CN101333540A - 一种能快速检测外源蛋白表达的光合细菌表达体系及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种能快速检测外源蛋白表达的光合细菌表达体系及其应用，该能检测外源蛋白表达的表达体系包含表达载体和目的蛋白的诱导表达及分离纯化两部分，其中表达载体含puc操纵子序列。本发明通过将目的蛋白连接在pucA或pucB基因后构建成融合蛋白，就可根据光合细菌在800nm和850nm处是否有特征吸收峰出现来判断目的蛋白是否表达，并根据其峰值和面积推测目的蛋白的表达量，从而大大简化了检测外源目的蛋白是否在表达体系内表达的操作程序并节省了实验时间。

Description

一种能快速检测外源蛋白表达的光合细菌表达体系及其应用

技术领域

本发明涉及一种蛋白表达体系，尤其涉及一种能快速检测外源蛋白表达的表达体系及其制备方法与应用。

背景技术

大肠杆菌表达体系和酵母表达体系是当今研究得比较成熟并被广泛使用的原核和真核表达体系，大肠杆菌和酵母成为重组蛋白的理想表达宿主。但利用当前这些表达体系表达目的蛋白或多肽时，必需首先小量初提目的蛋白，采用SDS-PAGE、Western Blot等常规方法检测外源目的蛋白是否表达，表达量如何，经上述常规方法分析表明目的蛋白已获得大量表达后，才大量提取纯化目的蛋白。在这些表达体系内采用现有常规方法检测目的蛋白的表达情况，操作比较繁琐且耗时。

光合细菌提供了解决上述缺陷的新思路。类球红细菌Rhodobacter sphaeroides是一种革兰氏阴性光合细菌，属于紫色非硫细菌科红细菌属。它能够以好氧、厌氧、发酵和厌氧光合作用等多种代谢方式生长，成为研究细菌光合作用的重要的模式生物。在进行光合作用的过程中，捕光系统2(LH2)吸收光能，然后经捕光系统1(LH1)传递到光化学反应中心(RC)，在RC中发生电荷分离并经过一系列的电子传递，最后在ADP和ATP合成酶的作用下合成ATP。

LH2、LH1和RC构成光合细菌的捕光系统，对光合细菌的光合作用及维持其生存起着重要的作用。研究表明，LH2和LH1是由α/β亚基组成的异质二聚体，α亚基分布在二聚体的内部，β亚基分布于二聚体的外部。LH2由8或9对α/β亚基组成，而LH1包含16对α/β亚基，RC的结构和LH2、LH1有所不同，它由H、M、L三个亚基组成。LH2和LH1都能够非共价地结合细菌叶绿素(BChl)和类胡萝卜素(Crt)，研究发现，LH2中每个α/β亚基非共价地结合了3个BChl和1个Crt分子，LH1中每个α/β亚基非共价地结合了2个BChl和2个Crt分子。LH2结合BChl和Crt分子后使得其在800nm和850nm处有特征吸收峰，而LH1在875nm处有特征吸收峰。BChl分子的主要作用是吸收光能，Crt分子的作用是保护光合机构免受光氧化作用破坏、驱散多余的辐射能量并有助于维持LH2的结构。

在LH2中α和β亚基大小分别是5.457KDa和6.809KDa，分别由puc操纵子(puc operon)中的结构基因pucA和pucB编码。此外，puc操纵子中的结构基因pucC能够引导α亚基和β亚基进入内膜系统，它对α亚基和β亚基正确组装成有功能的LH2起着重要的作用。puc操纵子的表达受到一系列调控蛋白的调控，如PrrA/PrrB，PpsR/CrtJ，AerR，AppA，FnrL，IHF，TspO等，只有在氧气浓度较低的情况下才能表达。当在合适的氧气浓度下，光合细菌的内膜会自动凹陷，极大的增加了光合细菌的内膜系统，为膜蛋白的表达提供了大量的空间，为了填充这些空间，光合细菌puc操纵子中的结构基因pucB、pucA和pucC大量表达，并迅速在内膜上组装成捕光系统2。光合细菌的这种特性为在其中表达外源蛋白质提供了理论和现实依据，使其具有开发成为一种新的蛋白质表达体系的潜力，具有极大的应用前景。同时，在一定的时间范围内，诱导时间越长，光合细菌的特征吸收峰峰值和面积越大，特征吸收峰的峰值和面积与α和β亚基组装成的LH2的含量相关，即特征吸收峰的峰值和面积间接地表示了α和β亚基的含量。

发明内容

本发明的一个目的是提供一种能快速检测外源蛋白表达的表达体系，它包含表达载体和目的蛋白的诱导表达及分离纯化两部分，其中表达载体含puc操纵子序列，该puc操纵子包括结构基因pucB，pucA和pucC。

本发明的优选实施例中，上述的puc操纵子获自类球红细菌。

本发明的优选实施例中，所述的表达载体包括pRK-CH或pRK-AH，目的蛋白基因序列可以通过限制性内切酶位点Sac I和Xba I连接到上述表达载体上形成目的融合蛋白表达载体，使其目的蛋白的5’端带有Xa因子，3’末端带有组氨酸标记，便于目的蛋白的分离纯化。

本发明的优选实施例中，所述的表达载体pRK-CH的制备方法在公开号为CN101148679A的专利申请中描述。

本发明的优选实施例中，所述的表达载体pRK-AH的制备方法在本发明的优选实施例一中描述，使用引物包括SEQ ID NO：2-SEQ ID NO：3所示的核苷酸序列，其PCR克隆产物具有SEQ ID NO：4所示的核苷酸序列，通过酶切连接，最终获得的表达载体pRK-AH的核苷酸序列为SEQ ID NO：1所示。

本发明还有一个目的是提供上述的能快速检测外源蛋白表达的表达体系的构建方法，其主要包括以下步骤：

1)目的蛋白基因的克隆；

2)步骤1)获得的目的蛋白基因与表达载体连接，获得含有目的蛋白基因的融合蛋白表达载体；

3)步骤2)获得的融合蛋白表达载体通过大肠杆菌S17-1接合转移到类球红细菌突变株DD13，构建成目的融合蛋白的工程菌；

4)目的融合蛋白工程菌的诱导表达；

5)光谱分析检测步骤4)所得的目的融合蛋白的表达情况；

6)目的融合蛋白的提取和分离纯化。

本发明的优选实施例中，步骤1)中进行目的蛋白基因的克隆时需使用引物，该引物包括SEQ ID NO：5-SEQ ID NO：10所示的核苷酸序列，目的蛋白基因的克隆产物具有SEQ IDNO：11-SEQ ID NO：13所示的核苷酸序列。

本发明的优选实施例中，步骤2)中所述的表达载体包括pRK-CH或pRK-AH；

本发明的优选实施例中，步骤3)中所述的类球红细菌突变株DD13为缺失LH2、LH1和RC基因的菌株。

本发明的优选实施例中，步骤4)所述的诱导表达方法为：黑暗和半厌氧条件下，添加IPTG至终浓度1mM；

本发明的优选实施例中，步骤5)所述的光谱分析方法为：采用紫外/可见分光光度计直接在700nm-880nm波段扫描分析步骤4)所述诱导表达后的工程菌发酵液；

本发明的优选实施例中，步骤6)所述的目的融合蛋白的提取和分离纯化方法为：步骤4)所得工程菌发酵液经离心收集菌体，并用机械破碎法破碎细胞，然后采用高速和超高速离心法将破碎细胞的可溶性蛋白和膜蛋白分离开，用LDAO去垢剂处理总膜蛋白，最后采用组氨酸亲和层析法分离纯化目的融合蛋白；

本发明所述的可快速检测外源蛋白表达的表达体系可用于蛋白质或多肽的表达。

本发明根据类球红细菌的内膜在氧气浓度较低的情况会自动内陷为膜蛋白的生物合成提供足够空间的特性，以及puc操纵子中的结构基因pucB、pucA和pucC表达后在800nm和850nm处具有特征吸收峰的特点，采用类球红细菌puc操纵子的结构基因pucB，pucA和pucC构建外源蛋白表达载体，将目的蛋白基因连结到pucB或pucA基因序列之后构建成pucB或pucA融合蛋白表达载体，该融合蛋白表达载体转移到类球红细菌突变株DD13(基因组缺失LH2、LH1和RC基因)中，然后筛选鉴定阳性转化子，发酵培养诱导表达目的融合蛋白，通过近红外光谱分析快速检测融合蛋白的表达情况，待融合蛋白大量表达后通过离心和组氨酸亲和层析对其进行快速有效的分离纯化。该发明可用于蛋白质和多肽的表达，并能快速检测外源蛋白的表达情况。

本发明的优点是：(1)光合细菌表达出α亚基和β亚基并在膜上组装出LH2后，在800nm和850nm处有显著的光谱吸收，依此可以判断pucBA基因是否表达，本发明中外源蛋白基因可以和pucB或pucA基因融合在一起，因此，在不提取蛋白质的情况下，对光合细菌发酵液进行近红外光谱分析，根据在800nm和850nm处有无光谱吸收即可判断外源蛋白质是否表达，相对于现有的外源蛋白质表达体系来说，利用该体系表达外源目的蛋白，可以实时监控目的蛋白的表达情况，操作简便，节约时间。(2)目的蛋白的N-末端带有肠激酶识别位点，C-末端带有His-tag序列，可以利用组氨酸亲和层析快速纯化融合蛋白，然后将融合蛋白N端连接的α亚基或β亚基剪切，纯化出目的蛋白，使蛋白质的纯化过程简化。

为让本发明的上述和其它目的、特征和优点能更明显易懂，下文特举较佳实施例，并配合附图，作详细说明如下。

附图说明

图1为本发明的一优选实施例的表达载体pRK-AH构建过程示意图；

图2为本发明的一优选实施例的融合蛋白表达载体pRK-CH-GST构建过程示意图；

图3为本发明一优选实施例的的融合蛋白表达载体pRK-CH-GFP构建过程示意图；

图4为本发明一优选实施例的的融合蛋白表达载体pRK-CH-GUS构建过程示意图；

图5为本发明一优选实施例的的融合蛋白表达载体的酶切验证示意图；

图6为本发明一优选实施例的近红外光谱分析示意图；

图7为本发明一优选实施例的融合蛋白的Western Blot图；

图8为本发明一优选实施例的步骤示意图。

具体实施方式

材料：

1.PrimeSTAR^TM HS DNA聚合酶(Takara公司产品，中国大连)

2.各种限制性内切酶(Takara公司产品，中国大连)

3.连接试剂盒DNA Ligation Kit Ver.2.0(Takara公司产品，中国大连)

4.DNA纯化试剂盒、离心柱型普通琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒(TIANGEN公司产品，中国北京)

5.DNA提取试剂盒Universal Genomic DNA Extraction Kit Ver.3.0(Takara公司产品，中国大连)

6.一抗Anti-His Antibody、二抗羊抗鼠IgG-HRP和Western Blot封闭液(TIANGEN公司产品，中国北京)

7.LDAO(SIGMA公司产品，Switzerland)

8.HiTrap^TM prepacked columns亲和层析预装柱(Pharmacia公司产品，美国)

9.大肠杆菌JM109感受态细胞(Takara公司产品，中国大连)

10.大肠杆菌S17-1(美国典型微生物菌种保藏中心，保藏登记号为：ATCC No.47055，保藏时间：1960)

11.类球红细菌RS-1(英国国家菌种保藏中心，保藏登记号为：UKNCC No.8253，保藏时间：1956)

12.质粒pGEX-6P-3(Amersham公司产品，瑞典)

13.pGFP(Clontech公司产品，美国)

14.pCAMBIA-1301(CAMBIA公司产品，英国)

注：以下试剂均为市售产品。

15.LB培养基

酵母提取物  5g

胰蛋白胨    10g

NaCl        10g

固体培养基：加入1.5％(w/v)琼脂粉

溶于1000ml去离子水中，并用1mol/L的NaOH调节pH值至7.0，高压蒸汽灭菌。

16.M22+培养基

固体M22+：向100ml 10×M22储备液中加入900ml去离子水和15g琼脂粉，混匀，高压蒸汽灭菌。使用之前使固体培养基溶解，降温到60℃时加入1ml过滤灭菌的1000×维生素混合液。

其中：10×M22储备液的配制

KH₂PO₄         30.6g

K₂HPO₄.3H₂O    30g

乳酸钠         25g

(NH4)₂SO₄      5g

NaCl           5g

琥珀酸钠       43.425g

谷氨酸钠       2.7g

天冬氨酸       0.4g

Solution C     200ml

去离子水定容到1000ml，用NaOH调节pH值至6.8，高压蒸汽灭菌。

其中：Solution C的配制

MgCl₂.6H₂O          24g

CaCl₂               3.34g

EDTA.Na₂.2H₂O       0.125g

ZnCl₂               0.261g

FeCl₂.4H₂O          0.25g

MnCl₂.4H₂O          0.09g

(NH₄)₆Mo₇O₂₄·4H₂O  0.009g

CuCl₂.2H₂O          0.008g

Co(NO₃)₂.6H₂O       0.0124g

硼酸                0.0057g

氮川三乙酸          10g

去离子水定容到1000ml，-20℃保存，无需灭菌。

其中：1000×维生素混合液的配制

烟酸             1g

硫胺素           0.5g

对氨基苯甲酸     0.1g

生物素           0.01g

去离子水定容到1000ml，过滤灭菌，-20℃保存。

液体M22+：在超净工作台上向一经过高压蒸汽灭菌的1L培养瓶中分别加入100ml高压蒸汽灭菌的10×M22储备液，1ml过滤灭菌的1000×维生素混合液，20ml 5％高压蒸汽灭菌的酸水解酪素和879ml灭菌去离子水，混匀后于4℃保存备用。

其中：5％酸水解酪素的配制

称取5g酸水解酪素，用去离子水溶解定容到100ml，高压蒸汽灭菌，-20℃保存。

实施例一表达载体pRK-AH的构建

该发明的目的融合蛋白具有以下特征：光合细菌pucB基因产物β亚基或pucA基因产物α亚基之后连接目的蛋白，该目的蛋白的N-末端带有肠激酶识别位点，C-末端带有His-tag序列。那么在构建目的蛋白表达载体时需要将目的蛋白基因序列连接在pucB或pucA基因序列之后，并且在该目的蛋白基因序列5’端加上Xa因子识别序列，3’末端加上His-tag序列。

根据以上表达载体的特征，本发明采用表达载体pRK-CH(制备方法在公开号为CN101148679A的专利申请中)将目的蛋白基因插入到pucB基因后面进行目的融合蛋白表达载体的构建。由于表达载体pRK-CH具有pucB、pucA、pucC基因序列，在pucB基因后连有Xa因子和His-tag序列，并在Xa因子和His-tag序列之间包含了两个限制性内酶切位点SacI和XbaI，可将目的蛋白基因序列通过SacI和XbaI连接在Xa因子和His-tag之间，构建成目的蛋白和β亚基的融合蛋白表达载体。

此外，本发明中的目的蛋白还可连接到pucA基因序列之后构建成目的蛋白和α亚基的融合蛋白表达载体。其目的融合蛋白表达载体的出发载体pRK-AH的构建过程如图1所示。其构建过程详细描述如下：

首先，利用DNA提取试剂盒提取类球红细菌RS-1基因组DNA，根据GenBank上报道的puc操纵子序列(GenBank accession number：X68796)设计一对PCR引物F1和R1(SEQ IDNO：2和SEQ ID NO：3)，上游引物F1的5’端含有保护碱基和酶切位点KpnI，下游引物R1的5’端含有保护碱基、BamHI、终止密码子、10个组氨酸的DNA序列、XbaI和SacI。引物序列如下：

上游引物F1：5’-agctggtaccagttg ggagacgaca cagtgac-3’；

下游引物R1：5’-tataggatcc tta gtg gtg gtg gtg gtg gtg gtg gtg gtg gtg tctagagagctcccttccctcgatctcggccgcgaccgcagccg-3’

以类球红细菌RS-1基因组DNA为模板，利用上述引物F1/R1进行PCR扩增，扩增体系为50ul，10uM的引物F1/R1各1ul，dNTP Mixture 4ul，5×PrimeSTAR^TM反应缓冲液10μl，PrimeSTAR^TM HS DNA聚合酶0.5ul。PCR反应条件为98℃变性10s，55℃退火15s，72℃延伸30s，30个循环。所获得PCR产物大小为427bp(SEQ ID NO：4)，包含SD、pucBA、Xa、His-tag等基因序列，通过电泳、回收纯化该PCR产物。

取上述PCR纯化产物，用KpnI和BamH I进行酶切，酶切体系为：2ul 10×K缓冲液，1ulKpnI，1ul BamHI，取适量的PCR纯化产物，加灭菌蒸馏水至40ul，37℃酶切3h，DNA纯化试剂盒过柱纯化酶切产物。同时，按照上述酶切体系将同时受外源IPTG和O₂浓度调控的表达载体pRK-CH进行酶切后并用DNA纯化试剂盒过柱纯化。

按照连接试剂盒的操作说明将适量经KpnI和BamH I酶切的pRK-CH质粒DNA和上述PCR产物进行连接。连接产物通过CaCl₂转化法转化大肠杆菌JM109感受态细胞，经50μg/ml四环素抗性筛选后，挑取LB平板上的菌落于含有50μg/ml四环素的LB液体培养基中，37℃，250rpm，振荡培养过夜，次日提取质粒DNA，采用PCR或酶切法筛选阳性转化子，然后经测序验证，该表达载体命名为pRK-AH(SEQ ID NO：1)。

实施例二GST、GFP、GUS融合蛋白表达载体的构建

本实施例中分别采用GST、GFP、GUS基因和pucB构建融合蛋白表达载体，其构建过程见图2，图3，图4。

根据NCBI上公布的GST基因序列(GenBank accession number：U78874)设计引物对F2(SEQ IDNO：5)和R2(SEQ IDNO：6)，序列如下：

上游引物F2：5′--CGA GCT CAT GTC CCC TAT ACT AGG TTA TTG G--3′

下游引物R2：5′-GCT CTA GAG TCA GTC ACG ATG CGG CCG CTC--3′

根据NCBI上公布的GFP基因序列(GenBank accession number：U17997)设计引物对F3(SEQ ID NO：7)和R3(SEQ ID NO：8)，序列如下：

上游引物F3：5′-C GAGCTC ATGAGTAAAGGAGAAGAAC-3′

下游引物R3：5′-GCTCTAGATTTGTATAGTTCATCCATGC-3′

根据NCBI上公布的GUS基因序列(GenBank accession number：AF234297)设计引物对F4(SEQ ID NO：9)和R4(SEQ ID NO：10)，序列如下：

上游引物F4：5’GCGAGCTCATCAAAAAACTCGACGGCC 3’

下游引物R4：5’GCTCTAGATTGTTTGCCTCCCTGCTGCG 3’

PCR反应体系为50ul，其中10uM的引物各1ul，dNTP Mixture 4ul，5×PrimeSTAR^TM反应缓冲液10μl，PrimeSTAR^TM HS DNA聚合酶0.5ul，模板分别为适量的pGEX-6P-3、pGFP和pCAMBIA-1301质粒DNA。PCR反应条件为：98℃变性10s，55℃退火15s，72℃延伸45s(GUS基因延伸时间为2min)，30个循环。所获得PCR产物为目的DNA片段(GST片段的核苷酸序列为SEQ ID NO：11，GFP片段的核苷酸序列为SEQ ID NO：12，GUS片段的核苷酸序列为SEQ ID NO：13)，并对其进行电泳、回收和纯化。

分别取PCR纯化产物，用Sac I和Xba I进行酶切，酶切体系为：4ul 10×M缓冲液，2ul SacI，2ul Xba I，取适量的PCR纯化产物，加灭菌蒸馏水至40ul，37℃酶切3h，DNA纯化试剂盒过柱纯化Sac I和Xba I酶切产物。同时，按照上述酶切体系将同时受外源IPTG和O₂浓度调控的表达载体pRK-CH进行酶切后并用DNA纯化试剂盒过柱纯化。

按照连接试剂盒的操作说明将适量经SacI和Xba I酶切的pRK-CH质粒DNA分别和GST、GFP、GUS的PCR产物进行连接。连接产物通过CaCl₂转化法转化大肠杆菌JM109感受态细胞，经50μg/ml四环素抗性筛选后，挑取LB平板上的菌落于含有50μg/ml四环素的LB液体培养基中，37℃，250rpm，振荡培养过夜，次日提取质粒DNA，采用酶切法筛选阳性转化子，酶切过程如下：

由于pRK-CH中，EcoR I和Xba I之间的片段长度约为1800bp插入GST、GFP和GUS基因片段后EcoR I和Xba I之间的片段长度应分别增加735bp、714bp和1773bp左右，因此，用EcoRI和Xba I同时酶切提取的质粒DNA和pRK-CH，从电泳条带差异可以验证克隆片段是否连接到pRK-CH中。EcoR I和Xba I双酶切体系为：2μl 10×M缓冲液，0.5μl EcoRI，0.5μl Xba I，适量质粒DNA，加灭菌双蒸水到20μl，37℃酶切3h，酶切图谱如图5所示，1表示DNA Marker DL2000plus(分子量从大到小为：5000bp，3000bp，2000bp，1000bp，750bp，500bp，250bp，100bp)。2表示表达载体pRK-CH的酶切产物，3表示pRK-CH-GFP的酶切产物，4表示pRK-CH-GST的酶切产物，5表示pRK-CH-GUS的酶切产物。酶切结果表明，GST、GFP和GUS基因片段已连接到pRK-CH中，然后经测序验证，结果显示载体构建正确，其融合蛋白表达载体命名为pRK-CH-GST，pRK-CH-GFP和pRK-CH-GUS。

上述实施例中描述了GST、GFP、GUS基因连接到pRK-CH载体上构建成目的蛋白和β亚基的融合蛋白表达载体的过程，由于可以根据上述同样的方法将GST、GFP、GUS基因连接到pRK-AH载体上构建成目的蛋白和α亚基的融合蛋白表达载体，在本实施例中就不重复描述。同时，由于篇幅有限，本发明的实施例中只选择了GST、GFP、GUS基因来构建融合蛋白表达载体，实际上，从理论上来说，可以利用表达载体pRK-AH和pRK-CH构建各种蛋白质和多肽的融合蛋白表达载体，并应用本发明的表达体系进行表达。

实施例三利用大肠杆菌S17-1将融合蛋白表达载体导入光合细菌突变株DD13

(1)S17-1感受态细胞的制备

取-80℃保藏的大肠杆菌S17-1划线于LB平板上，37℃过夜培养；挑单菌落接种于10mlLB培养液中，37℃，250rpm，振荡培养过夜；取1ml过夜培养物加入100ml LB培养液中，37℃，250rpm，振荡培养2h；将100ml培养物置于冰水中10min使细菌冷却到0℃；然后于4℃，2500rpm，离心7min；弃上清，用10ml冰浴预冷的0.1M CaCl₂重悬；4℃，2000rpm，离心5min；弃上清，用2ml冰浴预冷的0.1M CaCl₂重悬，冰水中静置2h备用。

(2)转化

取100μl冰浴的S17-1感受态细胞加到预冷的1.5ml EP管中，再加入1μl构建好的融合蛋白表达载体pRK-CH-GST、pRK-CH-GFP和pRK-CH-GUS质粒DNA，轻轻地混合均匀，冰水中放置30min；然后于42℃热激90s，迅速置于冰水中，放置2min；加入500μl LB培养液，37℃，150rpm，振荡培养1h；取50μl菌液均匀涂布于含有10μg/ml四环素的LB平板上，37℃，倒置培养过夜。次日，于四环素抗性平板上正常生长的为S17-1转化菌。

(3)融合蛋白表达载体pRK-CH-GST、pRK-CH-GFP和pRK-CH-GUS经S17-1接合转移到光合细菌突变株DD13

按照Jones等(Jones MR，Fowler GJ，Gibson LC，Grief GG，Olsen JD，Crielaard W，HunterCN.Mutants of Rhodobacter sphaeroides lacking one or more pigment-protein complexes andcomplementation with reaction-centre，LH1，and LH2 genes.Mol Microbiol.1992；6(9)：1173-1184.)报道的方法，将类球红细菌RS-1中的捕光系统1，捕光系统2和光合反应中心敲除，获得类球红细菌突变株Rhodobacter sphaeroides DD13。当融合蛋白表达载体pRK-CH-GST、pRK-CH-GFP和pRK-CH-GUS转化到Rhodobacter sphaeroides DD13后，在外源IPTG和合适氧浓度条件下表达出LH2的α亚基和β亚基，正确组装成有功能的LH2，在800nm和850nm处可检测出特征吸收峰，互补了Rhodobacter sphaeroides DD13LH2缺失的功能。

将Rhodobacter sphaeroides DD13划线于含有20μg/ml新霉素的M22+培养基上，34℃，黑暗，倒置培养3天；挑取单菌落接种于10ml含有20μg/ml新霉素的M22+培养液中，34℃，250rpm，黑暗振荡培养过夜；次日，4℃，6000rpm，离心10min收集菌体，1ml LB培养液重悬菌体；刮取S17-1转化菌单菌落加入100μl LB细菌重悬液中，充分混匀，然后滴到充分干燥的LB培养基上，34℃，培养6-8h，从LB培养基上刮取细菌，1ml M22+重悬菌体，取100μl重悬菌液涂布于M22+培养基上(含有四环素：1μg/ml，新霉素：20μg/ml)，34℃，黑暗培养3-4天左右即可看到红色菌落；由于表达载体pRK-CH上含有四环素抗性基因，Rhodobactersphaeroides DD13基因组中含有新霉素抗性基因，只有含有目的融合蛋白表达载体pRK-CH-GST、pRK-CH-GFP和pRK-CH-GUS质粒DNA的Rhodobacter sphaeroides DD13才能在具有这两种抗生素的培养基中正常生长，所以这些红色菌落即为含有表达载体pRK-CH-GST、pRK-CH-GFP和pRK-CH-GUS的质粒DNA的Rhodobacter sphaeroides DD13；挑取单菌落接种到10ml M22+培养液(四环素：1μg/ml，新霉素：20μg/ml)中，34℃，250rpm，黑暗振荡培养过夜；次日，-80℃菌种保藏，保藏菌命名为DD13/pRK-CH-GST，DD13/pRK-CH-GFP，DD13/pRK-CH-GUS。同时，向Rhodobacter sphaeroides DD13中接合转移了pRK-CH质粒DNA作为无外源蛋白的空载体对照，并命名为DD13/pRK-CH。

实施例四融合蛋白的诱导表达和近红外光谱分析融合蛋白表达情况

(1)融合蛋白的诱导表达

取DD13/pRK-CH-GST，DD13/pRK-CH-GFP和DD13/pRK-CH-GUS的-80℃保藏菌划线培养于M22+培养基(四环素：1μg/ml，新霉素：20μg/ml)上，34℃，黑暗倒置培养3天；挑取单菌落接种到10ml M22+培养液(四环素：1μg/ml，新霉素：20μg/ml)中，34℃，250rpm，黑暗条件下振荡培养过夜；取过夜培养物按1∶100接种到M22+培养液中(四环素：1μg/ml，新霉素：20μg/ml，培养基体积/容量瓶体积＝20％)，34℃，250rpm，黑暗条件下振荡培养20h；将180ml上述培养物倒入一250ml三角瓶中并加入IPTG至终浓度1mM，34℃，150rpm，黑暗条件下诱导5-8h。同时，在相同条件下，DD13/pRK-CH菌和DD₁₃菌(培养基中不含四环素)做为对照。

(2)近红外光谱分析

采用分光光度计Lambda 900UV/VIS/NIR spectrometer(美国)，以M22+培养液为参比，在700-880nm波长范围内扫描DD₁₃菌和转化菌DD13/pRK-CH、DD13/pRK-CH-GST、DD13/pRK-CH-GFP、DD13/pRK-CH-GUS的诱导培养液，在800nm和850nm处除了DD₁₃菌液以外，其余四个转化菌的发酵液都分别出现特征吸收峰，扫描结果如图6所示，图中A表示DD13/pRK-CH菌液扫描结果，图中B表示DD13菌液扫描结果，图中C表示DD13/pRK-CH-GST菌液扫描结果，图中D表示DD13/pRK-CH-GPF菌液扫描结果，图中E表示DD13/pRK-CH-GUS菌液扫描结果。该近红外光谱分析结果表明，构建的融合蛋白表达载体已成功接合转移到Rhodobacter sphaeroides DD13中，并表达出目的融合蛋白。

实施例五融合蛋白的提取和纯化

(1)融合蛋白的提取

1)用80ml Resuspension Buffer(20mM MOPS pH7.2，200mM NaCl)重悬2L细菌，加入1protease inhibitor tablets(EDTA Free)，并加入少量的Dnase I，冰浴20min；

2)用高压均质机(Niro Soavi S.P.A，意大利)破碎，1200bar，三个循环；

3)用高速冷冻离心机(Avanti J-E Centrifuge，BECKMAN)于11000rpm，4℃，15min离心2次去除细胞壁碎片和杂质；

4)将步骤3)得到的上清用超高速离心机(Optima^TM L-90K Ultracentrifuge，BECKMAN)于45.000rpm，4℃，离心90min得到膜蛋白沉淀；

5)用含1％LDAO的Resuspension Buffer于26℃黑暗条件下重悬总膜蛋白1h；

6)45.000rpm，4℃，超高速离心30min，得到膜蛋白上清；

7)对总蛋白进行近红外光谱分析以确定目的蛋白的存在，然后进行下一步纯化工作。

(2)融合蛋白的纯化

1)用适量体积的水冲洗预装柱(1ml HiTrap prepacked columns，Pharmacia)，至蛋白质纯化仪(AKTA Primer蛋白质纯化系统，Pharmacia)上紫外吸收和电导趋于稳定，流速为1ml/min；

2)用10倍柱体积的Charge buffer(100mM NiSO₄)填充预装柱，流速为1ml/min；

3)用适量体积的水冲洗柱子以去除未结合的Ni²⁺，流速为1ml/min；

4)用10倍柱体积的Binding Buffer(20mM MOPS pH7.2，200mM NaCl，10mM Imidazole，0.1％Brij)平衡，流速为1ml/min；

5)将蛋白质样品上样，流速为0.5ml/min；

6)用Binding Buffer冲洗柱子，流速为1ml/min；

7)用约10倍柱体积的Wash Buffer(20mM MOPS pH7.2，200mM NaCl，20mM Imidazole，0.1％Brij)洗脱杂蛋白，流速为1ml/min；

8)用约5倍柱体积Elute Buffer(20mM MOPS pH7.2，200mM NaCl，500mM Imidazole，0.1％Brij)洗脱目的蛋白，流速为0.5ml/min；

9)用水冲洗柱子，流速控制在1ml/min；

10)用10倍柱体积的Strip Buffer(20mM MOPS pH7.2，200mM NaCl，50mM EDTA)螯合Ni²⁺；

11)用水冲洗柱子，流速为1ml/min；

12)用10倍柱体积的20％乙醇冲洗柱子；

13)取下柱子，4℃保存；

14)对洗脱样品进行近红外光谱分析，以确定目的蛋白的存在。

实施例六Western Blot鉴定融合蛋白

(1)配制聚丙烯酰胺胶，其中分离胶浓度为15％(1.1ml ddH₂O，2.5ml 30％储备胶溶液，1.3ml1.5mol/LTris-HCl(pH8.8)，50ul 10％SDS，40ul10％APS，2ul TEMED)，浓缩胶浓度为5％(1.4ml ddH₂O，0.334ml 30％储备胶溶液，0.25ml 1.0mol/LTris-HCl(pH6.8)，20ul 10％SDS，20ul 10％APS，2ul TEMED)

(2)蛋白样品的处理

取10ul蛋白样品加入等体积的2×SDS电泳上样缓冲液(2.5ml 1.0mol/LTris-HCl(pH6.8)，1.0mlβ-巯基乙醇，0.6g SDS，2.0ml甘油，1.0ml 0.1％溴酚蓝，3.5ml ddH₂O)，混匀，室温放置10min。

(3)上样

分别用10ug总蛋白样品、纯化样品，10ul的预染蛋白分子量Marker(蛋白低分子量Marker，北京鼎国)，BCA蛋白定量试剂盒为Pierce公司产品。

(4)SDS-PAGE电泳(蛋白质电泳组件，Bio-Rad)，浓缩胶部分电压50V，分离胶部分电压100V。

(5)电转移：

1)电泳结束后将胶条割至合适大小，用转膜缓冲液(2.9g甘氨酸，5.8g Tris，0.37g SDS，200ml甲醇，加ddH₂O至1000ml)平衡15min，剪掉一角标记；

2)膜处理：预先裁好与胶条同样大小的滤纸和PVDF膜(Milipore公司产品)，浸入转膜缓冲液中30min。

3)转膜：恒流150mA，转移2h。

(6)杂交

1)将膜浸入封闭液中，室温摇动1h；

2)弃封闭液，用PBST(8.0g NaCl，0.2g KCl，1.44g Na₂HPO₄，0.24g KH₂PO₄，0.05％Tween 20，加ddH₂O至1000ml)洗膜，10min×3次；

3)用封闭液以1∶1000稀释一抗，将PVDF膜置于稀释抗体中，4℃孵育过夜；

4)弃一抗，用PBST洗膜，10min×3次；

5)将膜置于用封闭液按1∶1000稀释过的二抗中，平稳摇动1h；

6)弃二抗，PBST洗膜，10min×3次；

7)显色：D-AB显色液。

Western Blot结果如图7所示。该结果表明，通过本发明的表达体系，可以表达并分离纯化出GST、GFP、GUS蛋白和β亚基的融合蛋白。如果需要进一步获得GST、GFP、GUS蛋白，可以采用肠激酶将β亚基酶切掉，然后利用上述亲和层析方法纯化出目的蛋白。

本发明提供的上述新的蛋白质表达体系及该表达体系的使用方法和步骤示意图如图8所示，由于利用载体pRK-CH和pRK-AH构建GST、GFP、GUS融合蛋白表达载体的操作过程和方法完全一样，所以在本发明的实施例中，通过构建GST、GFP、GUS和pucB的融合蛋白表达载体pRK-CH-GST，pRK-CH-GFP和pRK-CH-GUS，然后利用大肠杆菌S17-1通过接合转移将其导入宿主Rhodobacter sphaeroides DD13，诱导表达和提取纯化融合蛋白，近红外光谱分析和Western Blot检测证实了目的融合蛋白在该体系中已获得表达，表明光合细菌DD13可以作为一种新的蛋白质表达宿主表达外源蛋白质或多肽，并通过简单的近红外光谱分析快速检测外源蛋白的表达情况。

虽然本发明已以较佳实施例披露如上，然其并非用以限定本发明，任何所属技术领域的技术人员，在不脱离本发明的精神和范围内，当可作些许的更动与改进，因此本发明的保护范围当视权利要求所界定者为准。

序列表

<110>重庆大学

<120>一种能快速检测外源蛋白表达的光合细菌表达体系及其应用

<130>

<160>13

<170>PatentIn version 3.2

<210>1

<211>14477

<212>DNA

<213>pRK-AH载体的核苷酸序列

<400>1

ctgccatttt tggggtgagg ccgttcgcgg ccgaggggcg cagcccctgg ggggatggga    60

ggcccgcgtt agcgggccgg gagggttcga gaaggggggg cacccccctt cggcgtgcgc   120

ggtcacgcgc acagggcgca gccctggtta aaaacaaggt ttataaatat tggtttaaaa   180

gcaggttaaa agacaggtta gcggtggccg aaaaacgggc ggaaaccctt gcaaatgctg   240

gattttctgc ctgtggacag cccctcaaat gtcaataggt gcgcccctca tctgtcagca   300

ctctgcccct caagtgtcaa ggatcgcgcc cctcatctgt cagtagtcgc gcccctcaag   360

tgtcaatacc gcagggcact tatccccagg cttgtccaca tcatctgtgg gaaactcgcg   420

taaaatcagg cgttttcgcc gatttgcgag gctggccagc tccacgtcgc cggccgaaat   480

cgagcctgcc cctcatctgt caacgccgcg ccgggtgagt cggcccctca agtgtcaacg   540

tccgcccctc atctgtcagt gagggccaag ttttccgcga ggtatccaca acgccggcgg   600

ccgcggtgtc tcgcacacgg cttcgacggc gtttctggcg cgtttgcagg gccatagacg   660

gccgccagcc cagcggcgag ggcaaccagc ccggtgagcg tcggaaaggc gctcttccgc   720

ttcctcgctc actgactcgc tgcgctcggt cgttcggctg cggcgagcgg tatcagctca   780

ctcaaaggcg gtaatacggt tatccacaga atcaggggat aacgcaggaa agaacatgtg   840

agcaaaaggc cagcaaaagg ccaggaaccg taaaaaggcc gcgttgctgg cgtttttcca   900

taggctccgc ccccctgacg agcatcacaa aaatcgacgc tcaagtcaga ggtggcgaaa   960

cccgacagga ctataaagat accaggcgtt tccccctgga agctccctcg tgcgctctcc  1020

tgttccgacc ctgccgctta ccggatacct gtccgccttt ctcccttcgg gaagcgtggc  1080

gccattcgcc attcaggctg cgcaactgtt gggaagggcg atcggtgcgg gcctcttcgc  1140

tattacgcca gctggcgaaa gggggatgtg ctgcaaggcg attaagttgg gtaacgccag  1200

ggttttccca gtcacgacgt tgtaaaacga cggccagtga attctaattg cgttgcgctc  1260

actgcccgct ttccagtcgg gaaacctgtc gtgccagctg cattaatgaa tcggccaacg  1320

cgcggggaga ggcggtttgc gtattgggcg ccagggtggt ttttcttttc accagtgaga  1380

cgggcaacag ctgattgccc ttcaccgcct ggccctgaga gagttgcagc aagcggtcca  1440

cgctggtttg ccccagcagg cgaaaatcct gtttgatggt ggttaacggc gggatataac  1500

atgagctgtc ttcggtatcg tcgtatccca ctaccgagat atccgcacca acgcgcagcc  1560

cggactcggt aatggcgcgc attgcgccca gcgccatctg atcgttggca accagcatcg  1620

cagtgggaac gatgccctca ttcagcattt gcatggtttg ttgaaaaccg gacatggcac  1680

tccagtcgcc ttcccgttcc gctatcggct gaatttgatt gcgagtgaga tatttatgcc  1740

agccagccag acgcagacgc gccgagacag aacttaatgg gcccgctaac agcgcgattt  1800

gctggtgacc caatgcgacc agatgctcca cgcccagtcg cgtaccgtct tcatgggaga  1860

aaataatact gttgatgggt gtctggtcag agacatcaag aaataacgcc ggaacattag  1920

tgcaggcagc ttccacagca atggcatcct ggtcatccag cggatagtta atgatcagcc  1980

cactgacgcg ttgcgcgaga agattgtgca ccgccgcttt acaggcttcg acgccgcttc  2040

gttctaccat cgacaccacc acgctggcac ccagttgatc ggcgcgagat ttaatcgccg  2100

cgacaatttg cgacggcgcg tgcagggcca gactggaggt ggcaacgcca atcagcaacg  2160

actgtttgcc cgccagttgt tgtgccacgc ggttgggaat gtaattcagc tccgccatcg  2220

ccgcttccac tttttcccgc gttttcgcag aaacgtggct ggcctggttc accacgcggg  2280

aaacggtctg ataagagaca ccggcatact ctgcgacatc gtataacgtt actggtttca  2340

cattcaccac cctgaattga ctctcttccg ggcgctatca tgccataccg cgaaaggttt    2400

tgcaccattc gatggtgtcc tcgaggcctc ggacaccctc gtttttgcag cagcgagagg    2460

ctgcgggacg gccctgtggg gccgggacag gcagcgtcaa tttcccgcgc gcctgcggca    2520

aaattgtccc ttttcaagcc gttacgcagg attcccggcc gatctggcgg ccaataagtc    2580

gcacccaaaa cggccttgtc agccaacact gacattgaat ctgtcagcgc aatgtgacac    2640

ccataatgtg tggaattgtg agcggataac aatttcacac aggtaccagt tgggagacga    2700

cacagtgact gacgatctga acaaagtctg gccgagcggc ctgaccgttg ccgaagccga    2760

agaagttcat aagcaactca tcctcggcac ccgcgtcttc ggtggcatgg cgctcatcgc    2820

gcacttcctc gccgccgctg cgaccccgtg gctcggctga taggagaaga ctgacatgac    2880

caacggcaaa atctggctcg tggtgaaacc gaccgtcggc gttccgctgt tcctcagcgc    2940

tgccgtcatc gcctccgtcg ttatccacgc tgctgtgctg acgaccacca cctggctgcc    3000

cgcctactac caaggctcgg ctgcggtcgc ggccgagatc gagggaaggg agctctctag    3060

acaccaccac caccaccacc accaccacca ctaaggatcc ttgggttccg gcctgctcgt    3120

cacaccagcg acgtgttcct gtcgccttgc ccgttcgcgg tgtgtgcctg aagcccgaca    3180

tcctttccag tcgcgcagtc tgcgctaccc cgggattctt cacgcatgag ccgaattgcc    3240

gaacatctgg tccgcatcgg accgcggttt ctgccatttg ccgacgcggc ctcggaccag    3300

ctgcccctgc gcaagctgct gcgcctgtcg ctgtttcagg tcgccgtggg catggccatc    3360

gtcctgctcg tcggcacgct gaaccgggtg atgatcgtcg agctgaaggt gcccgcctcg    3420

gtggtgggga tcatgatctc gctgccgctc ctgttcgcgc ccttccgcgc gctgatcggg    3480

ttcaagtccg acacccatgt ctccgcactc ggctggcggc gcgtgccctg gatctaccgc    3540

gggacgctgg cgctgtgggg cggcttcgcc atcatgccct tcgcgctgat cgtgctcggc    3600

gggcagggct atgccgaggg ccagcccttc tggctcggcg tctcctcggc cgcgctcgcc    3660

ttcctgatgg tgggcggcgg cgtgcacacg atccagacgg tggggcttgc gctggccacc    3720

gacctcgccc cgcgcgagga ccagccgaag gtcgtgggcc tgatgtatgt ggtgctgctc    3780

atcagcatga tcttcgcctc gatcggcttc ggctggctgc tcgatcccta ttatgacgcg    3840

cagctcatca aggtcatctc gggcgtcgcc gtcgccgtgt tcttcctgaa catgatcgcc    3900

ctgtggaaga tggagccgcg caaccgcgcc ttcaccgtga agcccgagaa ggagcccgag    3960

ttcggcgacc actggcgcga gttcatcagc cgcgagaacg cgctccacgg gctgatcgtg    4020

atcgggctcg gcacgctggg cttcggcatg gccgacgtga tcctcgagcc ctacggcggc    4080

gaggtgctct cgatgacggt ggccgagacg acccggctga ccgcgacctt cgcggggggc    4140

gggctcgtgg gcttctggct ggcctcgtgg gtgctcggcc ggggcttcga tcccctgcgg    4200

atggccttcc tcggcgccgc cgcggggctg ccgggcttct tcgccatcat gggcgcgacc    4260

gagatgacga acgtctgggt cttcctcctc ggcacgctgg tggtggggtt cggcggcggg    4320

ctcttcagcc acgggacgct cacggccacg atgcggctgg cgccgaagga gcaggtgggc    4380

cttgcgctcg gcgcctgggg tgcggtgcag gccacggccg cgggcgtggc catcgcgggc    4440

gcaggcgtgc tgcgcgacat cctgcaggcg atgccggatc tctccggcta cggtcccggc    4500

gcgccctacg tcgcggtctt cgccctcgag gcaggcttcc tcttcctgac catgatcgtg    4560

atcctgcctc tcttgcgctc ggctctcgcc gcccgccgcc tgtgacgaat caccacgccc    4620

tgcgtgcccg cttcccggag gtgcaaaagg ctactccttt gggggtcttt gaaatctcag    4680

cctgcaggtt cgcgccctcg gcgcgcttcg ccgcagggtt gaaccaggac aaccctgacg    4740

gcgagattcc gcgcacgtcc cccactcgcc gccgaggcga aacccttggt taacacaacg    4800

ttaacaagac cttccctgcc ccgacttgtc cacaacctga ccatttcggc agggcacagg    4860

gtagcctccc cctttttcct gctataacag acctttgcgg catcattggc tgcatgctaa    4920

agtatggaaa tcgacaaaac tttgaagagt aggatttagc cgggtttgcg tcccaaacac    4980

aaagtggaca gattgtgatg aatcattcga ccgactcttt ttcgaaatct ttgaataccc    5040

taggcagcga cctgcctgcc actgctgcag gcatgcaagc ttggcgtaat catggtcata    5100

gctgtttcct gtgtgaaatt gttatccgct cacaattcca cacaacatac gagccggaag    5160

cataaagtgt aaagcctggg gtgcctaatg agtgagctaa ctcacattaa ttgcgttgcg    5220

ctcactgccc gctttccagt cgggaaacct gtcgtgccag ctgcattaat gaatcggcca    5280

acgcgcgggg agaggcggtt tgcgtattgg gcgctcggtc ttgccttgct cgtcggtgat    5340

gtacttcacc agctccgcga agtcgctctt cttgatggag cgcatgggga cgtgcttggc    5400

aatcacgcgc accccccggc cgttttagcg gctaaaaaag tcatggctct gccctcgggc    5460

ggaccacgcc catcatgacc ttgccaagct cgtcctgctt ctcttcgatc ttcgccagca    5520

gggcgaggat cgtggcatca ccgaaccgcg ccgtgcgcgg gtcgtcggtg agccagagtt    5580

tcagcaggcc gcccaggcgg cccaggtcgc cattgatgcg ggccagctcg cggacgtgct    5640

catagtccac gacgcccgtg attttgtagc cctggccgac ggccagcagg taggccgaca    5700

ggctcatgcc ggccgccgcc gccttttcct caatcgctct tcgttcgtct ggaaggcagt    5760

acaccttgat aggtgggctg cccttcctgg ttggcttggt ttcatcagcc atccgcttgc    5820

cctcatctgt tacgccggcg gtagccggcc agcctcgcag agcaggattc ccgttgagca    5880

ccgccaggtg cgaataaggg acagtgaaga aggaacaccc gctcgcgggt gggcctactt    5940

cacctatcct gcccggctga cgccgttgga tacaccaagg aaagtctaca cgaacccttt    6000

ggcaaaatcc tgtatatcgt gcgaaaaagg atggatatac cgaaaaaatc gctataatga    6060

ccccgaagca gggttatgca gcggaaaagc gccacgcttc ccgaagggag aaaggcggac    6120

aggtatccgg taagcggcag ggtcggaaca ggagagcgca cgagggagct tccaggggga    6180

aacgcctggt atctttatag tcctgtcggg tttcgccacc tctgacttga gcgtcgattt    6240

ttgtgatgct cgtcaggggg gcggagccta tggaaaaacg ccagcaacgc ggccttttta    6300

cggttcctgg ccttttgctg gccttttgct cacatgttct ttcctgcgtt atcccctgat    6360

tctgtggata accgtattac cgcctttgag tgagctgata ccgctcgccg cagccgaacg    6420

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gccgagcgcg gccgtgaggc ttggacgcta gggcagggca tgaaaaagcc cgtagcgggc    6540

tgctacgggc gtctgacgcg gtggaaaggg ggaggggatg ttgtctacat ggctctgctg    6600

tagtgagtgg gttgcgctcc ggcagcggtc ctgatcaatc gtcacccttt ctcggtcctt    6660

caacgttcct gacaacgagc ctccttttcg ccaatccatc gacaatcacc gcgagtccct    6720

gctcgaacgc tgcgtccgga ccggcttcgt cgaaggcgtc tatcgcggcc cgcaacagcg    6780

gcgagagcgg agcctgttca acggtgccgc cgcgctcgcc ggcatcgctg tcgccggcct    6840

gctcctcaag cacggcccca acagtgaagt agctgattgt catcagcgca ttgacggcgt    6900

ccccggccga aaaacccgcc tcgcagagga agcgaagctg cgcgtcggcc gtttccatct    6960

gcggtgcgcc cggtcgcgtg ccggcatgga tgcgcgcgcc atcgcggtag gcgagcagcg    7020

cctgcctgaa gctgcgggca ttcccgatca gaaatgagcg ccagtcgtcg tcggctctcg    7080

gcaccgaatg cgtatgattc tccgccagca tggcttcggc cagtgcgtcg agcagcgccc    7140

gcttgttcct gaagtgccag taaagcgccg gctgctgaac ccccaaccgt tccgccagtt    7200

tgcgtgtcgt cagaccgtct acgccgacct cgttcaacag gtccagggcg gcacggatca    7260

ctgtattcgg ctgcaacttt gtcatgcttg acactttatc actgataaac ataatatgtc    7320

caccaactta tcagtgataa agaatccgcg cgttcaatcg gaccagcgga ggctggtccg    7380

gaggccagac atgaaaccca acatacccct gatcgtaatt ctgagcactg tcgcgctcga    7440

cgctgtcggc atcggcctga ttatgccggt gctgccgggc ctcctgcgcg atctggttca    7500

ctcgaacgac gtcaccgccc actatggcat tctgctggcg ctgtatgcgt tggtgcaatt    7560

tgcctgcgca cctgtgctgg gcgcgctgtc ggatcgtttc gggcggcggc caatcttgct    7620

cgtctcgctg gccggcgcca ctgtcgacta cgccatcatg gcgacagcgc ctttcctttg    7680

ggttctctat atcgggcgga tcgtggccgg catcaccggg gcgactgggg cggtagccgg    7740

cgcttatatt gccgatatca ctgatggcga tgagcgcgcg cggcacttcg gcttcatgag    7800

cgcctgtttc gggttcggga tggtcgcggg acctgtgctc ggtgggctga tgggcggttt    7860

ctccccccac gctccgttct tcgccgcggc agccttgaac ggcctcaatt tcctgacggg    7920

ctgtttcctt ttgccggagt cgcacaaagg cgaacgccgg ccgttacgcc gggaggctct    7980

caacccgctc gcttcgttcc ggtgggcccg gggcatgacc gtcgtcgccg ccctgatggc    8040

ggtcttcttc atcatgcaac ttgtcggaca ggtgccggcc gcgctttggg tcattttcgg    8100

cgaggatcgc tttcactggg acgcgaccac gatcggcatt tcgcttgccg catttggcat    8160

tctgcattca ctcgcccagg caatgatcac cggccctgta gccgcccggc tcggcgaaag    8220

gcgggcactc atgctcggaa tgattgccga cggcacaggc tacatcctgc ttgccttcgc    8280

gacacgggga tggatggcgt tcccgatcat ggtcctgctt gcttcgggtg gcatcggaat    8340

gccggcgctg caagcaatgt tgtccaggca ggtggatgag gaacgtcagg ggcagctgca    8400

aggctcactg gcggcgctca ccagcctgac ctcgatcgtc ggacccctcc tcttcacggc    8460

gatctatgcg gcttctataa caacgtggaa cgggtgggca tggattgcag gcgctgccct    8520

ctacttgctc tgcctgccgg cgctgcgtcg cgggctttgg agcggcgcag ggcaacgagc    8580

cgatcgctga tcgtggaaac gataggccta tgccatgcgg gtcaaggcga cttccggcaa     8640

gctatacgcg ccctaggagt gcggttggaa cgttggccca gccagatact cccgatcacg     8700

agcaggacgc cgatgatttg aagcgcactc agcgtctgat ccaagaacaa ccatcctagc     8760

aacacggcgg tccccgggct gagaaagccc agtaaggaaa caactgtagg ttcgagtcgc     8820

gagatccccc ggaaccaaag gaagtaggtt aaacccgctc cgatcaggcc gagccacgcc     8880

aggccgagaa cattggttcc tgtaggcatc gggattggcg gatcaaacac taaagctact     8940

ggaacgagca gaagtcctcc ggccgccagt tgccaggcgg taaaggtgag cagaggcacg     9000

ggaggttgcc acttgcgggt cagcacggtt ccgaacgcca tggaaaccgc ccccgccagg     9060

cccgctgcga cgccgacagg atctagcgct gcgtttggtg tcaacaccaa cagcgccacg     9120

cccgcagttc cgcaaatagc ccccaggacc gccatcaatc gtatcgggct acctagcaga     9180

gcggcagaga tgaacacgac catcagcggc tgcacagcgc ctaccgtcgc cgcgacccgc     9240

ccggcaggcg gtagaccgaa ataaacaaca agctccagaa tagcgaaata ttaagtgcgc     9300

cgaggatgaa gatgcgcatc caccagattc ccgttggaat ctgtcggacg atcatcacga     9360

gcaataaacc cgccggcaac gcccgcagca gcataccggc gacccctcgg cctcgctgtt     9420

cgggctccac gaaaacgccg gacagatgcg ccttgtgagc gtccttgggg ccgtcctcct     9480

gtttgaagac cgacagccca atgatctcgc cgtcgatgta ggcgccgaat gccacggcat     9540

ctcgcaaccg ttcagcgaac gcctccatgg gctttttctc ctcgtgctcg taaacggacc     9600

cgaacatctc tggagctttc ttcagggccg acaatcggat ctcgcggaaa tcctgcacgt     9660

cggccgctcc aagccgtcga atctgagcct taatcacaat tgtcaatttt aatcctctgt     9720

ttatcggcag ttcgtagagc gcgccgtgcg cccgagcgat actgagcgaa gcaagtgcgt     9780

cgagcagtgc ccgcttgttc ctgaaatgcc agtaaagcgc tggctgctga acccccagcc     9840

ggaactgacc ccacaaggcc ctagcgtttg caatgcacca ggtcatcatt gacccaggcg     9900

tgttccacca ggccgctgcc tcgcaactct tcgcaggctt cgccgacctg ctcgcgccac     9960

ttcttcacgc gggtggaatc cgatccgcac atgaggcgga aggtttccag cttgagcggg    10020

tacggctccc ggtgcgagct gaaatagtcg aacatccgtc gggccgtcgg cgacagcttg    10080

cggtacttct cccatatgaa tttcgtgtag tggtcgccag caaacagcac gacgatttcc    10140

tcgtcgatca ggacctggca acgggacgtt ttcttgccac ggtccaggac gcggaagcgg    10200

tgcagcagcg acaccgattc caggtgccca acgcggtcgg acgtgaagcc catcgccgtc    10260

gcctgtaggc gcgacaggca ttcctcggcc ttcgtgtaat accggccatt gatcgaccag    10320

cccaggtcct ggcaaagctc gtagaacgtg aaggtgatcg gctcgccgat aggggtgcgc    10380

ttcgcgtact ccaacacctg ctgccacacc agttcgtcat cgtcggcccg cagctcgacg    10440

ccggtgtagg tgatcttcac gtccttgttg acgtggaaaa tgaccttgtt ttgcagcgcc    10500

tcgcgcggga ttttcttgtt gcgcgtggtg aacagggcag agcgggccgt gtcgtttggc    10560

atcgctcgca tcgtgtccgg ccacggcgca atatcgaaca aggaaagctg catttccttg    10620

atctgctgct tcgtgtgttt cagcaacgcg gcctgcttgg cctcgctgac ctgttttgcc    10680

aggtcctcgc cggcggtttt tcgcttcttg gtcgtcatag ttcctcgcgt gtcgatggtc    10740

atcgacttcg ccaaacctgc cgcctcctgt tcgagacgac gcgaacgctc cacggcggcc    10800

gatggcgcgg gcagggcagg gggagccagt tgcacgctgt cgcgctcgat cttggccgta    10860

gcttgctgga ccatcgagcc gacggactgg aaggtttcgc ggggcgcacg catgacggtg    10920

cggcttgcga tggtttcggc atcctcggcg gaaaaccccg cgtcgatcag ttcttgcctg    10980

tatgccttcc ggtcaaacgt ccgattcatt caccctcctt gcgggattgc cccgactcac    11040

gccggggcaa tgtgccctta ttcctgattt gacccgcctg gtgccttggt gtccagataa    11100

tccaccttat cggcaatgaa gtcggtcccg tagaccgtct ggccgtcctt ctcgtacttg    11160

gtattccgaa tcttgccctg cacgaatacc agcgacccct tgcccaaata cttgccgtgg    11220

gcctcggcct gagagccaaa acacttgatg cggaagaagt cggtgcgctc ctgcttgtcg    11280

ccggcatcgt tgcgccactc ttcattaacc gctatatcga aaattgcttg cggcttgtta    11340

gaattgccat gacgtacctc ggtgtcacgg gtaagattac cgataaactg gaactgatta    11400

tggctcatat cgaaagtctc cttgagaaag gagactctag tttagctaaa cattggttcc    11460

gctgtcaaga actttagcgg ctaaaatttt gcgggccgcg accaaaggtg cgaggggcgg    11520

cttccgctgt gtacaaccag atatttttca ccaacatcct tcgtctgctc gatgagcggg    11580

gcatgacgaa acatgagctg tcggagaggg caggggtttc aatttcgttt ttatcagact    11640

taaccaacgg taaggccaac ccctcgttga aggtgatgga ggccattgcc gacgccctgg    11700

aaactcccct acctcttctc ctggagtcca ccgaccttga ccgcgaggca ctcgcggaga  11760

ttgcgggtca tcctttcaag agcagcgtgc cgcccggata cgaacgcatc agtgtggttt  11820

tgccgtcaca taaggcgttt atcgtaaaga aatggggcga cgacacccga aaaaagctgc  11880

gtggaaggct ctgacgccaa gggttagggc ttgcacttcc ttctttagcc gctaaaacgg  11940

ccccttctct gcgggccgtc ggctcgcgca tcatatcgac atcctcaacg gaagccgtgc  12000

cgcgaatggc atcgggcggg tgcgctttga cagttgtttt ctatcagaac ccctacgtcg  12060

tgcggttcga ttagctgttt gtcttgcagg ctaaacactt tcggtatatc gtttgcctgt  12120

gcgataatgt tgctaatgat ttgttgcgta ggggttactg aaaagtgagc gggaaagaag  12180

agtttcagac catcaaggag cgggccaagc gcaagctgga acgcgacatg ggtgcggacc  12240

tgttggccgc gctcaacgac ccgaaaaccg ttgaagtcat gctcaacgcg gacggcaagg  12300

tgtggcacga acgccttggc gagccgatgc ggtacatctg cgacatgcgg cccagccagt  12360

cgcaggcgat tatagaaacg gtggccggat tccacggcaa agaggtcacg cggcattcgc  12420

ccatcctgga aggcgagttc cccttggatg gcagccgctt tgccggccaa ttgccgccgg  12480

tcgtggccgc gccaaccttt gcgatccgca agcgcgcggt cgccatcttc acgctggaac  12540

agtacgtcga ggcgggcatc atgacccgcg agcaatacga ggtcattaaa agcgccgtga  12600

ttgatgatat agcggcccgg ctgctcctgg ttctcgcgca ccgaaatggg tgacttcacc  12660

ccgcgctctt tgatcgtggc accgatttcc gcgatgctct ccggggaaaa gccggggttg  12720

tcggccgtcc gcggctgatg cggatcttcg tcgatcaggt ccaggtccag ctcgataggg  12780

ccggaaccgc cctgagacgc cgcaggagcg tccaggaggc tcgacaggtc gccgatgcta  12840

tccaacccca ggccggacgg ctgcgccgcg cctgcggctt cctgagcggc cgcagcggtg  12900

tttttcttgg tggtcttggc ttgagccgca gtcattggga aatctccatc ttcgtgaaca  12960

cgtaatcagc cagggcgcga acctctttcg atgccttgcg cgcggccgtt ttcttgatct  13020

tccagaccgg cacaccggat gcgagggcat cggcgatgct gctgcgcagg ccaacggtgg  13080

ccggaatcat catcttgggg tacgcggcca gcagctcggc ttggtggcgc gcgtggcgcg  13140

gattccgcgc atcgaccttg ctgggcacca tgccaaggaa ttgcagcttg gcgttcttct  13200

ggcgcacgtt cgcaatggtc gtgaccatct tcttgatgcc ctggatgctg tacgcctcaa  13260

gctcgatggg ggacagcaca tagtcggccg cgaagagggc ggccgccagg ccgacgccaa  13320

gggtcggggc cgtgtcgatc aggcacacgt cgaagccttg gttcgccagg gccttgatgt  13380

tcgccccgaa cagctcgcgg gcgtcgtcca gcgacagccg ttcggcgttc gccagtaccg  13440

ggttggactc gatgagggcg aggcgcgcgg cctggccgtc gccggctgcg ggtgcggttt  13500

cggtccagcc gccggcaggg acagcgccga acagcttgct tgcatgcagg ccggtagcaa  13560

agtccttgag cgtgtaggac gcattgccct gggggtccag gtcgatcacg gcaacccgca  13620

agccgcgctc gaaaaagtcg aaggcaagat gcacaagggt cgaagtcttg ccgacgccgc  13680

ctttctggtt ggccgtgacc aaagttttca tcgtttggtt tcctgttttt tcttggcgtc  13740

cgcttcccac ttccggacga tgtacgcctg atgttccggc agaaccgccg ttacccgcgc  13800

gtacccctcg ggcaagttct tgtcctcgaa cgcggcccac acgcgatgca ccgcttgcga  13860

cactgcgccc ctggtcagtc ccagcgacgt tgcgaacgtc gcctgtggct tcccatcgac  13920

taagacgccc cgcgctatct cgatggtctg ctgccccact tccagcccct ggatcgcctc  13980

ctggaactgg ctttcggtaa gccgtttctt catggataac acccataatt tgctccgcgc  14040

cttggttgaa catagcggtg acagccgcca gcacatgaga gaagtttagc taaacatttc  14100

tcgcacgtca acacctttag ccgctaaaac tcgtccttgg cgtaacaaaa caaaagcccg  14160

gaaaccgggc tttcgtctct tgccgcttat ggctctgcac ccggctccat caccaacagg  14220

tcgcgcacgc gcttcactcg gttgcggatc gacactgcca gcccaacaaa gccggttgcc  14280

gccgccgcca ggatcgcgcc gatgatgccg gccacaccgg ccatcgccca ccaggtcgcc  14340

gccctcactg cccggcacct ggtcgctgaa tgtcgatgcc agcacctgcg gcacgtcaat  14400

gcttccgggc gtcgcgctcg ggctgatcgc ccatcccgtt actgccccga tcccggcaat  14460

ggcaaggact gccagcg                                                 14477

<210>2

<211>32

<212>DNA

<213>克隆SD、pucBA、Xa、His-tag等基因序列的上游引物

<400>2

agctggtacc agttgggaga cgacacagtg ac                                 32

<210>3

<211>87

<212>DNA

<213>克隆SD、pucBA、Xa、His-tag等基因序列的下游引物

<400>3

tataggatcc ttagtggtgg tggtggtggt ggtggtggtg gtgtctagag agctcccttc   60

cctcgatctc ggccgcgacc gcagccg                                       87

<210>4

<211>427

<212>DNA

<213>克隆的SD、pucBA、Xa、His-tag等基因序列

<400>4

agctggtacc agttgggaga cgacacagtg actgacgatc tgaacaaagt ctggccgagc   60

ggcctgaccg ttgccgaagc cgaagaagtt cataagcaac tcatcctcgg cacccgcgtc  120

ttcggtggca tggcgctcat cgcgcacttc ctcgccgccg ctgcgacccc gtggctcggc  180

tgataggaga agactgacat gaccaacggc aaaatctggc tcgtggtgaa accgaccgtc  240

ggcgttccgc tgttcctcag cgctgccgtc atcgcctccg tcgttatcca cgctgctgtg  300

ctgacgacca ccacctggct gcccgcctac taccaaggct cggctgcggt cgcggccgag  360

atcgagggaa gggagctctc tagacaccac caccaccacc accaccacca ccactaagga  420

tcctata                                                            427

<210>5

<211>31

<212>DNA

<213>克隆GST基因的上游引物

<400>5

cgagctcatg tcccctatac taggttattg g                                 31

<210>6

<211>30

<212>DNA

<213>克隆GST基因的下游引物

<400>6

gctctagagt cagtcacgat gcggccgctc                                   30

<210>7

<211>26

<212>DNA

<213>克隆GFP基因的上游引物

<400>7

cgagctcatg agtaaaggag aagaac                                       26

<210>8

<211>28

<212>DNA

<213>克隆GFP基因的下游引物

<400>8

gctctagatt tgtatagttc atccatgc                                     28

<210>9

<211>27

<212>DNA

<213>克隆GUS基因的上游引物

<400>9

gcgagctcat caaaaaactc gacggcc                                       27

<210>10

<211>28

<212>DNA

<213>克隆GUS基因的下游引物

<400>10

gctctagatt gtttgcctcc ctgctgcg                                      28

<210>11

<211>750

<212>DNA

<213>克隆的GST基因的序列

<400>11

cgagctcatg tcccctatac taggttattg gaaaattaag ggccttgtgc aacccactcg   60

acttcttttg gaatatcttg aagaaaaata tgaagagcat ttgtatgagc gcgatgaagg  120

tgataaatgg cgaaacaaaa agtttgaatt gggtttggag tttcccaatc ttccttatta  180

tattgatggt gatgttaaat taacacagtc tatggccatc atacgttata tagctgacaa  240

gcacaacatg ttgggtggtt gtccaaaaga gcgtgcagag atttcaatgc ttgaaggagc  300

ggttttggat attagatacg gtgtttcgag aattgcatat agtaaagact ttgaaactct  360

caaagttgat tttcttagca agctacctga aatgctgaaa atgttcgaag atcgtttatg  420

tcataaaaca tatttaaatg gtgatcatgt aacccatcct gacttcatgt tgtatgacgc  480

tcttgatgtt gttttataca tggacccaat gtgcctggat gcgttcccaa aattagtttg  540

ttttaaaaaa cgtattgaag ctatcccaca aattgataag tacttgaaat ccagcaagta  600

tatagcatgg cctttgcagg gctggcaagc cacgtttggt ggtggcgacc atcctccaaa  660

atcggatctg gaagttctgt tccaggggcc cctgggatcc ccgaattccc gggtcgactc  720

gagcggccgc atcgtgactg actctagagc                                   750

<210>12

<211>729

<212>DNA

<213>克隆的GFP基因的序列

<400>12

cgagctcatg agtaaaggag aagaactttt cactggagtt gtcccaattc ttgttgaatt   60

agatggtgat gttaatgggc acaaattttc tgtcagtgga gagggtgaag gtgatgcaac  120

atacggaaaa cttaccctta aatttatttg cactactgga aaactacctg ttccatggcc  180

aacacttgtc actactttct cttatggtgt tcaatgcttt tcaagatacc cagatcatat  240

gaaacggcat gactttttca agagtgccat gcccgaaggt tatgtacagg aaagaactat  300

atttttcaaa gatgacggga actacaagac acgtgctgaa gtcaagtttg aaggtgatac  360

ccttgttaat agaatcgagt taaaaggtat tgattttaaa gaagatggaa acattcttgg  420

acacaaattg gaatacaact ataactcaca caatgtatac atcatggcag acaaacaaaa  480

gaatggaatc aaagttaact tcaaaattag acacaacatt gaagatggaa gcgttcaact  540

agcagaccat tatcaacaaa atactccaat tggcgatggc cctgtccttt taccagacaa  600

ccattacctg tccacacaat ctgccctttc gaaagatccc aacgaaaaga gagaccacat  660

ggtccttctt gagtttgtaa cagctgctgg gattacacat ggcatggatg aactatacaa  720

atctagagc                                                          729

<210>13

<211>1789

<212>DNA

<213>克隆的GUS基因的序列

<400>13

gcgagctcat caaaaaactc gacggcctgt gggcattcag tctggatcgc gaaaactgtg    60

gaattgatca gcgttggtgg gaaagcgcgt tacaagaaag ccgggcaatt gctgtgccag   120

gcagttttaa cgatcagttc gccgatgcag atattcgtaa ttatgcgggc aacgtctggt   180

atcagcgcga agtctttata ccgaaaggtt gggcaggcca gcgtatcgtg ctgcgtttcg   240

atgcggtcac tcattacggc aaagtgtggg tcaataatca ggaagtgatg gagcatcagg   300

gcggctatac gccatttgaa gccgatgtca cgccgtatgt tattgccggg aaaagtgtac   360

gtatcaccgt ttgtgtgaac aacgaactga actggcagac tatcccgccg ggaatggtga   420

ttaccgacga aaacggcaag aaaaagcagt cttacttcca tgatttcttt aactatgccg   480

gaatccatcg cagcgtaatg ctctacacca cgccgaacac ctgggtggac gatatcaccg   540

tggtgacgca tgtcgcgcaa gactgtaacc acgcgtctgt tgactggcag gtggtggcca   600

atggtgatgt cagcgttgaa ctgcgtgatg cggatcaaca ggtggttgca actggacaag   660

gcactagcgg gactttgcaa gtggtgaatc cgcacctctg gcaaccgggt gaaggttatc   720

tctatgaact gtgcgtcaca gccaaaagcc agacagagtg tgatatctac ccgcttcgcg   780

tcggcatccg gtcagtggca gtgaagggcg aacagttcct gattaaccac aaaccgttct   840

actttactgg ctttggtcgt catgaagatg cggacttacg tggcaaagga ttcgataacg   900

tgctgatggt gcacgaccac gcattaatgg actggattgg ggccaactcc taccgtacct   960

cgcattaccc ttacgctgaa gagatgctcg actgggcaga tgaacatggc atcgtggtga  1020

ttgatgaaac tgctgctgtc ggctttaacc tctctttagg cattggtttc gaagcgggca  1080

acaagccgaa agaactgtac agcgaagagg cagtcaacgg ggaaactcag caagcgcact  1140

tacaggcgat taaagagctg atagcgcgtg acaaaaacca cccaagcgtg gtgatgtgga  1200

gtattgccaa cgaaccggat acccgtccgc aagtgcacgg gaatatttcg ccactggcgg  1260

aagcaacgcg taaactcgac ccgacgcgtc cgatcacctg cgtcaatgta atgttctgcg  1320

acgctcacac cgataccatc agcgatctct ttgatgtgct gtgcctgaac cgttattacg  1380

gatggtatgt ccaaagcggc gatttggaaa cggcagagaa ggtactggaa aaagaacttc  1440

tggcctggca ggagaaactg catcagccga ttatcatcac cgaatacggc gtggatacgt  1500

tagccgggct gcactcaatg tacaccgaca tgtggagtga agagtatcag tgtgcatggc  1560

tggatatgta tcaccgcgtc tttgatcgcg tcagcgccgt cgtcggtgaa caggtatgga  1620

atttcgccga ttttgcgacc tcgcaaggca tattgcgcgt tggcggtaac aagaaaggga  1680

tcttcactcg cgaccgcaaa ccgaagtcgg cggcttttct gctgcaaaaa cgctggactg  1740

gcatgaactt cggtgaaaaa ccgcagcagg gaggcaaaca atctagagc              1789

Claims (10)

1.一种能快速检测外源蛋白表达的光合细菌表达体系，包含表达载体和目的蛋白的诱导表达及分离纯化两部分，其特征在于表达载体含puc操纵子序列，该puc操纵子包括结构基因pucB，pucA和pucC。

2.根据权利要求1所述的表达体系，其特征在于所述的puc操纵子获自类球红细菌。

3.根据权利要求1或2所述的表达体系的构建方法，其特征在于包括以下步骤：

1)目的蛋白基因的克隆；

2)步骤1)获得的目的蛋白基因与表达载体连接，获得含有目的蛋白基因的融合蛋白表达载体；

3)步骤2)获得的融合蛋白表达载体通过大肠杆菌S17-1接合转移到类球红细菌突变株DD13，构建成目的融合蛋白的工程菌；

4)目的融合蛋白工程菌的诱导表达；

5)光谱分析检测步骤4)所得的目的融合蛋白的表达情况；

6)目的融合蛋白的提取和分离纯化。

4.根据权利要求3所述的能快速检测外源蛋白表达的表达体系的构建方法，其特征在于步骤2)中所述的表达载体包括pRK-CH或pRK-AH；

5.根据权利要求3所述的能快速检测外源蛋白表达的表达体系的构建方法，其特征在于步骤2)所述的表达载体pRK-AH的序列为SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列。

6.根据权利要求3所述的能快速检测外源蛋白表达的表达体系的构建方法，其特征在于步骤3)中所述的类球红细菌突变株DD13为缺失LH2、LH1和RC基因的菌株。

7.根据权利要求3所述的能快速检测外源蛋白表达的表达体系的构建方法，其特征在于步骤4)所述的诱导表达方法为：黑暗和半好氧条件下，添加IPTG至终浓度1mM；

8.根据权利要求3所述的能快速检测外源蛋白表达的表达体系的构建方法，其特征在于步骤5)所述的光谱分析方法为：采用紫外/可见分光光度计直接在700nm-880nm波段扫描分析步骤4)所述诱导表达后的工程菌发酵液；

9.根据权利要求3所述的能快速检测外源蛋白表达的表达体系的构建方法，其特征在于步骤6)所述的目的融合蛋白的提取和分离纯化方法为：步骤4)所得工程菌发酵液经离心收集菌体，并用机械破碎法破碎细胞，然后采用高速和超高速离心法将破碎细胞的可溶性蛋白和膜蛋白分离开，用LDAO去垢剂处理总膜蛋白，最后采用组氨酸亲和层析法分离纯化目的融合蛋白；

10.权利要求1或2所述的表达体系在蛋白质或多肽的表达中的应用。

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