CN104136613A - 带有毒性基因的载体、方法及其用途 - Google Patents

Abstract

本公开内容描述核酸、包含此类核酸的病毒，用于在昆虫细胞内增殖毒性基因。这些核酸包含：编码毒性多肽的序列，和中断所述序列的内含子，从而使所述内含子在哺乳动物细胞内而不是昆虫细胞内被剪接。用所述核酸或病毒感染哺乳动物细胞而不是昆虫细胞能导致毒性水平的毒性多肽在哺乳动物细胞而不是昆虫细胞内表达。包含所述核酸的病毒如AAV或杆状病毒可在离体的昆虫细胞系内繁殖，并可施用于需要治疗的受试者，如需要癌症治疗的受试者。

Description

带有毒性基因的载体、方法及其用途

相关申请

本申请要求于2011年12月8日提交的美国临时专利申请第61/568,595号和于2012年3月31日提交的美国临时专利申请第61/618,689号的优先权。这些申请的全部内容通过引用的方式并入本文。

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背景技术

本公开内容属于病毒学领域，且更具体而言属于核酸载体领域，所述核酸载体能在昆虫细胞中增殖，并用于哺乳动物疾病如癌症的治疗。

毒性基因和由此类基因编码的蛋白已被用于或被提议用于涉及诱导细胞死亡的疾病治疗，比如，例如涉及导致细胞死亡的基因表达的癌症治疗。自杀基因治疗已成为有吸引力的癌症治疗策略(参见，例如Rodrguez,R.and Simons,J.W.Urology54:401-406,1999)。自杀基因治疗依赖于基因递送，所述基因的产物是毒性的，或者所述基因与前药施用结合产生毒性产物(Denning,C,et al.HumanGene Therapy8:1825-1835,1997)。自杀基因治疗在用于治疗人类免疫缺陷病毒(HIV)感染、用于控制移植物抗宿主病和用于癌症治疗中获得广泛研究。包含毒性基因如白喉毒素A片段(DT-A)、绿脓杆菌外毒素(PE)或核糖核酸酶的病毒载体的产生由于这些毒素的强毒性而难以实现。

由毒性基因编码的某些蛋白质能够在非常低的表达水平杀死宿主细胞。例如，单个分子的白喉毒素(DT-A)能杀死一个细胞(Yamaizumi,M.et al.(1978)Cell15:245-250)。据信，DT通过催化延伸因子2(EF2)的ADP核糖基化而阻碍(poison)蛋白质合成。DT主要通过凋亡介导的通路杀死，并且据信以细胞周期非依赖性的方式杀死细胞。这使得DT成为有吸引力的癌症疗法，因为一些恶性肿瘤如前列腺癌趋向于具有很低的细胞分裂指数。类似地，核糖核酸酶芽孢杆菌RNA酶(barnase)已被建议作为强有力的毒性剂用于靶向癌症细胞(Edelweiss,E.,et al.,PloS ONE3:e2434,2008)。

然而，能够用于递送毒性基因到靶细胞如癌细胞的病毒载体，如重组腺病毒、重组杆状病毒和腺相关病毒的产生，可受到毒性基因对宿主细胞的毒性的限制。因此，带有毒性基因的病毒载体不仅必须在对用于增殖所述载体的宿主细胞非致命性的条件下增殖，而且所述载体也必须能够对靶细胞如癌细胞产生毒性。

以前通过使用可诱导性和/或组织特异性启动子来限制毒性基因如DT-A毒性的尝试已经导致多变的结果。例如，Maxwell等人(Cancer Res.46:4660-4664,1986)使用截短形式的金属硫蛋白启动子证实了该启动子的基础表达，即使在缺乏重金属时，也能导致蛋白质合成的实质性抑制。通过加入免疫球蛋白增强子元件但仅最低限度地加入镉，可增强这种抑制。该作者不能证实真实的特异性细胞毒性，而仅能证实对DT-A介导的细胞死亡优先的细胞敏感性，推测是由于该高毒性基因的基础表达。该研究组还提出了DT-A的减毒突变体(Maxwell,F等人,(1987)Mol.Cell.Biol.7:1576-1579；Robinson,D.F.和Maxwell,I.H.(1995)Hum,Gene Ther,6:137-143)。该研究组和其他人的后续努力集中于提出DT-A的减毒突变体(Maxwell,F等人,(1987)Mol.Cell.Biol.7:1576-1579)或者集中于使用原核调控元件严密地调控基因表达(Robinson,D.F.和Maxwell,I.H.(1995)Hum,Gene Ther,6:137-143；Paulus,W.等人.(1997),J.Neurosurg.87:89-95)。在两种情况下，尽管能够证实优先的细胞杀伤，但是仍不能实现完全消除非特异性细胞杀伤。Keyvani等人使用基于四环素阻遏子(tet.repressor)的系统表达减毒的DT-A突变体，但是这些工作者推断(1)所述DT-A突变体的表达而不是毒性可通过四环素响应启动子被充分控制。

Rodriguez,R.等人的美国专利7,582,290公开了通过前列腺特异性启动子驱动的复制缺陷性腺病素(Ad)表达白喉毒素(DT-A)的A亚基，用于前列腺癌的自杀基因治疗。该专利描述了EF-2蛋白的位点705处的甘氨酸突变为精氨酸，其产生对由DT带来的蛋白合成抑制的抗性。该发明人在该专利中声称，复制缺陷性腺病毒在基因治疗中应用的主要问题是能复制腺病毒(RCA)的存在，它是由Ad载体中的序列与辅助(helper)细胞中的同源Ad序列之间重组产生的。这些发明人也公开了一种DT-抗性辅助细胞系，DPL，用于包装用于自杀基因治疗的表达DT的腺病毒，其中细胞不产生RCA。这些发明人还公开了他们从TSU细胞(一种前列腺癌细胞系)中，从跨越密码子705的EF-2基因中扩增到一个500bp的区域。利用定点突变，这些发明人将密码子705从“GGA”变成“AGA”，以编码精氨酸而不是甘氨酸。利用同源重组他们在PER.C6细胞(由二倍体人类胚胎成视网膜细胞(HER)衍生而来，描述于美国专利号5,994,128,6,265,212,6,033,908和6,306,652中)中在EF-2蛋白的位点705处用精氨酸代替甘氨酸，并产生了用于腺病毒载体包装的DT-抗性辅助细胞系。这些细胞包含在人类磷酸甘油酸酯激酶(PGK)启动子控制下的Ad血清型5(Ad5)E1-A和E1-B编码序列(Ad5核苷酸459-3510)。根据这些发明人，这些细胞与非重叠E1-删除腺病毒结合使用，消除病毒中RCA的存在。

Wang等人(Wang C-Y等人,Cancer Research66:5798-5806,2006)描述了一种适应于胶质原纤维酸性蛋白(GFAP)的转录调控序列的重组杆状病毒，以驱动胶质瘤细胞中DT-A基因的表达。由于在昆虫细胞中GFAP启动子是非活性的，它们能够产生携带DT-A毒性基因的重组杆状病毒。然而，相比于衍生自病毒的阳性对照序列，例如人类巨细胞病毒(CMV)即刻早期基因的增强子/启动子，细胞类型特异性启动子如GFAP启动子显示相对弱的转录活性并因此限制了其应用。

Kohlschutter等人,Toxin2:2754-2768,2010中描述了携带DT-A基因的AAV载体，其中使用TetR阻遏子系统降低DT-A的表达。尽管该作者在HEK293T细胞中产生出一些携带DT-A基因的AAV载体，然而他们的AAV产率比不携带DT-A基因的AAV载体如携带PUMA基因的载体(AAVTetO-PUMA)通常要低2至3logs。该作者将较低的滴度归结于DTA蛋白的残留表达。

Kotin等人的美国专利6,723,551描述了在昆虫细胞中产生腺相关病毒(AAV)的方法。这些发明人声称昆虫细胞中AAV基因所包含的内含子不正确地剪接。这些发明人通过使用被设计为缺乏内含子的AAV基因在昆虫细胞中产生AAV。然而，该专利既没有教导也没有暗示在昆虫细胞中增殖带有毒性基因的载体。

目前需要额外的组合物和方法，以产生用于治疗用途如用于杀死癌细胞的自杀基因治疗载体。

发明内容

鉴于有在昆虫细胞中增殖带有毒性基因的病毒载体的需要，本发明人开发出包含毒性基因的改性的杆状病毒和腺相关病毒载体，包含此类载体的昆虫细胞，制备此类载体和细胞的方法，以及使用此类载体的治疗方法。

本教导的核酸可以是用于在昆虫细胞中增殖毒性基因的核酸。在一些配置(configuration)中，核酸可包括、基本上由或由编码毒性多肽的序列和中断所述序列的内含子组成，从而包含所述内含子的RNA可通过哺乳动物细胞而不是通过昆虫细胞进行剪接，以在哺乳动物细胞中而不是昆虫细胞中形成可翻译的mRNA，经翻译产生细胞毒性水平的毒性多肽。在一些配置中，核酸可包括编码毒性多肽的序列，所述毒性多肽例如但不限于，白喉毒素(DT-A)、芽孢杆菌RNA酶、蓖麻毒素、红豆素、绿脓杆菌外毒素或促凋亡多肽。编码此类毒性多肽(和肽)的序列为本领域技术人员所熟知(参见，例如，Ellerby,H.M.等,NatureMedicine5:1032-1038,1999)并可从公共资源如，例如，美国国立生物技术信息中心网站获得。在一些配置中，所述核酸可编码毒性多肽如白喉毒素，例如DT-A。在一些配置中，所述核酸可编码毒性多肽如芽孢杆菌RNA酶。

在各种配置中，本教导的内含子可以是在昆虫细胞中不能正确地剪接而通过哺乳动物细胞正确地剪接的任何内含子，如，例如但不限于，来源于人类生长激素基因的内含子或来源于SV40大T抗原基因的内含子。

在各种配置中，本教导的核酸可进一步包括与编码毒性多肽的序列可操作地连接的表达控制序列。表达控制序列可以是，例如，启动子、IRES、增强子和/或它们的组合。

以非限制性说明的方式，图1示出了毒性基因如包含内含子并且与启动子如CMV启动子可操作地连接的DT-A基因的遗传和转录图谱。通过将包含本教导内含子的DT-A基因引入哺乳动物细胞，可转录所述基因，并在哺乳动物细胞通过内含子剪接形成成熟的DT-A mRNA。所述成熟的RNA翻译成功能性DT-A蛋白，用于杀死细胞。基于DT-A编码序列(Genbank登录号X00703)的遗传图谱上面的数字指示所述内含子插入的核苷酸位点。CMVpr＝巨细胞病毒启动子；DT-A＝白喉毒素A核酸序列；pA＝多腺苷酸化信号。

在一些实施方案中，本教导包括包含如前描述的核酸的病毒载体。在各种配置中，病毒载体可以是，例如，杆状病毒、反转录病毒、腺病毒、腺相关病毒(AAV)或它们的组合，比如例如包含AAV序列(比如例如在美国专利申请公布20090203071中描述的)但是被改性为也包括编码毒性基因的序列(其中所述编码序列由内含子中断)的杆状病毒。

在一些实施方案中，本教导包括包含如前描述的核酸的离体的昆虫细胞，或包含如前描述的核酸的病毒基因组。

在各种配置中，昆虫细胞可以是但不限于，本领域技术人员已知的已建立的昆虫细胞系的细胞，如但不限于，粉纹夜蛾(Trichoplusia ni)BT1-Tn-5B1-4细胞、草地贪夜蛾(Spodoptera frugiperda)Sf9细胞或草地贪夜蛾Sf21细胞。

在一些实施方案中，本教导包括包含如前描述的诸多细胞的细胞培养物；和培养基。在各种配置中，此类细胞系可积聚病毒如，例如AAV，其中未浓缩的细胞培养基能以高于109个AAV基因组/mL、高于1010个AAV基因组/mL、高于1011个AAV基因组/mL或高于1012个AAV基因组/mL的滴度包含所述病毒。例如，在各种配置中，用本教导的杆状病毒感染昆虫细胞培养物后，3天内，1升未浓缩的培养的细胞培养基可包括至少1013个、至少1014个或至少1015个AAV病毒颗粒。

在各种配置中，本教导的细胞系或细胞培养物可积聚杆状病毒，其中转染后4天内，未浓缩的细胞培养基能以高于109pfu/L、高于1010pfu/L、高于1011pfu/L或高于1012pfu/L的滴度包含所述病毒。

在一些实施方案中，本教导包括在体外增殖包含毒性基因的载体的方法。在各种配置中，这些方法包括：提供包含昆虫细胞的细胞培养物；用本教导的核酸或病毒感染或转染所述细胞；以及在适于病毒产生的条件下孵育所述细胞。

在一些实施方案中，本教导包括治疗癌症的方法。在各种配置中，这些方法包括对需要治疗的受试者施用本教导的核酸或病毒。在一些配置中，所述病毒可以是杆状病毒或腺相关病毒。经受使用本教导的核酸或病毒的治疗的癌症可以是任何癌症，如但不限于，前列腺癌、乳腺癌、脑瘤、宫颈癌或鼻咽癌。在本教导的各种实施方案中，本教导的病毒，如本教导的AAV或本教导的杆状病毒，可以是能感染哺乳动物细胞但不能在哺乳动物细胞内复制的病毒。

在各种实施方案中，本教导包括使用如前描述的核酸或病毒治疗疾病，如癌症。

在各种实施方案中，本教导包括本文描述的核酸或病毒用于治疗癌症。在各种实施方案中，本教导包括本文描述的核酸或病毒用于制造用于治疗癌症的药物。

在各种实施方案中，本教导包括包含毒性基因(如但不限于DT-A基因或芽孢杆菌RNA酶基因)的重组杆状病毒或核酸，所述毒性基因进一步包括内含子，以致哺乳动物细胞而不是在昆虫细胞内能表达可被宿主细胞翻译产生对宿主细胞致命的多肽的成熟的mRNA。在一些配置中，如在图1中展示的，可通过哺乳动物细胞而不是通过昆虫细胞，从毒性基因的转录本中剪接中断所述毒性基因编码序列的内含子。当将包含内含子的毒性基因引入哺乳动物细胞(如体外或体内的人体细胞)时，所述细胞能产生毒性基因的成熟mRNA。所述成熟mRNA可由哺乳动物细胞翻译成功能性DT-A蛋白(或其它毒性蛋白)以杀死细胞。

在一些实施方案中，本教导包括在昆虫细胞中产生携带包含内含子的毒性基因的重组杆状病毒的方法。在这些实施方案中，重组杆状病毒可根据本领域技术人员熟知的技术产生。此类方法可包括但不限于，例如，用载体比如被改性为包含有内含子插入的毒性基因的杆粒(bacmid)将杆状病毒DNA转染进入离体的昆虫细胞，如Sf9细胞。

本教导的一些实施方案包括携带有毒性基因的AAV载体，所述毒性基因如包含内含子的DT-A基因或包含内含子的芽孢杆菌RNA酶基因。可在昆虫细胞中生产包含带有内含子的毒性基因的AAV载体。当引入宿主哺乳动物细胞时，本教导的由AAV载体包含的毒性基因可在哺乳动物细胞内转录和剪接以形成成熟的毒性基因mRNA(如DT-A mRNA或芽孢杆菌RNA酶mRNA)。成熟的毒性基因mRNA可由宿主哺乳动物细胞翻译产生毒性蛋白(如DT-A或芽孢杆菌RNA酶)，从而致残或杀死宿主哺乳动物细胞。

本教导的一些实施方案包括在昆虫细胞中生产携带有毒性基因如，例如，DA-A基因或芽孢杆菌RNA酶基因的AAV载体的方法。在这些方法中，第一载体与第二载体可与宿主昆虫细胞接触，以共感染宿主细胞，其中第一载体包含杆状病毒和AAV序列，例如，Bac-Rep-Cap(或Bac-inCap-inRep)，并且第二载体包含杆状病毒和ITR序列及被内含子中断的毒性基因(如，例如，DT-A或芽孢杆菌RNA酶)。被感染的细胞能产生包含被内含子中断的毒性基因的AAV。感染昆虫细胞如Sf9细胞的培养物后3天内，体外生长的此类感染的细胞能够在未浓缩的培养基中产生至少109个病毒基因组/mL、至少1010个病毒基因组/mL、至少1011个病毒基因组/mL或至少1012个病毒基因组/mL的包含毒性基因的重组AAV的滴度。

本教导的一些实施方案包括在昆虫细胞中产生携带有毒性基因的AAV载体的其它方法。在这些方法中，可提供包含稳定整合的包含内含子的转基因(比如包含位于毒性基因(比如DT-A或芽孢杆菌RNA酶)两侧的AAV ITR的转基因)的昆虫细胞。参见，例如，图5，这些实施方案的细胞可用Bac-Rep-Cap感染。用Bac-Rep-Cap感染后，所述细胞可产生包含包含内含子的毒性基因(如DT-A)的AAV载体。在各种配置中，在体外生长的感染细胞群可在未浓缩的培养基中产生至少109个病毒基因组/mL、至少1010个病毒基因组/mL、至少1011个病毒基因组/mL或至少1012个病毒基因组/mL的重组AAV的滴度。在一些配置中，可在感染后大约3天内获得如此高的滴度。

在一些实施方案中，本教导包括使用带有稳定整合的携带inDTA或inBarnase的AAV基因组的昆虫细胞(如，例如，Sf9细胞)产生携带有毒性基因的AAV载体。在各种配置中，此类细胞可用携带有Rep和Cap基因的重组杆状病毒感染3天。可收获并处理细胞团以纯化所述AAV载体。

相应地，在一些实施方案中，本教导包括包含编码毒性多肽的序列和中断所述序列的内含子的核酸，从而所述内含子在哺乳动物细胞而不是昆虫细胞中被剪接以形成在哺乳动物细胞而不是昆虫细胞中被翻译以形成细胞毒性水平的毒性多肽的mRNA。在一些配置中，由毒素基因编码的毒素多肽可以是但不限于白喉毒素(DT-A)、芽孢杆菌RNA酶、蓖麻毒素、红豆素或绿脓杆菌外毒素。在一些优选的配置中，所述毒素可以是分别由白喉毒素(DT-A)基因或芽孢杆菌RNA酶基因编码，但是被内含子如但不限于人类生长激素内含子或SV40大T抗原内含子中断的白喉毒素(DT-A)或芽孢杆菌RNA酶。在各种配置中，本教导的核酸可进一步包括与所述序列可操作地连接的至少一个表达元件。此类表达元件可包括启动子、IRES、增强子及它们的组合中的一种或多种。在一些配置中，由本教导的核酸所包含的表达元件可包括CMV启动子、AFP启动子、AFP增强子、SURV启动子、CXCR4启动子、TERT启动子、COX2启动子和CCKAR启动子中的一种或多种。在一些配置中，由本教导的核酸所包含的表达元件可包括hAFP启动子、hAFP增强子、hSURV启动子、hCXCR4启动子、hTERT启动子、hCOX2启动子和hCCKAR启动子中的一种或多种。在一些配置中，表达控制元件可以是能在肿瘤细胞中指导表达的启动子，如hSURV启动子或CXCR4启动子。在一些优选的配置中，表达元件可以是hSURV或CXCR4启动子。

在一些实施方案中，中断毒性基因序列的内含子可以是由哺乳动物细胞而不是昆虫细胞剪接的任何内含子。在各种配置中，所述内含子可以是人工内含子，人类生长激素内含子或SV40大T抗原内含子。

在各种实施方案中，本教导的核酸或病毒载体可包含至少一个ITR。

在一些实施方案中，本教导的核酸或病毒载体按5’到3’端的顺序可包含，第一ITR，启动子，毒性基因的第一部分，内含子，毒性基因的第二部分，多腺苷酸化信号，和第二ITR。在各种配置中，第一ITR可以是AAV ITR，并且第二ITR可以是AAV ITR。

本教导的一些实施方案包括包含本文所描述的核酸的病毒载体。在一些配置中，病毒载体可以是但不限于，杆状病毒、反转录病毒、腺病毒、腺相关(AAV)病毒或它们的组合，并且尤其地所述载体可以是杆状病毒、腺相关(AAV)病毒或它们的组合。包含本教导的核酸的AAV的非限制性实例包括AAV2和AAV9，优选AAV2。

本教导的一些实施方案包括包含本文描述的核酸的离体的昆虫细胞。本教导的各种实施方案包括体外的单独的昆虫细胞、昆虫细胞系、昆虫细胞培养物和离体的昆虫细胞群。在各种配置中，本教导的昆虫细胞可以包括但不限于，粉纹夜蛾BT1-Tn-5B1-4细胞、草地贪夜蛾Sf9细胞或草地贪夜蛾Sf21细胞；所述昆虫细胞群或细胞培养物可包括但不限于，粉纹夜蛾BT1-Tn-5B1-4细胞、草地贪夜蛾Sf9细胞、草地贪夜蛾Sf21细胞以及它们的任意组合。在各种配置中，昆虫细胞可包含被病毒基因组所包含的核酸。在一些实施方案中，本教导的昆虫细胞可包含包含本教导的核酸的病毒。在各种配置中，这些实施方案的病毒可以是AAV、杆状病毒或它们的组合。在一些实施方案中，本教导的昆虫细胞可以用本教导的核酸稳定地转化。

本教导的实施方案包括细胞培养物如昆虫细胞培养物。在各种配置中，细胞培养物可包括包含本教导的核酸的细胞，和细胞培养基。在各种配置中，细胞培养物可包含高于109个病毒基因组/mL(未浓缩细胞培养基)，高于1010个病毒基因组/mL(未浓缩细胞培养基)，高于1011个病毒基因组/mL(未浓缩细胞培养基)，高于1012个病毒基因组/mL(未浓缩细胞培养基)。在各种实施方案中，本教导的细胞系、细胞培养物或细胞群可包括包含本教导的核酸的杆状病毒。在各种配置中，细胞系、细胞培养物或细胞群可包含高于106PFU/mL(在未浓缩培养基中)、高于107PFU/mL(在未浓缩培养基中)、高于108PFU/mL(在未浓缩培养基中)或高于109PFU/mL(在未浓缩培养基中)的杆状病毒。

本教导的一些实施方案包括在体外增殖包含毒性基因的载体的方法。在各种配置中，这些方法包括提供包含昆虫细胞的细胞培养物；用本教导的核酸感染或转染所述细胞，其中所述核酸包含编码毒性多肽的序列和中断所述序列的内含子；以及在适于病毒产生的条件下孵育所述细胞。在各种配置中，核酸可由病毒，如杆状病毒、AAV或它们的组合所包含。相应地，在各种配置中，这些方法包括：提供包含昆虫细胞的细胞培养物；以及用病毒载体如包含本教导的核酸的AAV，和用第二载体如Bac-inCap-inRep感染所述细胞。所述感染可发生最少大约1天以上，最少2天，最少3天，大约3天，最少4天，最少5天，高达大约5天，至少6天，高达大约6天，7天，或高达大约7天。在各种配置中，这些方法可进一步包括裂解所述细胞以形成包含AAV的裂解物。由于裂解物也可包括细胞碎片，所述方法可进一步包括用核酸酶(benzonase)消化所述细胞碎片。在各种配置中，包含这些方法的核酸的AAV可以是任意AAV，如AAV2或AAV9。在一些配置中，所述昆虫细胞可以是粉纹夜蛾BT1-Tn-5B1-4细胞、草地贪夜蛾Sf9细胞或草地贪夜蛾Sf21细胞。在一些优选配置中，这些方法中的昆虫细胞可以是草地贪夜蛾Sf9细胞。

本教导的一些实施方案包括治疗疾病或医学病况如HIV感染、移植物抗宿主病或癌症的方法。在各种配置中，这些方法可包括向需要治疗的受试者施用治疗有效量的本教导的核酸。在各种配置中，所述核酸可由病毒如AAV包含，这样所述方法包括向需要治疗的受试者施用治疗有效量的病毒，如包含本教导的核酸的AAV。在一些优选实施方案中，AAV可以是AAV2或AAV9，更优选AAV2。在各种配置中，可由所述公开的方法治疗的癌症包括但不限于，前列腺癌、乳腺癌、脑瘤、宫颈癌或鼻咽癌。

本教导的一些实施方案包括使用本教导的核酸或病毒治疗HIV感染、移植物抗宿主病或癌症。

本教导的一些实施方案包括本教导的核酸或病毒用于治疗HIV感染、移植物抗宿主病或癌症。

本教导的一些实施方案包括本教导的核酸或病毒用于治疗HIV感染、移植物抗宿主病或癌症。

附图说明

图1说明了包含内含子和与启动子如CMV启动子可操作地连接的毒性基因如DT-A基因的遗传和转录图谱。

图2说明了在昆虫细胞中生产携带由人类生长激素内含子中断的DT-A基因或者携带由SV40大T抗原内含子中断并在框内与GFP融合的芽孢杆菌RNA酶基因的重组杆状病毒的方法。

图3说明了携带被改性为在开放读码框内包含内含子的毒性基因如DT-A基因的代表性AAV载体的遗传和转录图谱。

图4说明了在昆虫细胞中生产携带毒性基因如DT-A基因的AAV载体的方法。

图5说明了在具有稳定整合的AAV转基因的昆虫细胞中生产携带包含内含子的毒性基因如DT-A基因的AAV载体的另一种方法。Bac、Rep、Cap和ITR描述于美国专利申请公开20090203071中。

图6-11说明了可用于本教导的各种配置的pFastBac穿梭质粒的图谱。每个载体包含：Tn7R和Tn7L靶位点；氨苄青霉素抗性选择标记(AMP)；庆大霉素抗性选择标记；不在编码序列内的hGH内含子；AAV ITR’s；和SV40pA 144bp的多腺苷酸化序列，

CATGGCCCAACTTGTTTATTGCAGCTTATAATGGTTACAAATAAAGCAATAGCATCACAAATTTCACAAATAAAGCATTTTTTTCACTGCATTCTAGTTGTGGTTTGTCCAAACTCATCAATGTATCTTATCATGTCTGGATCT(SEQ ID NO：1).

然而，对于实施本教导的各种实施方案，可能不单独需要这些组件。缩写：DT-A，白喉毒素A片段；CMV，巨细胞病毒启动子；hGH，人类生长激素内含子；Bar，芽孢杆菌RNA酶；GFP，绿色荧光蛋白；SV40，猿猴病毒40大T抗原内含子；hTERT，人类端粒酶逆转录酶启动子。

图6说明了在AAV ITR’s之间包含与DT-A编码序列可操作地连接的CMV启动子的pFastBac穿梭质粒的图谱，其中所述载体包含：Tn7R和Tn7L靶位点；氨苄青霉素抗性选择标记；庆大霉素抗性选择标记；不在编码序列内的hGH内含子；AAV ITR’s；和SV40pA 144bp的多腺苷酸化序列。缩写：DT-A，白喉毒素A片段；CMV，巨细胞病毒启动子；hGH，人类生长激素内含子。

图7说明了在AAV ITR’s之间包含与由人类生长激素内含子中断的DT-A编码序列可操作地连接的CMV启动子的pFastBac穿梭质粒，，其中所述载体包含：Tn7R和Tn7L靶位点；氨苄青霉素抗性选择标记；庆大霉素抗性选择标记；不在编码序列内的hGH内含子；AAV ITR’s；和SV40pA 144bp的多腺苷酸化序列。缩写：DT-A，白喉毒素A片段；CMV，巨细胞病毒启动子；hGH，人类生长激素内含子；SV40，猿猴病毒40大T抗原内含子。

图8说明了在AAV ITR’s之间包含与在框内与GFP编码序列融合的芽孢杆菌RNA酶编码序列可操作地连接的CMV启动子的pFastBac穿梭质粒图谱，其中所述载体包含：Tn7R和Tn7L靶位点；氨苄青霉素抗性选择标记；庆大霉素抗性选择标记；不在编码序列内的hGH内含子；AAV ITR’s；和SV40pA 144bp的多腺苷酸化序列。缩写：CMV，巨细胞病毒启动子；hGH，人类生长激素内含子；Bar，芽孢杆菌RNA酶；GFP，绿色荧光蛋白；SV40，猿猴病毒40大T抗原内含子。

图9说明了在AAV ITR’s之间包含与由SV40大T抗原内含子中断并在框内与GFP编码序列融合的芽孢杆菌RNA酶编码序列可操作地连接的CMV启动子的pFastBac穿梭质粒图谱，其中所述载体包含：Tn7R和Tn7L靶位点；氨苄青霉素抗性选择标记；庆大霉素抗性选择标记；不在编码序列内的hGH内含子；AAV ITR’s；和SV40pA 144bp的多腺苷酸化序列。缩写：CMV，巨细胞病毒启动子；hGH，人类生长激素内含子；Bar，芽孢杆菌RNA酶；GFP，绿色荧光蛋白；SV40，猿猴病毒40大T抗原内含子。

图10说明了在AAV ITR’s之间包含与由人类生长激素内含子中断的DT-A编码序列可操作地连接的hTERT启动子的pFastBac穿梭质粒图谱，其中所述载体包含：Tn7R和Tn7L靶位点；氨苄青霉素抗性选择标记；庆大霉素抗性选择标记；不在编码序列内的hGH内含子；AAV ITR’s；和SV40pA 144bp的多腺苷酸化序列。缩写：DT-A，白喉毒素A片段；hGH，人类生长激素内含子；SV40，猿猴病毒40大T抗原内含子；hTERT，人类端粒酶逆转录酶启动子。

图11说明了在AAV ITR’s之间包含与GFP编码序列可操作地连接的hTERT启动子的pFastBac穿梭质粒图谱，其中所述载体包含：Tn7R和Tn7L靶位点；氨苄青霉素抗性选择标记；庆大霉素抗性选择标记；不在编码序列内的hGH内含子；AAV ITR’s；和SV40pA 144bp的多腺苷酸化序列。缩写：hGH，人类生长激素内含子；Bar，芽孢杆菌RNA酶；GFP，绿色荧光蛋白；SV40，猿猴病毒40大T抗原内含子；hTERT，人类端粒酶逆转录酶启动子。

图12说明了重组杆状病毒在用杆粒DNA转染后在Sf9细胞内的产生(图12A，图12C)，以及重组杆状病毒通过感染在Sf9细胞内的扩增。

图13说明了携带由人类生长激素内含子中断的DT-A基因，和由SV40大T抗原内含子中断并在框内与GFP融合的芽孢杆菌RNA酶基因的代表性重组杆状病毒的遗传和转录图谱。

图14说明了用带有毒性基因的重组杆状病毒转导48小时对哺乳动物(人类胚胎肾脏HEK293)细胞的杀伤效应。

图15说明了在携带稳定整合的AAV-转基因的昆虫细胞内生产携带包含人类生长激素内含子的DT-A基因或包含SV40大T抗原内含子并在框内与GFP基因融合的芽孢杆菌RNA酶基因的AAV载体的方法。

图16说明了携带包含人类生长激素内含子的DT-A基因，或包含SV40大T抗原内含子并在框内与GFP基因融合的芽孢杆菌RNA酶基因的代表性的AAV载体的遗传和转录图谱。

图17说明了AAV2-CMV-inDTA(hGH)对哺乳动物细胞的杀伤效应。

图18说明了通过带有毒性基因的AAV载体转导，对哺乳动物细胞的杀伤效应。

图19说明了AAV2-hSURV-inDTA(hGH)对细胞杀伤的代表性结果。

图20说明了被携带在各种肿瘤特异性启动子控制下的DT-A的AAV2载体转导的肿瘤细胞的细胞活力测定。将所述细胞接种在96-孔板上，并用4倍系列稀释的AAV2载体转导4天，并用CellTiter Glo Luminescent Cell Viability Assay试剂盒测定所述细胞的活力。(a)HepG2细胞，(b)Hep3B细胞，和(c)BE(2)-M17细胞。

具体实施方式

本教导公开了一种包含内含子的毒性基因，其中在昆虫细胞内转录后，内含子不被剪接，以致在昆虫细胞内没有毒性基因产物形成。包含此类内含子中断的毒性基因的载体能在昆虫细胞内增殖。然而，当引入哺乳动物细胞如癌细胞中，毒性基因转录导致成熟mRNA的形成，成熟mRNA被翻译成杀死宿主哺乳动物细胞的毒性蛋白。

图1说明了包含内含子和与CMV启动子可操作地连接的DT-A基因的示例性的遗传和转录图谱。当包含本教导的内含子的DT-A基因引入哺乳动物细胞中，基因被转录，并且在哺乳动物细胞内通过内含子剪接而形成成熟的DT-AmRNA。所述成熟的mRNA被翻译成功能性DT-A蛋白以杀死细胞。基于DT-A编码序列(Genbank登录号X00703)的遗传图谱上面的数字指示所述内含子插入的核苷酸位点。CMVpr＝巨细胞病毒启动子；DT-A＝白喉毒素A核酸序列；pA＝多腺苷酸化信号。

本文描述的方法和组合物利用本领域技术人员熟知的，并且能够在实验室操作手册如Sambrook,J等人,Molecular Cloning:A Laboratory Mannual,3rd ed.Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring,N.Y.,2001；Methods InMolecular Biology,ed.Richard,Humana Press,NJ,1995；Spector,D.L.等人,Cells:A Laboratory Mannual,Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring,N.Y.,1998；和Harlow,E.,Using Antibodies:A Laboratory Manual,Cold Spring HarborLaboratory Press,Cold Spring,N.Y.,1999中找到的实验室技术。描述在昆虫细胞中表达异源多肽的方法以及向昆虫细胞引入载体和核酸的方法和维持昆虫细胞培养物的方法的另外的参考文献包括，例如，O’Relliy等人,BaculovirusExpression Vectors,A Laboratory Manual,Oxford Univ.Press,1994；Samulski等人,J.Vir.63:3822-3288,1989；Kajigaya等人,Proc.Nati.Acad.Sci.USA88:4646-4650,1991；Ruffing等人,J.Vir.66:6922-6930,1992；Kimbauer等人,Vir.219:37-44,1996；Zhao等人,Vir.272:382-393,2000；和Samulski等人,美国专利第6,204,059号。

本文描述的实验也可以使用以下材料和方法。

细胞培养。HEK293细胞在37℃下在含有100U/ml的青霉素和100mg/ml的链霉素、并补充有10％胎牛血清(Sigma-Aldrich，St.Louis，MO)的杜氏改良Eagle培养基(Invitrogen,Carlsbad,CA)中维持。HepG2、Hep3B和W138细胞在37℃下在含有100U/ml的青霉素和100mg/ml的链霉素、并补充有10％胎牛血清的EMEM完全生长培养基(美国典型微生物菌种保藏中心)中维持。BE(2)M17细胞(美国典型微生物菌种保藏中心)在含有100U/ml的青霉素和100mg/ml的链霉素、并补充有10％胎牛血清的50％EMEM+50％F12完全生长培养基中维持。草地贪夜蛾Sf9细胞(Invitrogen,Carlsbad,CA)在28℃下在含有100U/ml的青霉素和100mg/ml的链霉素(Invitrogen,Carlsbad,CA)的ESF921无血清培养基(Expression Systems，Woodland，CA)中维持。

重组杆状病毒的产生和滴定。使用如以上描述所构建的质粒转化DH10Bac感受态细胞，以产生重组杆粒。按照生产商的方案(Invitrogen,Carlsbad,CA)，有细微改动，用含有靶基因的杆粒产生重组杆状病毒。简而言之，用2ng质粒DNA转化20μl DH10Bac感受态细胞。在37℃、500μl SOC培养基中孵育4小时后，将25μl和2.5μl培养物分别涂在选择性平板上，孵育48小时以允许形成白/蓝菌落。一般，针对每个构建体挑取3个白色菌落，小量提取制备杆粒DNA。使用杆粒DNA转染Sf9细胞以产生重组杆状病毒。扩增重组杆状病毒一次，并用实时定量PCR(qPCR)分析确定滴度，并基于经验性研究转化成空斑形成单位(pfu)，其中20个拷贝转化成1pfu。

AAV载体的生产、纯化和滴定。以前已经描述了用于AAV载体生产、纯化和滴定的方法(Chen,H.,Mol Ther16:924-930,2008)。简而言之，在28℃下，含有100U/ml青霉素和100μg/ml链霉素的ESF921无血清培养基中，使Sf9细胞生长到～1×107个细胞/ml，并在感染前稀释到～5×106个细胞/ml。使用双感染以生产AAV载体。在28℃下，使用感染复数(moi)为5的Bac-AAV-转基因，和10moi的Bac-inCap-inRep感染Sf9细胞3天以生产AAV载体。感染3天后，通过3000rpm离心15分钟收集细胞沉淀物。在改良Sf9裂解缓冲液(50mMTris-HCl,pH8.0,1％十二烷基肌氨酸钠,1％Triton X-100,2mM MgCl2)中裂解所述细胞沉淀物，并用核酸酶(Sigma-Aldrich，St.Louis，MO)消化细胞的核酸(DNA和RNA)。通过在8000rpm下离心20min，澄清化细胞裂解物，并使上清液经受2轮超速离心以纯化AAV载体。用2个PD-10脱盐柱(GE HealthCare Bio-ScienceCorp，Piscataway，NJ)将AAV载体缓冲液置换成含0.001％普流尼克(Pluronic)F-68(Sigma-Aldrich，St.Louis，MO)的PBS。纯化后，使用实时定量PCR(qPCR)方法滴定所述AAV载体。

细胞增殖测定。使HEK293细胞在24-孔板(1.5e+5个细胞/孔)中生长过夜，并用AAV2载体(1.5e+9vg/孔)转导48小时。然后将细胞用胰蛋白酶消化并计数细胞数目。将所述细胞进一步培养48小时直到融合，并用胰蛋白酶消化，计数细胞数目然后转入较大培养瓶中。另外培养72小时后，将细胞用胰蛋白酶消化并计数。用台盼蓝染色计数活细胞。

细胞活力测定。根据生产商的方案(Promega，Madison，WI)使用CellTiterGlo Luminescent Cell Viability Assay试剂盒测试细胞活力。简而言之，将细胞(W138、HepG2、Hep3B和BE(2)M17)按3.2e+4个细胞/孔接种到96-孔板，过夜，并用4倍系列稀释的AAV2载体转导4天。重构试剂并加到细胞中。在涡旋振荡器上混合2分钟以裂解细胞后，将培养板在室温下孵育10分钟，然后记录发光信号。

当用在说明书、附图和任意所附的权利要求中时，单数形式的“a”、“an”和“the”意图包括复数形式，除非文中另有明确说明。

本发明人开发出用于在昆虫细胞中生产包含毒性基因的载体的组合物和方法，以及能包括包含毒性基因的载体，并能在未浓缩培养基中生产病毒如AAV至滴度为至少109病毒基因组/mL，至少1010病毒基因组/mL，至少1011病毒基因组/mL，至少1012病毒基因组/mL的昆虫细胞培养物。在各种配置中，细胞培养物能在未浓缩培养基中生产杆状病毒至滴度至少106空斑形成单位(PFU)/ml，至少107PFU/ml，至少108PFU/ml，至少109PFU/ml或至少1010PFU/ml。

可用于本教导的各种配置的昆虫细胞可以是任何能在体外培养生长的昆虫细胞。此类细胞是本领域技术人员熟知的，包括但不限于，在Kost,T.A.等人Nature Biotechnology23:567-575,2005和本文引用的参考文献中公开的那些昆虫细胞。

实施例

下面的实施例是对本教导的各种实施方案的解释性说明，并不意在限制任一权利要求的范围。本领域的技术人员应知道在本教导的范围内的许多变化是可能的。

实施例1

该实施例说明了质粒pFB-CMV-DTA，一个包含与DT-A编码序列在上游可操作地连接的CMV启动子的pFastBack穿梭质粒(Invitrogen Corporation,Carlsbad,CA)，的结构和构建(图6)。

为构建该质粒，用限制性内切酶EcoRI和BamHI消化含有DT-A基因(GenBank登录号X00703)的质粒，产生含有DT-A编码序列与EcoRI和BamHI粘性末端的片段。将该片段连入质粒pFB-AAV-CMV-SV40pA的EcoRI和BamHI位点生成pFB-CMV-DTA。为将人类生长激素内含子插入DT-A基因，使用PCR方法。首先，使用正向引物5’-GATTATGATCACTAGTCGAG-3’(SEQ ID NO：2)和反向引物5’-CTTTTTGAATGGAATCTACA-3’(SEQ ID NO：3)(粗体指示人类生长激素内含子序列)扩增上游连接序列和5’-DT-A序列的从1至103的核苷酸。使用正向引物5’-ATTCAAAAAG-3’(SEQ ID NO：4)(粗体指示人类生长激素内含子序列)和反向引物5’-TTTT-3’(SEQ ID NO：5)(斜体指示BstZ171的限制性位点；粗体指示人类生长激素内含子序列)扩增人类生长激素内含子。通过使用正向引物5’-GATTATGATCACTAGTCGAG-3’(SEQ ID NO：6)和反向引物5’-TTTTGTATACCTGGGGAGAAACCAGAGGGC-3’(SEQ ID NO：7)的第二PCR扩增将这两个PCR片段连接在一起。然后使用限制性内切酶EcoRI和BstZ171消化这个连接起来的片段，并将其连入pFB-CMV-DTA的EcoRI和BstZ171位点，生成pFB-CMV-inDTA(hGH)(图1，图7)，以及连入pFB-CMVtetO-DTA-p10-TetR的EcoRI和BstZ171位点，生成pFB-CMVtetO-inDTA-p10-TetR。通过DNA测序分析确认表达盒。

在该实施例中使用的DT-A基因(GenBank登录号X00703)的DNA序列是：

gtgagcagaaaactgtttgcgtcaatcttaataggggcgctactggggataggggccccaccttcagcccatgcaggcgctgatgatgttgttgattcttctaaatctttgtgatggaaaactttcttcgtaccacgggactaaacctggttatgtagattccattcaaaaaggtatacaaaagccaaaatctggtacacaaggaaattatgacgatgattggaaagggtttatagtaccgacaataaatacgacgctgcgggatactctgtagataatgaaaacccgctctctggaaaagctggaggcgtggtcaaagtgacgtatccaggactgacgaaggttctcgcactaaaagtggataatgccgaaactattaagaaagagttaggtttaagtctcactgaaccgttgatggagcaagtcggaacggaagagtttatcaaaaggttcggtgatggtgcttcgcgtgtagtgctcagccttcccttcgctgaggggagttctagcgttgaatatattaataactgggaacaggcgaaagcgttaagcgtagaacttgagattaattttgaaacccgtggaaaacgtggccaagatgcgatgtatgagtatatggctcaagcctgtgcaggaaatcgtgtcaggcgatcagtaggtagctcattgtcatgcataaatcttgattgggatgtcataagggataaaactaagacaaagatagagtctttgaaagagcatggccctatcaaaaataaaatgagcgaaagtcccaataaaacagtatctgagggaaaaagctaaacaatacctagaagaatttcatcaaacggcattagagcatcctgaattgtcagaacttaaaaccgttactgggaccaatcctgtatcgctggggctaactatgcggcgtgggcagtaaacgttgcgcaagttatcgatagcgaaacagctgataatttggaaaagacaactgctgctctttcgatacttcctggtatcggtagcgtaatgggcattgcagacggtgccgttcaccacaatacagaagagatagtggcacaatcaatagctttatcgtctttaatggttgctcaagctattccattggtaggagagctagttgatattggtttcgctgcalataatttgtagagagtattatcaatttatttcaagtagttcataatcgtataatcgtcccgcgtattctccggggcataaaacgcaaccatttcttcatgacgggtatgctgtcagtttggaacactgttgaagattcgataatccgaactggttttcaaggggagagtgggcacgacataaaaattactgctgaaaataccccgcttccaatcgcgggtgtcctactaccgactattcctggaaagctggacgttaataagtccaagactcatatttccgtaaatggtcggaaaataaggatgcgttgcagagctatagacggtgatgtaacttttgtcgccctaaatctcctgtttatgtggtaatggtgtgcatgcgaatcttcacgtggcatttcacagaagcagctcggagaaaattcattctaatgaaattcgtcggattccataggcgttcttgggtaccagaaaacagtagatcacaccaaggttaattctaagctatcgctattttttgaaatcaaaagctga(SEQ ID NO：8).

含有hGH内含子的DT-A编码序列如下：

ATGGGCGCTGATGATGTTGTTGATTCTTCTAAATCTTTTGTGATGGAAAACTTTTCTTCGTACCACGGGACTAAACCTGGTTATGTAGATTCCATTCAAAAAGgtaagcgcccctaaaatccctttggcacaatgtgtcctgaggggagaggcagcgacctgtagatgggacgggggcactaaccctcagggttttggggttctgaatgtgagtatcgccatgtaagcccagtatttggccaatctcagaaagctcctggctccctggaggatggagagagaaaaacaaacagctcctggagcagggagagtgctggcctcttgctctccggctccctctgttgccctctggtttctccccagGTATACAAAAGCCAAAATCTGGTACACAAGGAAATTATGACGATGATTGGAAAGGGTTTTATAGTACCGACAATAAATACGACGCTGCGGGATACTCTGTAGATAATGAAAACCCGCTCTCTGGAAAAGCTGGAGGCGTGGTCAAAGTGACGTATCCAGGACTGACGAAGGTTC.TCGCACTAAAAGTGGATAATGCCGAAACTATTAAGAAAGAGTTAGGTTTAAGTCTCACTGAACCGTTGATGGAGCAAGTCGGAACGGAAGAGTTTATCAAAAGGTTCGGTGATGGTGCTTCGCGTGTAGTGCTCAGCCTTCCCTTCGCTGAGGGGAGTTCTAGCGTTGAATATATTAATAACTGGGAACAGGCGAAAGCGTTAAGCGTAGAACTTGAGATTAATTTTGAAACCCGTGGAAAACGTGGCCAAGATGCGATGTATGAGTATATGGCTCAAGCCTGTGCAGGAAATCGTGTCAGGCGATGA(SEQ ID NO：39).

实施例2

该实施例说明质粒pFB-CMVtetO-DTA-p10-TetR的结构和构建。为了构建pFB-CMVtetO-DTA-p10-TetR，p10-驱动的TetR表达盒通过用限制性内切酶HindIII和AvrII消化从质粒释放出来。所释放的片段插入已用限制性内切酶HindIII和AvrII消化的质粒pFB-CMV-DTA的HindIII和AvrII粘性末端。

实施例3

该实施例说明中断毒性基因ORF的哺乳动物内含子的插入。

为产生本教导的一些实施方案的载体，将人类生长激素(hGH)内含子插入DT-A ORF的核苷酸103和104(起始密码子ATG的第一个字母标记为核苷酸1号)之间。将SV40大T抗原(SV40LT)内含子插入芽孢杆菌RNA酶ORF的核苷酸9和10之间。没有内含子中断的DT-A ORF和芽孢杆菌RNA酶ORF用作对照。将所有带有或没有内含子中断的毒素编码序列克隆至pFastBack穿梭质粒，图3示出了表达盒的结构示意图。

图3说明了携带两侧为AAV ITR的毒素表达盒的代表性重组杆状病毒的的遗传和转录图谱。通过用携带有AAV rep和cap基因的第二重组杆状病毒共感染昆虫细胞产生AAV载体。当将杆状病毒或AAV载体引入哺乳动物细胞时，成熟的毒素mRNA经内含子剪接而形成并被翻译成功能性蛋白以杀死细胞。(a)被hGH内含子插入并在各种肿瘤特异性启动子控制下的DT-A基因。基于DT-A编码序列(Genbank登录号X00703)的遗传图谱上面的数字指示所述内含子插入的核苷酸位点。(b)被SV40LT抗原内含子插入并在框内与GFP基因融合的芽孢杆菌RNA酶基因。遗传图谱上面的数字是基于芽孢杆菌RNA酶编码序列(Genbank登录号M14442)，并指示所述内含子插入的核苷酸位点。(c)没有内含子插入的DT-A和芽孢杆菌RNA酶基因。

包含SV40LT抗原内含子的芽孢杆菌RNA酶编码序列的详细序列如下：

ATGGCACAGgtatttgcttcttccttaaatcctggtgttgatgcaatgtactgcaaacaatggcctgagtgtgcaaagaaaatgtctgctaactgcatatgcttgctgtgcttactgaggatgaagcatgaaaatagaaaattatatacaggaaagatccacttgtgtggttgattgctactgcttcgattgctttagaatgtggtttggacttgatctttgtgaaggaaccttacttctgtggtgtgacataattggacaaactacctacagagatttaaagctctaaggtaaatataaaatttttaagtgtataatgtgttaaactactgattctaattgtttgtgtattttagGTTATCAACACGTTTGACGGGGTTGCGGATTATCTTCAGACATATCATAAGCTACCTGATAATTACATTACAAAATCAGAAGCACAAGCCCTCGGCTGGGTGGCATCAAAAGGGAACCTTGCAGACGTCGCTCCGGGGAAAAGCATCGGCGGAGACATCTTCTCAAACAGGGAAGGCAAACTCCAGGGCAAAAGCGGACGAACATGGCGTGAAGCGGATATTAACTATACATCAGGCTTCAGAAATTCAGACCGGATTCTTTACTCAAGCGACTGGCTGATTTACAAAACAACGGACCATTATCAGACCTTTACAAAAATCAGAATGGTGAGCAAGGGC(SEQ ID NO：40).与GFP融合，附加的序列是——GFP——GAGCTGTACAAGTAA(SEQ ID NO：41)。

实施例4

本实施例说明包含与在框内与绿色荧光蛋白(GFP)编码序列融合的芽孢杆菌RNA酶编码序列在上游可操作地连接的CMV启动子的质粒pFB-CMV-Bar-GFP的结构和构建(图8)。

为了构建pFB-CMV-Bar-GFP(图8)，使用正向引物5’-CCCGCCACCATGGCACAGGTTATCAAC-3’(SEQ ID NO：9)(斜体指示EcoRI的限制位点)和反向引物5’-TGCTCACCATTCTGATTTTTGTAAAGGTCT-3’(SEQ ID NO：10)从质粒pF1A-T7(Promega，Madison WI)扩增芽孢杆菌RNA酶编码序列(Genbank登录号M14442)。使用正向引物5’-CAAAAATCAGAATGGTGAGCAAGGGCGAGG-3’(SEQ ID NO：11)和反向引物5’-GGGGTCATTACTTGTACAGCTCGTCC-3’(SEQ ID NO：12)(斜体指示KpnI的限制位点)从pFB-GFP质粒扩增GFP编码序列(Genbank登录号U55762)。使用正向引物CCCGAATTCGCCACCATGGCACAGGTTATCAAC-3’(SEQ ID NO：13)和反向引物5’-GGGGGGTACCTCATTACTTGTACAGCTCGTCC-3’(SEQ ID NO：14)进行第二轮PCR将芽孢杆菌RNA酶编码序列和GFP编码序列融合在一起。融合的PCR片段使用限制性内切酶EcoRI和KpnI进行消化，并连入pFB-CMV-inDTA(hGH)的EcoRI和KpnI位点以替代DT-A序列并生成pFB-CMV-Bar-GFP。

在该实施例中使用的芽孢杆菌RNA酶基因的DNA序列(Genbank登录号M14442)是：

ctggaaaacgtcacattgcttccgcatatcgggtcagcaacggctaaaatccgcttgaatatgttcacacaagccgctcaaaacatgattgacgccgtatacggaagaacgccgaaaaaccttactaaggaatttcaataagaagaaaaatcccggttggttcagccggggtttatttttcgctagataaaaagtactatttttaaattctttctattcctttctttcgttgctgatacaatgaaaaggaatcagcttcacatgatgaaaatgggaggtattgctttgaaaaaacgattatcgtggatttccgtttgtttactggtgcttgtctccgcggcggggatgctgttttcaacagctgccaaaacggaaacatcttctcacaaggcacacacagaagcacaggttatcaacacgtttgacggggttgcggattatcatcagacatatcataagctacctgataattacattacaaaatcagaagcacaagccctcggctgggtggcatcaaaagggaaccttgcagacgtcgctccggggaaaagcatcggcggagacatcttctcaaacagggaaggcaaactcccgggcaaaagcggacgaacatggcgtgaagcggatattaactatacatcaggcttcagaaattcagaccggattctttactcaagcgactggctgatttacaaaacaacggaccattatcagacctttacaaaaateagataacgaaaaaaacggcttccctgcggaggccgtttttttcagctttacataaagtgtgtaataaatttttcttcaaactctgatcggtcaatttcacttt(SEQ IDNO：15).

在该实施例中使用的GFP基因的DNA序列是：

tagttattaatagtaatcaattacggggtcattagttcatagcccataatatggagttccgcgttacataacttacggtaaatggccgctggctgaccgcccaacgacccccgcccattgacgtcaataatgacgtatgttcccatagtaacgccaatagggactttccatgacgtcaatgggtggagtatttacggtaaactgcccacttggcagtacatcaagtgtatcatatgccaagtacgccccctattgacgtcaatgacggtaaatggcccgcctggcattatgcccagtacatgaccttatgggactttcctacttggcagtacatctacgtattagtcatcgctattaccatggtgatgcggttttggcagtacatcaatgggcgtggatagcggtttgactcacggggatttccaagtctccaccccattgacgtcaatgggagtttgttttggcaccaaaatcaacgggactttccaaaatgtcgtaacaactccgccccattgacgcaaatgggcggtaggcgtgtacggtgggaggtctatataagcagagctggtttagtgaaccgtcagatccgctagcgctaccggactcagatctcgagctcaagcttcgaattfctgcagtcgacggtaccgcgggcccgggatccaccggtcgccaccatggtgagcaagggcgaggagctgttcaccggggtggtgcccatcctggtcgagctggacggcgacgtaaacggccacaagttcagcgtgtccggcgagggcgagggcgatgccacctacggcaagctgaccctgaagttcatctgcaccaccggcaagctgcccgtgccctggcccaccctcgtgaccaccctgacctacggcgtgcagtgcttcagccgctaccccgaccacatgaagcagcacgacttcttcaagtccgccatgcccgaaggctacgtccagggagcgcaccatcttcttcaaggacgacggcaactacaagacccgcgccgaggtgaagttcgagggcgacaccctggtgaaccgcatcgagctgaagggcatcgacttcaaggaggacggcaacatcctggggcacaagctggagtacaactacaacagccacaacgtctatatcatggccgacaagcagaagaacggcatcaaggtgaacttcaagatccgccacaacatcgaggacggcagcgtgcagctcgccgaccactaccagcagaacacccccatcggcgacggccccgtgctgctgcccgacaaccactacctgagcacccagtccgcccttgagcaaaaaccccaaceagaagcgcgatcacatggtcctgctggagttcgtgaccgccgccgggatcactctcggcatggacgagctgtacaagtaaagcggccgcgactctagatcataatcagccataccacatttgtagaggttttacttgctttaaaaaacctcccacacctccccctgaacctgaaacataaaatgaatgcaattgttgttgttaacttgtttattgcagettataatggttacaaataaagcaatagcatcacaaatttcacaaataaagcatttttttcactgcattctagttgtggtttgtccaaactcatcaatgtatcttaaggcgtaaattgtaagcgttaatattttgttaaaattcgcgttaaatttttgttaaatcagctcattttttaaccaataggccgaaatcggcaaaatcccttataaatcaaaagaatagaccgagatagggttgagtgttgttccagtttggaacaagagtccactattaaagaacgtggactccaacgtcaaagggcgaaaaaccgtctatcagggcgatggcccactacgtgaaccatcaccctaatcaagttttttggggtcgaggtgccgtaaagcactaaatcggaaccctaaagggagcccccgatttagagcttgacggggaaagccggcgaacgtggcgagaaaggaagggaagaaagcgaaaggagcgggcgctagggcgctggcaagtgtagcggtcacgctgcgcgtaaccaccacacccgccgcgcttaatgcgccgctacagggcgcgtcaggtggcacttttcggggaaatgtgcgcggaacccctattttgttatttttctaaatacattcaaatatgtatccgtctcatgatacaataaccctgataaatgcttcaataatattgaaaaaggaagagtcctgaggcggaaagaaccagctgtggaatgtgtgtcagttagggtgtggaaagtccccaggctccccagcaggcagaagtatgcaaagcatgcatctcaattagtcagcaaccaggtgtggaaagtccccaggctccccagcaggcagaagtatgcaaagcatgcatctcaattagtcagcaaccatagtcccgcccctaactccgcccatcccgcccctaactccgcccagttccgcccattctccgccccatggctgactaattttttttatttatgcagaggccgaggccgcctcggcctctgagctattccagaagtagtgaggaggcttttttggaggcctaggcttttgcaaagatcgatcaagagacaggatgaggatcgtttcgcatgattgaacaagatggattgcacgcaggttctccggccgcttgggtggagaggctattcggctatgactgggcacaacagacaatcggctgctctgatgccgccgtgttccggctgtcagcgcagggggcgcccggttctttttgtcaagaccgacctgtccggtgccctgaatgaactgcaagacgaggcagcgcggctatcgtggctggccacgacgggcgttccttgcgcagctgtgctcgacgttgtcactgaagcgggaagggactggctgctattgggcgaagtgccggggcaggatctcctgtcatctcaccttgctcctgccgagaaagtatccatcatggctgatgcaatgcggcggctgcatacgcttgatccggctacctgcccattcgaccaccaagcgaaacatcgcatcgagcgagcacgtactcggatggaagccggtcttgtcgatcaggatgatctggacgaagagcatcaggggctcgcgccagccgaactgttcgccaggctcaaggcgagcatgcccgacggcgaggatctcgtcgtgacccatggcgatgcctgcttgccgaatatcatggtggaaaatggccgcttttctggattcatcgactgtggccggctgggtgtggcggaccgctatcaggacatagcgttggctacccgtgatattgctgaagagcttggcggcgaatgggctgaccgcttcctcgtgctttacggtatcgccgctcccgattcgcagcgcatcgccttctatcgccttcttgacgagttcttctgagcgggactctggggttcgaaatgaccgaccaagcgacgcccaacctgccatcacgagatttcgattccaccgccgccttctatgaaaggttgggcttcggaatcgttttccgggacgccggctggatgatcctccagcgcggggatctcatgctggagttcttcgcccaccctagggggaggctaactgaaacacggaaggagacaataccggaaggaacccgcgctatgacggcaataaaaagacagaataaaacgcacggtgttgggtcgtttgttcataaacgcggggttcggtcccagggctggcactctgtcgataccccaccgagaccccattggggccaatacgcccgcgtttcttccttttccccaccccaccccccaagttcgggtgaaggcccagggctcgcagccaacgtcggggcggcaggccctgccatagcctcaggttactcatatatactttagattgatttaaaacttcatttttaatttaaaaggatctaggtgaagatcctttttgataatctcatgaccaaaatcccttaacgtgagttttcgttccactgagcgtcagaccccgtagaaaagatcaaaggatcttcttgagatcctttttttctgcgcgtaatctgctgcttgcaaacaaaaaaaccaccgctaccagcggtggtttgtttgccggatcaagagctaccaactctttttccgaaggtaactggcttcagcagagcgcagataccaaatactgtccttctagtgtagccgtagttagggccaccacttcaagaactctgtagcaccgcctacatacctcgctctgctaatcctgttaccagtggctgctgccagtggcgataagtcgtgtcttaccgggttggactcaagacgatagttaccggataaggcgcagcggtcgggctgaacggggggttcgtgcacacagcccagcttggagcgaacgacctacaccgaactgagatacctacagcgtgagctatgagaaagcgccacgcttcccgaagggagaaaggcggacaggtatccggtaagcggcagggtcggaacaggagagcgcacgagggaccttccagggggaaacgcctggtatctttatagtcctgtcgggtttcgccacctctgacttgagcgtcgatttttgtgatgctcgtcaggggggcggagcctatggaaaaacgccagcaacgcggcctttttacggtcctggccttttggcctttgctcacatgttctttcctgcgttatcccctgattctgtggataaccgtattaccgccatgcat(SEQ ID NO：16).

实施例5

该实施例说明质粒pFB-CMV-InBar(SV40)-GFP的结构和构建，其包含与芽孢杆菌RNA酶编码序列在上游可操作地连接的CMV启动子，所述芽孢杆菌RNA酶编码序列具有插入的SV40大T抗原内含子(SV40)并在框内与GFP编码序列融合(图9)。

为了将SV40大T抗原内含子插入芽孢杆菌RNA酶并构建pFB-CMV-inBar(SV40)-GFP(图9)，使用PCR方法。使用正向引物5’-CCCCGCCACCATGGCACAG-3’(SEQ ID NO：17)(斜体指示EcoRI的限制位点；粗体指示SV40大T抗原内含子序列)和反向引物5’-TGTTGATAAC-3’(SEQ ID NO：18)(粗体指示SV40大T抗原内含子序列)从SV40质粒(pUCSV40-B2E，ATCC，Manassas，VA)中PCR扩增芽孢杆菌RNA酶编码序列的5’部分和全长的SV40大T抗原内含子。使用正向引物5’-GTTATCAACACGTTTGACGG-3’(SEQ ID NO：19)(粗体指示SV40大T抗原内含子序列)和反向引物5’-GGGGGGTACCTCATTACTTGTACAGCTCGTCC-3’(SEQ ID NO：20)以及pFB-CMV-Bar-GFP作为模板，PCR扩增芽孢杆菌RNA酶编码序列的3’部分和GFP编码序列。使用正向引物5’-CCCCGAATTCGCCACCATGGCACAGGTATTTGCTTCTTCCTTAAA-3’(SEQ ID NO：21)和反向引物5’-5’-GGGGGGTACCTCATTACTTGTACAGCTCGTCC-3’(SEQ ID NO：22)进行第二PCR将这两个PCR片段连接在一起。使用限制性内切酶EcoRI和KpnI消化上述连接的PCR片段，并将其连入pFB-CMV-inDTA(hGH)的EcoRI和KpnI位点以替换DTA序列并生成pFB-CMV-inBar(SV40)-GFP。

实施例6

该实施例说明质粒pFB-hTERT-inDTA(hGH)的结构和构建，其包含与具有插入的人类生长激素内含子的DT-A编码序列在上游可操作地连接的人类端粒酶逆转录酶启动子(hTERT)(图10)。

为构建pFB-hTERT-inDTA(hGH)(图10)，使用正向引物5’-5’-GCGCATCATCAGCTTTTCAAAGAC-3’(SEQ ID NO：23)(斜体寸旨示MluI的限制位点)和反向引物5’-CGCGCGCTGCCTGAAACTCGCCGCC-3’(SEQ ID NO：24)(斜体指示AgeI的限制位点)从由人类胚胎肾脏HEK293细胞纯化的基因组DNA中使用PCR扩增hTERT。使用MluI和AgeI消化PCR片段，并将其连入pFB-CMV-inDTA(hGH)的MluI和AgeI位点，以生成pFB-hTERT-inDTA(hGH)。

实施例7

该实施例说明质粒pFB-hTERT-GFP(hGH)的结构和构建，其包含与绿色荧光蛋白(GFP)编码序列在上游可操作地连接的人类端粒酶逆转录酶启动子(图11)。

为了构建pFB-hTERT-GFP，使用限制性内切酶KpnI和AgeI消化pFB-CMV-GFP以去除CMV启动子，并且pFB-hTERT-inDTA(hGH)也使用相同的限制酶消化以释放包含hTERT启动子的片段。将该片段连入消化的pFB-CMV-GFP(没有CMV启动子)以产生pFB-hTERT-GFPs。

实施例8

该实施例说明重组杆状病毒的生产。

在这些实验中，如在实施例3中描述的，将带有或没有内含子中断的毒素编码序列克隆至pFastBac穿梭质粒。图3示出了表达盒的结构示意图。使用产生的pFastBac质粒转化DH10Bac感受态细菌，并从白色菌落中制备杆粒DNA。使用杆粒DNA生产如上描述的重组杆状病毒。如图12中说明的，结果显示，不能从包含没有内含子插入的DT-A ORF或芽孢杆菌RNA酶ORF的杆粒DNA产生重组杆状病毒，然而能从包含被哺乳动物内含子中断的DT-A ORF或芽孢杆菌RNA酶ORF的杆粒DNA产生和扩增出正常水平的重组杆状病毒。用含有没有内含子中断的毒素基因的杆粒DNA不能产生重组杆状病毒，证明DT-A或芽孢杆菌RNA酶对昆虫细胞是致命性的，即使毒素基因在CMV启动子(不是昆虫启动子)的控制之下。另一方面，从含有内含子中断的毒性基因的杆粒DNA成功产生和扩增出重组杆状病毒，表明hGH和SV40LT内含子在昆虫细胞中都没有被剪接，并因此由于DT-A和核糖核酸酶ORF的中断而没有毒素产生。

图12示出了通过用杆粒DNA转染在Sf9细胞内产生重组杆状病毒(A和C)，并通过感染在Sf9细胞内扩增重组杆状病毒(B和D)。

在这些实验中，从转染后4天或扩增后3天收获的上清液确定杆状病毒的滴度。CMV-inDTA(hGH)，带有包含在CMV启动子控制下的人类生长激素内含子(hGH)的DT-A编码序列的重组杆状病毒；CMV-GFP，带有在CMV启动子控制下的GFP编码序列的重组杆状病毒；CMV-Bar-GFP，带有在框内与GFP融合的芽孢杆菌RNA酶编码序列的重组杆状病毒；CMV-inBar(SV40)-GFP，带有包含SV40大T抗原内含子并在框内与GFP编码序列融合的芽孢杆菌RNA酶编码序列的重组杆状病毒；CMV-inDTA(hGH)，带有包含在CMV启动子控制下的人类生长激素内含子(hGH)的DT-A编码序列的重组杆状病毒；CMV-GFP，带有在CMV启动子控制下的GFP编码序列的重组杆状病毒；CMV-Bar-GFP，带有在框内与GFP融合的芽孢杆菌RNA酶编码序列的重组杆状病毒；CMV-inBar(SV40)-GFP，带有包含SV40大T抗原内含子并在框内与GFP编码序列融合的芽孢杆菌RNA酶编码序列的重组杆状病毒。注意用CMV-inBar(SV40)-GFP转染后在昆虫细胞内产生的重组杆状病毒的滴度大约4.4×106pfu/ml，或用pCMV-inDTA(hGH)转染后大约9×107pfu/ml，并且用CMV-inBar(SV40)-GFP感染后在昆虫细胞内产生的重组杆状病毒的滴度大约6.1×108pfu/ml，或用CMV-inDTA(hGH)或CMV-GFP感染后大约1.2×109pfu/ml。

实施例9

在图2中说明的，该实施例证明携带包含内含子的DT-A编码序列的重组杆状病毒的产生。

在这些实验中，根据生产商的方案(Invitrogen)产生重组杆状病毒。简而言之，分别将质粒在TE缓冲液中稀释至1ng/μl，并用2μl每个稀释的质粒转化DH10Bac感受态细菌。孵育48小时后，挑取白色菌落并小量提取制备杆粒DNA。分别将小量提取的杆粒DNA转染Sf9细胞4天。观察用携带包含内含子的DT-A基因的杆粒转染的Sf9细胞的细胞病变效应(CPE)，然而无论是否存在Tet阻遏子表达盒用携带DT-A基因的杆粒转染的Sf9细胞均未观察到CPE。这些结果表明用携带DT-A毒性基因的杆粒转染的任何细胞都被杀灭并且没有重组杆状病毒产生且未观察到CPE。收获来自所有转染的Sf9细胞的上清液作为杆状病毒储备(stock)，并使用相应于杆状病毒gp64基因的引物用定量实时PCR方法确定杆状病毒滴度。从显示明显CPE的那些细胞扩增重组杆状病毒并确定其滴度。为了确定滴度，分别将重组杆状病毒在2×TE缓冲液中稀释，并在95℃下加热30min以破裂病毒颗粒并释放出病毒DNA分子。降温到室温后，杆状病毒样品用QPCR稀释缓冲液进行稀释并用QPCR方法以正向引物5’-CCCTCTGTGTACTTGGCTCTAACG-3’(SEQ ID NO：25)和反向引物5’-CGGTGAAACGCAAAGTCGAGCACCG-3’(SEQ ID NO：26)进行测定。通过除以因子20(经验性确定)将QPCR滴度(基因组拷贝/ml)转换为空斑形成单位(pfu/ml)。下面的表1和图12显示了杆状病毒滴度。结果显示，携带包含人类生长激素内含子的DT-A基因或携带包含SV40大T抗原内含子的芽孢杆菌RNA酶基因的重组杆状病毒能产生高滴度，然而从携带没有内含子插入的DT-A基因或芽孢杆菌RNA酶基因的杆粒不产生重组杆状病毒。含有内含子中断的毒素ORF的重组杆状病毒的成功产生和扩增表明在昆虫细胞内不剪接哺乳动物细胞内含子。

CMV启动子尽管不是昆虫启动子，但在昆虫细胞内仍有一些活性，并能驱动低水平的血凝素表达(He,F等人,BMC Microbial8:238,2008)。该低水平的启动子活性能够驱动DT-A的一定的基础表达，这将杀死表达所述毒素的任何昆虫细胞。从含有与所述CMV启动子反义方向的、两侧具有loxP位点的DT-A ORF的杆粒DNA不能生产重组杆状病毒，表明即使loxP位点的隐含启动子TATA-样序列也能够驱动能杀死昆虫细胞的痕量DT-A表达。对于芽孢杆菌RNA酶基因观察到同样的现象，其中仅当它的ORF被SV40LT抗原内含子中断的时候才能产生重组杆状病毒(图12c)，表明芽孢杆菌RNA酶也是对昆虫细胞有毒的。另一方面，带有内含子中断的DT-A或芽孢杆菌RNA酶-GFP基因的重组杆状病毒的成功产生表明，在昆虫细胞内hGH和SV40LT抗原内含子不被剪接，并且通过该内含子中断完全消除了DT-A和芽孢杆菌RNA酶-GFP的表达。

表1.通过QPCR方法确定的重组杆状病毒滴度

实施例10

该实施例说明内含子从重组杆状病毒携带的毒素ORF的剪接以及在哺乳动物细胞内毒素蛋白的表达。

为了确定毒素ORF中插入的内含子是否能在哺乳动物细胞内剪接，使用带有内含子中断的DT-A或芽孢杆菌RNA酶基因的重组杆状病毒转导HEK293细胞。转导后2天检测所述细胞的形态并拍照。

在这些实验中，人类HEK293细胞在补充10％FBS和100单位/ml青霉素和100μg/ml链霉素(Invitrogen,Carlsbad,CA)的DMEM培养基中培养直至融合。然后用胰蛋白酶消化所述细胞，并在含血清培养基中按1.5e+5个细胞/孔接入24-孔板。生长过夜后，移除培养基并用250μl培养基加250μl重组杆状病毒替代，或用400μl培养基加100μl重组杆状病毒替代。除了使用Sf9细胞培养基以外，负对照按同样的方式进行。

图13示出了携带包含人类生长激素内含子的DT-A基因或携带包含SV40大T抗原内含子并在框内与GFP融合的芽孢杆菌RNA酶基因的代表性重组杆状病毒的遗传和转录图谱，和。当引入哺乳动物细胞内，成熟的DT-A mRNA或Bar-GFP mRNA经由内含子剪接形成，并被翻译成完全功能性的DT-A或芽孢杆菌RNA酶蛋白以杀死细胞。基于DT-A和芽孢杆菌RNA酶编码序列的遗传图谱上面的数字指示内含子插入的核苷酸位置。

在这些实验中，将含有内含子的核糖核酸酶基因引入哺乳动物细胞并培养3天后，在显微镜下检测细胞并记录细胞的CPE。结果示于表2和图14。图14说明用带有毒性基因的重组杆状病毒转导48小时对哺乳动物(人类胚胎肾脏HEK293)细胞的杀伤效应。A、B和C：使用钨光源在明场发光下用20倍物镜拍摄的代表性视野。D：使用滤光片与适于GFP荧光的激发和传送波长组合，通过荧光照射成像的与C中相同的视野。A，Bac-CMV-inDTA(hGH)；B，Bac-CMV-inBar(SV40)-GFP；C，Bac-CMV-GFP；D，与C相同的显示GFP表达的图像。图14中的结果显示携带内含子中断的DT-A或芽孢杆菌RNA酶基因的重组杆状病毒导致HEK293细胞碎裂，这是细胞进行凋亡的典型迹象，然而携带GFP基因的重组杆状病毒没有导致这种碎裂。在用携带Bar-GFP的杆状病毒转导的293细胞中，观察到非常微弱的GFP表达(数据未显示)。用100μl或250μl携带包含hGH内含子的DT-A基因或携带包含SV40大T抗原内含子的芽孢杆菌RNA酶基因的重组杆状病毒转导的HEK293细胞，其大部分聚拢并松散地分离，展示严重的CPE，然而所有用携带有GFP的重组杆状病毒转导的HEK293细胞未显示任何CPE迹象，生长地与负对照一样好。这些结果表明，在哺乳动物HEK293细胞中，内含子(hGH内含子或SV40大T抗原内含子)被剪切掉，形成DT-A mRNA或芽孢杆菌RNA酶-GFP mRNA并被翻译，这样宿主细胞表达功能性DT-A或芽孢杆菌RNA酶-GFP-融合蛋白，从而杀死宿主HEK293细胞。

表2.通过杆状病毒转导在人类HEK293细胞内表达DT-A

实施例11

该实施例说明带有毒素ORF的AAV载体在昆虫细胞内的生产

在这些实验中，在昆虫细胞内生产携带含有人类生长激素内含子的DT-A基因或携带含有SV40大T抗原内含子并在框内与GFP基因融合的芽孢杆菌RNA酶基因的AAV载体(图15，图16)。图15说明在携带稳定整合的AAV转基因的昆虫细胞内生产携带含有人类生长激素内含子的DT-A基因或携带含有SV40大T抗原内含子并在框内与GFP基因融合的芽孢杆菌RNA酶基因的AAV载体的方法。图16说明携带含有人类生长激素内含子的DT-A基因或携带含有SV40大T抗原内含子并在框内与GFP基因融合的芽孢杆菌RNA酶基因的代表性AAV载体的遗传和转录图谱。基于DT-A编码序列和芽孢杆菌RNA酶编码序列的遗传图谱上面的数字指示内含子插入的核苷酸位置。

用带有内含子中断的毒素ORF的重组杆状病毒在Sf9细胞内进行AAV载体的生产。使用重组杆状病毒与表达AAV Rep和Cap基因的第二重组杆状病毒共感染Sf9细胞3天，并纯化和滴定AAV载体。表3和4中的结果显示，与仅携带GFP基因的AAV载体相比，产生非常相似量的携带内含子中断的毒素ORF的AAV载体。

在这些实验中，在补充100单位/ml的青霉素和100μg/ml的链霉素的ESF921培养基(Expression Systems，CA)中使Sf9细胞生长到大约1E+9个细胞/ml。然后用新鲜培养基1:1稀释所述细胞，并用10moi的Bac-RepCap9和5moi的Bac-CMV-inDTA或Bac-CMVtetO-inDTA-p10-TetR感染3天。通过2000rpm离心10min收获细胞沉淀物，并将其在SF9裂解缓冲液(50mM Tris-HCl，pH7.4，2mMMgCl2，1％十二烷基肌氨酸钠，1％triton X-100，125单位/ml的核酸酶)中裂解。在37℃下孵育60min消化细胞的DNA。通过在8000rpm下离心30min使细胞裂解物澄清，将其装入含有5ml1.55g/cc、和10ml1.32g/cc CsCl溶液的SW28离心管中。在15℃，28,000rpm下离心大约16小时后，通过用注射针头刺破离心管收集含rAAV部分，并使其经受第二轮CsCl超速离心。通过用注射针头刺破离心管再次收集含rAAV部分，并将其在PBS缓冲液中透析以去除盐和去垢剂。根据生产商的方案(Applied Biosystem，Foster City，CA)通过定量实时PCR试验确定载体滴度。在表3和表4中展示的结果显示，在有或没有tet阻遏的情况下，使用携带含有内含子的DT-A基因的重组杆状病毒，能在Sf9细胞中产生高滴度的携带毒性DT-A基因的rAAV载体，说明内含子插入是AAV载体产生需要的。

表3.生产携带DT-A基因的AAV载体

表4.生产携带包含人类生长激素内含子的DT-A基因或携带包含SV40大T抗原内含子的芽孢杆菌RNA酶基因的AAV9和AAV2载体

样品	描述	总产量(vg/升培养物)
			1	AAV9-CMV-GFP(对照载体)	6.63E+14
2	AAV9-CMV-inDTA	7.53E+14
			3	AAV2-CMV-GFP(hGH)(对照载体)	1.15E+15
4	AAV2-CMV-inDTA(hGH)	1.15E+15
			5	AAV2-CMV-inBar(SV40)-GFP	6.58E+14
6	AAV2-hTERT-inDTA(hGH)	9.30E+14

这些结果证实在昆虫细胞中哺乳动物内含子不是功能性的，其导致携带内含子中断的毒素ORF的AAV载体的成功生产。此外，AAV2和AAV9载体以相似的产量产生，说明该AAV载体的生产是普遍性而不是血清型特异性的。

实施例12

该实施例说明由含CMV启动子控制下的DT-A的AAV载体的非特异性杀伤。

由于带有内含子中断的毒素基因的重组杆状病毒能通过转导杀死哺乳动物细胞，我们检测了带有毒素基因的AAV载体是否也能对HEK293细胞发挥杀伤效应。为了测试这种可能性，将HEK293细胞接种在24-孔板上，过夜，并用AAV2和AAV9载体转导。结果显示转导48小时后，用携带DTA或芽孢杆菌RNA酶基因的AAV2或AAV9载体转导的HEK293细胞展现成碎片的细胞形态，细胞进行凋亡的典型现象。相反，用携带GFP基因的AAV2或AAV9载体转导的细胞没有细胞凋亡的迹象(数据未示出)。这些结果证明，内含子被从毒素编码序列中剪接除去以形成成熟mRNA，并且mRNA被翻译成杀死HEK293细胞的毒素蛋白。由于AAV2在体外表现出比AAV9更高的转导效率，选择AAV2用于进一步的体外实验。对HEK293细胞进行细胞增殖测定以进一步证实细胞杀伤效应，结果显示于图17a中。用AAV2-CMV-inDTA(hGH)转导的HEK293细胞被抑制，没有生长迹象，而用AAV2-CMV-GFP转导的细胞生长的如未处理的细胞一样好。此外，进行细胞活力测定以确认AAV2-CMV-inDTA(hGH)对Hep3B细胞的细胞毒性。结果显示于图17b中。观察到良好的剂量-响应曲线。随着携带DTA的AAV2载体的减少，细胞活力增加，然而对于AAV2-CMV-GFP处理的细胞，细胞活力基本上没有变化。

图17说明AAV2-CMV-inDTA(hGH)对哺乳动物细胞的杀伤效应。(a)用AAV2载体转导的293细胞的增殖。将细胞(1.5E+5个细胞/孔)接种在24孔板过夜并用AAV2-CMV-inDTA(hGH)或AAV2-CMV-GFP转导。在不同时间点计数细胞数目。当它们达到融合时，将细胞分进较大的培养区并使其生长。(b)用AAV2载体转导的Hep3B细胞的活力。将Hep3B细胞(3.2E+4个细胞/孔)接种在96孔板过夜并用4倍系列稀释的AAV2-CMV-GFP或AAV2-CMV-inDTA(hGH)转导。用CellTiter Glo Luminescent Cell Viability Assay试剂盒(Promega)测定细胞活力。

图18说明用带有毒性基因的AAV载体转导48小时对人类HEK293细胞的杀伤效应。图像是用20倍镜在钨灯光照(A、B和C)或荧光光照(D)下拍摄的。A，AAV2-CMV-inDTA(hGH)；B，AAV2-CMV-inBar(SV40)-GFP；C，AAV2-CMV-GFP；D，如C显示GFP表达的图像。

在这些实验中，带有具有CMV-inDTA(hGH)或CMV-inBar(SV40)-GFP的AAV的HEK293细胞聚拢在一起并松散地分离，显示严重的CPE。然而，所有用携带GFP的重组杆状病毒转导的HEK293细胞未显示任何CPE迹象，并且生长地如负对照一样好。这些结果证明，在这些哺乳动物细胞中，内含子(hGH内含子或SV40大T抗原内含子)被剪接除去并且DT-A mRNA或芽孢杆菌RNA酶-GFP mRNA形成并被翻译，宿主细胞表达功能性DT-A或芽孢杆菌RNA酶-GFP-融合蛋白，从而杀死宿主HEK293细胞。

实施例13

该实施例说明包含在AFP增强子和启动子序列控制下的，具有被内含子中断的读码框的DT-A基因的AAV载体的生产。

在这些实验中，从由人类胚胎肾脏HEK293细胞纯化的基因组DNA PCR扩增人类AFP增强子和启动子序列。用正向引物5’-CCGCCTTAGAAATATGGGGGTAGGGGTGG-3’(SEQ ID NO：27)(斜体印刷指示MluI限制位点)和反向引物5’-CTCAAACTCTAGTGGCCTGGATAAAGCTGAGTG-3’(SEQ ID NO：28)扩增AFP增强子。用正向引物5’-CTTTATCCAGGCCACTAGAGTTTGAGGAGAATATTTG-3’(SEQ ID NO：29)和反向引物5’-ACTTACCTGACCGGTTGCTAGTTATTTTGTTAT-3’(SEQ ID NO：30)扩增AFP启动子。用上面描述的用于AFP增强子的正向引物和用于AFP启动子的反向引物通过第二轮PCR扩增，将两个PCR片段连接在一起。用MluI和AgeI消化最终的PCR片段，并将其连入pFB-CMV-inDTA(hGH)的MluI和AgeI位点以替换CMV启动子并生成pFB-hAFP-inDTA(hGH)。

通过本文描述的方法在昆虫细胞内生产AAV2-hAFP-inDTA(hGH)至1.69E+15的滴度。

实施例14

该实施例说明包含在人类凋亡抑制蛋白(SURV)启动子序列控制下的，具有被内含子中断的读码框的DT-A基因的AAV载体的生产。

在这些实验中，人类凋亡抑制蛋白(SURV)启动子序列用从人类胚胎肾脏HEK293细胞纯化的基因组DNA，使用正向引物5’-GGGGCTGGCCATAGAACCAGAGAAGTGA-3’(SEQ ID NO：31(斜体印刷指示SpeI限制位点)和反向引物5’-TTTTCACCTCTGCCAACGGGTCCCGCG-3’(SEQ ID NO：32)(斜体印刷指示AgeI限制位点)进行PCR扩增。用SpeI和AgeI消化PCR片段，并将其连入pFB-CMV-inDTA(hGH)的SpeI和AgeI位点以替换CMV启动子并生成pFB-hSURV-inDTA(hGH)。

通过本文描述的方法在昆虫细胞内生产AAV2-hSURV-inDTA(hGH)至1.41E+15vg/升培养物的滴度。

实施例15

该实施例说明包含在人类环氧化酶-2(COX2)启动子序列控制下的，具有被内含子中断的读码框的DT-A基因的AAV载体的生产。

在这些实验中，人类环氧化酶-2(COX2)启动子序列用从人类胚胎肾脏HEK293细胞纯化的基因组DNA，使用正向引物5’-GCCCTGAGGTACCTGGTGTAGTTT-3’(SEQ ID NO：33)(斜体印刷指示SpeI限制位点)和反向引物5’-ATATAGCGGCGGGCAGGGCGCGG-3’(SEQ ID NO：34)(斜体印刷指示AgeI限制位点)进行PCR扩增。用SpeI和AgeI消化PCR片段，并将其连入pFB-CMV-inDTA(hGH)的SpeI和AgeI位点以替换CMV启动子并生成pFB-hCOX2-inDTA(hGH)。

通过本文描述的方法在昆虫细胞内生产AAV2-hCOX2-inDTA(hGH)至2.22E+13vg/升培养物的滴度。

实施例16

该实施例说明包含在人类胆囊收缩素A型受体(CCKAR)启动子序列(Takata,Y.等人,J.Gastroenterol.37:815-820,2002)控制下的，具有被内含子中断的读码框的DT-A基因的AAV载体的生产。

在这些实验中，人类胆囊收缩素A型受体(CCKAR)启动子序列用从人类胚胎肾脏HEK293细胞纯化的基因组DNA，使用正向引物5’-GCCCACCCAGGTACCTATGTTCAAAAAG-3’(SEQ ID NO：35)(斜体印刷指示SpeI限制位点)和反向引物5’-GCGCTTGCCTGCTGCTTTCCACCAAG-3’(SEQ ID NO：36)(斜体印刷指示AgeI限制位点)进行PCR扩增。用SpeI和AgeI消化PCR片段，并将其连入pFB-CMV-inDTA(hGH)的SpeI和AgeI位点以替换CMV启动子并生成pFB-hCCKAR-inDTA(hGH)。

通过本文描述的方法在昆虫细胞内生产AAV2-hCCKAR-inDTA(hGH)至1.96E+14vg/升培养物的滴度。

实施例17

该实施例说明包含在人类CXCR4基因启动子序列(Caruz,M等人,FEBSLetters,426:271-278,1998)控制下的，具有被内含子中断的读码框的DT-A基因的AAV载体的生产。

在这些实验中，人类CXCR4基因启动子序列用从人类胚胎肾脏HEK293细胞纯化的基因组DNA，使用正向引物5’-GCCCTACCGACCACCCGCAAACAG-3’(SEQ ID NO：37)(斜体印刷指示SpeI限制位点)和反向引物5’-GCGCTAACCGCTGGTTCTCCAGA-3’(SEQ ID NO：38)(斜体印刷指示AgeI限制位点)进行PCR扩增。用SpeI和AgeI消化PCR片段，并将其连入pFB-CMV-inDTA(hGH)的SpeI和AgeI位点以替换CMV启动子并生成pFB-hCXCR4-inDTA(hGH)。

通过本文描述的方法在昆虫细胞内生产AAV2-hCXCR4-inDTA(hGH)至1.81E+15vg/升培养物的滴度。

实施例18

该实施例说明通过携带肿瘤特异性启动子控制下的DT-A的AAV载体的肿瘤特异性杀伤。

在这些实验中，将细胞接种在24孔板并用上面描述的携带各种肿瘤特异性启动子控制下的DT-A的AAV2载体转导。结果显示，神经母细胞瘤BE(2)-M17细胞被hSURV或hCXCR4而不是hAFG启动子控制下的DT-A杀死，然而肝细胞癌Hep3B和HepG2细胞被AFG、SURV或CXCR4启动子控制下的DT-A杀死。正常人类肺细胞系W138不被AFG、SURV或hTERT启动子控制下的DT-A影响。图19说明了通过AAV2-hSURV-inDTA(hGH)的代表性的细胞杀伤结果。在这些实验中，将细胞接种在24孔板并用AAV2-CMV-GFP(a)、(c)、(e)和(g)或AAV2-hSURV-inDTA(hGH)(b)、(d)、(f)和(h)转导。转导后3天拍摄照片。(a)和(b)，W138；(c)和(d)，HepG2；(e)和(f)，Hep3B；(g)和(h)，BE(2)-M17细胞。

所述三种肿瘤细胞学也用人类COX2、CCKAR和hTERT启动子控制下的DTA进行测试，但是未观察到明显的细胞杀伤效应。为进一步表征细胞杀伤效应，用AFP、SURV和CXCR4启动子控制下的DTA进行细胞活力测定。图20说明了被携带各种肿瘤特异性启动子控制下的DT-A的AAV2载体处理的肿瘤细胞的细胞活力测定。在这些实验中，将细胞接种在96孔板并用4倍系列稀释的AAV2载体转导4天，用CellTiter Glo Luminescent Cell Viability Assay试剂盒测定细胞活力。(a)HepG2细胞，(b)Hep3B细胞，以及(c)BE(2)-M17细胞。所有三个肿瘤特异性启动子均在HepG2细胞内显示转录活性。其中，当使用高滴度AAV2载体时，CXCR4启动子表现出最高的驱使DTA杀死HepG2细胞的活性(图20a)。对Hep3B细胞，SURV启动子控制下的DTA表现出最强杀伤效应，然而AFP和CXCR4显示部分杀伤活性(图20b)。有趣的是，在BE(2)-M17细胞内AFP启动子无活性，然而CXCR4和SURV启动子控制下的DTA表现出强杀伤效应(图20c)。

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Claims (65)

1.一种核酸，包含：

编码毒性多肽的序列；和

中断所述序列的内含子，从而所述内含子在哺乳动物细胞内而不是昆虫细胞内被剪接形成mRNA，所述mRNA在哺乳动物细胞内而不是昆虫细胞内被翻译形成细胞毒性水平的毒性多肽。

2.根据权利要求1所述的核酸，其中所述毒性多肽选自由白喉毒素(DT-A)、芽孢杆菌RNA酶、蓖麻毒素、红豆素和绿脓杆菌外毒素组成的组。

3.根据权利要求1所述的核酸，其中所述毒性多肽是白喉毒素(DT-A)。

4.根据权利要求1所述的核酸，其中所述毒性多肽是芽孢杆菌RNA酶多肽。

5.根据权利要求1所述的核酸，进一步包含至少一种与所述序列可操作地连接的表达元件。

6.根据权利要求5所述的核酸，其中所述表达元件选自由启动子、IRES、增强子及它们的组合组成的组。

7.根据权利要求5所述的核酸，其中所述表达元件选自由CMV启动子、AFP启动子、AFP增强子、hSURV启动子、CXCR4启动子、hTERT启动子、COX2启动子和CCKAR启动子组成的组。

8.根据权利要求5所述的核酸，其中所述表达元件选自由hSURV启动子和CXCR4启动子组成的组。

9.根据权利要求1-8任一项所述的核酸，其中所述内含子是人工内含子。

10.根据权利要求1-8任一项所述的核酸，其中所述内含子是人类生长激素内含子。

11.根据权利要求1-8任一项所述的核酸，其中所述内含子是SV40大T-抗原内含子。

13.根据权利要求1-8任一项所述的核酸，按5’至3’顺序包括：第一ITR、启动子、毒性基因的第一部分、内含子、毒性基因的第二部分、多腺苷酸化信号和第二ITR。

14.根据权利要求13所述的核酸，其中所述第一ITR是AAV ITR。

15.根据权利要求13所述的核酸，其中所述第二ITR是AAV ITR。

16.根据权利要求13所述的核酸，其中所述启动子是CMV启动子。

17.根据权利要求13所述的核酸，其中所述启动子是hSURV启动子。

18.根据权利要求13所述的核酸，其中所述启动子是hCXCR4启动子。

19.根据权利要求13所述的核酸，其中所述启动子是hAFP启动子。

20.根据权利要求13所述的核酸，其中所述毒素基因编码DT-A。

21.根据权利要求13所述的核酸，其中所述毒性基因编码芽孢杆菌RNA酶。

22.一种包含权利要求1-8任一项所述的核酸的病毒载体。

23.根据权利要求22所述的病毒载体，其中所述载体选自由杆状病毒、反转录病毒、腺病毒、腺相关病毒(AAV)及它们的组合组成的组。

24.根据权利要求22所述的病毒载体，其中所述载体是杆状病毒、腺相关病毒(AAV)或它们的组合。

25.根据权利要求22所述的病毒载体，其中所述载体是腺相关病毒(AAV)。

26.根据权利要求22所述的病毒载体，其中所述载体是AAV2。

27.根据权利要求22所述的病毒载体，其中所述载体是AAV9。

28.根据权利要求22所述的病毒载体，其中所述载体包含ITR。

29.一种包含权利要求1-8任一项所述的核酸的离体昆虫细胞。

30.根据权利要求29所述的昆虫细胞，其中所述细胞选自由粉纹夜蛾BT1-Tn-5B1-4细胞、草地贪夜蛾Sf9细胞和草地贪夜蛾Sf21细胞组成的组。

31.根据权利要求29所述的昆虫细胞，其中所述核酸被病毒基因组包含。

32.根据权利要求29所述的昆虫细胞，其中所述核酸被病毒包含。

33.根据权利要求29所述的昆虫细胞，其中所述细胞用权利要求1-8任一项所述的核酸稳定转化。

34.一种细胞培养物，包含：

许多权利要求29所述的细胞；和

培养基。

35.根据权利要求34所述的细胞培养物，其中未浓缩的培养基包含超过109病毒基因组/ml。

36.根据权利要求34所述的细胞培养物，其中未浓缩的培养基包含超过1010病毒基因组/ml。

37.根据权利要求34所述的细胞培养物，其中未浓缩的培养基包含超过1011病毒基因组/ml。

38.根据权利要求34所述的细胞培养物，其中未浓缩的培养基包含超过1012病毒基因组/ml。

39.根据权利要求34所述的细胞培养物，其中未浓缩的培养基包含超过106PFU/ml的杆状病毒。

40.根据权利要求34所述的细胞培养物，其中未浓缩的培养基包含超过107PFU/ml的杆状病毒。

41.根据权利要求34所述的细胞培养物，其中未浓缩的培养基包含超过108PFU/ml的杆状病毒。

42.根据权利要求34所述的细胞培养物，其中未浓缩的培养基包含超过109PFU/ml的杆状病毒。

43.一种体外增殖含毒性基因的载体的方法，包括：

提供含昆虫细胞的细胞培养物；

用权利要求1-8任一项所述的核酸感染或转染所述细胞；和

在适于病毒生产的条件下培养所述细胞。

44.一种治疗癌症的方法，包括向需要治疗的受试者施用治疗有效量的权利要求1-8任一项所述的核酸。

45.一种治疗癌症的方法，包括向需要治疗的受试者施用治疗有效量的包含权利要求1-8任一项所述的核酸的腺相关病毒。

46.根据权利要求45所述的治疗癌症的方法，其中所述癌症选自由前列腺癌、乳腺癌、脑瘤、宫颈癌和鼻咽癌组成的组。

47.权利要求1-8任一项所述的核酸用于癌症治疗的用途。

48.用于癌症治疗的根据权利要求1-8任一项所述的核酸。

49.权利要求1-8任一项所述的核酸在制造用于治疗癌症的药物中的用途。

50.权利要求22所述的病毒载体用于治疗癌症的用途。

51.用于治疗癌症的权利要求22所述的病毒载体。

52.权利要求22所述的病毒载体在制造用于治疗癌症的药物中的用途。

53.一种体外生产包含毒性基因的AAV的方法，包括：

提供含昆虫细胞的细胞培养物；

用权利要求24所述的病毒载体和用Bac-inCap-inRep感染细胞至少大约1天；和

裂解所述细胞形成包含所述AAV的裂解物。

54.根据权利要求53所述的方法，其中所述感染细胞至少大约1天包括感染所述细胞至少2天。

55.根据权利要求53所述的方法，其中所述感染细胞至少大约1天包括感染所述细胞至少3天。

56.根据权利要求53所述的方法，其中所述感染细胞至少大约1天包括感染所述细胞大约3天。

57.根据权利要求53所述的方法，其中所述感染细胞至少大约1天包括感染所述细胞至少4天。

58.根据权利要求53所述的方法，其中所述感染细胞至少大约1天包括感染所述细胞至少5天。

59.根据权利要求53所述的方法，其中所述感染细胞至少大约1天包括感染所述细胞多达大约5天。

60.根据权利要求53所述的方法，其中所述感染细胞至少大约1天包括感染所述细胞多达大约6天。

61.根据权利要求53所述的方法，其中所述感染细胞至少大约1天包括感染所述细胞多达大约7天。

62.根据权利要求53所述的方法，进一步包括用核酸酶消化所述细胞碎片。

63.根据权利要求53所述的方法，其中所述AAV是AAV2。

64.根据权利要求53所述的方法，其中所述AAV是AAV9。

65.根据权利要求53所述的方法，其中所述昆虫细胞选自由粉纹夜蛾BT1-Tn-5B1-4细胞、草地贪夜蛾Sf9细胞、草地贪夜蛾Sf21细胞及它们的任意组合组成的组。

66.根据权利要求53所述的方法，其中所述昆虫细胞为草地贪夜蛾Sf9细胞。