CN107586760A - 一种猪圆环病毒2型病毒样颗粒的纯化方法及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种猪圆环病毒2型病毒样颗粒的纯化方法及其应用，包括如下步骤：将表达猪圆环病毒2型病毒样颗粒的培养物进行澄清，收集上清液并用二乙烯亚胺灭活，以得到半成品；调节半成品的pH值偏酸性；将调节pH值后的半成品加入到用第一缓冲液平衡过的强阳离子交换柱中，并用第二缓冲液洗脱强阳离子交换柱，收集各个出峰组分；用聚丙烯酰胺凝胶电泳确定的各个峰的活性蛋白组分。根据本发明的纯化方法得到的猪圆环病毒2型病毒样颗粒纯度高达87.40％，回收率高达95％，且本发明的一种猪圆环病毒2型病毒的纯化方法利于生产操作，为猪圆环病毒2型杆状病毒载体灭活疫苗的制备提供了更加安全可靠的途径。

Description

一种猪圆环病毒2型病毒样颗粒的纯化方法及其应用

技术领域

本发明涉及生物制品分离纯化技术领域，具体涉及一种猪圆环病毒2型病毒样颗粒的纯化方法及其应用。

背景技术

猪圆环病毒2型(Porcine circovirus type 2,PCV2)是断奶仔猪多系统衰竭综合症(PMWS)的必须病原，并破坏猪体免疫系统，导致猪繁殖与呼吸系统综合症病毒、伪狂犬病毒以及副猪嗜血杆菌等继发感染，给养猪带来了巨大的经济损失。疫苗免疫接种可以有效的控制PCV2的感染。

迄今为止，国内普遍应用的疫苗主要为全病毒灭活疫苗和杆状病毒表达的重组亚单位疫苗，相对于全病毒灭活疫苗而言，亚单位疫苗具有抗原表达量高的优点，但杆状病毒表达的重组亚单位疫苗在临床应用中存在一些过敏反应(如呕吐、震颤等)，这些副反应的产生主要是由于亚单位疫苗未经纯化而引起的。

发明内容

本发明的一个目的在于提出一种高纯度、高得率、利于生产操作的纯化猪圆环病毒2型病毒样颗粒的方法。

根据本发明的一种猪圆环病毒2型病毒样颗粒的纯化方法，包括如下步骤：S101：将表达猪圆环病毒2型病毒样颗粒的培养物进行澄清，收集上清液并用二乙烯亚胺灭活，以得到半成品；S102：调节半成品的pH值至偏酸性；S103：将调节pH值后的半成品加入到用第一缓冲液平衡过的强阳离子交换柱中，并用第二缓冲液洗脱强阳离子交换柱，收集各个出峰组分；S104：用聚丙烯酰胺凝胶电泳确定的各个峰的活性蛋白组分。

根据本发明实施例的纯化方法得到的猪圆环病毒2型病毒样颗粒纯度高达87.40％，回收率高达95％，且本发明的一种猪圆环病毒2型病毒样颗粒的纯化方法利于生产操作，为猪圆环病毒2型杆状病毒载体灭活疫苗的制备提供了更加安全可靠的途径。

另外，根据本发明上述实施例的一种猪圆环病毒2型病毒样颗粒的纯化方法，还可以具有如下附加的技术特征：

进一步地，猪圆环病毒2型病毒样颗粒培养物的获取包括如下步骤：用嵌合有编码猪圆环病毒2型蛋白基因的杆状病毒感染昆虫细胞，培养昆虫细胞，以得到表达猪圆环病毒2型病毒样颗粒的培养物。

进一步地，培养昆虫细胞时采用无血清培养基，培养温度为25℃～30℃，转速为130rpm～150rpm，培养时间为96h～144h。

进一步地，培养昆虫细胞时采用无血清培养基，培养温度为27℃，转速为140rpm，培养时间为96h～120h。

进一步地，在步骤S102中，pH值为6.5～6.8。

进一步地，在步骤S103中，第一缓冲液包括20mM的PBS和0.1M的NaCl，第一缓冲液的pH为6.8；第二缓冲液包括20mM PBS和0.1M NaCl，第二缓冲液的pH为8.0。

进一步地，在步骤S103中，第二缓冲液的体积为强阳离子交换柱体积的3～5倍。

本发明的另一目的在于保护一种含有通过上述的一种猪圆环病毒2型病毒样颗粒的纯化方法得到的猪圆环病毒2型病毒样颗粒的疫苗。

本发明的附加方面和优点将在下面的描述中部分给出，部分将从下面的描述中变得明显，或通过本发明的实践了解到。

附图说明

图1是根据本发明的一种猪圆环病毒2型病毒样颗粒的纯化方法得到的的离子交换层析色谱；

图2是根据本发明的一种猪圆环病毒2型病毒样颗粒的纯化方法得到的各组分的聚丙烯酰胺凝胶电泳图。

具体实施方式

下面详细描述本发明的实施例。下面通过参考附图描述的实施例是示例性的，旨在用于解释本发明，而不能理解为对本发明的限制。

实施例1

实施例1是根据本发明的纯化方法中的猪圆环2型病毒半成品的制备过程。

将编码猪圆环病毒2型病毒样颗粒基因的核苷酸序列连接到杆状病毒，构建重组杆状病毒毒种，毒种感染昆虫细胞(Sf9细胞)，Sf9细胞培养条件为27℃、140rpm、96h～120h。当细胞裂解释放病毒后，收集毒液并由二乙烯亚胺(BEI)灭活后获得的猪圆环病毒2型病毒样颗粒。

将灭活后的毒液澄清去除沉淀，用0.2M Na₂HPO₄调节半成品pH在6.5～6.8左右，得猪圆环病毒2型病毒样颗粒纯化前半成品。

实施例2猪圆环病毒2型病毒样颗粒的纯化

1)强阳离子交换层析

将经过预处理的半成品加入到用PBS缓冲液A(20mM PBS，0.1M NaCl，pH＝6.8)平衡好的强阳离子交换柱中，用PBS缓冲液B(20mM PBS，1.0M NaCl，pH＝8.0)进行洗脱，洗脱体积为3个柱体积，流速为2.0ml/min，并收集各出峰组分，强离子交换层析谱图如图1所示。

2)聚丙烯酰氨凝胶电泳(SDS-PAGE)确定活性蛋白组分

取各个阶段样品80μl于1.5ml EP管中，再加入20μl 5×SDS-PAGE上样缓冲液，混匀。各个EP管置于沸水浴中5min，4000rpm离心3min，得到SDS-PAGE样品，各组分SDS-PAGE如图2所示，图2中，泳道M：蛋白分子Marker；泳道1：猪圆环病毒2型病毒样颗粒培养液；泳道2：层析流穿液；泳道3：猪圆环病毒2型病毒样颗粒纯化样品。

3)猪圆环病毒2型病毒样颗粒纯化回收率

利用猪圆环病毒2型病毒样颗粒定量检测试剂盒检测各个纯化组分的猪圆环病毒2型病毒样颗粒含量(参照扬州优邦生物药品有限公司猪圆环病毒2型病毒样颗粒样颗粒含量Elisa检测试剂盒)，BCA法测定总蛋白含量(参照南京诺唯赞生物科技有限公司BCA蛋白浓度测定试剂盒)。半成品中的猪圆环病毒2型病毒样颗粒含量为83.1μg/ml(体积为100ml)；上样流穿液中的猪圆环病毒2型病毒样颗粒含量为0.49μg/ml(体积为100ml)；洗脱液中猪圆环病毒2型病毒样颗粒含量为342.75μg/ml(体积为23ml)。结果显示：猪圆环病毒2型病毒样颗粒半成品经过一步强阳离子交换层析后，纯化倍数为33，病毒纯度达87.40％，回收率高达95％，具体结果见表1。

表1 猪圆环病毒2型病毒样颗粒纯化效果分析

实施例3

实施例3是含有通过上述的一种猪圆环病毒2型病毒样颗粒的纯化方法得到的猪圆环病毒2型病毒样颗粒的疫苗的安全性检验。

1、实验疫苗猪圆环病毒2型病毒样颗粒纯化前、后样品加入同样的适量的佐剂制备疫苗。

2、试验猪仔猪购自镇江市丹徒区云立牧业有限公司，经检测猪圆环病毒2型抗原抗体均为阴性。

3、实验方法

3.1 单剂量接种安全性实验

选取2周龄～3周龄的仔猪，将纯化前后的病毒制备的疫苗分别颈部肌肉注射200头仔猪，1ml/头。注射后每日观察各组猪精神状况、饮水、进食量等情况；有无过敏反应；免疫后21日每日测量体温，并观察有无一过性热反应；免疫后7日、14日、21日触摸检查各免疫组猪注射部位，是否有红肿等局部注射炎症反应。

3.2 加倍剂量接种安全性试验

选取2周龄～3周龄断奶仔猪，纯化前后病毒制备的疫苗分别颈部肌肉注射200头仔猪，2ml/头。注射后每日观察各组猪精神状况、饮水、进食量等情况；有无过敏反应；免疫后21日每日测量体温，并观察有无一过性热反应；免疫后7日、14日、21日触摸检查各免疫组猪注射部位，是否有红肿等局部注射炎症反应。

4、结果

仔猪安全性试验结果表明，单倍剂量免疫试验中，纯化前病毒制备的疫苗免疫仔猪后出现呕吐反应、体温升高、局部炎症反应的比例分别为7.5％、2.5％和6％；纯化后的病毒制备的疫苗免疫后未发生免疫副反应。双倍剂量接种组猪免疫试验中，纯化前病毒制备的疫苗免疫仔猪后出现呕吐反应、体温升高、局部炎症反应的比例分别为17.5％、6.5％和20％；纯化后的病毒制备的疫苗免疫仔猪后均未出现呕吐反应、体温升高、局部炎症等副反应案例(见表2)。

表2 仔猪安全性试验

通过以上试验结果可见，应用强阳离子交换层析(CaptoTM SP ImRes，GEHealthcare，US)纯化猪圆环病毒2型病毒样颗粒与适量佐剂混合制备的疫苗，对仔猪安全可靠更高，可以显著提高现有猪圆环病毒2型杆状病毒载体灭活疫苗的安全性。

在本发明的描述中，术语“第一”、“第二”仅用于描述目的，而不能理解为指示或暗示相对重要性或者隐含指明所指示的技术特征的数量。由此，限定有“第一”、“第二”的特征可以明示或者隐含地包括一个或者更多个该特征。在本发明的描述中，“多个”的含义是两个以上，除非另有明确具体的限定。

在本说明书的描述中，参考术语“一个实施例”、“一些实施例”、“示例”、“具体示例”、或“一些示例”等的描述意指结合该实施例或示例描述的具体特征、结构、材料或者特点包含于本发明的至少一个实施例或示例中。在本说明书中，对上述术语的示意性表述不必须针对的是相同的实施例或示例。而且，描述的具体特征、结构、材料或者特点可以在任一个或多个实施例或示例中以合适的方式结合。此外，在不相互矛盾的情况下，本领域的技术人员可以将本说明书中描述的不同实施例或示例以及不同实施例或示例的特征进行结合和组合。

尽管上面已经示出和描述了本发明的实施例，可以理解的是，上述实施例是示例性的，不能理解为对本发明的限制，本领域的普通技术人员在本发明的范围内可以对上述实施例进行变化、修改、替换和变型。

Claims (8)

1.一种猪圆环病毒2型病毒样颗粒的纯化方法，其特征在于，包括如下步骤：

S101：将表达猪圆环病毒2型病毒的培养物进行澄清，收集上清液并用二乙烯亚胺灭活，以得到半成品；

S102：调节所述半成品的pH值至偏酸性；

S103：将所述调节pH值后的半成品加入到用第一缓冲液平衡过的强阳离子交换柱中，并用第二缓冲液洗脱所述强阳离子交换柱，收集各个出峰组分；

S104：用聚丙烯酰胺凝胶电泳确定所述的各个峰的活性蛋白组分。

2.根据权利要求1所述的一种猪圆环病毒2型病毒样颗粒的纯化方法，其特征在于，所述猪圆环病毒2型病毒样颗粒培养物的获取包括如下步骤：用嵌合有编码猪圆环病毒2型蛋白基因的杆状病毒感染昆虫细胞，培养所述昆虫细胞，以得到表达猪圆环病毒2型病毒样颗粒的培养物。

3.根据权利要求2所述的一种猪圆环病毒2型病毒样颗粒的纯化方法，其特征在于，培养所述昆虫细胞时采用无血清培养基，培养温度为25℃～30℃，转速为130rpm～150rpm，培养时间为96h～144h。

4.根据权利要求3所述的一种猪圆环病毒2型病毒样颗粒的纯化方法，其特征在于，培养所述昆虫细胞时采用无血清培养基，培养温度为27℃，转速为140rpm，培养时间为96h～120h。

5.根据权利要求1所述的一种猪圆环病毒2型病毒样颗粒的纯化方法，其特征在于，在步骤S102中，所述pH值为6.5～6.8。

6.根据权利要求1所述的一种猪圆环病毒2型病毒样颗粒的纯化方法，其特征在于，在步骤S103中，所述第一缓冲液包括20mM的PBS和0.1M的NaCl，所述第一缓冲液的pH为6.8；所述第二缓冲液包括20mM PBS和0.1M NaCl，所述第二缓冲液的pH为8.0。

7.根据权利要求1所述的一种猪圆环病毒2型病毒样颗粒的纯化方法，其特征在于，在步骤S103中，所述第二缓冲液的体积为所述强阳离子交换柱体积的3～5倍。

8.一种含有根据权利要求1～7任一项所述的一种猪圆环病毒2型病毒样颗粒的纯化方法得到的猪圆环病毒2型病毒样颗粒的疫苗。