JP2001069990A - 抱合胆汁酸脱抱合酵素タンパク質 - Google Patents
抱合胆汁酸脱抱合酵素タンパク質Info
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Abstract
パク質の提供。 【解決手段】 ビフィドバクテリウム・ロンガム(Bifid
obacterium longum) が産生するBSH活性を有するタ
ンパク質。BSHタンパク質は、グリシン抱合型胆汁酸
に対する脱抱合活性がタウリン抱合型胆汁酸に対する脱
抱合活性より約2倍高い特徴を有する。ビフィドバクテ
リウム・ロンガム(Bifidobacterium longum) の菌体抽
出液を陰イオン交換クロマトグラフィー及び陽イオン交
換クロマトグラフィーで処理することにより、分離、精
製することができる。
Description
ウム・ロンガム(Bifidobacterium longum) が産生する
新規な抱合胆汁酸脱抱合酵素(Bile salt hydrolase;B
SH)活性を有するBSHタンパク質に関する。また、
本発明は、BSHタンパク質産生能を有するビフィドバ
クテリウム・ロンガム(Bifidobacterium longum) の菌
体抽出液からBSHタンパク質を分離、精製する上記B
SHタンパク質の製造法に関する。
ンパク質には、ヒトの血清脂質代謝、特にコレステロー
ル代謝に対する作用が示唆されている。すなわち、ヒト
腸管内に存在する抱合胆汁酸をBSHタンパク質の触媒
作用によって脱抱合胆汁酸に変換することでヒト血清コ
レステロール濃度が低下するという、いわゆるBSH説
がそれである (例えば、Smetらの報告 (Microbial Ecol
ogy in Health and Disease, vol.7, pp.315-329, 199
4))。
から形成されている。第一に、十二指腸から分泌される
胆汁酸は抱合胆汁酸であり、脂質の吸収に大きく関与す
る複合ミセルの形成能力が脱抱合胆汁酸よりも抱合胆汁
酸の方が高いので、腸内の抱合胆汁酸を脱抱合胆汁酸に
変換すればするほど、経口的に摂取したコレステロール
を含む脂質類の腸管からの吸収量が減少し、これによっ
て血清コレステロール濃度が低下する要因となる (例え
ば、Sanders の報告 (Advance in Food and Nutri. Re
s., vol.37, pp.67-130, 1993))。
は、抱合胆汁酸に特異的な受容体を介しての能動輸送に
より主に小腸下部から再吸収されて肝臓に運ばれるが、
特異的な受容体を介しての脱抱合胆汁酸に対する能動輸
送系は腸管内には存在しておらず、腸管からの脱抱合胆
汁酸の再吸収は、もっぱら受動輸送のみに依っている。
したがって、脱抱合胆汁酸の方が抱合胆汁酸に比べて腸
管からの再吸収の割合が低く、また、腸管から再吸収さ
れない胆汁酸は糞便中に排泄されるので、糞便中に排泄
される胆汁酸の総量が増加する。体外に排泄される胆汁
酸量が増加すると胆汁酸の体内での生合成量、つまり肝
臓におけるコレステロールから胆汁酸への異化作用が亢
進し、同時に肝臓ではLDLレセプターを介しての血液
中からのLDLの取り込みが亢進し、これが血清コレス
テロールを低下させる要因となる (例えば、Huisらの報
告 (TIBTECH, vol.12, pp.6-8, 1994)) 。
で、ある報告ではBSHが働いて血清コレステロール濃
度が低下すること (例えば、Smetらの報告 (British J.
Nutrition, vol.79, pp.185-194, 1998))を結論として
いる一方で、また、ある報告はBSHは機能せず、した
がって、BSHは血清コレステロール濃度に影響を与え
ないこと (例えば、Pearceの報告 (Int. Dairy Sci., v
ol.6, pp.661-672))を結論としている。
度に対する影響に関するこれまでの研究報告は、全てマ
ウス、ラット、あるいはブタといった実験動物を対象と
したものである (例えば、Smetの報告 (British J. Nut
ri., vol.79, pp.185-194, 1998)) 。コレステロール代
謝及び胆汁酸代謝の様式は、同じ哺乳動物とはいえ動物
種によって大きく異なっていることが知られているの
で、ヒトにおけるBSHの効果を確認するためにはヒト
を用いた実験が必須であるが、現在までのところ、ヒト
での実験は試みられていない。
なわち、ヒト腸管内でBSHタンパク質によって抱合胆
汁酸を脱抱合胆汁酸に変換することが血清コレステロー
ル濃度の低下につながる可能性に関しては、一定の結論
を得ていないものの、その可能性が十分に期待されてい
るという状況にある。
bacillus) 属菌、ビフィドバクテリウム(Bifidobacteri
um) 属菌、エンテロコッカス (Enterococcus) 属菌、ク
ロストリジウム(Clostridium) 属菌、バクテロイデス(B
acteroides) 属菌等にBSHタンパク質の存在が知られ
ており、精製、遺伝子構造、酵素の性状等に関する報告
がなされており、ビフィドバクテリウム(Bifidobacteri
um) 属菌に関しては、Grill らがビフィドバクテリウム
・ロンガム(Bifidobacterium longum) BB536に由来す
るBSHタンパク質の精製とその性状について報告して
いる (Appl. Environ. Microbiol., vol.61, pp.2577-2
582, 1995)。
クテリウム・ロンガム(Bifidobacterium longum) が産
生する新規な抱合胆汁酸脱抱合酵素(BSH)タンパク
質及びその製造法を提供することを課題とする。
うに前記BSH説の検証に好都合な酵素学的性質を有
し、この用途に使用されるばかりではなく、その酵素的
特徴から化学試薬としても有用である。また、ヒトの血
清コレステロール濃度を調節する機能を有する飲食品や
医薬等の素材としても有用である。
に存在する抱合胆汁酸を脱抱合することのできるBSH
タンパク質を探索している過程で、ビフィドバクテリウ
ム・ロンガム(Bifidobacterium longum) が、他の乳酸
菌に比べてBSHタンパク質を多量に産生し、かつヒト
に存在する6種類の抱合胆汁酸を幅広く脱抱合する能力
を有することを見出し、ビフィドバクテリウム・ロンガ
ム(Bifidobacterium longum) が産生するBSHタンパ
ク質の精製を行なった。そして、得られたBSHタンパ
ク質が、Grillらが報告しているビフィドバクテリウム
・ロンガム(Bifidobacterium longum) BB536 が産生す
るBSHタンパク質の性状とは異なる性状を有する新規
なBSHタンパク質であることを確認し、本発明を完成
するに至った。
ィドバクテリウム・ロンガム(Bifidobacterium longu
m) の菌株としては、ビフィドバクテリウム・ロンガム
(Bifidobacterium longum) SBT-2933R (FERM P-8743)
、ビフィドバクテリウム・ロンガム(Bifidobacterium
longum) SBT-2928 (FERM P-10657) 等を例示すること
ができる。
ム(Bifidobacterium longum) が産生する、次の性質を
有する新規なBSHタンパク質であり、また、配列表配
列番号1に示したアミノ酸配列で規定されるものであ
る。 (1) 分子量:変性状態での分子量 (サブユニットの分子
量) が37,000±2,000 及び非変性状態での分子量 (生理
条件下での分子量) が130,000 ±10,000である。なお、
変性状態での分子量はSDS-PAGE法で、また、非変性状態
での分子量はゲル濾過法で測定される。 (2) 基質特異性:グリシン抱合型胆汁酸に対する脱抱合
活性がタウリン抱合型胆汁酸に対する脱抱合活性よりも
約2倍高い。 (3) 活性剤:ジチオスレイトール(DTT)、メルカプ
トエタノール、塩化ナトリウム。 (4) 阻害剤:SH酵素の阻害剤、塩化銅、塩化カルシウ
ム、硫酸マグネシウム。 (5) 至適pH及びpH安定性:至適pHは6であり、酵素活性
はpH 4.5〜 7.6の範囲で安定である。 (6) 至適温度及び温度安定性:至適温度は40℃であり、
酵素活性は4〜37℃の範囲で安定である。 また、本発明は、BSHタンパク質産生能を有するビフ
ィドバクテリウム・ロンガム(Bifidobacterium longu
m) の菌体抽出液を陰イオン交換クロマトグラフィー、
及び陽イオン交換クロマトグラフィーで順次処理してB
SHタンパク質を分離、精製する上記BSHタンパク質
の製造法である。
ム・ロンガム(Bifidobacterium lo ngum) SBT-2928(FER
M P-10657)が産生するBSHタンパク質の性状は、 Gri
llらが報告しているビフィドバクテリウム・ロンガム(B
ifidobacterium longum) BB536 が産生するBSHタン
パク質の性状とは異なっている。すなわち、本発明のB
SHタンパク質と公知のBSHタンパク質(ビフィドバ
クテリウム・ロンガム(Bifidobacterium longum BB
536 株由来の酵素 (以下、BB536 酵素という)(Appl.E
nviron.Microbiol.,vol.61,pp.2577-2582,1995)との性
質の相違は次のとおりである。
質は、グリシン型抱合胆汁酸に対する脱抱合活性がタウ
リン型抱合胆汁酸に対する脱抱合活性よりも約2倍高
い。これに対し、BB536 酵素は、グリシン型抱合胆汁
酸に対する脱抱合活性がタウリン型抱合胆汁酸に対する
脱抱合活性と同等である。 (2) 分子量:本発明のBSHタンパク質は非変性状態で
の分子量は約 130,000、変性状態での分子量は約37,000
である。これに対し、BB536 酵素は、非変性状態での
分子量は約 250,000、変性状態での分子量は約40,000で
ある。 (3) 変性剤の存在下での安定性:本発明のBSHタンパ
ク質は、前記変性状態及び非変性状態での分子量の相違
からみて4量体であると考えられ、非変性状態では4量
体で安定的に存在している。これに対し、BB536 酵素
は、前記の変性状態及び非変性状態での分子量の相違か
らみて6量体であると考えられる。しかも、この6量体
の非変性状態において酵素は不安定であり、酵素は単量
体として存在する。 (4) 酵素阻害剤及び酵素活性剤に対する感受性:本発明
のBSHタンパク質の酵素阻害剤としては塩化カルシウ
ム、酵素活性剤としては塩化ナトリウム、システィン、
アスコルビン酸等が挙げられる。これに対し、BB536
酵素は塩化カルシウムでは活性が阻害されず、また、酵
素活性剤は不明である。
フィドバクテリウム・ロンガム(Bifidobacterium long
um) が産生し、前記のような性質を有し、また、配列表
配列番号1に示されるアミノ酸配列を有する。このBS
Hタンパク質は、上述したBSH説の検証に好都合な性
質を有している。つまり、他の細菌が産生するBSHタ
ンパク質に比べ比活性が遙かに高く、ヒト腸内に存在す
る6種類の抱合胆汁酸を全て脱抱合する能力を有してい
るからである。また、グリシン抱合型胆汁酸に対する特
異性は、ヒト胆汁中の抱合胆汁酸を効率良く脱抱合する
用途に適している。なぜなら、ヒト胆汁中の抱合胆汁酸
の構成比はグリシン抱合型胆汁酸:タウリン抱合型胆汁
酸=2:1であるが、ビフィドバクテリウム・ロンガム
(Bifidobacterium longum) が産生するBSHタンパク
質は、グリシン抱合型胆汁酸をタウリン抱合型胆汁酸よ
りも約2倍高い割合で脱抱合するからである。さらに、
本発明のBSHタンパク質のアミノ酸配列及びDNA配
列から通常の遺伝子操作によって、BSH活性のみを欠
損させた変異体を作出できるので、BSH説を検証する
際に必須となる陰性対照株を容易に作出することもでき
る。
るビフィドバクテリウム・ロンガム(Bifidobacterium
longum) は、ヒトの腸内菌叢の主要な構成菌種であり、
ヒトの腸内に定着して生息しているので、ヒトに与える
影響の潜在的な能力が高いことが考えられ、また、従来
よりヨーグルト等の発酵乳製品に幅広く使用されている
乳酸菌であるので、安全性という点からも何ら問題はな
い。
するビフィドバクテリウム・ロンガム(Bifidobacterium
longum) を嫌気条件下で培養した後、菌体抽出液から
BSHタンパク質を分離、精製する。
acterium longum) 菌体を培養するに際しては、嫌気性
細菌用の培地であればどのような培地をも使用すること
ができ、例えば、市販のTPY培地、M−17培地、MR
S培地、Briggs Liver液体培地等を使用して菌体を培養
すれば良い。なお、ビフィドバクテリウム・ロンガム(B
ifidobacterium longum) 菌体の培養は、嫌気条件下で
行うことが好ましいので、市販の酸素吸着材で培養器内
を嫌気条件にしたり、あるいは培養器内の酸素を強制的
に窒素ガスや炭酸ガスに置換して、嫌気的な環境とすれ
ば良い。また、培養は30〜37℃の温度範囲で10〜30時間
培養すれば良い。
る緩衝液を用いて洗浄し、培地成分を菌体成分から十分
に除去する。洗浄後の菌体については再び緩衝液に懸濁
して、適当な濃度の菌体懸濁液を調製する。菌体懸濁液
については次に超音波処理等を行って、菌体抽出液(粗
酵素画分)を調製する。菌体抽出液の調製方法には、超
音波処理装置を用いる方法の他に、フレンチプレスを用
いる方法、凍結融解による方法、リゾチーム(Lysozyme)
等の酵素処理による方法等が挙げられるが、超音波処理
が好ましい。
第一に陰イオン交換クロマトグラフィーを用いて分画す
る。陰イオン交換クロマトグラフィー用カラムとして
は、Pharmacia 社製のMonoQ カラム、また、DEAE-Sepha
roseカラム等を使用することができる。本クロマトグラ
フィーはpH 7付近で実施することが好ましく、この時、
BSH活性画分は陰イオン交換クロマトグラフィー用カ
ラムに吸着される。一旦カラムに吸着されたBSH活性
画分は、その後、0.25〜0.35 M食塩を含む緩衝液によっ
て当該カラムから溶出させることができる。
分画されたBSH活性画分を、次に陽イオン交換クロマ
トグラフィーで分画することによって、BSHタンパク
質を完全に精製することができる。陽イオン交換クロマ
トグラフィーに用いるカラムとしては、Pharmacia 社製
のMonoS カラム、また、CM-Sepharoseカラム等を使用す
ることができる。本クロマトグラフィーはpH4.5 〜6の
間で実施することが好ましい。緩衝液のpHが6を超える
と本クロマトグラフィーによる精製効果を期待すること
ができず、また、緩衝液のpHを 4.5未満にすると酵素が
失活し酵素活性の消失を招くことになる。
トグラフィーでは、BSH活性画分はカラムに保持され
ずに素通りして溶出される。それに対して、夾雑タンパ
ク質の殆ど全てがカラムに保持され、したがって、BS
Hタンパク質を、ほぼ純粋なタンパク質として分離、精
製することができる。
は、2種類のイオン交換クロマトグラフィーによる分画
操作を組み合わせることによって、ビフィドバクテリウ
ム・ロンガム(Bifidobacterium longum) SBT-2933R (F
ERM P-8743) 、ビフィドバクテリウム・ロンガム(Bifid
obacterium longum) SBT-2928 (FERM P-10657) 等が産
生するBSHタンパク質を容易に分離、精製することが
できる。
るタンパク質がBSH活性を示すことを確認するため
に、次の2種類の試験を実施した。一つは、部分精製酵
素画分をBSH活性染色法に供する方法であり、もう一
つはN末端アミノ酸配列分析による方法である。その結
果、実施例で示すように、本発明で得られるタンパク質
がBSH活性を有するBSHタンパク質であることが明
らかとなった。
ィドバクテリウム・ロンガム(Bifidobacterium longu
m) SBT-2933R (FERM P-8743) 、ビフィドバクテリウム
・ロンガム(Bifidobacterium longum) SBT-2928 (FERM
P-10657) 等が産生するBSHタンパク質のN末端アミ
ノ酸配列を配列相同性分析に供した結果、本発明で明ら
かにしたビフィドバクテリウム・ロンガム(Bifidobacte
rium longum) SBT-2933R (FERM P-8743) 、ビフィドバ
クテリウム・ロンガム(Bifidobacterium longum) SBT-
2928 (FERM P-10657) 等が産生するBSHタンパク質の
N末端アミノ酸配列は、他の細菌が産生するBSHタン
パク質のN末端アミノ酸配列に対して29〜58%の相同性
を示すものの、この配列は、これまでにいずれの学術論
文、特許明細書等の文献、あるいは、EMBL、GenBank 、
また、Swiss-PlotといったDNA、タンパク質の配列情
報データベースにも登録されていない新規な配列であっ
た。
(Bifidobacterium longum) SBT-2928(FERM P-10657)及
びビフィドバクテリウム・ロンガム(Bifidobacterium
longum) SBT-2933R (FERM P-8743) が産生するBSHタ
ンパク質に関する実施例を示し、本発明をさらに詳しく
説明する。また、その他のBSHタンパク質産生能を有
するビフィドバクテリウム・ロンガム(Bifidobacterium
longum) 菌株についても、以下の実施例に従って処理
することにより、BSHタンパク質を同様に分離、精製
することができる。
測定した。第1の方法では、酵素試料と抱合胆汁酸とを
反応させた後、抱合胆汁酸から遊離したアミノ酸を、遊
離アミノ基に対する修飾試薬であるトリニトロベンゼン
スルホン酸(TNBS)を用いて比色定量することでB
SH活性を測定した。反応液は、0.18mlの0.1Mリン酸ナ
トリウム緩衝液(pH 7.0)、0.01mlの基質溶液(200mM抱合
胆汁酸混合溶液) 、及び0.01mlの酵素試料から構成され
ている。緩衝液と基質溶液とを混合した後、酵素試料を
添加することで反応を開始させ、37℃で10分間反応させ
た後、反応液の0.05mlをサンプリングし、ここに0.05ml
の15%(w/v)トリクロロ酢酸(TCA)溶液を加えて反
応を停止させた。反応液の残りの0.15mlは、さらに37℃
で反応を継続させ、30分間反応させた後、反応液の0.05
mlをサンプリングし、ここに0.05mlの15%TCA溶液を
加えて反応を停止させた。このようにして得られた2つ
の試料中の遊離アミノ酸量をTNBS法(Barret,D. and
Edwards,B.F., Methods Enzymol., vol.45, pp.354-37
3, 1976)で測定し、反応開始後10〜30分の20分間に抱合
胆汁酸から遊離したアミノ酸量を計算した。
った。0.60mlの試料溶液に対し、0.30mlの4%(w/v) 炭
酸水素ナトリウム溶液、及び0.40mlの 0.1%(w/v) TN
BS溶液を加えて反応を開始し、暗所中、50℃で20分間
インキュべートした。反応後、0.25mlの2%(w/v) SD
S溶液、及び0.25mlの1N塩酸溶液を加えて反応を停止さ
せた。反応停止後1時間以内に、反応液の340 nmにおけ
る吸光度を測定した。なお、標準物質として、10〜40n
moles のグリシンを使用した。
leのアミノ酸を遊離するのに必要な酵素活性量を1単位
(1 unit)と定義した。また、200mM 抱合胆汁酸混合溶液
はタウロコール酸ナトリウム(12.9mg/ml) 、タウロデオ
キシコール酸ナトリウム(8.4mg/ml)、タンロケノデオキ
シコール酸ナトリウム(12.5mg/ml) 、グリココール酸ナ
トリウム(22.4mg/ml)、グリコデオキシコール酸ナトリ
ウム (15.1mg/ml)、及びグリコケノデオキシコール酸ナ
トリウム(21.7mg/ml) から構成されている。TNBS法
では、DTTの存在下で酵素反応を行った試料中のアミ
ノ酸量を測定することができなかった(DTTがTNB
Sと反応し、バックグラウンドが上昇するため)。
る比色定量法(Lee,Y.P. and Takahashi,T., Anal. Bioc
hem., vol.14, pp.71-77, 1966) を用いることによっ
て、DTTを含む試料中のアミノ酸量を定量した。0.1
mlの試料に1.9 mlのニンヒドリン試薬を加えた試験管を
十分撹拌した後、沸騰水(100℃) 中で14分間反応させ
た。反応後、試験管を水道水中で3分間保持して反応液
を冷却した後、1時間以内に反応液の570 nmにおける吸
光度を測定した。標準試料には、10〜40n moles のグリ
シンを使用した。なお、試料がTCA及びDTTを含む
場合は、標準試料にも同量のTCA及びDTTを加え
た。
leのアミノ酸を遊離するのに必要な酵素活性量を1単位
(1 unit)と定義した。また、ニンヒドリン試薬(1.9ml)
は、0.5 mlの1%(w/v) ニンヒドリン溶液を含む0.5Mク
エン酸緩衝液(pH 5.5)、 1.2mlのグリセロール、及び
0.2mlの0.5Mクエン酸緩衝液(pH 5.5)から構成されてい
る。
ガム(Bifidobacteriumlongum) SBT2928(FERM P-10657)
の菌体を37℃で1夜、嫌気培養した。M-17培地には、
さらにアスコルビン酸(5g/リットル) とシステイン(0.3
g/リットル)を添加した。また、嫌気培養は、市販の酵
素吸着剤(AnaeroGen, OXOID社製) を用いて行った。1
夜培養後の培養液の濁度(600nm における吸光度) は2
から3の範囲であった。菌体を培養後、培養液を遠心分
離して菌体を回収した。回収した菌体を0.1Mリン酸ナト
リウム緩衝液(pH 7.0)で洗浄した後、再び遠心分離して
菌体を回収した。この洗浄操作を2回行った後、菌体を
0.1Mリン酸ナトリウム緩衝液(pH 7.0)に再懸濁し、菌体
懸濁液のA600 値を15に調整した。
菌体抽出液を調製した。菌体破砕条件は、装置(Model V
C375;Sonics and Materials Inc.)の出力が5、Duty c
ycleが50%、処理時間は3分とした。破砕後の菌体懸濁
液を25,000×g で10分間遠心分離し、上清を菌体抽出液
とした。この菌体抽出液は、使用前まで−20℃で保存し
た。
プとして、Mono Qカラム(0.5×5cm;Pharmacia社製)を
用いて陰イオン交換クロマトグラフィーを行った。緩衝
液には、0.1Mリン酸ナトリウム緩衝液(pH 7.0)を使用し
た。また、カラムに吸着したタンパク質の溶出には、上
記の緩衝液に1.0M塩化ナトリウムを加えた緩衝液を使用
した。流速は1.0ml/分とした。菌体抽出液をカラムに添
加した後、10mlの緩衝液でカラムを洗浄した。次に、溶
出用の緩衝液を用いて塩化ナトリウムの濃度勾配を形成
し、カラムに吸着したタンパク質を溶出した。BSH活
性画分は、約0.3M塩化ナトリウムを含む緩衝液によって
Mono Qカラムから溶出された。
たBSH活性画分を、次にMono Sカラム(0.5×5cm; Pha
rmacia社製) を用いた陽イオン交換クロマトグラフィー
に供した。緩衝液には、0.05M 酢酸ナトリウム緩衝液(p
H 5.0)を使用した。また、カラムに吸着したタンパク質
の溶出には、上記の緩衝液に1.0M塩化ナトリウムを加え
た緩衝液を用いた。流速は1.0ml/分とした。
H活性画分を9倍量の緩衝液(0.05M酢酸ナトリウム緩衝
液(pH 5.0)) で希釈した後、0.05M 酢酸溶液を用いて溶
液のpHを 5.0に調整してカラムに添加する試料とした。
試料をカラムに添加した後、10mlの緩衝液でカラムを洗
浄した。次に、溶出用の緩衝液を用いて塩化ナトリウム
の濃度勾配を作成し、カラムに吸着したタンパク質を溶
出した。この条件において、BSH活性画分はMono Sカ
ラムに吸着されずに素通りした。
得た菌体抽出液を2種類のイオン交換クロマトグラフィ
ーを用いて分画することにより、比較的容易にBSHタ
ンパク質を分離、精製することができた。それぞれ600
mlの培養液から精製を開始し、ビフィドバクテリウム・
ロンガム(Bifidobacterium longum) SBT-2928(FERMP-1
0657)の菌体の場合は 1.0mg及びビフィドバクテリウム
・ロンガム(Bifidobacterium longum) SBT-2933R (FER
M P-8743) の菌体の場合は 1.7mgの精製酵素を得た。活
性回収率はそれぞれ17%及び24%であり、最終精製酵素
標品の比活性はそれぞれ21U/mg及び63U/mgであった。
ンパク質であることの確認:SDS-PAGE活性染色法 対象試料に含まれるタンパク質をSDS-PAGE法で分離した
後、Coleman and Hudsonの方法 (Appl. Environ. Micro
biol., vol.61, pp.2514-2520, 1995)により、ゲル上で
BSHタンパク質のみを活性染色した。この方法は、SD
S-PAGEにより変性した酵素タンパク質をTriton X-100処
理により再構成し、その後、ゲルを抱合胆汁酸溶液を含
む酸性緩衝液中でインキュべートすることにより、BS
Hタンパク質バンド上に白色沈澱(脱抱合胆汁酸の沈
澱)を形成させる方法である。
のタンパク質をSDS-PAGE法で分離した後、ゲルを再構成
緩衝液中で室温、一夜インキュべートした。その後、ゲ
ルを基質溶液に移し、室温で1時間から数時間インキュ
べートした。再構成緩衝液の組成は0.1Mリン酸ナトリウ
ム緩衝液(pH 7.0)、1%(v/v) Triton X-100、及び10mM
DTTであり、また、基質溶液の組成は0.5M酢酸ナトリウ
ム緩衝液(pH 5.5)、10mM DTT、1mM EDTA、及び10mMグリ
コデオキシコール酸ナトリウムである。Mono Qクロマト
グラフィー後の部分精製画分をSDS-PAGEした後、活性染
色法に供した結果、精製されたタンパク質とSDS-PAGE上
の移動度が同一のタンパク質バンド上に白色沈澱が形成
された。この結果から、本発明で精製したタンパク質が
BSH活性を有することが確認された。
ンパク質であることの確認:N末端アミノ酸配列分析 精製したBSHタンパク質をSDS-PAGEで処理した後、Ma
tsudairaの方法 (J. Biol. Chem., vol.262, pp.10035-
10038, 1987)に従ってゲル内のBSHタンパク質をPVDF
膜に転写し、N末端アミノ酸配列分析用の試料とした。
転写の際にはTowbin緩衝液を使用し、150Vの定圧条件下
で1時間30分通電した。
BSHタンパク質バンドを切り出した。この試料を直
接、Applied Biosystem 社のProtein Sequencer Model
476Aで分析した。その結果、ビフィドバクテリウム・ロ
ンガム(Bifidobacterium longum)SBT-2928(FERM P-106
57) の菌体、及び Bifidobacterium longum SBT-2933R
(FERM P-8743) の菌体が産生するBSHタンパク質のN
末端アミノ酸配列を、以下のように決定した。両菌体に
由来するBSHタンパク質のN末端アミノ酸配列は同一
のものであった。 Xaa-Thr-Gly-Val-Arg-Phe-Xaa-Asp-Asp-Glu-Gly-Asn-Th
r-Tyr-Phe-Gly-Arg-Asn-Leu-Asp-Trp-Ser-Phe-Ser-Tyr-
Gly-Glu-Thr-Ile-Leu-Val-Thr-Pro-Arg-Gly-Tyr-His-
(Xaa は未同定のアミノ酸)(配列表配列番号2)。
に、GenBank 及びEMBLのDNAデータベース、及びSwis
s-Plotのタンパク質データベースに対してホモロジー検
索を実施した。その結果、ビフィドバクテリウム・ロン
ガム(Bifidobacterium longum)SBT-2928(FERM P-1065
7) の菌体、及びビフィドバクテリウム・ロンガム(Bifi
dobacterium longum)SBT-2933R(FERM P-8743) の菌体
由来のBSHタンパク質のN末端アミノ酸配列は、DN
Aデーターベースに登録されている Lactobacillusjohn
sonii のBSH遺伝子から推定されるN末端アミノ酸配
列(NCBI Accession No. AF054971)に対して62%の相同
性を示した。また、DNAデーターベースに登録されて
いる Lactobacillus acidophilus のBSH遺伝子から
推定されるN末端アミノ酸配列(NCBI Accession No. A
F091248)に対しても60%の相同性を示した。さらに、こ
れまでに報告されている Lactobacillus plantarum の
BSH遺伝子から推定されるN末端アミノ酸配列(NCBI
Accession No. S51638,(Christiaens, H., Leer, R.
J., Pouwels, P. H. and Verstraete, W. Appl. Enviro
n. Microbiol. 58, 3792-3798, 1992)) に対しては56%
の相同性を示し、また、 Clostridium perfringens の
BSH遺伝子から推定されるN末端アミノ酸配列(NCBI
Accession No. U20191)に対しては34%の相同性を示し
た。
ロジー検索の結果から、本発明のBSHタンパク質のN
末端アミノ酸配列が、これまでに報告されている他のB
SHタンパク質のN末端アミノ酸配列に相同性を示すこ
とが明らかとなった。よって、本発明のタンパク質がB
SHタンパク質であることが確認できた。
より、変性状態でのBSHタンパク質の分子量を測定し
た。これによると、ビフィドバクテリウム・ロンガム(B
ifidobacterium longum) SBT-2928 (FERM P-10657) の
菌体及びビフィドバクテリウム・ロンガム(Bifidobacte
rium longum) SBT-2933R (FERM P-8743) の菌体が産生
するBSHタンパク質の分子量は、共に37 kDa±2 kDa
と測定された。
バクテリウム・ロンガム(Bifidobacterium longum) SB
T-2928 (FERM P-10657) の菌体及びビフィドバクテリウ
ム・ロンガム(Bifidobacterium longum) SBT-2933R (F
ERM P-8743) の菌体が産生するBSHタンパク質の非変
性状態での分子量を測定した。ゲル濾過の条件は、カラ
ムにはSupelco 社製のSigma Chrom GFC-1300カラムを使
用して、移動相は0.15M 塩化ナトリウムを含む0.1Mリン
酸ナトリウム緩衝液(pH 7.0)とし、流速は0.5ml/分とし
た。分子量測定の標準物質には、Sigma 社製の分子量測
定キット(MW-1000) を使用した。その結果、ビフィドバ
クテリウム・ロンガム(Bifidobacteriumlongum) SBT-29
28 (FERM P-10657) の菌体及びビフィドバクテリウム・
ロンガム(Bifidobacterium longum) SBT-2933R (FERM
P-8743) の菌体が産生するBSHタンパク質の非変性状
態での分子量は、共に130 kDa ±10 kDaと測定された。
の主要6種類の抱合胆汁酸及びタウロウルソデオキシコ
ール酸とタウロヒオデオキシコール酸に対するビフィド
バクテリウム・ロンガム(Bifidobacterium longum) SB
T-2928 (FERM P-10657) の菌体及びビフィドバクテリウ
ム・ロンガム(Bifidobacterium longum) SBT-2933R (F
ERM P-8743) の菌体が産生するBSHタンパク質の基質
特異性を検討した。なお、BSH活性の測定は、 10mM
DTT存在下で、先に説明したニンヒドリンによる比色
測定法により行った。結果を表1に示す。
する活性値を 100とした場合の相対活性値で示した。
し、グリシン抱合型胆汁酸に対する活性値がタウリン抱
合型胆汁酸に対する活性値よりも約2倍高かった。ま
た、両者とも、ケノデオキシコール酸に対する活性値が
コール酸及びデオキシコール酸に対する活性値よりも高
かった。さらに、これらのBSHタンパク質はヒト腸内
からは検出されないタウロウルソデオキシコール酸及び
タウロヒオデオキシコール酸に対しても脱抱合活性を示
すことが明らかとなった。
ィドバクテリウム・ロンガム(Bifidobacterium longu
m) SBT-2928 (FERM P-10657) の菌体が産生するBSH
タンパク質のKm値を測定した。また、ヒト腸内にみられ
る3種類の抱合胆汁酸に対して、ビフィドバクテリウム
・ロンガム(Bifidobacterium longum) SBT-2933R (FER
M P-8743) の菌体が産生するBSHタンパク質のKm値を
測定した。Km値は、異なる基質濃度条件下における反応
初期速度を基に測定する際に通常用いられる方法によっ
て測定した。結果を表2に示す。
る親和性が、タウリン抱合型胆汁酸に対する親和性より
も高いことが明らかになった。また、ケノデオキシコー
ル酸に対する親和性がコール酸及びデオキシコール酸に
対する親和性よりも高いことが明らかになった。
テリウム・ロンガム(B ifidobacterium longum) SBT-29
28(FERM P-10657)の菌体が産生するBSHタンパク質に
対する種々の酵素阻害剤の影響を検討した。酵素活性の
測定は、一定濃度の酵素阻害剤を反応混合液に加えた以
外は、先に説明した方法で実施した。結果を表3に示
す。
阻害剤であるヨード酢酸、過ヨウ素酸、N−エチルマレ
イミド、塩化水銀、p-chloromercuribenzoic acid(pC
MBA) によって、酵素活性が60〜 100%の範囲で阻害
された。なお、塩化水銀による酵素活性の阻害は、 10m
M DTTの添加によって酵素活性が完全に回復した。金
属イオン類では、塩化銅、塩化カルシウムが酵素活性を
阻害した。また、硫酸マグネシウムが酵素活性を阻害し
たものの、塩化マグネシウムは酵素活性を阻害しなかっ
たことから、硫酸マグネシウムの阻害活性はマグネシウ
ムイオンに由来するものではなく、硫酸イオンに由来す
るものであることが考えられた。金属イオン依存性酵素
の阻害剤であるEDTA及びセリンプロテアーゼ阻害剤
のPMSFは、本酵素活性に対して弱い阻害活性を示し
た。
ngum) SBT-2928 (FERMP-10657) の菌体が産生するBS
Hタンパク質に対するSH試薬の影響を検討した。本試
験例では、SH試薬としてDTTを使用した。酵素活性
に対するDTTの影響は、酵素抽出時、及び酵素活性測
定時の2点に関して検討を実施した。10mMDTT存在
下、あるいは非存在下でBSH活性画分を超音波処理
(実施例1で説明した方法による)によって抽出した
後、10mMDTTの存在下、あるいは非存在下で、先に説
明した方法により酵素活性を測定した。結果を表4に示
す。
素活性測定時にDTTを添加することによって酵素活性
値が約8倍上昇した。一方、DTT存在下で酵素を抽出
した場合は、酵素活性測定時のDTT添加の有無に関わ
らず、一定(DTT非存在下で酵素を抽出し、DTT存
在下で酵素活性を測定した場合に得られる活性値の約2.
7倍)の酵素活性値を得た。これらの結果から、DTT
には超音波処理に起因する酵素の酸化を抑制する作用、
及び超音波処理時に酸化変性したBSHタンパク質を還
元することで酵素活性を再活性化する作用のあることが
明らかになった。なお、DTT以外のSH試薬として
は、メルカプトエタノールが同様な効果を示した。
ngum) SBT-2928 (FERMP-10657) の菌体が産生するBS
Hタンパク質に対する塩化ナトリウムの影響を検討し
た。BSH活性測定用の反応液に、最終濃度が50mM、10
0mM 、500mM となるように塩化ナトリウムを添加した
後、BSH活性を先に説明した方法で測定した。その結
果を表5に示す。
はBSH活性を約 1.5倍活性化した。
ngum) SBT-2928 (FERMP-10657) の菌体が産生するBS
Hタンパク質のBSH活性に対するpH及び温度の影響を
調べた。酵素活性は、先に説明した方法で測定した。そ
の結果、図1及び2に示すように、本発明のBSHタン
パク質のBSH活性の至適pHは6付近に存在し、BSH
活性はpH 4.5〜 7.6の範囲で安定であった。また、図3
及び4に示すように、本発明のBSHタンパク質のBS
H活性の至適温度は40℃付近に存在し、BSH活性は4
〜37℃の範囲で安定であった。なお、温度安定性はpH6
の条件で酵素溶液を30分間保存した後に残存する酵素活
性量を測定することで評価し、また、pH安定性は、各pH
条件に酵素溶液を30分間保存した後に残存する酵素活性
量を測定することで評価した。
取得と遺伝子配列分析 定法に従ってビフィドバクテリウム・ロンガム(Bifidob
acterium longum) SBT-2928 (FERM P-10657) の菌体の
染色体DNAを調製した後、制限酵素(Sau3A)を用いて
DNAを断片化し、平均DNA長が 3kbであるようなD
NAバンクを調製した。その後、定法に従ってDNA断
片を大腸菌に組み込み、ビフィドバクテリウム・ロンガ
ム(Bifidobacterium longum) SBT-2928 (FERMP-10657)
の菌体の染色体DNA断片が組み込まれた大腸菌を多
数取得した。
よるスクリーニング法(Appl.Environ, Microbiol.,vol.
58, pp.3792-3798,1992)で、BSHタンパク質をコード
しているDNA断片が組み込まれた大腸菌を選択した。
当該DNA断片が組み込まれた大腸菌は、この寒天培地
上で生育し、コロニーの周辺に脱抱合胆汁酸の結晶から
なるハローを形成するので、このハローの形成を指標と
してBSH遺伝子断片が組み込まれた大腸菌を選択し
た。選択された大腸菌に組み込まれたDNA断片を、さ
らに、定法に従って大腸菌から単離、増幅した後、遺伝
子配列分析を実施した。その結果、配列表配列番号1に
示した遺伝子配列、及び遺伝子配列から推測されるアミ
ノ酸配列を得た。
素(BSH)タンパク質が提供される。本発明のタンパ
ク質はBSH説の検証に好都合な酵素学的性質を有し、
化学試薬として、あるいはヒト血清コレステロール濃度
を調節する機能を有する飲食品や医薬等の素材として用
いられる。従来、ヒト胆汁中のグリシン抱合型胆汁酸に
対するタウリン抱合型胆汁酸の比は2:1であることが
知られている。従って、本発明のBSHタンパク質は、
その脱抱合性からみて、他の抱合胆汁酸脱抱合酵素(B
SH)、特にBB536 酵素よりもヒト胆汁を効率的に脱
抱合することができ、ヒトに投与する場合その投与量を
最小限にすることができる。
体において安定性が高い。酵素精製の過程において、B
B536 酵素は多量体が不安定であるので単量体に変換さ
れてしまうのに対し、本発明のBSHタンパク質は生理
条件下で存在すると考えられる4量体の構造を維持し、
精製の前後で酵素の性質に大きな差異はみられない。こ
のような酵素精製時及び酵素保存時における酵素タンパ
ク質の安定性が高いことは、酵素の製造上、及び実験上
の取り扱いを容易とするものであり、性質の安定した酵
素標品を製造し、種々の生命科学の実験に使用すること
ができる。
の酵素活性が塩化カルシウムで阻害されるので、食品添
加物として認められている物質を用いて酵素活性を抑制
できる。これに対し、BB536 酵素は、このような物質
で酵素活性を阻害することができない。本発明のBSH
タンパク質のこのような塩化カルシウムに対する感受性
は、この酵素タンパク質を食品等に利用する場合、その
用途、及び使用方法を拡大する上で有用である。
適pHを示す。
安定性を示す。
適温度示す。
度安定性を示す。
Claims (4)
- 【請求項1】 ビフィドバクテリウム・ロンガム(Bifid
obacterium longum) が産生する、抱合胆汁酸脱抱合酵
素(Bile salt hydrolase;BSH) 活性を有し、次の性
質を有するBSHタンパク質。 (1) 分子量:変性状態での分子量 (サブユニットの分子
量) が37,000±2,000 及び非変性状態での分子量 (生理
条件下での分子量) が130,000 ±10,000である。 (2) 基質特異性:グリシン抱合型胆汁酸に対する脱抱合
活性がタウリン抱合型胆汁酸に対する脱抱合活性よりも
約2倍高い。 (3) 活性剤:ジチオスレイトール(DTT)、メルカプ
トエタノール、塩化ナトリウム。 (4) 阻害剤:SH酵素の阻害剤、塩化銅、塩化カルシウ
ム、硫酸マグネシウム。 (5) 至適pH及びpH安定性:至適pHは6であり、酵素活性
はpH 4.5〜 7.6の範囲で安定である。 (6) 至適温度及び温度安定性:至適温度は40℃であり、
酵素活性は4〜37℃の範囲で安定である。 - 【請求項2】 配列表配列番号1に示したアミノ酸配列
で規定される請求項1に記載のBSHタンパク質。 - 【請求項3】 BSHタンパク質産生能を有するビフィ
ドバクテリウム・ロンガム(Bifidobacterium longum)
の菌体抽出液を陰イオン交換クロマトグラフィー、及び
陽イオン交換クロマトグラフィーで順次処理してBSH
タンパク質を分離、精製することを特徴とする請求項1
又は2に記載のBSHタンパク質の製造法。 - 【請求項4】 BSHタンパク質産生能を有するビフィ
ドバクテリウム・ロンガム(Bifidobacterium longum)
が、ビフィドバクテリウム・ロンガム(Bifidobacterium
longum) SBT-2933R(FERM P-8743)またはビフィドバク
テリウム・ロンガム(Bifidobacterium longum) SBT-29
28(FERM P-10657)である請求項3記載のBSHタンパク
質の製造法。
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