisteína e uma enzima. Especificamente, o caldo de fermentação que contém L-cisteína pode ser um meio de cultura ou uma solução de conversão de enzima que contém L-cisteína natural. Mais especificamente, pode ser uma cultura de L- cisteína ou o meio de cultura biologicamente preparado pelos microrganismos de fermentação com uma habilidade de produzir L-cisteína, ou uma solução de conversão de enzima de L-cisteína natural obtida pela indução de uma reação de enzima catalítica de O-fosfohomoserina, que é uma precursora preparada pela fermentação microbiana, com um sulfeto na presença de fosfoserina sulfidrilase. Cristais de cloridrato de L-cisteína hidratado preparados usando-se o caldo de fermentação como uma fonte líquida não dependem de uma reação química e, portanto, pode estar implícito que são derivados da natureza.

[0017] Na presente revelação, o caldo de fermentação pode ser usado como uma fonte líquida para um processo de cromatografia contínua. Ou seja, ele pode ser introduzido no aparelho de cromatografia contínua da etapa (a).

[0018] O pH do caldo de fermentação a ser introduzido no aparelho de cromatografia contínua pode variar dependendo do método de preparação, mas pode estar na faixa de 2,5 a 9,5, 2,5 a 9,0, 3,0 a 9,0, 3,5 a 8,5, 3,5 a 7,5, 4,5 a 7,0, ou 5,0 a 6,0. O próprio caldo de fermentação pode ser usado como uma fonte líquida para a cromatografia contínua, e uma etapa de ajuste do caldo de fermentação que contém L-cisteína a um pH de 2,5 a 9,5, 2,5 a 9,0 ou 3,0 a 9,0; especificamente 3,5 a 8,5 ou 3,5 a 7,5; mais especificamente 4,5 a 7,0 ou 5,0 a 6,0, ainda pode ser incluída. Por exemplo, o pH pode ser ajustado pela adição de um ácido, tal como ácido sulfúrico ou ácido clorídrico ou de uma base, tal como hidróxido de sódio (soda cáustica), amônia, hidróxido de lítio ou hidróxido de potássio etc., porém sem limitações. O agente ajustador de pH pode ser apropriadamente selecionado e usado por pessoas versadas na técnica desde que os cristais de cloridrato de L-cisteína hidratado possam ser obtidos sem afetar a estrutura de L-cisteína.

[0019] Conforme o pH do caldo de fermentação de L-cisteína é reduzido, há uma forte tendência para que a L-cisteína passe pelo processo de cationização. Conforme a fase estacionária da cromatografia contínua usada no presente documento é de uma resina de troca catiônica fortemente ácida, a mesma tende a adsorver cátions, de modo que, quando a L-cisteína tiver passado pelo processo de cationização, o mesmo possa ser parcialmente adsorvido na fase estacionária para, assim, reduzir a taxa de recuperação do processo de cromatografia contínua. Além disso, o L-cisteína tem uma forte tendência de ser oxidado e convertido para L-cistina a pH's elevados, o que pode reduzir a taxa de recuperação do processo de cromatografia contínua. Portanto, o caldo de fermentação que contém L-cisteína pode ser um caldo de fermentação com um pH de 2,5 a 9,5; especificamente de 3,0 a 9,0; mais especificamente de 3,5 a 8,5; ainda mais especificamente de 3,5 a 7,5, 4,5 a 7,0 ou 5,0 a 6,0.

[0020] Entretanto, conforme a taxa de recuperação do processo de cromatografia contínua pode ser afetada por vários parâmetros do processo, tais como a taxa de fluxo entre as torres de resina do processo de cromatografia contínua, a temperatura do processo, a composição da fase móvel, a sequência de cromatografia contínua, etc., a taxa de recuperação do processo de cromatografia contínua não é um fator que é limitado apenas pelo pH da fonte líquida para a cromatografia contínua.

[0021] Na presente revelação, o método ainda pode incluir uma etapa de diluir ou concentrar o caldo de fermentação que contém L-cisteína antes da etapa (a). A etapa pode ser realizada antes ou após a etapa de ajuste pH descrita acima.

[0022] A concentração pode ser realizada em um evaporador convencional (por exemplo, um evaporador de circulação forçada, um evaporador de filme fino ou um evaporador rotativo etc.).

[0023] A concentração de L-cisteína no caldo de fermentação diluído ou concentrado pode ser ajustada para 10 g/l a 180 g/l; especificamente para 10 g/l a 150 g/l, porém isso não é um fator que afete muito a taxa de recuperação do processo de cromatografia contínua e a qualidade do líquido separado (especificamente, o teor sólido de L-cisteína excluindo a umidade no líquido separado) obtida através do processo de cromatografia contínua. Portanto, para ajustar a concentração do caldo de fermentação que contém L- cisteína usado como uma fonte líquida para o processo de cromatografia contínua não é um processo essencial para separar e purificar L-cisteína. Entretanto, quando a concentração é ajustada para 180 g/l ou mais, a concentração de L-cisteína é maior do que a solubilidade de L-cisteína, de modo que os cristais de L-cisteína de baixa qualidade são produzidos, cujos são inadequados para a recuperação, resultando na deterioração da taxa de recuperação do processo de cromatografia contínua. Quando a concentração da fonte líquida para o processo de cromatografia contínua é alta, a quantidade de água usada no processo de cromatografia contínua pode ser reduzida em relação à quantidade de L-cisteína usada para o tratamento. Tal característica não pode ser encontrada em um processo de troca iônica, no qual a quantidade de água usada é determinada pela quantidade de adsorção máxima de L-cisteína e por uma resina de troca iônica.

[0024] Conforme é usado no presente documento, o termo “cromatografia contínua” refere-se a um processo pelo qual um processo de cromatografia em batelada convencional é realizado continuamente. Especificamente, uma fase sólida e uma fase líquida podem ser continuamente fornecidas ao aparelho de cromatografia, e a fase sólida e a fase líquida se movem em direções opostas entre si para fazer com que a contracorrente faça contato para, assim, permitir a separação de substâncias mais eficientemente. Na presente revelação, a cromatografia contínua pode ser usada no sentido de que a mesma inclui tanto a cromatografia de leito móvel verdadeiro (TMB) quanto à cromatografia de leito móvel simulado (SMB). Além disso, visto que a cromatografia de leito móvel verdadeiro e a cromatografia de leito móvel simulado empregam os mesmos princípios, elas podem ser apropriadamente selecionadas e usadas pelas pessoas versadas na técnica em consideração da produtividade e outras matérias.

[0025] Quando o processo de cromatografia contínua é empregado na presente revelação, um processo de adsorção/eluição não é necessário, e, portanto, tem suas vantagens, visto que tem uma alta produtividade por hora em comparação a um processo de troca iônica e que reduz a quantidade de água usada no processo. Além disso, a fim de obter um produto em pó de L- cisteína a partir de um líquido de processo que contém L-cisteína obtido por um processo de troca iônica ou por um processo de cromatografia comum com um alto rendimento, uma grande quantidade de energia é necessária em um processo de cristalização de concentração. Quanto a isso, o gasto de energia pode ser reduzido de acordo com o método da presente revelação.

[0026] Em uma modalidade da presente revelação, um aparelho de cromatografia SMB pode ser usado, e um diagrama esquemático do aparelho de cromatografia SMB é mostrado na Figura 2. Os parâmetros do processo, tais como o número de torres de resina, o volume das torres de resina, a capacidade de enchimento de resina, a taxa de fluxo de cada seção, a presença ou ausência de instalação de tanque tamponado, o tempo de movimento das torres de resina, etc. podem variar e não há limitações para as condições específicas fixadas acima.

[0027] A fase estacionária do aparelho de cromatografia contínua pode ser de uma resina de troca iônica, e, especificamente, pode ser de uma resina de troca catiônica fortemente ácida. O grupo funcional da resina de troca catiônica fortemente ácida pode ser um grupo sulfônico, porém sem limitações. Além disso, o composto precursor da resina de troca catiônica fortemente ácida usado no presente documento é sem limitações desde que um grupo funcional fortemente ácido possa ser fixado ao mesmo. Por exemplo, aqueles derivados a partir de um copolímero de estireno- divinilbenzeno podem ser usados, porém sem limitações. Em um exemplo específico, a resina de troca catiônica fortemente ácida pode ser um copolímero de ácido sulfônico de estireno-divinilbenzeno, porém sem limitações.

[0028] Quando os copolímeros de estireno-divinilbenzeno têm nenhum grupo funcional, as resinas de troca têm nenhum grupo funcional, tais como os polímeros de metacrilato que têm nenhum grupo funcional; as resinas de troca de ânion fortemente básica, tais como os copolímeros de trimetilamina estireno-divinilbenzeno; as resinas de troca de ânion fracamente básica, tais como os copolímeros de amina terciária estireno-divinilbenzeno; as resinas de troca catiônica fracamente básica, tais como os polímeros de metacrilato de carboxila, etc., são usados na presente revelação como outros tipos de fases estacionárias comumente usados na separação e na purificação de aminoácidos na técnica, é difícil de purificar L-cisteína em um teor sólido de 50% (p/p) ou mais excluindo a umidade do líquido separado obtido através do processo de cromatografia contínua. Entretanto, quando uma resina de troca catiônica fortemente ácida, tal como um copolímero de ácido sulfônico de estireno-divinilbenzeno é usado, é possível purificar L-cisteína em um teor sólido de 80% (p/p) ou mais excluindo a umidade no líquido separado obtido através do processo de cromatografia contínua, especificamente de 90% (p/p) ou mais.

[0029] No aparelho de cromatografia, a água, na qual nenhum composto químico (tal como um solvente orgânico, tal como metanol, álcool isopropílico, acetonitrila, etc.) é adicionado, uma solução diluída em soda cáustica, uma solução diluída em ácido sulfúrico, uma solução diluída em ácido fosfórico, uma solução diluída em ácido clorídrico, uma solução diluída em hidróxido de potássio, ou uma mistura dos mesmas pode ser usada como uma fase móvel, porém sem limitações. Em um exemplo específico, a água pode ser usada como uma fase móvel para a cromatografia contínua. Quando a fase móvel que contém um composto químico é usada, o composto químico pode permanecer no produto final, de modo que possa não ser possível vender o produto, visto que o mesmo pode ter excedido o limite de resíduos padrão para o composto químico, ou possa ser impossível distribuir o produto como um natural produto. Além disso, visto que nenhuma substância química, além de água, é adicionada ao processo aquoso, um efeito de redução nos custos da produção pode ser esperado. No processo de troca iônica, a fim de fazer a elução do L-cisteína ligado, um solvente, tal como ácido clorídrico ou ácido sulfúrico, é essencialmente usado como um eluente, e, consequentemente, seu uso é inevitavelmente acompanhado pelo aumento do custo do produto em associação ao uso e a disposição da substância química.

[0030] Quando o caldo de fermentação que contém L-cisteína é introduzido no aparelho de cromatografia contínua na etapa (a), um líquido separado que contém L-cisteína pode ser obtido conforme o L-cisteína é separado de acordo com a cromatografia contínua. Na presente revelação, o líquido separado que contém L-cisteína separado pode ser brevemente referido como um “líquido separado”, um “líquido separado de cromatografia”, ou um “líquido de processo”.

[0031] A qualidade do líquido separado pode ser avaliada pelo teor de L-cisteína no sólido excluindo a umidade no líquido separado. O líquido separado da presente revelação pode ter um teor sólido de L-cisteína excluindo a umidade de 80% (p/p), especificamente de 85% (p/p), mais especificamente de 90% (p/p) ou mais. Confirmou-se experimentalmente que os cristais de cloridrato de L-cisteína hidratado que têm uma pureza de 98% ou mais podem ser preparados quando o teor sólido de L-cisteína excluindo a umidade no líquido separado for de 80% ou mais. Entretanto, visto que a pureza dos cristais de cloridrato de L-cisteína hidratado pode ser afetada por outras condições do processo, tais como a concentração, cristalização, separação de cristal, etc., a pureza dos cristais de cloridrato de L-cisteína hidratado não é um fator que seja limitante unicamente pelo teor sólido de L- cisteína excluindo a umidade no líquido de processo produzida pela cromatografia contínua.

[0032] Na presente revelação, a etapa (a) pode ser referida como um “processo de cromatografia contínua”. O termo “a taxa de recuperação do processo de cromatografia contínua” refere-se à taxa de recuperação de L- cisteína no líquido separado obtida em relação ao caldo de fermentação introduzido na etapa (a), e é usada para avaliar a eficiência do processo. A taxa de recuperação da cromatografia contínua na presente revelação pode ser de 50% (p/p); especificamente de 60% (p/p); mais especificamente de 70% (p/p); e mais especificamente de 80% (p/p) ou mais, porém sem limitações.

[0033] A fim de converter L-cisteína contido no líquido separado da presente revelação em cloridrato de L-cisteína, o ácido clorídrico pode ser adicionado ao líquido separado na etapa (b). Especificamente, o ácido clorídrico pode ser adicionado de tal modo que a razão de equivalência ([HCl]/[L-cisteína]) de ácido clorídrico a L-cisteína contidos no líquido separado seja maior do que 0,85 e 3,5 ou menos; maior do que 1,0 e menor do que 3,0, 0,9 a 3,0; especificamente, 1,5 a 2,5; mais especificamente, 2.0. Quando a razão de equivalência é de 0,9 a 3,0, a taxa de recuperação do processo de cristalização pode ser de 40% ou mais, e espera-se que seja de 50% ou mais na razão de equivalência maior do que 1,0 e menor do que 3,0, e a taxa de recuperação do processo de cristalização pode ser de 60% ou mais na razão de equivalência de 1,5 a 2,5.

[0034] A etapa (c) é uma etapa para a concentração do líquido separado, no qual o ácido clorídrico é adicionado para a cristalização. Na etapa (c), um concentrado pode ser obtido pela concentração do líquido separado no qual o ácido clorídrico é adicionado. A concentração pode ser realizada em um evaporador convencional (por exemplo, um evaporador de circulação forçada, um evaporador de filme fino ou um evaporador rotativo etc.) pelas pessoas versadas na técnica através de uma seleção apropriada. A concentração de L-cisteína no concentrado da etapa (c) pode estar na faixa de 100 g/l a 900 g/l; especificamente de 200 g/l a menos de 900 g/l, 300 g/l a menos de 900 g/l, 400 g/l a menos de 900 g/l; mais especificamente menos de 500 g/l a 900 g/l.

[0035] Quando a concentração de L-cisteína no concentrado é baixa, a cristalização não ocorre durante a concentração devido à falta de supersaturação necessária para a nucleação e o cultivo de cristal, e a cristalização pode ser alcançada durante o resfriamento, ou a cristalização pode ser realizada através de um processo adicional. Entretanto, a taxa de recuperação pode ser baixa, ou o tempo de cristalização pode ser prolongado. Quando a concentração de L-cisteína no concentrado é de 300 g/l ou mais, os núcleos de cristal de cloridrato de L-cisteína hidratado podem ser formados durante o processo de concentração. Além do mais, quando o cloridrato de L- cisteína hidratado concentrado em lama a 300 g/l ou mais é resfriado, a taxa de recuperação do processo de cristalização para o cloridrato de L-cisteína hidratado pode aumentar. Quando a concentração do cloridrato de L-cisteína hidratado no concentrado é de 900 g/l, a solidificação pode ocorrer devido à formação de uma grande quantidade de partículas de cristal, e, consequentemente, o remeximento do cristal em lama e a separação de cristal pode não ser possível. Portanto, a etapa de concentração do líquido separado, na qual o ácido de cloridrato é adicionado, é concentrada de modo que a concentração de L-cisteína seja de 200 g/l a menos de 900 g/l; especificamente de 300 g/l a menos de 900 g/l; mais especificamente de 500 g/l a menos de 900 g/l.

[0036] A cristalização de cloridrato de L-cisteína hidratado pode ocorrer durante a concentração de acordo com a etapa (c). Conforme é usado no presente documento, o termo “cristalização” refere-se a um fenômeno através do qual um líquido ou um sólido em estado amorfo forma um cristal, e é acompanhado pelos dois fenômenos denominados de nucleação e cultivo de cristal.

[0037] O concentrado pode formar e/ou cultivar núcleos de cristal através do resfriamento e/ou envelhecimento antes da recuperação. Além disso, mesmo quando os cristais de cloridrato de L-cisteína hidratado não são precipitados a partir do concentrado, os cristais podem ser formados durante o resfriamento ou o envelhecimento do concentrado.

[0038] A etapa de resfriamento pode especificamente se referir ao resfriamento a uma temperatura de -10 °C a 55 °C por um período de duas horas a seis horas; especificamente o resfriamento a uma temperatura de 0 °C a 45 °C por um período de duas horas a seis horas; mais especificamente, o resfriamento a uma temperatura de 0 °C a 30 °C; e, ainda mais especificamente, o resfriamento a uma temperatura de 0 °C a 15 °C por um período de duas horas a seis horas. A etapa de envelhecimento pode se referir à permissão de permanecer sem mudar a temperatura. Na presente revelação, pode se referir constantemente à manutenção da temperatura resfriada, ou pode se referir constantemente à manutenção da temperatura do concentrado mesmo quando o mesmo não é resfriado. Especificamente, o envelhecimento pode ser alcançado por volta de um período de uma hora a três horas.

[0039] A série da etapa (c), na presente revelação, pode se referir a um “processo de cristalização”. A “taxa de recuperação do processo de cristalização” refere-se à taxa de recuperação de L-cisteína dos cristais de cloridrato de L-cisteína hidratado obtidos em relação ao L-cisteína no líquido separado de acordo com o processo de cromatografia contínua, e é usada para avaliar a eficiência do processo de cristalização. A taxa de recuperação da recuperação do processo de cromatografia contínua pode ser de 40% (p/p); especificamente de 50% (p/p); mais especificamente, de 60% (p/p); ainda mais especificamente, de 70% (p/p).

[0040] Na etapa (d), os cristais de cloridrato de L-cisteína hidratado precipitados a partir do concentrado podem ser recuperados. Especificamente, os cristais de cloridrato de L-cisteína hidratado podem ser recuperados a partir da lama sujeitando-se o concentrado a uma separação de sólido-líquido. Isso pode ser realizado com o uso de um separador de sólido-líquido, tal como um aparelho de filtração de membrana com pressão reduzida, um aparelho de filtração de membrana com pressão, um aparelho de separação centrífuga etc., porém sem limitações. A lama e/ou cristais de cisteína precipitados podem ser sujeitos a uma lavagem ou secagem adicional.

[0041] Na presente revelação, o filtrado obtido pela recuperação dos cristais na etapa (d) é um líquido mãe com cisteína em resíduos, e pode ser total ou parcialmente adicionado ao caldo de fermentação da etapa (a), o líquido separado da etapa (b) ou o líquido separado no qual o ácido clorídrico é adicionado da etapa (c), a fim de aumentar a taxa de recuperação durante a purificação final de L-cisteína, porém sem limitações.

[0042] O cloridrato de L-cisteína hidratado, preparado de acordo com o método de preparação da presente revelação, pode ser um monoidrato. A pureza dos cristais de cloridrato de L-cisteína hidratado, preparados de acordo com o método de preparação da presente revelação, pode ser de 95% (p/p) ou mais; especificamente de 98% (p/p); mais especificamente, de 99% (p/p).

[0043] Em outro aspecto da presente revelação, a fim de superar os objetivos acima, são fornecidos cristais de cloridrato de L-cisteína hidratado preparados pelo método para preparar cristais de cloridrato de L-cisteína hidratado descrito acima.

[0044] Os cristais de cloridrato de L-cisteína hidratado e o método de preparação dos mesmos são conforme descritos acima.

[EFEITOS VANTAJOSOS]

[0045] O método para preparar cristais de cloridrato de L-cisteína hidratado da presente revelação é capaz de separar e purificar o caldo de fermentação de L-cisteína como em seu estado natural sem uma reação química ou o uso de compostos sintéticos artificiais, e obter cristais de cloridrato de L-cisteína hidratado com uma taxa de recuperação alta e/ou de pureza ao mesmo tempo. Além disso, o método de preparação da presente revelação mostra uma produtividade eficaz, e, em particular, o consumo de água pode ser consideravelmente reduzido.

[BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS]

[0046] A Figura 1 mostra uma ilustração representativa de um processo para preparar cristais de cloridrato de L-cisteína hidratado através de cromatografia contínua a partir de L-cisteína natural contido em um caldo de fermentação.

[0047] A Figura 2 mostra a disposição de torres de resina e a taxa de fluxo para cada seção de cromatografia SMB usada em uma modalidade da presente revelação.

[MODO PARA A INVENÇÃO]

[0048] Doravante, a presente revelação será descrita em maiores detalhes com referência aos Exemplos. Entretanto, esses Exemplos são dados somente para fins ilustrativos, e não há intenção de limitar o escopo da invenção através desses Exemplos.

MÉTODOS DE TESTE

[0049] Métodos analíticos comuns usados nos Exemplos da presente revelação são apresentados a seguir: (1) HPLC PARA ANÁLISE QUANTITATIVA DE CLORIDRATO DE L-CISTEÍNA MONOIDRATADO

[0050] As condições para a análise de HPLC a fim de analisar a pureza e a concentração de cloridrato de L-cisteína monoidratado na presente revelação são apresentados a seguir: Aparelho: Sistema Infinito de HPLC 1260 (Agilent Technology Inc.) Coluna: HP C18 (150 mm x 3,9 mm; 5 μm) Fase móvel: Acetonitrila/Água/Ácido heptafluorobutírico (8/92/0,1) Taxa de fluxo: 0,425 ml/min Temperatura: 30 °C Detecção: UV a 220 nm Volume da amostra introduzida: 2 μl (2) MÉTODO PARA MEDIR A PUREZA DE CRISTAIS DE CLORIDRATO DE L-CISTEÍNA MONOIDRATADO

[0051] Na presente revelação, a qualidade de cristais de cloridrato de L-cisteína monoidratado é avaliada com base na pureza de cloridrato de L- cisteína monoidratado, e o procedimento do mesmo é conforme apresentado a seguir: (a) preparar os cristais de cloridrato de anidro de L-cisteína colocando-se os cristais de cloridrato de L-cisteína monoidratado em um secador a vácuo que contém gel de sílica por vinte e quatro horas sob um vácuo de 20 mmHg ou inferior para remover a umidade dos resíduos e resfriar a temperatura dos cristais de cloridrato de anidro de L-cisteína a uma temperatura ambiente; (b) preparar uma amostra de 0,5000 g/l através da medição quantitativa de 0,5000 g dos cristais de cloridrato de anidro de L-cisteína resfriados a uma temperatura ambiente, colocando-a em um balão volumétrico de 1 l e diluindo-a com água triplamente destilada; (c) preparar uma amostra de 0,5000 g/l através da medição quantitativa de 0,5000 g dos cristais de cloridrato de anidro de L-cisteína, colocando-a em um balão volumétrico de 1 l, e diluindo-a com água triplamente destilada, após tratar os cristais de cloridrato de L-cisteína monoidratado padrões (Sigma, > 99,0%) da mesma maneira que da etapa (a), consequentemente, determinar a pureza de um produto padrão através do certificado do fabricante do reagente padrão, e então converter a concentração de cloridrato de anidro de L-cisteína na amostra (convertida [concentração de cloridrato de anidro de L-cisteína] é de 0,5000 g/l x [pureza de produto padrão]); e (d) analisar a pureza dos cristais de cloridrato de anidro de L- cisteína usados na etapa (a) usando-se a amostra preparada na etapa (c) como um padrão externo e analisar a amostra preparada na etapa (b) por HPLC (a pureza dos cristais analisados de cloridrato de anidro de L-cisteína é a mesma que a pureza dos cristais de cloridrato de L-cisteína monoidratado). (3) MÉTODO PARA ANALISAR O TEOR DE L-CISTEÍNA COM BASE NOS SÓLIDOS NO CALDO DE FERMENTAÇÃO OU NO LÍQUIDO SEPARADO DE ACORDO COM O PROCESSO DE CROMATOGRAFIA

[0052] Na presente revelação, a qualidade do caldo de fermentação ou do líquido separado, de acordo com o processo de cromatografia, é avaliada com base no teor de L-cisteína nos sólidos obtidos através da remoção da umidade da solução, e o procedimento do mesmo é conforme apresentado a seguir: (a) desodorizar um recipiente de porcelana com cerca de 5 g de areia do mar (0,84 a 2,0 mm; Daejung Chemicals) e remover a umidade dos resíduos colocando-os em uma estufa de circulação forçada a 105 °C por três horas, e então resfriá-los a uma temperatura ambiente colocando-os em um secador a vácuo que contém gel de sílica por uma hora; (b) adicionar a solução a ser analisada ao recipiente da etapa (a) e quantificar a [massa da solução] usando a diferença de peso antes e após a adição; (c) remover a umidade dos resíduos colocando-os no recipiente em uma estufa de circulação forçada a 105 °C por três horas, e então resfriá-los a uma temperatura ambiente colocando-os em um secador a vácuo que contém gel de sílica por uma hora, consequentemente, quantificar a quantidade de umidade removida usando a diferença de peso, e converter o teor sólido por massa da solução a ser medida usando o mesmo ([teor sólido por massa] é ([massa da solução] - [massa da umidade removida]) / [massa da solução]); (d) medir a densidade da solução a ser analisada com o uso um analisador de gravidade específico; (e) medir a concentração de L-cisteína na solução a ser analisada por HPLC; e (f) converter o teor de L-cisteína no sólido excluindo a umidade na solução a ser analisada usando o teor sólido por massa da solução, a densidade e a concentração de L-cisteína ([teor de L-cisteína no sólido excluindo a umidade na solução] é [concentração de L-cisteína] / [densidade da solução] / [teor sólido por massa da solução]).

EXEMPLO DE PREPARAÇÃO (1) PREPARAÇÃO DE CALDO DE FERMENTAÇÃO QUE CONTÉM L-CISTEÍNA

[0053] Após obter um caldo de fermentação de O-fosfoserina através do cultivo de um microrganismo capaz de produzir O-fosfoserina em um meio de fermentação, o caldo de fermentação foi sujeito a uma reação de conversão de enzima com um sulfeto usando O-fosfoserina sulfidrase (sulfidrase OPS) para obter um caldo de fermentação que contém L-cisteína.

[0054] Especificamente, KCCM 11103P (CA07-0022/pCL-prmf- serA*(G336V)-serC; Patente n° KR 10-1381048) a cepa, que é uma cepa modificada E. coli W3110, em que serB é deletado e o mutante serA* é introduzido para ter uma habilidade de produção OPS, foi cultivado em uma placa de ágar MMYE a 33 °C por vinte e quatro horas e 1/10 das células na placa foram descartadas de uma placa e inoculadas em um meio em frasco para sementes (10 g/l de glucose, 0,5 g/l de sulfato de magnésio, 3 g/l de drihidrogenofosfato de potássio, 10 g/l de extrato de levedura, 0,5 g/l de cloreto de sódio, 1,5 g/l de cloreto de amônio, 12,8 g/l de pirofosfato de sódio, 1 g/l de glicina) em um frasco de chicana defletora para transportar uma cultura de semente a 200 rpm a 30 °C por seis horas. Após a cultura de semente estiver completa, o meio de cultura de semente com um volume correspondente a 16% do volume do meio de cultura principal for inoculado em um fermentador de tamanho pequeno de 1 l preenchido com 300 ml do meio de cultura principal, e a cultura for realizada a 33 °C a um pH de 7,0 obtém-se um caldo de fermentação OPS. 50 mM de caldo de fermentação OPS reagem com Mycobacterium tuberculosis H37Rv-derivado 50 mg/ml Msm-T enzima sob uma condição de 100 mM Na2S e de 0,2 mM piridoxal 5'- fosfato (PLP) para obter um caldo de fermentação que contém L-cisteína (Patente n° KR 10-1381048).

[0055] O pH do caldo de fermentação de L-cisteína era de 9,3 e a concentração de L-cisteína era de 26 g/l. O teor sólido de L-cisteína excluindo a umidade no caldo de fermentação de L-cisteína foi de 26,7%. O pH do caldo de fermentação foi ajustado reduzindo-se a um pH de 5,5 usando 98% de ácido sulfúrico. O caldo de fermentação foi concentrado com o uso de um evaporador de filme fino para preparar um caldo de fermentação de L-cisteína com uma concentração de L-cisteína de 120 g/l como uma fonte líquida para a cromatografia SMB. As condições de concentração são apresentadas a seguir: Pressão interna: 80 mmHg Pressão de vapor: 200 kPa Quantidade de injeção máxima: 100 l Taxa de fluxo de circulação forçada de líquido de processo: 10 l/min Taxa de evaporação: cerca de 25 l/h (2) OBTER O LÍQUIDO SEPARADO NO QUAL L-CISTEÍNA É SEPARADO COM O USO DE UM APARELHO DE CROMATOGRAFIA CONTÍNUA

[0056] A fim de obter um líquido separado, no qual L-cisteína foi separado, um aparelho de cromatografia SMB foi usado. Um diagrama esquemático do aparelho de cromatografia SMB é mostrado na Figura 2.

[0057] Entretanto, conforme mostrado na Figura 2, o aparelho era composto de um total de 15 torres de resina. O volume de cada torre era de 1,5 l, e a resina foi preenchida a 95% do volume da torre. A fonte líquida SMB foi introduzida na torre de resina 8 a uma taxa de fluxo de 15 ml/min. A fase móvel foi introduzida na torre de resina 1 a uma taxa de fluxo de 95 ml/min. O líquido de processo de produção de SMB (líquido separado) foi descarregado da torre de resina 3 a uma taxa de fluxo de 50 ml/min. O líquido de refugo de processo de SMB foi descarregado da torre de resina 12 a uma taxa de fluxo de 60 ml/min. O líquido descarregado da torre de resina 15 foi misturado com a fase móvel a uma taxa de fluxo de 65 ml/min e então a mistura foi introduzida na torre de resina 1 a uma taxa total de fluxo de 160 ml/min. Um tanque tamponado de 1 l foi instalado entre as torres de resina 7 e 8 para permitir o controle automático controlando-se o nível de água de modo que a fonte líquida para cromatografia SMB pudesse fluir nas torres de resina a uma taxa de fluxo constante. As torres de resina foram movidas na direção de número decrescente a cada 8 min, mas elas foram acionadas de uma forma circulante de tal modo que a torre de resina 1 foi movida para a torre de resina 15.

[0058] No Exemplo de Preparação, cada uma dentre as resinas TRILITE® MCK32L, PUROLITE® PCR642 ou DIAION® UBK555, que são resinas de copolímero de estireno-divinilbenzeno que têm um grupo de ácido sulfônico forte como um grupo funcional, foram carregadas na torre de resina do aparelho de cromatografia, e 0,1 kl ou mais da fonte líquida para cromatografia SMB foi introduzida às mesmas. Então, o aparelho foi operado para obter um líquido de processo de produção de SMB (líquido separado). Os líquidos separados tinham um pH de 6,1, 6,3 e 5,9, respectivamente, e a concentração de L-cisteína era de 35,1 g/l, 34,8 g/l e 33,9 g/l, respectivamente. (3) REAÇÃO E CONCENTRAÇÃO DA ADIÇÃO DE ÁCIDO CLORÍDRICO

[0059] 36% de ácido clorídrico foram adicionados ao líquido separado acima de modo que a razão de equivalência [HCl]/[L-cisteína] fosse 2, e o líquido foi concentrado conectando-se linearmente um tubo de concentração de filme fino e um tubo de concentração de circulação do tipo forçada até que a concentração de L-cisteína alcançasse 700 g/l. Os cristais de cloridrato de L-cisteína monoidratado foram precipitados durante a concentração, e a temperatura do cristal de cloridrato de L-cisteína monoidratado em lama foi de 55 °C imediatamente após a concentração. As condições de concentração são apresentadas a seguir: Pressão interna: 80 mmHg Pressão de vapor: 200 kPa Quantidade de injeção máxima: 100 l Taxa de fluxo de circulação forçada de líquido de processo: 10 l/min Taxa de evaporação: cerca de 10 l/h (4) O RESFRIAMENTO E A RECUPERAÇÃO DE CRISTAIS DE CLORIDRATO DE L-CISTEÍNA

[0060] O cristal de cloridrato de L-cisteína monoidratado em lama foi resfriado em uma camisa de tanque a 15 °C por quatro horas a uma taxa constante de resfriamento enquanto era remexido e agitado por duas horas na mesma temperatura que a temperatura na finalização de resfriamento. Depois disso, os cristais de cloridrato de L-cisteína monoidratado foram sujeitos a uma separação de sólido-líquido do cristal de cloridrato de L-cisteína monoidratado em lama com o uso de um separador centrífugo em formato de anel. As condições de separação do separador em formato de anel são apresentadas a seguir: Equipamento: 4,5 l de separador em formato de anel (H-122; Kokusan) Líquido de lavagem: água triplamente destilada Tipo de filtro: Tecido de filtro de fibra com multifilamentos de poliamida Permeabilidade de ar de filtro: 250 l/m2/s (a 0,2 kPa) Velocidade de rotação de cilindro de calandra: 3.000 rpm Tempo de rotação de cilindro de calandra: 20 min

[0061] Durante a separação, o líquido de lavagem acrescentou 10% do volume do cristal de cloridrato de L-cisteína monoidratado em lama. Após a separação, o obtido foi secado a 35 °C por duas horas ou mais com o uso de um secador de leito fluidizado para reduzir a umidade dos resíduos a 12,0% ou inferior, e finalmente, os cristais de cloridrato de L-cisteína monoidratado foram preparados.

[0062] Consequentemente, o rendimento do processo de cromatografia SMB, o teor sólido de L-cisteína (%) no líquido separado obtido através do processo de cromatografia SMB e a pureza dos cristais de cloridrato de L-cisteína monoidratado foram medidos. A taxa de recuperação do processo de cromatografia SMB foi calculada como a taxa de recuperação de L-cisteína no líquido separado em comparação ao caldo de fermentação introduzido no aparelho de cromatografia SMB. Os resultados são mostrados na Tabela 1 junto com os resultados obtidos no Exemplo de Preparação. Quando uma resina de copolímero de estireno-divinilbenzeno com um grupo sulfônico como um grupo funcional foi usada como fase estacionária, todo os resultados experimentais mostraram que o rendimento do processo de cromatografia SMB foi maior do que 90%, que o teor sólido de L-cisteína excluindo a umidade no líquido separado obtido através do processo de cromatografia SMB foi de 92,5% ou mais, e que a pureza dos cristais de cloridrato de L-cisteína monoidratado foi de 99,5% ou mais.

[0063] Com base nisso, pode-se confirmar que, quando a cromatografia contínua é realizada empregando-se uma resina de fase estacionária com um grupo funcional fortemente ácido, os cristais de cloridrato de L-cisteína monoidratado podem ser obtidos com um maior rendimento e pureza.

EXEMPLO EXPERIMENTAL 1 - AVALIAÇÃO DE ACORDO COM OS TIPOS DE RESINAS DE TROCAS IÔNICAS

[0064] No Exemplo de Preparação, os cristais de cloridrato de L- cisteína hidratado foram preparados variando-se apenas as resinas de fase estacionária carregadas no aparelho de cromatografia SMB. Como as resinas usadas foram aquelas com a fase estacionária, aquelas que podem ser industrialmente usadas sem dificuldade e que podem ser produzidas através de produção em massa foram selecionadas. As resinas foram selecionadas com base nos grupos funcionais, de tal modo que eles contivessem um grupo de ácido carboxílico fraco, um grupo de trimetilamina básico forte, um grupo de amina terciária básico fraco e nenhum grupo funcional.

[0065] Consequentemente, o rendimento do processo de cromatografia SMB, o teor sólido de L-cisteína (%) no líquido separado obtido através do processo de cromatografia SMB e a pureza dos cristais de cloridrato de L-cisteína monoidratado finalmente recuperados foram medidos. A taxa de recuperação do processo de cromatografia SMB foi calculada como a taxa de recuperação de L-cisteína no líquido separado em comparação ao caldo de fermentação introduzido no aparelho de cromatografia SMB. Os resultados são mostrados na Tabela 1 junto com os resultados obtidos no Exemplo de Preparação.

[0066] Quando a resina de copolímero de estireno-divinilbenzeno com um grupo sulfônico como um grupo funcional foi usada como uma fase estacionária, todos os resultados experimentais mostraram que o rendimento do processo de cromatografia SMB foi maior do que 90%, que o teor de L- cisteína foi de 92,5% ou mais, e que a pureza dos cristais de cloridrato de L- cisteína monoidratado foi de 99,5% ou mais. Em oposição, quando os cristais foram obtidos empregando-se as resinas com um grupo de ácido carboxílico fraco, um grupo de trimetilamina básico forte, um grupo de amina terciária básico fraco ou nenhum grupo funcional, o rendimento do processo de cromatografia SMB foi de 13,5% a 25,8% e o teor de L-cisteína foi de 31,8% a 44,5%. Ou seja, o rendimento e o teor foram reduzidos em 50% ou mais em comparação ao rendimento e o teor obtidos quando um grupo funcional fortemente ácido foi usado como uma fase estacionária.

[0067] Com base nisso, confirmou-se que, nesse caso, em que a resina com um grupo funcional fortemente ácido foi usada como uma fase estacionária quando o caldo de fermentação de L-cisteína foi separado e cristalizado pela cromatografia contínua, os cristais de cloridrato de L-cisteína monoidratado puderam ser obtidos com um alto rendimento, concentração e pureza.

EXEMPLO EXPERIMENTAL 2 - AVALIAÇÃO DE CALDO DE FERMENTAÇÃO QUE CONTÉM L-CISTEÍNA DE ACORDO COM O PH

[0068] No Exemplo de Preparação (TRILITE® MCK32L usado), os cristais de cloridrato de L-cisteína hidratado foram preparados variando-se apenas o pH do caldo de fermentação que contém L-cisteína. Especificamente, após obter o caldo de fermentação que contém L-cisteína da mesma maneira que no Exemplo de Preparação, o pH do caldo de fermentação variou de 2,5 a 9,5 usando 98% de ácido sulfúrico ou uma solução de soda cáustica de 50%.

[0069] Consequentemente, o rendimento do processo de cromatografia SMB, o teor sólido de L-cisteína (%) no líquido separado obtido através do processo de cromatografia SMB e a pureza dos cristais de cloridrato de L-cisteína monoidratado finalmente recuperados foram medidos. A taxa de recuperação do processo de cromatografia SMB foi calculada como a taxa de recuperação de L-cisteína no líquido separado em comparação ao caldo de fermentação introduzido no aparelho de cromatografia SMB. Os resultados são mostrados na Tabela 2 abaixo.

[0070] Constatou-se que o rendimento do processo de cromatografia SMB é de 50% ou mais a uma faixa de pH de 3,0 a 9,0, é de 85% ou mais a uma faixa de pH de 4,5 a 7,0 e é de 90% a uma faixa de pH de 5,0 a 6,0. O teor sólido de L-cisteína excluindo a umidade no líquido separado obtido através do processo de cromatografia SMB foi de 85% ou mais a uma faixa de pH de 3,0 a 9,0 e de 90% ou mais a uma faixa de pH de 3,5 a 7,5.

[0071] Além disso, constatou-se que a pureza dos cristais de cloridrato de L-cisteína monoidratado é de 98% ou mais a uma faixa de pH de 2,5 a 9,0 e é de 99% ou mais a uma faixa de pH de 3,5 a 8,5. Ou seja, confirmou-se que, quando o método da presente revelação foi empregado, os cristais de cloridrato de L-cisteína monoidratado puderam ser obtidos com uma pureza bem alta sem afetar consideravelmente a faixa de pH.

EXEMPLO EXPERIMENTAL 3 - AVALIAÇÃO DE ACORDO COM A QUANTIDADE DE ÁCIDO CLORÍDRICO ADICIONADA

[0072] No Exemplo de Preparação (TRILITE® MCK32L usado), os cristais de cloridrato de L-cisteína hidratado foram preparados variando-se apenas a razão de equivalência [HCl]/[L-cisteína] de ácido clorídrico adicionado na faixa de 0,80, 0,85, 0,90, 1,0, 1,5, 2,0, 2,5, 3,0 e 3,5.

[0073] Consequentemente, o rendimento da cromatografia SMB e a pureza dos cristais de cloridrato de L-cisteína monoidratado finalmente recuperados foram medidos. A taxa de recuperação do processo de cristalização foi calculada como a taxa de recuperação de L-cisteína contido nos cristais de cloridrato de L-cisteína monoidratado finalmente recuperados em relação a L-cisteína no líquido separado de acordo com o processo de cromatografia SMB. Os resultados são mostrados na Tabela 3 abaixo.

[0074] Todos os cristais foram precipitados durante a concentração, mas quando a razão de equivalência [HCl]/[L-cisteína] foi de 0,85 ou menos, os cristais de L-cisteína foram precipitados e, quando a razão de equivalência foi de 0,9 ou mais, os cristais de cloridrato de L-cisteína monoidratado foram precipitados. Ou seja, pode-se interpretar que, quando a razão de equivalência foi maior do que 0,85, os cristais de cloridrato de L-cisteína monoidratado foram precipitados.

[0075] Constatou-se que a pureza de cristais de cloridrato de L- cisteína monoidratado era de 98% ou mais quando o cloridrato de L-cisteína monoidratado era formado independentemente da razão de equivalência [HCl]/[L-cisteína]. Constatou-se que a taxa de recuperação do processo de cristalização para o cloridrato de L-cisteína monoidratado era de 40% ou mais a uma razão de equivalência [HCl]/[L-cisteína] de 0,9 a 3,0, e espera-se que seja maior do que 50% a uma razão de equivalência maior do que 1,0 e menor do que 3,0. Além disso, constatou-se que a pureza era de 60% ou mais a uma razão de equivalência de 1,5 a 2,5, e prevê-se que pode haver uma condição ideal para alcançar a taxa de recuperação mais alta a uma razão de equivalência de 1,5 a 2,5.

EXEMPLO EXPERIMENTAL 4 - AVALIAÇÃO DE ACORDO COM A CONCENTRAÇÃO DE CONCENTRADO

[0076] No Exemplo de Preparação (TRILITE® MCK32L usado), os cristais de cloridrato de L-cisteína hidratado foram preparados variando-se apenas a concentração do concentrado obtido pela concentração do líquido separado no qual o ácido clorídrico foi adicionado a partir de 100 g/l a 900 g/l.

[0077] Consequentemente, o momento no qual a nucleação ocorreu, a pureza dos cristais de cloridrato de L-cisteína monoidratado finalmente recuperados e a taxa de recuperação do processo de cristalização foram medidos. A taxa de recuperação do processo de cristalização foi calculada como a taxa de recuperação de L-cisteína contido nos cristais de cloridrato de L-cisteína monoidratado finalmente recuperados em relação a L-cisteína no líquido separado de acordo com o processo de cromatografia SMB. Os resultados são mostrados na Tabela 4 abaixo.

[0078] A nucleação do cloridrato de L-cisteína monoidratado ocorreu quando a concentração foi de 200 g/l ou mais, mas a nucleação ocorreu durante a concentração quando a concentração foi de 300 g/l ou mais, e foi possível realizar uma cristalização rápida.

[0079] A pureza dos cristais de cloridrato de L-cisteína monoidratado foi 99% ou mais em todos os casos nos quais os cristais foram formados. Ou seja, confirmou-se que quando os cristais foram obtidos usando o método da presente revelação, os cristais de cloridrato de L-cisteína monoidratado puderam ser obtidos com uma pureza bem alta independentemente da concentração do líquido separado. A taxa de recuperação do processo de cristalização aumentou em proporção à concentração. Entretanto, quando a concentração foi de 800 g/l, os cristais de L-cisteína puderam ser obtidos com uma pureza alta e uma taxa de recuperação alta, enquanto, quando a concentração foi de 900 g/l, a solidificação do cristal de cloridrato de L- cisteína monoidratado em lama ocorreu, e, consequentemente, o remeximento e separação dos cristais tornaram-se impossíveis. Portanto, espera-se que os cristais de L-cisteína possam ser obtidos com uma pureza alta e uma taxa de recuperação alta a uma concentração menor do que 900 g/l.

[0080] Com base nesses resultados, confirmou-se que quando a concentração do líquido separado para a cromatografia SMB foi a partir de 200 g/l a menos do que 900 g/l, os cristais de L-cisteína foram obtidos facilmente. Em particular, confirmou-se que quando a concentração estava na faixa de 300 g/l a 800 g/l, os cristais puderam ser obtidos com um processo de cristalização mais rápido, a uma pureza alta e a uma taxa de recuperação alta. EXEMPLO EXPERIMENTAL 5 - AVALIAÇÃO DE ACORDO COM A MUDANÇA DE CONDIÇÃO DE RESFRIAMENTO A UMA BAIXA CONCENTRAÇÃO

[0081] O concentrado, a partir da qual os cristais de cloridrato de L- cisteína monoidratado foram formados mesmo quando resfriados a 15 °C , quando a concentração do líquido separado para a cromatografia SMB foi de 100 g/l no Exemplo 4, foi resfriado a -10 °C a uma taxa constante de resfriamento por duas horas e trinta minutos em uma camisa de tanque junto com o remeximento, e então agitado a uma mesma temperatura que a temperatura na finalização de resfriamento por doze horas. Como um resultado, os cristais de cloridrato de L-cisteína monoidratado foram formados. Os cristais foram sujeitos a uma separação de sólido-líquido usando um aparelho de filtração de membrana com pressão reduzida, 100 ml de um líquido de lavagem foram adicionados aos mesmos e secados em um secador de estufa a 35 °C por doze horas para reduzir a umidade dos resíduos a 12,0% ou menos. Finalmente, os cristais de cloridrato de L-cisteína monoidratado estavam preparados. A pureza dos cristais de cloridrato de L- cisteína monoidratado foi de 99,8%, e constatou-se que a taxa de recuperação do processo de cristalização foi de 9,7%.

[0082] Com base nisso, confirmou-se que mesmo quando a concentração do líquido separado para a cromatografia SMB foi menor do que 200 g/l, os cristais de cloridrato de L-cisteína monoidratado puderam ser obtidos controlando-se a temperatura de resfriamento. Entretanto, a taxa de recuperação do processo de cristalização foi muito baixa para ser aplicada industrialmente. Além disso, houve desvantagens quanto ao processo de cristalização de resfriamento, o qual precisa ser realizado mesmo sob uma condição de temperatura severa inferior a zero e quanto ao tempo de cristalização ser longo.

EXEMPLO EXPERIMENTAL 6 - AVALIAÇÃO DE ACORDO COM A TEMPERATURA DE RESFRIAMENTO

[0083] No Exemplo de Preparação, os cristais de cloridrato de L- cisteína monoidratado foram preparados variando-se apenas a temperatura de resfriamento do cristal de cloridrato de L-cisteína monoidratado em lama. Especificamente, um total de 5 experimentos de cristalização foi realizado incluindo o remeximento do cristal de cloridrato de L-cisteína monoidratado em lama a 55 °C por duas horas sem o resfriamento, e o resfriamento do cristal de cloridrato de L-cisteína monoidratado em lama a várias faixas de temperatura a partir de 0 °C a 45 °C com uma taxa de resfriamento de 10 °C /h enquanto ocorria o remeximento. O volume inicial do cloridrato de L- cisteína monoidratado em lama usado em cada experimento foi de 1 l.

[0084] Consequentemente, a pureza dos cristais de cloridrato de L- cisteína monoidratado e a taxa de recuperação do processo de cristalização são mostrados na Tabela 5. A taxa de recuperação do processo de cristalização foi calculada como a taxa de recuperação de L-cisteína contido nos cristais de cloridrato de L-cisteína monoidratado finalmente recuperados em relação a L-cisteína no líquido separado de acordo com o processo de cromatografia SMB. Os resultados são mostrados na Tabela 5.

[0085] A pureza dos cristais de cloridrato de L-cisteína monoidratado foi de 99,5% ou mais em todos os casos. Além disso, a taxa de recuperação do processo de cristalização foi de 64% ou mais mesmo quando o resfriamento não ocorreu, e a taxa de recuperação do processo de cristalização aumentou conforme a temperatura de resfriamento diminuiu. Constatou-se que a taxa do processo de recuperação foi de 70% ou mais a uma temperatura inferior a 45 °C, e era esperado que a taxa do processo de recuperação fosse de 74% ou mais a uma temperatura de 30 °C ou inferior.

EXEMPLO 7 - AVALIAÇÃO DE ACORDO COM CONCENTRAÇÃO DE CALDO DE FERMENTAÇÃO QUE CONTÉM L-CISTEÍNA USADO COMO FONTE MATERIAL PARA A CROMATOGRAFIA SMB

[0086] No Exemplo de Preparação, os cristais de cloridrato de L- cisteína hidratado foram preparados variando-se apenas a concentração do caldo de fermentação (com pH de 5,5) que contém L-cisteína usado como uma fonte material para a cromatografia SMB. Especificamente, um total de 6 experimentos foram conduzidos incluindo o uso do caldo de fermentação de L-cisteína com uma concentração de 26 g/l obtido no Exemplo de Preparação como uma fonte líquida para a cromatografia SMB, usando um caldo de fermentação com uma concentração de L-cisteína de 10 g/l como uma fonte líquida para a cromatografia SMB através da diluição com água, e usando um caldo de fermentação com uma concentração de L-cisteína a partir de 60 g/l a 150 g/l como uma fonte líquida para a cromatografia SMB através da concentração usando um evaporador de filme fino. Quando a concentração de L-cisteína foi aumentada para 180 g/l, o processo de cromatografia SMB não foi realizado, visto que os cristais de L-cisteína foram precipitados.

[0087] O volume da fonte líquida usado em cada experimento foi de 0,1 kl ou mais. O rendimento do processo de cromatografia SMB e o teor sólido de L-cisteína excluindo a umidade no líquido de processo produzidos pela cromatografia SMB são mostrados na Tabela 6.

[0088] O rendimento do processo de cromatografia SMB foi de 90% ou mais em todas as seções, e o teor sólido de L-cisteína excluindo a umidade no líquido de processo produzidos pela cromatografia SMB foi de 90% ou mais em todas as seções. De acordo com os resultados acima, pode-se interpretar que o método para purificar L-cisteína através da cromatografia SMB da presente revelação é bastante efetivo para purificar e cristalizar o caldo de fermentação que contém L-cisteína independentemente da concentração de L-cisteína na fonte líquida.

[0089] Embora a presente revelação tenha sido descrita com referência às modalidades ilustrativas particulares, será compreendido pelas pessoas versadas na técnica as quais a presente revelação pertence que a presente revelação pode ser incorporada em outras formas específicas sem se afastar do espírito da técnica ou das características essenciais da presente revelação. Portanto, as modalidades descritas acima são consideradas como ilustrativas em todos os aspectos e não restritivas. Além disso, o escopo da presente revelação é definido pelas reivindicações anexas ao invés da descrição detalhada, e deve ser entendido que todas as modificações ou variações derivadas dos significados e do escopo da presente revelação e equivalentes da mesma são incluídas no escopo das reivindicações anexas.

Claims

1. Método para preparar cristais de cloridrato de L-cisteína hidratado, caracterizado pelo fato de que compreende: (a) obter um líquido separado após introduzir um caldo de fermentação a uma faixa de pH de 3,0 a 9,0 que contém L-cisteína em um aparelho de cromatografia contínua com uma resina de troca catiônica fortemente ácida como uma fase estacionária; (b) adicionar ácido clorídrico ao líquido separado de tal modo que a razão de equivalência ([HCl]/[L-cisteína]) de ácido clorídrico a L- cisteína seja de a partir de 0,9 a 3,0; (c) concentrar o líquido separado no qual o ácido clorídrico é adicionado; e (d) recuperar os cristais de cloridrato de L-cisteína hidratado do concentrado, em que a cromatografia contínua na etapa (a) não compreende adsorção/eluição de L-cisteína, em que o líquido separado na etapa (a) tem um teor de sólidos de L-cisteína excluindo umidade de 85% (p/p) ou mais.

2. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que ainda compreende o ajuste do caldo de fermentação que contém L-cisteína a um pH de 3,5 a 7,5 antes da etapa (a).

3. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que ainda compreende a concentração do caldo de fermentação a uma faixa de pH de 3,0 a 9,0 que contém L-cisteína antes da etapa (a).

4. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a resina de troca catiônica fortemente ácida na etapa (a) ter um grupo funcional de ácido sulfônico.

5. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a resina de troca catiônica fortemente ácida na etapa (a) ser um copolímero de estireno-divinilbenzeno.

6. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o aparelho de cromatografia contínua na etapa (a) ser um aparelho de cromatografia de leito móvel simulado (SMB).

7. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a taxa de recuperação do processo de cromatografia contínua na etapa (a), como uma razão de L-cisteína no líquido separado obtido em relação ao caldo de fermentação introduzido, ser de 50% (p/p).

8. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a razão de equivalência ([HCl]/[L-cisteína]) de ácido clorídrico a L-cisteína na etapa (b) ser a partir de 1,5 a 2,5.

9. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a etapa (c) ser realizada de tal modo que a concentração de L- cisteína no líquido separado, na qual o ácido clorídrico é adicionado, seja a partir de 200 g/l a menos de 900 g/l.

10. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a etapa (c) ser realizada de tal modo que a concentração de L- cisteína no líquido separado, na qual o ácido clorídrico é adicionado, seja a partir de 500 g/l a menos de 900 g/l.

11. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que ainda compreende o resfriamento do concentrado antes da etapa (d).

12. Método de acordo com a reivindicação 11, caracterizado pelo fato de que o concentrado ser resfriado a uma temperatura de 0°C a 30°C.

13. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que compreende a adição de um filtrado obtido pela recuperação dos cristais na etapa (d) ao caldo de fermentação da etapa (a), ao líquido separado da etapa (b), ou ao líquido separado no qual o ácido clorídrico é adicionado.