JP5592588B2 - Ｌ−システインを精製する方法 - Google Patents

Description

本発明は、Ｌ−システインを含有する発酵ブロスからＬ−システインを精製する方法に関する。

Ｌ−システインは、水への溶解度が高く、またＳＨ基の感度が多くの試薬（例えば、酸化剤）に対して高いことから、精製及び単離が非常に困難であり、高額な費用がかかるアミノ酸である。

ＵＳ２５９０２０９には、アミノ酸混合物を酸性、中性および塩基性のアミノ酸に分離するための一般的な方法が記載されており、この方法では、まず、酸性タンパク質加水分解物を陽イオン交換体に通し、次いで、塩基性アミノ酸を保持しつつ、酸性および中性のアミノ酸を水酸化ナトリウムを用いて溶出させる。その後に、カーボナート溶液を用い、これらを陽イオン交換体から流し出す。次いで、酸性アミノ酸のみが結合する下流の陰イオン交換体によって、酸性アミノ酸と中性アミノ酸を分離する。記載の方法は、溶出液として塩基を使用するが、システインは、特に高ｐＨ値で酸化されやすいため、システインの精製には適していない。

Ｌ−システインの精製に関する問題と、さらに単離に関する従来技術は、ＥＰ １９５８９３３ Ａ１に記載されている（ＵＳ ２００８−０１９０８５４に対応）。この出願には、５未満のｐＨ値でＬ−システインを酸化することができる酸化剤を含む、Ｌ−システインを含有する発酵ブロスを、５から９のｐＨでイオン交換体と接触させ、発酵ブロス中で、ｐＨが５未満、好ましくは２未満となる方法が記載されている。ここで、Ｌ−システインはイオン交換体に結合し、結合したＬ−システインをイオン交換体から溶出液によって除去する。その後、分別晶出によって溶出液からＬ−システイン一塩酸塩一水和物を得ることができる。まず、濃ＨＣｌを加えることによって、またはＨＣｌガスを導入することによって、無機アルカリ金属イオンおよびアルカリ土類金属イオンの塩化物、また、塩化アンモニウムを結晶化させる。濾過した後、Ｌ−システインを含有する母液を−１０℃まで冷却し、Ｌ−システイン塩酸塩一水和物を結晶化させる。しかし、収率および純度は、使用するＬ−システイン含有溶液の純度によって変わり、純度を９８重量％より高くするには、さらなる分別晶出および／または再結晶化が必要である。

Ｌ−システインを発酵によって調製する方法は、例えば、ＥＰ０８８５９６２Ｂ１（ＵＳ５９７２６６３Ａに対応）から既知である。これらの方法によって、大量のＬ−システインを含有する発酵ブロスを安価に入手することができる。

このようなＬ−システインを含有する発酵ブロスは、物質の複雑な混合物である。このブロスは、Ｌ−システインだけではなく、一般的に、発酵条件下で、特に、酸素が存在することによって酸化によってＬ−システインから簡単に生成するＬ−シスチンも含む。例えば、ＥＰ０８８５９６２Ｂ１に記載されるように、アルデヒドまたはケトン存在下、Ｌ−システインの対応するヘミチオケタールおよび／またはチアゾリジン誘導体も存在する場合がある。発酵ブロスは、少量のさらなるアミノ酸またはこの誘導体も含有する場合がある。発酵ブロスは、一般的に、炭水化物、有機および無機の陽イオンおよび陰イオンの塩、例えば、アルカリ金属およびアルカリ土類金属の塩も含み、さらに、痕跡量の重金属塩（例えば、Ｆｅ、Ｃｕ、Ｍｎ、Ｚｎなど）、着色剤およびさらなる不純物および添加剤、例えば、発酵中で用いられる微生物の望ましい代謝物を含む。さらに、発酵ブロスは、発酵に使用する原材料および構成物質、例えば、一般的なＣ源（例えば、グルコース、ラクトース、デンプンなど）、Ｎ源（例えば、アンモニア／アンモニウムまたはタンパク質またはタンパク質加水分解物など、さらにＳ源（例えば、硫化物、亜硫酸物、硫酸物、チオ硫酸物または亜ジチオン酸物など）も含んでいてもよい。Ｌ−システインは、硫黄を含有するアミノ酸であるため、Ｌ−システインの生成に必要な十分な量の硫黄を与えるために、発酵中にＳ源（例えば、硫化物、亜硫酸物、硫酸物、チオ硫酸物または亜ジチオン酸塩）が一般的に供給される。さらに、発酵中に導入される酸素の結果、発酵ブロス中に溶存酸素も存在する。これらの発酵ブロスのｐＨは、例えば、ＥＰ０８８５９６２Ｂ１に記載されるように、通常は７である。

発酵ブロスの組成が複雑ということ以外にも、ブロスが生物学的プロセスの産物であるため、個々の構成物質の比率が自然に変動することもさらに起こる。

米国特許第２５９０２０９号明細書 欧州特許出願公開第１９５８９３３号明細書 欧州特許第０８８５９６２号明細書

本発明の目的は、Ｌ−システインを含有する発酵ブロスから、精製したＬ−システイン含有溶液を製造する、単純で、安価で、産業的に実施可能な方法を提供することである。

この目的は、Ｌ−システインを含有する発酵ブロスを、６から９のｐＨで塩基性陰イオン交換体と接触させ、Ｌ−システインが陰イオン交換体に結合し、陰イオン交換体が第１の洗浄溶液で流され、結合したＬ−システインは、酸によって陰イオン交換体から除去され、溶出液に移され、この溶出液を４以下のｐＨで酸性陽イオン交換体と接触させ、Ｌ−システインが陽イオン交換体に結合し、陽イオン交換体が第２の洗浄溶液で流され、結合したＬ−システインが強酸によって陽イオン交換体から除去される方法によって達成される。

本発明の方法は、Ｌ−システインが、すべての並存する物質から信頼性高く実質的に完全に分離されるため、常に、発酵ブロスの組成変動にかかわらず、均一な溶液が得られる。次いで、必要な場合、この溶液から、Ｌ−システイン、Ｌ−システイン塩酸塩またはＬ−システイン塩酸塩一水和物を固体として得ることができる。この目的のために、得られた溶液を、好ましくは、望ましい生成物、好ましくはＬ−システイン塩酸塩一水和物が晶出するまで濃縮する。この様式で得られたＬ−システイン塩酸塩一水和物は、純度が９８重量％より高い。ＥＰ１９５８９３３Ａ１に記載される分別晶出は必要ではない。

Ｌ−システインを含有する発酵ブロスは、好ましくは、細胞および固体を分離した後に、まず、塩基性イオン交換体を用い、次いで酸性イオン交換体を用いて本発明の方法を用いて精製される。

酸性および塩基性のイオン交換体が知られており、市販されている。種々の適切な材料の選択がＵｌｌｍａｎｎ’ｓ Ｅｎｃｙｃｌｏｐｅｄｉａ ｏｆ Ｉｎｄｕｓｔｒｉａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、Ｖｏｌ．Ａ１４、ｐ．４５１に報告されている。活性なイオン交換基として、これらのイオン交換基は、例えば、カルボン酸基（弱酸性イオン交換体）、スルホン酸およびホスホン酸基（強酸性イオン交換体）、四級アンモニウム基（強塩基性イオン交換体）またはアミン基（弱塩基性イオン交換体）を含む。活性イオン交換基に対する対イオンとして、陽イオンまたは陰イオンをイオン交換体に結合してもよい。酸性イオン交換体は、よくプロトン化Ｈ^＋形態で用いられるが、さらに、一般的な対イオンは、例えば、アンモニウムイオン、アルカリ金属イオンおよび／またはアルカリ土類金属イオンである。塩基性、特に、強塩基性のイオン交換体は、よくＯＨ⁻形態で用いられるが、さらに、一般的な対イオンは、例えば、塩素および従来技術で記載されるさらなる陰イオンでもある。

強酸性および強塩基性のイオン交換体を用いることが好ましい。陰イオン交換体は、好ましくはＯＨ⁻形態で用いられ、一方、陽イオン交換体は、好ましくはＨ^＋形態で用いられる。しかし、原理的に、他の対イオンを含むイオン交換体を使用することも可能である。

Ｌ−システインを含有する発酵ブロスを、好ましくは、まず、強塩基性陰イオン交換体と接触させ、その後、陰イオン交換体からのＬ−システイン含有溶出液を強酸性陽イオン交換体と接触させる。これは、例えば、対応するイオン交換体が封入されたカラムを介して圧送される発酵ブロスまたは溶出液によって行われてもよい。適用される発酵ブロスのｐＨは、発酵中のｐＨに対応し、ｐＨ６から９、好ましくは６から８の範囲である。

陰イオン交換体からのＬ−システイン含有溶出液を、好ましくは、１から４のｐＨで陽イオン交換体に適用する。

第１の洗浄溶液は、好ましくは、ｐＨ６から８の範囲の水であり、特に好ましくは、ｐＨ７の水（中性水）である。この洗浄溶液を用いた洗浄によって、陰イオン交換体から、発酵ブロスの中性および陽イオン性の構成要素が除去される。

第２の洗浄溶液は、好ましくは、ｐＨ４から８の範囲の水であり、特に好ましくは、５から７のｐＨの水である。中性から弱酸性の水を用いた洗浄によって、陽イオン交換体から陰イオン性不純物が除去される。

本特許出願に報告されているすべてのｐＨ値は、２５℃で決定したｐＨに関するものである。

本発明に導かれる実験において、驚くべきことに、大気中の酸素または他の酸化剤を用い、Ｌ−システインは７より高いｐＨ値で簡単にＬ−シスチンに変換されるが、このＬ−システインが、塩基性イオン交換体に吸着し、適切な酸化を行うことなく再び塩基性イオン交換体から溶出することを発見した。このことは、酸性陽イオン交換体に結合したＬ−システインの溶出に塩基（例えば、アンモニア水溶液）を用いたときにＬ−システインからＬ−シスチンへの顕著な酸化が観察されるため、特に驚くべきことであった。この酸化によって、直接的で顕著な収率の低下（例えば、例３および６）が引き起こされ、従って、この方法の経済性は、もはや満足のいくものではない。

中性のＬ−システイン含有溶液または発酵ブロスを、陰イオン交換体、好ましくはＯＨ⁻形態の陰イオン交換体、に接触させると、Ｌ−システインは、この作業で実質的に定量的に陰イオン交換体に結合する。ここで、発酵ブロス中に存在し得る他のアミノ酸（例えば、Ｌ−シスチン）および／またはさらなる陰イオンも、イオン交換樹脂に結合してもよい。多くのさらなる不純物（例えば、中性化合物または陽イオンまたはこれらの対応する塩基）は、陰イオン交換樹脂に結合せず、流出物中に存在する。

酸を用いた溶出の後、Ｌ−システイン含有溶液を陽イオン交換体、好ましくはＨ^＋形態の強酸性陽イオン交換体と接触させると、Ｌ−システインが陽イオン交換体に定量的に結合する。陰イオン性不純物は、陽イオン交換樹脂に結合せずに存在し、流出物中に存在する。

溶出液として、強酸を用いることが好ましく、本発明の目的のために、好ましくは、ｐＫａが４．５未満の酸、特に好ましくは塩酸を用いることが好ましい。塩酸水溶液が特に有用である。

塩酸を用いる溶出において、塩酸水溶液、好ましくは、異なる規定度の塩酸、さらに好ましくは、０．０１から１２ＮのＨＣｌ、特に好ましくは、０．０１から１ＮのＨＣｌを、Ｌ−システインを保持する陰イオン交換体を通して圧送する。溶出中にＨＣｌ濃度が初期の０．０１Ｎから１Ｎまで上がるような溶出液が特にきわめて好ましい。

塩酸を用いる溶出において、異なる規定度の塩酸水溶液、好ましくは０．１から１２ＮのＨＣｌ、特に好ましくは、１から２ＮのＨＣｌを、Ｌ−システインを保持する陽イオン交換体を通して圧送する。

保持、洗浄方法および溶出は、好ましくは、２５℃、周囲雰囲気の圧力（即ち、９００から１１００ｈＰａ）で行われる。しかし、これより低いか、または高い温度および圧力で行うこともできる。

塩酸を用いたＬ−システインの溶出によって、Ｌ−システインの精製したＨＣｌ溶液を与える。この溶液は、場合により濃縮されてもよく、例えば、活性炭素を用いて脱色されてもよい。場合により、ＨＣｌを加えた後、産業的に特に重要な生成物であるＬ−システイン塩酸塩一水和物が結晶化する。二重のイオン交換体を用いた精製によって、もともと適用される発酵プロセスの組成にかかわらず、Ｌ−システインを高純度で得ることができる。さらなる精製（例えば、分別晶出による。）は必要ではない。

本発明の方法によって、Ｌ−システインを含有する発酵ブロスから出発して、良好な収率で、経済的にＬ−システインを効率よく精製することができる。必要な場合または所望な場合、Ｌ−システインの任意の誘導体、例えば、達成される収率を高めるために、存在し得るＬ−シスチンまたはチアゾリジン誘導体を、例えば、特定の方法条件下でＬ−システインに変換することができる。従って、例えば、強酸性陽イオン交換体の上にあるシステインチアゾリジン誘導体の開裂は既知であり、ＥＰ １０５９２８８ Ｂ１に記載されている。適切な還元剤を加え、Ｌ−シスチンを開裂させてＬ−システインを生成することも同様に想像できる。

記載される方法は、もともとの適用される発酵ブロスの組成にかかわらず、外来のアミノ酸含有量をＬ−システインを基準として５重量％未満、好ましくは１重量％未満に減らすことができる。さらに、Ｌ−システインを基準として１０重量％未満、好ましくは１重量％未満まで塩含有量を減らすことも可能である。それに加え、記載された方法は、例えば、分別晶出によってさらに精製することなく、Ｌ−システインを含有する発酵ブロスから、９８重量％を超える純度で、９９％を超える光学純度で、Ｌ−システインまたはＬ−システイン塩酸塩またはＬ−システイン塩酸塩一水和物の調製を可能にする。

本発明の方法を行う前に、微生物細胞および／または不溶性構成物質を、好ましくは方法の第１のステップでＬ−システインを含有する発酵ブロスから分離する。このことは、例えば、遠心分離、濾過、デカンテーション、膜濾過、または当業者にとって細胞／固体を発酵ブロスから分離するのに有名な別の方法によって行われる。分離は、場合により、セライト（登録商標）、活性炭または珪藻土のような濾過助剤を加えて行われる。方法のこのステップにおいて、細胞以外のさらなる不溶性の構成物質（例えば、溶液から析出したシスチンまたは他のやや溶けにくい構成物質の沈殿）が、微生物による発酵中に生成してもよく、有利なことに、これも発酵ブロスから分離される。さらに、タンパク質のような高分子は、例えば、場合により使用される濾過助剤または活性炭などから分離し、またはこれらに吸着し、このようにして、この方法のステップで分離されてもよい。本発明の目的のため、この前処理によって得られるＬ−システイン含有溶液も発酵ブロスという用語に含まれる。

以下の実施例は、本発明を説明するのに役立つ。

［実施例１］：本発明の方法による、Ｌ−システインを含有する発酵ブロスの精製
５００ｍｌの細胞を含まない発酵ブロス（２４ｇ／ｌのＬ−システイン、１．２ｇ／ｌのＬ−シスチン、１８ｇ／ｌのＮ−アセチルセリン）を、中性ｐＨ（ｐＨ：７）でＡｍｂｅｒｌｉｔｅ（登録商標）ＦＰＡ ４２Ｃｌの名称でＲｏｈｍ ＆ Ｈａａｓから市販される陰イオン交換樹脂（ＯＨ⁻形態）１５０ｍｌに適用した。次いで、この樹脂を２５０ｍｌの水（ｐＨ７）で洗浄し、１７５０ｍｌのＨＣｌを用いて溶出させた。ここで、酸濃度を２５０ｍｌごとに、０．０１Ｍ ＨＣｌから０．１Ｍ ＨＣｌ、さらに０．２５Ｍ ＨＣｌから０．５Ｍ ＨＣｌまで段階的に上げた。

溶出画分のシステイン含有量は、それぞれの場合にＨＰＬＣを用いて決定され、システインを含有する画分を合わせた。この合わせた溶液の中で、５００ｍｌをＡｍｂｅｒｌｉｔｅ（登録商標）ＦＰＡ １４−Ｎａの名称でＲｏｈｍ ＆ Ｈａａｓから市販される陽イオン交換樹脂（Ｈ^＋形態）１２０ｍｌに適用した。次いで、この樹脂を１２０ｍｌの水で洗浄し、７２０ｍｌの１Ｍ ＨＣｌを用いて溶出させた。

陰イオン交換体からの溶出液のうち、システインを含有する画分は、適用される発酵ブロス中に存在するＬ−システインのうち、８５％より多くを含んでおり、陽イオン交換樹脂からの溶出液の生成物画分中のＬ−システインの収率は、定量的であった。

［例２］：比較例：陽イオン交換体による、排他的なＬ−システインを含有する発酵ブロスの精製（ＥＰ １９５８９３３ Ａ１中の方法に対応）、溶出液：ＨＣｌ
６５００ｍｌのｐＨ７の細胞を含まない発酵ブロスを６Ｍ ＨＣｌを用いてｐＨ＝１まで酸性にし、１時間後に遠心分離処理をし、変性タンパク質および他の固体を分離した。５３５０ｍｌの透明なＨＣｌ含有溶液（１９ｇ／ｌのＬ−システイン、１．４ｇ／ｌのＬ−シスチン、８ｇ／ｌのＮ−アセチルセリン）を陽イオン交換体（１１００ｍｌのＡｍｂｅｒｌｉｔｅ（登録商標）ＦＰＣ １４−Ｎａ、Ｈ^＋形態）を用いて精製した。この溶液をイオン交換体に適用し、カラムを３３００ｍｌの水で洗浄し、５５００ｍｌの１Ｍ ＨＣｌを用いて溶出させた。溶出液のうち、システインを含有する画分は、使用されるシステインの量の８５％を含んでおり、さらに、溶液中に存在するカチオンも含んでいた。

［例３］：比較例：陽イオン交換体による、塩基性条件でのＬ−システインを含有する発酵ブロスの精製、溶出液：ＮＨ_４ＯＨ
１００ｍｌのｐＨ７の細胞を含まない発酵ブロスを６Ｍ ＨＣｌを用いてｐＨ＝１まで酸性にし、１時間後に遠心分離処理をし、変性タンパク質および他の固体を分離した。透明なＨＣｌ含有溶液（２０ｇ／ｌのＬ−システイン、１．２ｇ／ｌのＬ−シスチン、８ｇ／ｌのＮ−アセチルセリン）を陽イオン交換体（２０ｍｌのＡｍｂｅｒｌｉｔｅ（登録商標）ＦＰＣ １４−Ｎａ、Ｈ^＋形態）を用いて精製した。この溶液をイオン交換体に適用し、カラムを６０ｍｌの水で洗浄し、１００ｍｌの２Ｍ ＮＨ_３を用いて溶出させた。生成物の画分は、適用された発酵ブロス中に存在するＬ−システインの約５０％を含んでおり、さらに、初期の量と比較して、顕著に多い量のシスチンも含む。

［実施例４］：実施例１から得たＨＣｌ溶出液からＬ−システイン塩酸塩一水和物の結晶化
５００ｍｌの実施例１から得られたＬ−システインを含有する精製溶液（１Ｍ ＨＣｌを用いて得られた溶出液）をロータリーエバポレーターによって、結晶化が起こるまで４５℃、５０ｍｂａｒで蒸発させ、次いで、この溶液を室温までゆっくりと戻し、その後、温度を連続して−１８℃まで下げた。３時間攪拌した後、あらかじめ冷却しておいた吸引フィルターで沈殿を吸引しつつ濾別し、空気中で乾燥させた。

収量：６．５ｇの微細な結晶性固体、９８重量％超のシステイン塩酸塩一水和物（出発溶液＝細胞を含まない発酵ブロスを基準として、システインの合計収率７０％に対応する。）。

［例５］：比較例：例２から得たＨＣｌ溶出液からＬ−システイン塩酸塩一水和物の結晶化
５５００ｍｌの例２から得られたＬ−システインを含有する精製溶液（１Ｍ ＨＣｌを用いて得られた溶出液）をロータリーエバポレーターによって、結晶化が起こるまで４５℃、５０ｍｂａｒで蒸発させ、次いで、この溶液を室温までゆっくりと戻し、その後、温度を連続して−１８℃まで下げた。３時間攪拌した後、あらかじめ冷却しておいた吸引フィルターで沈殿を吸引しつつ濾別し、空気中で乾燥させた。

収量：１２０ｇの微細な結晶性固体、７９重量％のシステイン塩酸塩一水和物（出発溶液＝細胞を含まない発酵ブロスを基準として、システインの合計収率６４％に対応する。）。

［例６］：比較例：例３から得たＮＨ_３溶出液からＬ−システインの結晶化
１００ｍｌの例３から得られたＬ−システインを含有する精製溶液（２Ｍ ＮＨ_３を用いて得られた溶出液）をロータリーエバポレーターによって、結晶化が起こるまで４５℃、５０ｍｂａｒで蒸発させ、次いで、この溶液を室温までゆっくりと戻し、その後、温度を連続して−１８℃まで下げた。３時間攪拌した後、あらかじめ冷却しておいた吸引フィルターで沈殿を吸引しつつ濾別し、空気中で乾燥させた。

収量：得られた生成物の分析では、使用したＬ−システインの約９０％がこれらの条件でＬ−シスチンに変換されたことを示した。

Claims (8)

1. Ｌ−システインを含有する発酵ブロスから、精製したＬ−システイン含有溶液を調製する方法であって、前記Ｌ−システインを含有する発酵ブロスを、６から９のｐＨで塩基性陰イオン交換体と接触させ、前記Ｌ−システインを前記陰イオン交換体に結合し、前記陰イオン交換体が第１の洗浄溶液で流され、前記結合Ｌ−システインは、酸によって前記陰イオン交換体から除去され、溶出液に移され、前記溶出液を４以下のｐＨで酸性陽イオン交換体と接触させ、前記Ｌ−システインが前記陽イオン交換体に結合し、前記陽イオン交換体が第２の洗浄溶液で流され、前記結合Ｌ−システインが強酸によって前記陽イオン交換体から除去されることを特徴とする、方法。
2. 強酸性および強塩基性のイオン交換体を使用することを特徴とする、請求項１に記載の方法。
3. 陰イオン交換体をＯＨ⁻形態で使用し、陽イオン交換体をＨ^＋形態で使用することを特徴とする、請求項１または２に記載の方法。
4. 第１の洗浄溶液が、ｐＨ６から８の範囲の水であることを特徴とする、請求項１から３のいずれかに記載の方法。
5. 第２の洗浄溶液が、ｐＨ４から８の範囲の水であることを特徴とする、請求項１から４のいずれかに記載の方法。
6. 細胞および固体が、発酵ブロスから最初に分離されることを特徴とする、請求項１から５のいずれかに記載の方法。
7. 結合Ｌ−システインを陽イオン交換体から除去することにより得られた溶液をまず濃縮し、続いて、濃縮した溶液からＬ−システイン塩酸塩一水和物を結晶化させることを特徴とする、請求項１から６のいずれかに記載の方法。
8. 得られたＬ−システイン塩酸塩一水和物が、９８重量％より高い純度を有することを特徴とする、請求項７に記載の方法。