CN102590393A

CN102590393A - 同时测定多维氨基酸咀嚼片中多种成分含量的方法

Info

Publication number: CN102590393A
Application number: CN2012100702039A
Authority: CN
Inventors: 魏桂香; 田会彦; 张江艳; 王付平
Original assignee: HEBEI KEXING DRUG INDUSTRY Co Ltd
Current assignee: HEBEI KEXING PHARMACEUTICAL CO Ltd
Priority date: 2011-11-30
Filing date: 2012-03-16
Publication date: 2012-07-18
Anticipated expiration: 2032-03-16
Also published as: CN102590393B

Abstract

本发明公开了一种同时测定多维氨基酸咀嚼片中多种成分含量的方法，即利用HPLC法同时测定多维氨基酸咀嚼片中L-谷氨酰胺、盐酸半胱氨酸和VB₂含量，该方法的色谱条件为：（1）色谱柱岛津VP-ODS（250mm×4.6mm，5μm）；（2）流动相为混合比例为10：90的乙腈和离子对试剂的水溶液；（3）紫外检测器的检测波长为215nm；所用流动相的流速为1.2mL/min，进样体积为20μL，柱温为35℃。本发明的测定方法操作简单，提高了检测的灵敏度和准确度，并可以适用于有颜色干扰的样品。本发明适于多维氨基酸咀嚼片中L－谷氨酰胺、盐酸半胱氨酸和VB₂含量的测定。

Description

同时测定多维氨基酸咀嚼片中多种成分含量的方法

技术领域

本发明属于分析化学领域，涉及定量测定制剂中L－谷氨酰胺、盐酸半胱氨酸和维生素B₂含量的方法，具体地说是一种同时测定多维氨基酸咀嚼片中多种成分含量的方法。

背景技术

国内研究用HPLC法测定药品、保健品、食品等中维生素的含量的较多，但对多维氨基酸咀嚼片中氨基酸（L－谷氨酰胺，盐酸半胱氨酸）和维生素（VB₂）在同一个体系中，一起测定含量的液相方法研究较少。目前，国内文献没有这方面的报道。传统检测制剂中氨基酸的含量用专门的氨基酸柱和特制的试剂配制流动相，比较复杂，成本可观。

发明内容

本发明要解决的技术问题，针对多维氨基酸咀嚼片中L-谷氨酰胺、盐酸半胱氨酸和维生素B₂的含量测定，由于现在文献没有这方面的记载，国家也没有现成的标准可参考，因此制定并验证了此方法，该方法属于HPLC法，本方法具有简便、准确、重复性好、专属性强等特点。

本发明以常用的十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂的柱子，用离子对试剂做为流动相的一部分，就能在同一个系统中把氨基酸和维生素B₂同时检测出，方法简单，专属性强，精密度和重复性良好。

为解决上述技术问题，本发明所采用的技术方案是：

一种同时测定多维氨基酸咀嚼片中多种成分含量的方法，它是利用HPLC法同时测定多维氨基酸咀嚼片中L-谷氨酰胺、盐酸半胱氨酸和VB₂含量，该方法的色谱条件为：

（1）色谱柱岛津VP-ODS（250mm×4.6mm，5μm）；

（2）流动相为混合比例为10：90的乙腈和离子对试剂的水溶液；

（3）紫外检测器的检测波长为215nm。

作为本发明的一种限定，所述的离子对试剂的水溶液为庚烷磺酸钠的的水溶液或辛烷磺酸钠的水溶液。

作为上述限定的进一步限定，所述的离子对试剂的水溶液为辛烷磺酸钠的水溶液。

作为上述限定的再次限定，所述的辛烷磺酸钠的水溶液浓度为0.0865％。

作为上述限定的最后限定，所述的辛烷磺酸钠的水溶液用85％的磷酸调节pH值至2.5。

作为本发明的另一种限定，该方法的色谱条件为：所用流动相的流速为1.2mL/min，进样体积为20μL，柱温为35℃。

通过本方法测定多维氨基酸咀嚼片中L-谷氨酰胺、盐酸半胱氨酸和维生素B₂的含量，分析结果真实、准确。

由于采用了上述的技术方案，本发明与现有技术相比，所取得的技术进步在于：采用HPLC法检测多维氨基酸咀嚼片中L-谷氨酰胺、盐酸半胱氨酸和维生素B₂的含量，操作简单，提高了检测的灵敏度和准确度，并可以适用于有颜色干扰的样品。

本发明适于多维氨基酸咀嚼片中L-谷氨酰胺、盐酸半胱氨酸和维生素B₂的含量测定。

附图说明

图1为本发明实施例溶剂干扰性试验的HPLC图；

图2为本发明实施例空白辅料干扰性试验的HPLC图；

图3为本发明实施例对照品L-谷氨酰胺的HPLC图；

图4为本发明实施例对照品盐酸半胱氨酸的HPLC图；

图5为本发明实施例对照品维生素B₂的HPLC图；

图6为本发明实施例L-谷氨酰胺，盐酸半胱氨酸和维生素B₂对照品混合物的HPLC图；

图7为本发明实施例样品的HPLC图；

图8为本发明实施例对照品进样量为5μL线性测定的HPLC图；

图9为本发明实施例对照品进样量为10μL线性测定的HPLC图；

图10为本发明实施例对照品进样量为20μL线性测定的HPLC图；

图11为本发明实施例对照品进样量为30μL线性测定的HPLC图；

图12为本发明实施例对照品进样量为40μL线性测定的HPLC图；

图13为本发明实施例对照品进样量为50μL线性测定的HPLC图；

图14为本发明实施例耐用性考察所使用的型号为Agilent（250*4.6mm，5μm）色谱柱的HPLC图；

图15为本发明实施例耐用性考察所使用的型号为Diamonsil C₁₈(2)（150*4.6mm，5μm）色谱柱的HPLC图；

图16为本发明实施例耐用性考察所使用的型号为月旭Ｗelchorm C₁₈（250*4.6mm，5μm）色谱柱的HPLC图；

图 17-图22分别为本发明实施例对照品精密度试验测定的HPLC图；

图23为本发明实施例样品稳定性试验标准品0h测定的HPLC图；

图24为本发明实施例样品稳定性试验标准品4.5h测定的HPLC图；

图25为本发明实施例样品稳定性试验标准品6h测定的HPLC图；

图26为本发明实施例样品稳定性试验标准品7h测定的HPLC图；

图27为本发明实施例样品稳定性试验标准品8.5h测定的HPLC图；

图28为本发明实施例对照品稳定性试验标准品0h测定的HPLC图；

图29为本发明实施例对照品稳定性试验标准品4.5h测定的HPLC图；

图30为本发明实施例对照品稳定性试验标准品6h测定的HPLC图；

图31为本发明实施例对照品稳定性试验标准品7h测定的HPLC图；

图32为本发明实施例对照品稳定性试验标准品8.5h测定的HPLC图。

本发明下面将结合说明书附图和具体实施例作进一步详细说明。

具体实施方式

以下实施例只用于说明本发明，并不限定本发明。

实施例 一种同时测定多维氨基酸咀嚼片中多种成分含量的方法

本测量方法是利用HPLC法同时测定多维氨基酸咀嚼片中L-谷氨酰胺、盐酸半胱氨酸和VB₂含量。该方法的色谱条件为：

（1）色谱柱岛津VP-ODS（250mm×4.6mm，5μm）；

（2）流动相是混合比例（体积比）为10：90的乙腈和离子对试剂的水溶液；流动相的流速为1.2mL/min，进样体积为20μL，柱温为35℃。其中：

离子对试剂的水溶液为按照0.865g辛烷磺酸钠加1000mL二次去离子水的比例溶解制得的0.0865％的辛烷磺酸钠的水溶液（也可以用庚烷磺酸钠的水溶液替代），用85％的磷酸调节pH值至2.5。

（3）紫外检测器的检测波长为215nm。

一、本发明方法的建立过程：

1、仪器与试剂

仪器：岛津LC-2010A高效液相色谱仪（LC-2010型号检测器，LC-2010型号泵，LC-2010柱温箱，LC-2010自动进样器），LCsolution色谱工作站。

试剂：乙腈（色谱级）、水（二次去离子水）、辛烷磺酸钠（优级纯，离子对试剂）、本申请人生产提供的多维氨基酸咀嚼片（样品）、L-谷氨酰胺对照品（SIGMA公司，批号0001410840 含量99.5%）、盐酸半胱氨酸一水物对照品（日本东京任成工业株式会社，批号 V4XRL，含量以盐酸半胱氨酸计为91.0%）、VB₂对照品（中国药品生物制品检定所，批号100369-200502，含量98.7%）。

2、含量测定方法的建立

2.1、波长的选择

根据L－谷氨酰胺、盐酸半胱氨酸和VB₂紫外光吸收具有的特性，测定了它的水溶液在紫外光下的吸收图谱，在波长为215nm处三种物质均有良好的吸收，因此确定检测波长为215nm。

2.2、溶液的配制

维生素B₂对照品贮备溶液的配制：精密称取VB₂对照品15mg，置于100mL棕色容量瓶中，加入大约20mL的二次去离子水和0.5mL冰乙酸，100℃水浴溶解，放冷后用二次去离子水定容，摇匀，即得。

对照品溶液的配制：精密称取L-谷氨酰胺对照品50mg和盐酸半胱氨酸一水物对照品16.25mg，置于同一100mL的棕色容量瓶中，精密量取VB₂对照品贮备液20mL，置于上述棕色容量瓶中，用二次去离子水溶解并稀释置刻度，摇匀，即得对照品溶液M。

样品溶液的配制：取样品10片精密称定，研细，精密称取细粉1.25g（大约相当于50mgL-谷氨酰胺、15mg盐酸半胱氨酸和30mg的维生素B₂），置于100ml的棕色容量瓶中，加入二次去离子水60mL，100℃水浴溶解后，冷却至室温，用二次去离子水稀释至刻度，摇匀，即得样品溶液N。

2.3、溶剂、空白辅料的干扰性试验和L－谷氨酰胺、盐酸半胱氨酸和VB₂定性

为排除色谱图中有溶剂和空白辅料干扰L－谷氨酰胺、盐酸半胱氨酸和VB₂峰的出现，对单独的溶剂和空白辅料进行专属性试验和三种物质的定性以增加检测的准确性。

溶剂的影响 将二次去离子水滤过，取20μL照上述色谱条件进样，记录色谱图，如图1所示，溶剂色谱图中没有干扰峰出现，表明溶剂对测定没有影响。

空白样品影响 按照制剂配方规定的比例，除L－谷氨酰胺、盐酸半胱氨酸、维生素B₂外，其他组分和辅料称取一定量，混匀，研细，精密称取细粉1.25g，置于100mL的棕色容量瓶中，用二次去离子水溶解并稀释至刻度，摇匀，过滤；取续滤液20μL照上述色谱条件进样，记录色谱图，如图2所示，空白样品色谱图中没有干扰峰出现，表明空白样品对测定没有影响。

谷氨酰胺的定性 精密称取L-谷氨酰胺对照品25mg，置于50mL棕色容量瓶中，用二次去离子水溶解并稀释至刻度，摇匀。取20μL照上述色谱条件进样，记录色谱图，如图3所示。

盐酸半胱氨酸的定性 精密称取盐酸半胱氨酸一水物对照品16mg，置于100mL棕色容量瓶中，用二次去离子水溶解并稀释至刻度，摇匀。取20μL照上述色谱条件进样，记录色谱图，如图4所示。

维生素B ₂ 的定性 精密量取2.2项下的维生素B₂ 对照品贮备液20mL，置于100mL棕色容量瓶中，用二次去离子水稀释至刻度，摇匀。取20μL照上述色谱条件进样，记录色谱图，如图5所示。

取2.2项下的对照品溶液M 20μL，按照上述色谱条件进样，记录色谱图，如图6所示。

取2.2项下的样品溶液N 20μL，按照上述色谱条件进样，记录色谱图，如图7所示。

说明对照品溶液的色谱图中L-谷氨酰胺、盐酸半胱氨酸和维生素B₂与样品溶液的色谱图中L-谷氨酰胺、盐酸半胱氨酸和维生素B₂保留时间一致。

2.4、样品的测定

取三批批号为10072801、10080501、10072601的样品，依照方法2.2制备样品溶液，每批样品做两个平行样，按上述色谱条件精密量取20μL进样，按面积外标法计算L-谷氨酰胺、盐酸半胱氨酸和维生素B₂的含量，样品测定结果见表1。试验测定结果显示：L－谷氨酰胺，盐酸半胱氨酸和VB₂含量均在标示量的90.0%-110.0% 范围内，说明此检测方法可行。

2.5、方法的专属性

由于氨基酸和维生素本身的特性，对空气中的氧气、光和热比较敏感，在操作的过程中会发生降解，避免降解产物对色谱峰的干扰，现进行破坏性试验下的分离，验证该检测方法。

破坏性试验下的分离：取本含量测定所需的对照品5组，每组3个平行，分别置于酸性环境（0.1mol/L的盐酸溶液中）、碱性环境（0.1mol/L的氢氧化钠溶液中）、氧化环境（20%双氧水中）、热环境（60℃）和光环境（4000LμX）的条件下，破坏3h，取破坏后的样品各20μL，进样。

实验结果表明，本制剂在上述破坏性条件下均有降解产物生成，但是降解产物与主峰均能够达到较好的分离效果，且降解产物峰之间也可以有较好的分离效果。

2.6、线性关系及范围的考察

取不同进样量的对照品溶液M：5μL、10μL、20μL、30μL、40μLl和50μL，按照上述色谱条件注入液相色谱仪，记录色谱图，如图8-13所示，以对照品浓度C(mg/mL)为横坐标，峰面积A为纵坐标进行回归分别制得线性回归方程：

L-谷氨酰胺的线性回归方程为：A=55351.7C+2154.477(R=0.99999)，结果显示：在浓度范围为2.5mg/mL-24.9mg/mL内线关系性良好；

盐酸半胱氨酸的线性回归方程为：A=76723.5C+894.523(R=0.999998)，在浓度范围为0.9mg/mL-8.9mg/mL内线性良好；

维生素B₂的线性方程为：A=234270.1C-6799.252(R=0.999998)，在浓度范围为0.2mg/mL-1.7mg/mL内线性良好。线性测定结果见表2-1～2-3所示。

2.7、检测线及定量限的确定

将对照品溶液逐级稀释，进样，记录峰高，当峰高为基线噪声的10倍高时的浓度为定量限浓度为L-谷氨酰胺为4.1μg/mL、盐酸半胱氨酸为16.2μg/mL、维生素B₂ 为0.8μg/mL；2-3倍高时的浓度为检测限浓度为L-谷氨酰胺为2.5μg/mL、盐酸半胱氨酸为4.8μg/mL、维生素B₂ 为0.3μg/mL。

2.8、耐用性的考察

选用不同生产厂家和规格的色谱柱，对同一样品按上述试验条件进行测定，记录色谱图，如图14-16所示，具体测定结果如表3所示，以L-谷氨酰胺的理论塔板数计算，具有理论塔板数良好，分离度，拖尾因子均符合规定的特点，试验表明不同的色谱柱测定时，耐用性良好，能够达到要求。

2.9、精密度试验的考察

精密量取对照品溶液M 6份各20μL，按照上述色谱条件连续进样6次，并记录色谱图，如图17-22所示，计算该方法进样的精密度。测试结果如表4所示，结果显示测得的L-谷氨酰胺、盐酸半胱氨酸和维生素B₂峰面积的相对标准偏差RSD＜2%，表明本方法的进样精密度良好。

2.10、稳定性试验

分别取样品溶液N，和对照品溶液M在0h、4.5h、6h、7h、8.5h，5个时间点进样测定，进样量为20μL，每个时间点分别进样，记录色谱图，如图23-32所示，计算得出L-谷氨酰胺、盐酸半胱氨酸和维生素B₂的平均峰面积的相对标准偏差RSD﹤2%，说明样品和对照品溶液溶液在8.5h内稳定。实验结果分别如表5，表6所示。

2.11、重复性试验

精密称取同一批号的样品溶液5份，照上述色谱条件测定，进样量20μL，依法测定其含量：L-谷氨酰胺、盐酸半胱氨酸和维生素B₂的平均含量分别为97.4%，98.5%，98.8%，相对标准偏差RSD＜2%。说明本方法的重现性良好，结果如表7所示。

2.12、添加空白辅料的回收率的考察

样品溶液制备：精密称取空白辅料9份均为1.25g,分别置于100mL棕色容量瓶中，分为3组，每组3份，每组分别加入相当于各组分标示量的80%，100%，120%的对照品溶液；用二次去离子水稀释至刻度,制得加对照品的样品溶液，分别吸取上述溶液20uL按上述色谱条件进样。

取对照品溶液M　20μL按上述色谱条件进样。照上述方法，测定计算各标准品的含量，按下式计算回收率，结果如表8所示。实验表明：L-谷氨酰胺、盐酸半胱氨酸、维生素B₂平均回收率的相对标准偏差RSD＜2%。说明其加样回收率合格。

L-谷氨酰胺回收率（%）=

盐酸半胱氨酸回收率（%）=

维生素B₂回收率（%）=

注：表8中“i”表示L-谷氨酰胺；“ii”表示盐酸半胱氨酸；“iii”表示维生素B₂。

2.13、不添加空白辅料的回收率的考察

样品溶液的制备：将样品分为3组，每组3份，每组分别加入相当于各组分标示量的80%，100%，120%的对照品溶液，用二次去离子水溶解并定容，60℃下超声5min，过滤，降至室温备用。

取对照品溶液M，备用。按上述色谱条件精密取样品溶液和对照品溶液M各20μl进样，测得各组分含量，计算回收率，结果如表9所示，表明L-谷氨酰胺、盐酸半胱氨酸、维生素B₂平均回收率的相对标准偏差RSD＜2%，说明其加样回收率合格。

注：表9中“i”表示L-谷氨酰胺；“ii”表示盐酸半胱氨酸；“iii”表示维生素B₂。

二、实测

本实施例按照以下检测方法对4批多维氨基酸咀嚼片中L-谷氨酰胺，盐酸半胱氨酸和维生素B₂的含量进行了测定。

以流动相为乙睛：辛烷磺酸钠溶液=10：90进行洗脱，其中辛烷酸钠溶液是由0.865g辛烷磺酸钠加1000mL二次去离子水溶解后加85%磷酸调节pH值为2.5制得的。流速为1.2ml/min；色谱柱为岛津VP-ODS（4.6*250mm，5μm）；紫外检测波长为215nm；柱温35℃；进样量为20μL，理论塔板数按L-谷氨酰胺的峰计算应不小于15000，主峰与杂质峰的分离度符合要求，拖尾因子不大于2.0。

₂ 对照品贮备液 精密称取VB₂对照品15mg，置于100mL棕色容量瓶中，加入适量的二次去离子水和0.5mL冰乙酸，水浴加热溶解，放冷后用二次去离子水定容，摇匀，即得。

对照品溶液的配制 精密称取L-谷氨酰胺对照品50mg和半胱氨酸标准品16.25mg，置于100mL棕色的容量瓶中，精密量取VB₂标准贮备液20mL，置于同一容量瓶中，用二次去离子水溶解并稀释置刻度，摇匀，即得对照品溶液。

样品溶液的配制 取样品10片，精密称定，研细，精密称取细粉1.25g，置于100mL棕色的容量瓶中，加二次去离子水适量，水浴加热溶解，冷却至室温，用二次去离子水稀释至刻度，即得样品溶液。

在本发明的色谱条件下，取供试品溶液和对照品溶液各20μL，进样，记录色谱图，以外标法按峰面积计算各组分含量。检测结果见下表：

Claims

1.一种同时测定多维氨基酸咀嚼片中多种成分含量的方法，其特征在于：它是利用HPLC法同时测定多维氨基酸咀嚼片中L-谷氨酰胺、盐酸半胱氨酸和VB₂含量，该方法的色谱条件为：

（1）色谱柱岛津VP-ODS（250mm×4.6mm，5μm）；

（2）流动相是混合比例为10：90的乙腈和离子对试剂的水溶液；

（3）紫外检测器的检测波长为215nm。

2.根据权利要求1所述的同时测定多维氨基酸咀嚼片中多种成分含量的方法，其特征在于：所述的离子对试剂的水溶液为庚烷磺酸钠的水溶液或辛烷磺酸钠的水溶液。

3.根据权利要求2所述的同时测定多维氨基酸咀嚼片中多种成分含量的方法，其特征在于：所述的离子对试剂的水溶液为辛烷磺酸钠的水溶液。

4.根据权利要求3所述的同时测定多维氨基酸咀嚼片中多种成分含量的方法，其特征在于：所述的辛烷磺酸钠的水溶液浓度为0.0865％。

5.根据权利要求4所述的同时测定多维氨基酸咀嚼片中多种成分含量的方法，其特征在于：所述的辛烷磺酸钠的水溶液用85％的磷酸调节pH值至2.5。

6.根据权利要求1-5中任一项所述的同时测定多维氨基酸咀嚼片中多种成分含量的方法，其特征在于该方法的色谱条件为：所用流动相的流速为1.2mL/min，进样体积为20μL，柱温为35℃。