CN110423781A - 一种哺乳动物系统高效表达膜蛋白抗原的载体pAntigen - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种哺乳动物系统高效表达膜蛋白抗原的载体pAntigen，所述载体包含CMV启动子，转录终止子SV40 poly A晚期信号，转座子元件Tn7L和Tn7R，抗性标记物氨苄青霉素，RNA剪接(合成内含子)，土拨鼠肝炎病毒转录后调控元件WPRE和合成内含子。本申请通过构建表达载体pAntigen，在哺乳动物细胞中使用杆状病毒表达系统可以高效表达膜蛋白抗原，细胞的悬浮培养特性可大规模生产，产量达毫克级别；在哺乳动物细胞中经过有效的蛋白折叠、充分的翻译后修饰等可以获得具有正常活性和构象的膜蛋白抗原；整个膜蛋白抗原表达及纯化过程耗时短。

Description

一种哺乳动物系统高效表达膜蛋白抗原的载体pAntigen
技术领域
本发明涉及蛋白表达技术领域，具体地，涉及一种哺乳动物系统高效表达膜蛋白抗原的载体pAntigen及用该载体pAntigen高效表达膜蛋白抗原的方法。
背景技术
膜蛋白是市场上50％以上临床药物的靶点，膜蛋白的功能失常与心血管疾病、恶性肿瘤和精神类疾病等重大疾病密切相关，但目前膜蛋白的生物药极其稀少，高质量膜蛋白抗原生产是膜蛋白抗体研发的主要瓶颈。因此，膜蛋白的抗原生产研究一直是很有挑战性的。
由于膜蛋白抗原的表达对细胞来说可能是毒性或是在表达过程中易形成包涵体，导致膜蛋白抗原的产量不高，而反反复复的优化又相当耗费时间。因此，缺乏理想的膜蛋白抗原表达系统使得膜蛋白抗原的生产研究停滞不前。
杆状病毒表达系统被广泛认为是一个强大且通用的表达系统，具有外源基因表达水平高、易于表达异源多聚体蛋白、安全性等优势。在昆虫细胞中使用杆状病毒表达系统，其膜蛋白抗原表达虽然具有表达水平高(特别是细胞内蛋白)、有效的细胞折叠、广泛的翻译后修饰、糖基化与哺乳动物细胞类似等优点。但是，仍有许多哺乳动物膜蛋白抗原在昆虫细胞中难以表达，并且需要哺乳动物细胞表达系统。这可能是由于昆虫细胞不是哺乳动物蛋白质的天然宿主，因此不能将这些膜蛋白抗原加工成正确的功能构象，导致膜蛋白抗原产量低和/或非功能性膜蛋白抗原。
哺乳动物细胞表达系统是复杂糖基化蛋白的表达系统，能够为重组人源膜蛋白抗原提供最接近于天然状态的翻译后再加工修饰，在膜蛋白抗原表达过程中会形成接近天然蛋白的蛋白质折叠和聚合，具备活性膜蛋白抗原所必须的空间结构和修饰。通过在哺乳动物细胞中开发四环素诱导表达系统，克服了在稳定细胞系开发中用于表达某些蛋白质遇到的毒性问题，且哺乳动物细胞表达系统容许插入较大的外源DNA片段(可达38kb)。此外，哺乳细胞表达系统具有潜在的缺点，即在表达的蛋白中复杂的N-聚糖是极其异质。因此，需要寻找一种改进的哺乳动物细胞表达系统使复杂的N-聚糖的形成受到限制且是均一。
我们通过在杆状病毒DNA中构建哺乳动物的转录单位，当哺乳动物细胞被转导时识别这些转录单位，使得杆状病毒介导的基因转导在哺乳动物细胞中产生重组膜蛋白抗原。这一方法可以获得相当数量且具有正常生理活性的膜蛋白抗原。
发明内容
本申请人提供了一种哺乳动物系统高效表达膜蛋白抗原的载体pAntigen，通过在杆状病毒DNA中构建哺乳动物的转录单位，当哺乳动物细胞被转导时识别这些转录单位，使得杆状病毒介导的基因转导在哺乳动物细胞中产生重组膜蛋白抗原。这一方法可以获得相当数量且具有正常生理活性的膜蛋白抗原，解决了现有膜蛋白抗原表达方法产量低或产生非功能性膜蛋白抗原的技术问题。
本发明的技术方案如下：一种哺乳动物系统高效表达膜蛋白抗原的载体pAntigen，所述载体包含CMV启动子，转录终止子SV40 poly A晚期信号，转座子元件Tn7L和Tn7R，抗性标记物氨苄青霉素，RNA剪接(合成内含子)；土拨鼠肝炎病毒转录后调控元件WPRE和合成内含子；其中CMV启动子是在许多哺乳动物细胞系中活性最强的启动子之一，可指导多个基因的表达。SV40poly A晚期信号是强转录终止信号；CMV和SV40 poly A的组合确保重组cDNA被转录，同时转录终止受到了严格调节；土拨鼠肝炎病毒转录后调控元件(WPRE)增强了重组膜蛋白抗原的表达；总之，所述载体pAntigen中包含了在哺乳动物细胞中强有力的重组基因转录和mRNA加工所必需的几个元件。
用上述的载体pAntigen高效表达膜蛋白抗原的方法，包括如下步骤：将pAntigen表达载体与膜蛋白抗原基因连接，构建重组质粒，将构建好的质粒转化感受态细胞DH10Bac，抽提杆粒DNA；使用杆粒DNA转染Sf9细胞，收集含有P1病毒的上清液，继续感染sf9细胞，直至收集P4病毒；用P4病毒感染哺乳细胞HEK293 GnTI-细胞，表达膜蛋白抗原。
其中，HEK293 GnTI-是HEK293S衍生的细胞系，由于GnTI-基因的两个等位基因的失活，它缺乏处理在糖蛋白上N-连接的聚糖从高甘露糖到复杂成熟形式的能力。因此，该哺乳细胞表达系统得到的N-连接的高甘露糖聚糖是均质的。在蛋白结晶过程中，均质的高甘露糖聚糖可以获得高分辨率衍射质量糖蛋白晶体。
使用MOI为2或更低的病毒滴度对HEK293 GnTI-细胞进行转导，使用太高病毒滴度导致低细胞数。
在37℃温室和37℃，5％CO2湿润培养箱中维持的培养物的蛋白质表达水平相似。
带挡板的烧瓶可以最大限度地减少细胞聚集并促进HEK293 GnTI-细胞生长。
加入丁酸钠至终浓度为10mM并将温度调至30℃可提高HEK293 GnTI-细胞中膜蛋白抗原的表达。
当培养物保持在温暖的室温环境中时，蛋白质表达的开始存在轻微滞后。因此，收获细胞的时间选择在72小时孵育期结束时。
使用病毒转导和蛋白质表达的最佳细胞密度是1-2×106细胞/ml。当在较高细胞密度下进行转导时，蛋白质表达显着降低，这可能与细胞代谢的变化或培养基组成的变化，例如乳酸积累或葡萄糖浓度的变化有关。
本发明的有益效果为：本申请通过构建表达载体pAntigen，在哺乳动物细胞中使用杆状病毒表达系统可以高效表达膜蛋白抗原，细胞的悬浮培养特性可大规模生产，产量达毫克级别；在哺乳动物细胞中经过有效的蛋白折叠、充分的翻译后修饰等可以获得具有正常活性和构象的膜蛋白抗原；整个膜蛋白抗原表达及纯化过程耗时短。
附图说明：
图1为载体pCI质粒图谱。
图2为载体pVL1393质粒图谱。
图3为载体pAntigen质粒图谱。
图4为蛋白SDS-PAGE电泳分析图。泳道M为蛋白分子量Marker,条带分子量自上向下依次100KD，85KD，70KD，60KD，,50KD，40KD，30KD，25KD，20K，泳道1为目的抗原蛋白洗脱液。
具体实施方式
为了使本发明的发明目的，技术方案及技术效果更加清楚明白，下面结合具体实施方式对本发明做进一步的说明。应理解，此处所描述的具体实施例，仅用于解释本发明，并不用于限定本发明。
①表达载体的构建
选用载体pCI和载体pVL1393构建载体pAntigen。载体pCI和载体pVL1393的质粒图谱如图1和图2所示。用限制性内切酶Bgl II和BamH I酶切载体pCI，酶切产物用琼脂糖凝胶分离，纯化1kbDNA片段。用限制性内切酶Bgl II和BamH I酶切载体pVL1393，酶切产物用琼脂糖凝胶分离，纯化酶切载体pVL1393。将纯化的1kbDNA片段连接到酶切载体pVL1393上。连接产物转化DH5α感受态细胞，筛选出阳性克隆并标记为pAntigen 1。用Not I和BamH I消化pAntigen 1并与片段A连接。片段A是定制合成的双链DNA片段，编码5'-Not I-[StopCodon]-[WPRE]-[SV40 Late poly A]-BamH I-3'。将连接复合物转化到DH5α感受态细胞中，筛选出阳性克隆并将该最终载体标记为pAntigen，其质粒图谱如图3所示。
②病毒制备和扩增
将pAntigen表达载体与膜蛋白抗原基因连接，构建重组质粒，将构建好的质粒转化感受态细胞DH10Bac，抽提杆粒DNA。在27℃，60％湿度，无CO2的条件下，将Sf9细胞在SF-900 III培养基中悬浮培养，维持摇床转速为110转/分钟。当细胞密度为2×106细胞/ml～4×106细胞/ml时，进行细胞传代，使细胞密度在4～8×105细胞/ml之间，一般控制在6×105细胞/ml。
使用杆粒DNA转染Sf9细胞，在6孔板中以每孔9×105的细胞数种板，加入2ml SF-900 III培养基。在27℃孵育至细胞贴壁，约30分钟。在EP管中，将10μl Cellfectin II添加到100μl SF-900 III培养基中。在另一个EP管中，将1-5μg的杆粒DNA添加到100μlSF-900III培养基中。随后，将Cellfectin II/SF-900 II培养基混合物与杆粒DNA/SF-900 IIISFM混合物混合，并在室温下孵育30分钟，然后将Cellfectin II/DNA混合物滴加到Sf9细胞上，确保均匀分散。将细胞置于27℃培养箱中孵育72-96小时，培养过程中确保培养箱内有水以防止培养基强烈蒸发。收集含有P1病毒的上清液，每孔约2ml，在3000rpm，4℃的条件下，离心10分钟，并使用装有小0.2μm过滤器的3ml注射器将含有P1病毒的培养基过滤到2ml离心管中，P1病毒加上2％FBS在4℃避光保存长达一个月。
对于病毒扩增，在6孔板中以每孔9×105的细胞数种板，加入2ml SF-900 III培养基，待细胞贴壁后，约30分钟后，用10％P1病毒感染Sf9细胞。将细胞置于27℃培养箱中孵育72-96小时，收集含有P2病毒的上清液，离心，过滤，P2病毒加上2％FBS在4℃避光保存长达一个月。在不带挡板的平底烧瓶中培养sf9细胞，密度为1×106细胞/ml，24小时后，用1％P2病毒感染Sf9细胞。将细胞置于27℃培养箱中孵育72-96小时，收集含有P3病毒的上清液，离心，过滤，P3病毒加上2％FBS在4℃避光保存长达一个月。重复上述步骤，收集P4病毒。
③HEK293 GnTI-细胞的培养
在37℃、5％CO2加湿培养条件下，将HEK293 GnTI-细胞在含有2％FBS和1％抗生素的FreeStyle293培养基中悬浮培养，维持摇床转速为110转/分钟。当细胞密度达到2×106细胞/ml～4×106细胞/ml时，进行细胞传代，使细胞密度在4～8×105细胞/ml之间，一般控制在6×105细胞/ml。
将来自T-75烧瓶中HEK293 GnTI-细胞转移到带挡板的125ml方瓶中，放置在培养箱内的定轨振荡器中培养，盖子打开半圈，用胶带粘住。48～72小时后，将HEK293 GnTI-细胞进行传代，加入培养基稀释细胞密度至6×105细胞/ml。通常，在每次细胞稀释后，它们在恢复生长之前表现出约24小时的滞后时间并且每24小时开始加倍。为了放大，将来自四个125ml瓶的细胞转移到1L方瓶中，使体积达到300ml，并在相同的搅拌条件下，37℃温室中进一步培养细胞。当细胞密度达到2×106个细胞/ml时，将细胞进一步分成2L方瓶，每瓶500ml培养物，直至达到所需的培养体积。
④病毒转导
对于病毒转导和膜蛋白抗原表达，在带挡板的烧瓶中培养HEK293 GnTI-细胞，密度为1×106细胞/ml，24小时后，细胞密度达到2×106细胞/ml时，使用MOI＝1感染HEK293GnTI-细胞，病毒体积不超过10％。在37℃下，12-18小时后，加入丁酸钠至终浓度为10mM，在30℃培养箱内的轨道振荡器上孵育。
5、蛋白纯化
病毒转导72小时后，收集细胞，用含30mM HEPES,150mM NaCl,1mM DTT,pH 7.5,的缓冲液重悬浮，该缓冲液含有罗氏蛋白酶抑制剂EDTA-free。30min后，在含1.0％(w/v)n-十二烷基-β-d-麦芽吡喃糖苷(Affymetrix),0.1％(w/v)CHS(Sigma),30mM HEPES,150mMNaCl,1mM DTT,pH 7.5缓冲液中裂解细胞，该缓冲液含有罗氏蛋白酶抑制剂EDTA-free。100000g离心60min,分离上清液，随后用直链淀粉树脂在4℃孵化过夜；用20柱体积的洗涤缓冲液洗涤树脂，该洗涤缓冲液含30mMHEPES,150mM NaCl,0.1％(w/v)digitonin,0.01％(w/v)CHS,1mM DTT,pH7.5。蛋白用四柱体积的洗涤缓冲液洗脱，浓缩，纯化，得到目的膜蛋白抗原。用SDS-page检测其蛋白表达，如图4所示。
以上内容是结合具体的优选实施方式对本发明所作的进一步详细说明，不能认定本发明的具体实施只局限于这些说明。对于本发明所属技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，其架构形式能够灵活多变，可以派生系列产品。只是做出若干简单推演或替换，都应当视为属于本发明由所提交的权利要求书确定的专利保护范围。

Claims (8)

1.一种哺乳动物系统高效表达膜蛋白抗原的载体pAntigen，其特征在于，所述载体包含CMV启动子，转录终止子SV40 poly A晚期信号，转座子元件Tn7L和Tn7R，抗性标记物氨苄青霉素，RNA剪接(合成内含子)，土拨鼠肝炎病毒转录后调控元件WPRE和合成内含子。
2.用权利要求1所述的载体pAntigen高效表达膜蛋白抗原的方法，其特征在于，包括如下步骤：将pAntigen表达载体与膜蛋白抗原基因连接，构建重组质粒，将构建好的质粒转化感受态细胞DH10Bac，抽提杆粒DNA；使用杆粒DNA转染Sf9细胞，收集含有P1病毒的上清液，继续感染sf9细胞，直至收集P4病毒；用P4病毒感染哺乳细胞HEK293 GnTI-细胞，表达膜蛋白抗原。
3.用权利要求2所述的载体pAntigen高效表达膜蛋白抗原的方法，其特征在于，使用低MOI＝1-2的病毒滴度对HEK293 GnTI-细胞进行转导。
4.权利要求2所述的载体pAntigen高效表达膜蛋白抗原的方法，其特征在于，不带挡板的平底烧瓶培养sf9细胞，带挡板的烧瓶培养HEK293 GnTI-细胞。
5.权利要求2所述的载体pAntigen高效表达膜蛋白抗原的方法，其特征在于，在加入病毒12-18小时后，加入丁酸钠至终浓度为10mM。
6.权利要求2所述的载体pAntigen高效表达膜蛋白抗原的方法，其特征在于，在加入丁酸钠后，将温度调至30℃。
7.权利要求2所述的载体pAntigen高效表达膜蛋白抗原的方法，其特征在于，收获细胞的时间选择在加入病毒后72小时孵育期结束时。
8.权利要求2所述的载体pAntigen高效表达膜蛋白抗原的方法，其特征在于，含有P4病毒的上清液感染HEK293 GnTI-细胞使时的最佳细胞密度是1-2×106细胞/ml。
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Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2022170651A1 (zh) * 2021-02-09 2022-08-18 江南大学 以α-脂霉素作为检测、诊断高血压的标志物制备相应检测工具的应用

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN1696294A (zh) * 2004-05-11 2005-11-16 中国农业科学院生物技术研究所 一种新型高效昆虫杆状病毒生物反应器
CN101163792A (zh) * 2005-04-22 2008-04-16 英国龙沙生物医药股份有限公司 包含mCMV启动子和hCMV主要立即早期基因第一内含子的哺乳动物表达载体

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN1696294A (zh) * 2004-05-11 2005-11-16 中国农业科学院生物技术研究所 一种新型高效昆虫杆状病毒生物反应器
CN101163792A (zh) * 2005-04-22 2008-04-16 英国龙沙生物医药股份有限公司 包含mCMV启动子和hCMV主要立即早期基因第一内含子的哺乳动物表达载体

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
ABHIRAM DUKKIPATI等: "BacMam System for High-Level Expression of Recombinant Soluble and Membrane Glycoproteins for Structural Studies", 《PROTEIN EXPR PURIF.》 *

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2022170651A1 (zh) * 2021-02-09 2022-08-18 江南大学 以α-脂霉素作为检测、诊断高血压的标志物制备相应检测工具的应用

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