CN102839141A - 一种产酯酶肠杆菌、其酯酶和基因及其在制备紫杉醇手性前体中的应用 - Google Patents

一种产酯酶肠杆菌、其酯酶和基因及其在制备紫杉醇手性前体中的应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种产酯酶的肠杆菌，所述肠杆菌产生的酯酶的蛋白质序列，该酯酶的基因，含有该基因的重组表达子和重组表达转化体，以及重组酯酶及其制备方法。本发明还公开了利用该肠杆菌整细胞，其酯酶或其重组酯酶催化消旋(±)-苯基缩水甘油酸甲酯对映选择性水解，制备生产手性紫杉醇前体(2S，3R)-苯基缩水甘油酸甲酯的用途。所述肠杆菌（Enterobacter sp.）ECU 1107的保藏编号为CGMCC No.5981。采用本发明提供的肠杆菌整细胞，其酯酶或重组酯酶催化制备紫杉醇前体，工艺简单，反应条件温和，催化效率高，产物光学纯度好，对映体过量值(ee)>99%，具有很好的工业应用前景。

Description

一种产酯酶肠杆菌、其酯酶和基因及其在制备紫杉醇手性前体中的应用
技术领域
本发明具体涉及一种产立体选择性酯酶的肠杆菌，该酯酶蛋白质，编码该酯酶的基因，含有该基因的重组载体和重组表达转化体，所述酯酶及其重组酯酶的制备方法，以及所述肠杆菌整细胞，或所述酯酶，或其重组酯酶作为催化剂在制备紫杉醇手性前体(2S，3R)-苯基缩水甘油酸甲酯中的应用。
背景技术
光学活性的苯基缩水甘油酸甲酯是一种重要的手性砌块，(2S，3R)-苯基缩水甘油酸甲酯可以用于合成抗癌药物紫杉醇的侧链，也可以作为手性药物黄皮酰胺的起始材料。紫杉醇具有良好的抗肿瘤活性，对于卵巢癌、乳腺癌、肺癌、白血病、肠胃癌等多种癌症具有良好的治疗作用，而黄皮酰胺具有促智作用，是一种抗老年痴呆药物。如何获得单一构型的光学纯苯基缩水甘油酸甲酯已成为人们所关注和研究的重要课题。
目前光学纯紫杉醇手性前体苯基缩水甘油酸甲酯的制备方法主要分为化学不对称合成法和酶促拆分法。化学不对称合成法主要是α，β-不饱和酮或酯的不对称环氧化(Journal of Organic Chemistry,2004,69:4216-4226;Chemistry-An Asian Journal,2007,2:257-264和Advanced Synthesis&Catalysis,2009,351:1685-1691)。然而这种方法合成的是(2R,3S)-构型的苯基缩水甘油酸甲酯。酶促拆分法包括苯基缩水甘油酸甲酯的转酯化拆分以及水解拆分两种(Advanced Synthesis&Catalysis,2001,343:721-725和WO Patent2004087932)，苯基缩水甘油酸甲酯的转酯化拆分法选择性低，产物分离困难。Zheng等用恶臭假单胞菌(Peseudomonas putida)整细胞为催化剂，催化苯基缩水甘油酸甲酯的水解拆分，30℃反应12h得到了对映体过量值(ee)为99%的(2S,3R)-苯基缩水甘油酸甲酯(Journal of Molecular Catalysis B:Enzymatic,2006,43:133-136)。尽管如此，该方法底物浓度较低，仅为50～60mM左右、催化剂活性差，反应时间较长，不适宜于工业化应用。
发明内容
因此，本发明要解决的技术问题就是针对现有的酯酶催化紫杉醇手性前体苯基缩水甘油酸甲酯水解拆分反应时酶催化活性偏低、底物耐受性差、反应时间长等问题，提供一种催化活性高、对映选择性好、底物耐受性好、反应时间短的肠杆菌菌株（Enterobacter sp.）ECU 1107以及该酯酶蛋白质，编码该酯酶蛋白质的基因，含有该基因的重组表达载体，含有该载体的重组表达转化体以及该重组酯酶的制备方法。本发明还公开了利用上述肠杆菌菌株、酯酶和重组表达转化体作为催化剂，催化拆分水解反应制备紫杉醇手性前体(2S,3R)-苯基缩水甘油酸甲酯的方法。
为解决上述技术问题，本发明采取的技术方案之一是：一种肠杆菌（Enterobacter sp.）ECU 1107，其保藏编号为CGMCC No.5981。
本发明人从中国上海、江苏、浙江、山东、黑龙江、海南等省市以及越南顺化等地采集土样，从土壤微生物中经过初筛、复筛和分离纯化，得到一种能够选择性催化苯基缩水甘油酸甲酯对映选择性水解制备(2S，3R)-苯基缩水甘油酸甲酯的肠杆菌，将其命名为肠杆菌（Enterobacter sp.）ECU 1107。该菌株已于2012年4月10日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，保藏号为CGMCC No.5981。
本发明所述的肠杆菌具有如下微生物学特征：
（1）形态特征：
短杆菌，革兰氏染色阴性，具有周身鞭毛帮助运动，大小约为长1.2～3.0μm、宽0.6～1.0μm。
（2）固体平板培养基上的菌落特征(30℃培养48h)：
该菌株呈粘液状，湿润、光滑，乳白色。
（3）生长环境：
该菌株可在温度15～40℃范围内生长，在pH5～9，NaCl浓度0～7%(w/v)的环境中生存。
其中所述肠杆菌（Enterobacter sp.）ECU 1107的培养基成分包括：葡萄糖含量较佳地为1～20g/L，优选地为10g/L，蛋白胨含量较佳地为1～20g/L，优选地为5g/L，酵母膏含量较佳地为1～20g/L，优选地为5g/L，KH2PO4含量较佳地为0.1～3g/L，优选地为1g/L，MgSO4含量较佳地为0.1～3g/L，优选地为0.5g/L，NaCl含量较佳地为0.1～3g/L，优选地为1g/L，pH较佳地为5～8，优选地为7，115℃灭菌30分钟。
所述肠杆菌（Enterobacter sp.）ECU 1107的培养方法较佳地包括摇瓶培养：其中，所述摇瓶装液量较佳地为10～30%，优选地为20%(v/v)，接种量较佳地为1～10%，优选地为1%(v/v)，培养温度较佳地为20～40℃，优选地为25～35℃，摇床转速100～200rpm，优选地为180rpm，培养时间较佳地为1～3天，优选地为24小时，培养液离心、洗涤之后得到菌体。
所述肠杆菌（Enterobacter sp.）ECU 1107的培养方法较佳地还包括发酵罐培养：培养基与摇瓶培养相同。发酵罐装液量较佳地为：40～60%(v/v)，115℃灭菌30分钟，接入5～10%（v/v）种子培养液，培养温度较佳地为25～35℃，pH较佳地为6.0～8.0，通气量较佳地为2.0～4.0L/min，搅拌转速较佳地为200～400转/分，发酵的时间较佳地为12～36小时，发酵液离心收集菌体。
为解决上述技术问题，本发明采取的技术方案之二是：一种分离的蛋白质，其是如下(a)或(b)的蛋白质：
(a)其氨基酸序列如序列表中SEQ ID No:2所示的蛋白质；
(b)在(a)中的氨基酸序列中经过取代、缺失或添加一个或几个氨基酸残基且具有酯酶活性的由(a)衍生的蛋白质。
其中所述的其氨基酸序列如序列表中SEQ ID No:2所示的蛋白质可以从肠杆菌（Enterobacter sp.）ECU 1107中分离获得，也可以从重组表达该蛋白质的表达转化体中分离获得，也可以人工合成获得。
蛋白质(b)是在(a)的氨基酸序列中经过取代、缺失或添加一个或几个氨基酸且具有酯酶活性的由(a)衍生的蛋白质。其中所述的“几个”是指二个至小于100个，更佳的小于30个。较佳地包括：添加一个外分泌信号肽的融合蛋白，本发明发现这样的融合蛋白同样具有酯酶活性。也就是说，只要由(a)衍生的蛋白质具有酯酶活性，且衍生方式如上所述，都可以达到本发明的发明目的。
为解决上述技术问题，本发明采取的技术方案之三是：一种分离的核酸，其是如下(1)或(2)的核酸：
(1)其核苷酸序列如序列表中SEQ ID No:1所示的核酸；
(2)编码如下蛋白质(a)或(b)的基因：
(a)其氨基酸序列如序列表中SEQ ID No:2所示的蛋白质；
(b)在(a)中的氨基酸序列经过取代、缺失或添加一个或几个氨基酸且具有酯酶活性的由(a)衍生的蛋白质。
本发明所述核苷酸序列如SEQ ID No:1所示的核酸较佳地包括：从肠杆菌（Enterobacter sp.）ECU 1107基因组中分离获得，从含有该SEQ ID No:1所示核苷酸序列的重组表达载体中或重组转化体中分离获得，也可以全基因人工合成获得。
本发明所述核酸的来源较佳地为：根据Genbank中收录的Enterobactercloacae subsp.cloacae ATCC 13047的全基因组序列中预测为酯酶基因(GeneID：9126831)的序列设计合成引物，以肠杆菌（Enterobacter sp）ECU1107基因组DNA为模板，通过PCR方法获得所述核苷酸序列。
本发明所述核酸的来源优选地为：设计PCR引物如下：
上游引物：5’-CGCGGATCCATGTCTACGCTCCTCTACCTGCAT-3’；
下游引物：5’-CCCAAGCTTTCAGAGGCTGTGCAGTCCAA-3’；
其中，上游引物（其序列如序列表中SEQ ID NO:3所示）下划线部分为BamHⅠ酶切位点，下游引物（其序列如序列表中SEQ ID NO:4所示）下划线部分为HindIII酶切位点。然后以肠杆菌（Enterobacter sp.）ECU 1107的基因组DNA为模板，利用聚合酶链式反应(PCR)进行DNA扩增，获得完整的酯酶基因全长DNA序列。
本发明中，其核苷酸序列如序列表中SEQ ID No:1所示的酯酶基因，命名为EnEst01，全长582bp。其中，其编码序列(CDS)从第1个碱基起至第579个碱基止，起始密码子为ATG，终止密码子为TGA。该序列不包含内含子，其编码的蛋白质的氨基酸序列如序列表中SEQ ID No:2所示。
如本领域技术人员所知，由于密码子的简并性，编码SEQ ID No:2的氨基酸序列的核苷酸序列不仅仅局限于序列表中SEQ ID No:1所示的核苷酸序列。本发明的酯酶基因的核苷酸序列也可以是编码具有序列表中SEQ IDNo:2所示氨基酸序列的蛋白质的其他任何核苷酸序列。所述核苷酸序列还包括通过适当引入替换、缺失或插入形成的多聚核苷酸的同系物。所述多聚核苷酸的同系物可以通过对核酸序列SEQ ID No:1的一个或多个碱基在保持酯酶活性范围内进行替换、缺失或增加来制得。
SEQ ID No:1的同系物也指启动子变体。在所述的核酸序列之前的启动子或信号序列可通过一个或多个核酸的替换、插入或缺失而改变，但这些改变对启动子的功能没有负面影响。而且通过改变启动子的序列或甚至用来自不同种生物体的更有效的启动子完全替换，可提高目标蛋白的表达水平。SEQ ID No:1的同系物还包括一类具有在标准条件下能够与SEQ ID No:1所示序列的多聚核酸进行杂交的碱基序列的多聚核酸，所述标准条件下进行的杂交可根据《分子克隆》（Cold Spring Harbor Laboratory Press）记载的分子生物学中的通用方案(Current Protocols in Molecular Biology)所述的方式进行。
为解决上述技术问题，本发明采取的技术方案之四是：一种包含如上所述的核酸的重组表达载体。
其中所述重组表达载体可通过本领域常规方法将本发明的所述的酯酶基因或其突变体的核苷酸分子连接于各种表达载体上构建而成。所述的表达载体包括本领域常规的各种载体。所述载体较佳地包括：各种质粒、粘粒、噬菌体或病毒载体等，所述载体优选地为质粒pET28a。
所述重组表达载体的构建方法为本领域常规质粒克隆方法。所述克隆方法较佳地为：将前述通过PCR扩增所得的核酸产物与表达载体pET28a分别用限制性内切酶BamHⅠ和HindIII双酶切，形成互补的粘性末端，经T4 DNA连接酶连接，形成含有本发明所述的酯酶基因的重组表达质粒，将其命名为pET-EnEst01。
为解决上述技术问题，本发明采取的技术方案之五是：一种包含如上所述的重组表达载体的重组表达转化体。
其中所述重组表达转化体的制备方法较佳地为：将如上所述的重组表达载体转化至宿主微生物中制得。所述的宿主微生物较佳地为本领域常规的各种宿主微生物，只要能满足使上述重组表达载体稳定地自行复制，且所携带的酯酶基因可被有效表达即可。其中所述宿主微生物较佳地为：大肠埃希氏菌(E.coli)，更佳地为大肠埃希氏菌BL21(DE3)或大肠埃希氏菌DH5α。将前述重组表达质粒pET-EnEst01转化至大肠埃希氏BL21(DE3)中，即可得本发明优选的基因工程菌株，即大肠埃希氏菌BL21(DE3)/pET-EnEst01。所述转化方法为本领域常规转化方法，其较佳地包括化学转化法，热激法或电转法。
为解决上述技术问题，本发明采取的技术方案之六是：一种重组酯酶的制备方法，其包括如下步骤：培养如上所述的重组表达转化体，从培养物中获得重组表达的酯酶。
其中，所述的重组表达转化体的制备方法同前述介绍，可通过将本发明的重组表达载体转化至宿主细胞得到。所述的培养重组表达转化体中所用的培养基可以是本领域常规的任何可使转化体生长并产生本发明的酯酶的培养基，对于大肠杆菌菌株，优选LB培养基（其配方为：蛋白胨10g/L，酵母膏5g/L，NaCl 10g/L，pH 7.0）。培养方法和培养条件没有特殊的限制，可以根据宿主类型和培养方法等因素的不同按本领域普通知识进行适当的选择，只要能使转化体生长并产生本发明的酯酶即可。
对于本发明所述菌株大肠埃希氏菌BL21(DE3)/pET-EnEst01，培养方法优选地包括：将本发明所述的重组大肠埃希氏菌接种至含有卡那霉素的LB培养基中30～40℃，150～200rpm培养，培养液的吸光密度OD600较佳地为0.5~0.7，优选地为0.6时，加入异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷(IPTG)进行诱导，培养基中IPTG的终浓度较佳地为0.01~1.0mmol/L，优选地为0.1mmol/L，诱导时间较佳地为10～24小时，优选地为12~16小时。
所述重组酯酶的制备方法还包括：诱导表达结束后，培养液离心，得到静息细胞，将细胞重悬于缓冲液中，在冰浴状态下超声破碎，离心收集上清液，即得重组酯酶的粗酶液，所述缓冲液较佳地为磷酸盐缓冲液。将所得粗酶液放入-80℃冰箱预冻过夜，真空条件下冷冻干燥，即得重组酯酶粗酶粉。所述真空条件较佳地为真空度0.1～0.2mbar，冷冻干燥的温度较佳地为-50～-80℃，冷冻干燥的时间较佳地为24～48h。
所述重组酯酶活力的测定方法较佳地包括如下步骤：移取300μl适量稀释的制备的粗酶液，加入2.67ml磷酸钾缓冲液(KPB，100mmol/L，pH7.0)中，在30℃预保温3分钟后，加入30μl对硝基苯酚丁酸酯(pNPB)的DMSO溶液(100mmol/L)，使pNPB的终浓度为1mmol/L，于30℃、405nm测定对硝基苯酚吸光度的增长速率。在上述反应条件下，每分钟生成1.0μmol对硝基苯酚所需要的酶量，定义为一个酶活力单位(U)，制备所得的重组酯酶命名为EnEst01重组酯酶。
为解决上述技术问题，本发明采取的技术方案之七是：一种酯酶的制备方法，其方法包括以下步骤：
(1)培养如前所述的肠杆菌，将其培养混合物离心后获得肠杆菌整细胞；或
(2)将步骤(1)所得肠杆菌整细胞破碎后制备成酯酶粗酶液；或
(3)将步骤(2)所得酯酶粗酶液冷冻干燥后制备成酯酶粗酶粉。
其中步骤(1)中所述发酵培养肠杆菌的方法如上文所述，其中所述离心的速度较佳地为8000~10000rpm，离心的时间较佳地为15~30min。
其中步骤(2)所述肠杆菌整细胞破碎的方法为本领域常规的细胞破碎方法。所述肠杆菌整细胞的破碎方法较佳地包括：将收获的肠杆菌湿菌体用500~1000ml磷酸盐缓冲液(10mM,pH 7.0)重新悬浮，冰浴状态下超声破碎，离心收集上清液即得所述肠杆菌酯酶。其中所述离心的速度较佳地为8000~10000rpm，优选地为9000rpm，离心时间较佳地为20~30min，优选为20分钟。
其中步骤(3)所述的粗酶液冷冻干燥的方法为本领域常规的冷冻干燥方法。本发明所述粗酶液的冷冻干燥方法较佳地为：将步骤(2)所得肠杆菌酯酶粗酶液放入-80℃冰箱预冻过夜，真空条件下冷冻干燥，真空度较佳地为0.1～0.2mbar，冷冻温度较佳地为-50～-80℃，冷冻干燥的时间较佳地为24～48h，即得肠杆菌酯酶粗酶粉。
为解决上述技术问题，本发明采取的技术方案之八是：如上所述的肠杆菌，或如上所述的蛋白质，或如上所述的重组表达转化体在制备(2S,3R)-苯基缩水甘油酸甲酯中的用途。
其中所述的用途较佳地为，如上所述的肠杆菌，或如上所述的蛋白质，或如上所述的重组表达转化体表达的重组酯酶作为催化剂，在酶促拆分制备手性药物紫杉醇合成前体(2S，3R)-苯基缩水甘油酸甲酯中的用途。
为解决上述技术问题，本发明采取的技术方案之九是：一种(2S,3R)-苯基缩水甘油酸甲酯的制备方法，所述的制备方法包括：在有机溶剂和水相缓冲液构成的两相体系中，在如上所述的肠杆菌，或蛋白质的催化下，消旋底物(±)-苯基缩水甘油酸甲酯进行水解拆分反应，形成(2S,3R)-苯基缩水甘油酸甲酯。
其中所述(2S,3R)-苯基缩水甘油酸甲酯的制备方法较佳地包括：将上述培养得到的肠杆菌（Enterobacter sp.）ECU 1107湿细胞或上述重组酯酶蛋白质作为催化剂，以(±)-苯基缩水甘油酸甲酯为底物，在有机溶剂和水相缓冲液构成的两相体系中进行水解拆分反应，反应结束后收集有机相，即得(2S，3R)-苯基缩水甘油酸甲酯。
其中所述(±)-苯基缩水甘油酸甲酯底物的浓度较佳地为10～600mM，所述催化剂为前述肠杆菌（Enterobacter sp.）ECU 1107的湿细胞时，其用量较佳地为20～250g湿细胞/L，所述催化剂为前述重组酯酶的蛋白质时，其用量较佳地为0.2～4kU重组酯酶/L(反应液总体积)。所述水相缓冲液优选地为磷酸盐缓冲液，所述有不溶于水的机溶剂较佳地为异丙醚、正己烷、环己烷或异辛烷，其优选地为异辛烷。所述不溶于水的有机溶剂-水两相的体积比较佳地为1︰9～9︰1，其优选地为1︰4～2︰1(v/v)。所述反应的反应温度较佳地为20～50℃，优选地为30～40℃。所述反应的pH值较佳地为pH5～8，优选地为pH 6～7，所述反应的时间较佳地为2～48小时。
所述(2S,3R)-苯基缩水甘油酸甲酯的制备方法更佳地还包括纯化步骤。所述纯化步骤较佳地包括：反应结束后，离心取得有机相，水相用乙酸乙酯萃取，合并有机相，用饱和食盐水洗涤，再加无水硫酸钠干燥后，旋转蒸发去除有机溶剂，再经过硅胶柱层析分离纯化，即得(2S,3R)-苯基缩水甘油酸甲酯，所述(2S,3R)-苯基缩水甘油酸甲酯即为手性药物紫杉醇合成前体。
在符合本领域常识的基础上，上述各优选条件，可任意组合，即得本发明各较佳实例。
本发明所用试剂和原料均市售可得。
本发明的积极进步效果在于：利用本发明所提供的肠杆菌整细胞和重组酯酶催化制备(2S,3R)-苯基缩水甘油酸甲酯，其反应工艺简单，反应条件温和，催化效率高，产物光学纯度好，对映体过量值(ee)>99%，收率接近50%的理论最大收率，具有较好的工业应用前景。
生物材料保藏信息
本发明提供的肠杆菌（Enterobacter sp.）ECU 1107菌株，已于2012年4月10日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，邮编：100101。该菌株的保藏编号为：CGMCC No.5981。
附图说明
图1为EnEst01基因的PCR扩增DNA片段电泳图谱，其中：1.DNAMarker(Marker IV，北京天根生化科技有限公司)；2.EnEst01基因的PCR扩增产物。
图2为重组大肠埃希氏菌(E.coli)DH5α/pET-EnEst01的菌液PCR扩增电泳图，其中：1.DNA Marker(Marker IV，北京天根生化科技有限公司)；2～3.重组大肠埃希氏菌(E.coli)DH5α/pET-EnEst01的菌液PCR扩增产物。
图3为重组大肠埃希氏菌(E.coli)BL21(DE3)/pET-EnEst01的菌液PCR扩增电泳图。其中：1.DNA Marker(Marker IV，北京天根生化科技有限公司)；2～3.重组大肠埃希氏菌(E.coli)BL21(DE3)/pET-EnEst01的菌液PCR扩增产物。
图4为重组表达质粒pET-EnEst01的构建示意图。
图5为EnEst01重组酯酶的SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳图。
具体实施方式
下面通过实施例的方式进一步说明本发明，但并不因此将本发明限制在所述的实施例范围之中。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，按照常规方法和条件，或按照商品说明书选择。
实施例1肠杆菌（Enterobacter sp.）CGMCC 5981的摇瓶培养
在250ml摇瓶中装入50ml培养基，其培养基组成如下：葡萄糖10g，蛋白胨5g，酵母膏5g，KH2PO4 1.0g，MgSO4 0.5g，NaCl 1.0g，自来水1000ml，pH自然。将菌株CGMCC 5981接种到摇瓶中，在30℃，180rpm条件下预培养12小时作为种子液，将种子液以1%(v/v)的接种量转入装有100ml相同培养基的500ml摇瓶中，在30℃，180rpm条件下培养24小时，酶产量为123U/L。培养结束后，于9,000rpm离心得到含酯酶湿菌体。
实施例2肠杆菌（Enterobacter sp.）CGMCC 5981的发酵罐培养
种子培养与实施例1相同。在5L发酵罐中装入3L培养基，其组成如下：葡萄糖60g，蛋白胨30g，酵母膏30g，KH2PO4 3.0g，MgSO4 1.5g，NaCl 3.0g，自来水3L，pH 7.0。培养基灭菌后，接入预培养12小时的种子液200ml，在30℃、400rpm和1vvm条件下通气发酵，其间在4～12小时匀速流加甘油(8ml/h)，若产生泡沫则滴加泡敌（1%水溶液，w/v，购自上海飞达贸易有限公司)，进行消泡。发酵12小时后放罐。培养结束后，于9,000rpm离心得到含酯酶湿菌体，产酶量达830U/L。
实施例3EnEst01酯酶基因的克隆
根据Genbank收录的预测为Enterobacter cloacae subsp.cloacac ATCC13047酯酶的基因序列(GeneID：9126831)为依据，设计PCR引物如下：
上游引物为：5’-CGCGGATCCATGTCTACGCTCCTCTACCTGCAT-3’；
下游引物为：5’-CCCAAGCTTTCAGAGGCTGTGCAGTCCAA-3’。
其中，上游引物（其序列如序列表中SEQ ID NO:3所示）下划线部分为BamHⅠ酶切位点，下游引物（其序列如序列表中SEQ ID NO:4所示）下划线部分为HindIII酶切位点。
以肠杆菌（Enterobacter sp.）ECU 1107的基因组DNA为模板，进行PCR扩增。PCR体系为：2×Taq PCR MasterMix 15μl，上游引物和下游引物各1μl(0.6μmol/L)，DNA模板2μl(0.1μg)和ddH2O11μl。PCR扩增程序为：(1)95℃，预变性8min；(2)94℃，变性1min；(3)59℃，退火1min；(4)72℃，延伸1.5min；步骤(2)～(4)重复30次；(5)72℃，继续延伸10min，冷却至4℃。PCR产物经琼脂糖凝胶电泳纯化，利用琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒回收500～700bp区间的目标条带，其电泳图谱如图1所示。获得一条完整的肠杆菌（Enterobacter sp.）ECU 1107酯酶全长基因序列DNA片段，经DNA测序，全长582bp，将该基因命名为EnEst01，其碱基序列如序列表中SEQ IDNo:1所示。
实施例4EnEst01酯酶重组表达载体和重组表达转化体的制备
将实施例3所得的酯酶基因DNA片段在37℃用限制性内切酶BamHⅠ和HindIII双酶切20h，经琼脂糖凝胶电泳纯化，利用琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒(北京天根生化科技有限公司)回收目标片段。将目标片段在T4 DNA连接酶的作用下，与同样经BamHⅠ和HindIII酶切后的质粒pET28a（上海Novagen公司），在4℃下连接过夜得到重组表达质粒pET-EnEst01。
将上述重组表达质粒转化到大肠埃希氏菌(E.coli)DH5α感受态细胞中，在含有卡那霉素的抗性平板上对阳性重组体进行筛选，挑取单克隆，菌落PCR验证阳性克隆，PCR条件如实施例3所述，其结果如图2所示。培养重组菌，待质粒扩增后提取质粒，重新转化至大肠埃希氏菌(E.coli)BL21(DE3)感受态细胞中，转化液涂布到卡那霉素的LB平板上，37℃倒置培养过夜，即获得阳性重组转化体大肠埃希氏菌(E.coli)BL21(DE3)/pET-EnEst01，菌落PCR验证阳性克隆，其结果如图3所示。所述pET-EnEst01质粒的构建策略如图4所示。
实施例5EnEst01重组酯酶的表达
将实施例4所得的重组大肠杆菌，接种至含卡那霉素的LB培养基(蛋白胨10g，酵母膏5g，NaCl 10g，去离子水1000ml，pH 7.0)中，37℃振荡培养过夜，按1%(v/v)的接种量接入装有100ml LB培养基的500ml摇瓶中，置于37℃、180rpm的摇床中振荡培养，当培养液的OD600达到0.6时，加入终浓度为0.1mmol/L的IPTG作为诱导剂，25℃诱导12h后，将培养液离心，收集细胞，并用生理盐水洗涤两次，得静息细胞。将所得的静息细胞悬浮于15ml pH 7.0的缓冲液中，在冰浴中超声破碎，离心收集上清液，即为重组酯酶的粗酶液。
所述重组酯酶活力的测定方法：移取300μl适量稀释的制备的粗酶液，加入2.67ml磷酸钾缓冲液(KPB，100mmol/L，pH7.0)中，在30℃预保温3分钟后，加入30μl对硝基苯酚丁酸酯(pNPB)的DMSO溶液(100mmol/L)，使pNPB的终浓度为1mmol/L，于30℃、405nm测定对硝基苯酚吸光度的增长速率。在上述反应条件下，每分钟生成1.0μmol对硝基苯酚所需要的酶量，定义为一个酶活力单位(U)。
经检测，所得重组酯酶的活力为52.5U/ml，将其命名为EnEst01重组酯酶。所得粗酶液经SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳图分析，其结果如图5所示。
实施例6不同重组酯酶催化苯基缩水甘油酸甲酯的水解
按照实施例3～5所述的方法以不同的酯酶基因序列设计引物，以肠杆菌（Enterobacter sp.）ECU 1107的基因组DNA为模板，通过PCR方法得到七条酯酶基因的完整序列，将其克隆到pET28a质粒后，转化感受态细胞，获得到一系列重组酯酶静息细胞。将一定的湿菌体量加入到2ml pH为6.0的磷酸盐缓冲液中，加入同等体积的底物苯基缩水甘油酸甲酯浓度为10mmol/L的异辛烷中，30℃，180rpm，反应一段时间。收集有机相，经无水硫酸镁干燥处理后，进行色谱分析。
反应转化率和剩余底物的对映体过量值(ees)采用液相色谱分析，分析方法为：手性
Figure BDA00002135354500131
AD-H柱
Figure BDA00002135354500132
日本Daicel公司)；流动相：正己烷/异丙醇(80:20，v/v)，流速为0.8ml/min；紫外检测，波长254nm；柱温25°C。出峰时间：(2S,3R)-苯基缩水甘油酸甲酯，8.2min；(2R,3S)-苯基缩水甘油酸甲酯，9.1min。以液相色谱仪检测反应的转化率和剩余底物的光学纯度，其结果如表1所示。
表1重组酯酶的催化性能比较
Figure BDA00002135354500133
由于肠杆菌（Enterobacter sp.）ECU 1107中含有数量很多的酯酶，能对底物(±)-苯基缩水甘油酸甲酯有作用的酯酶只占其中的一部分，而这些酯酶的底物特异性又不同，因此反应程度以及反应的选择性表现各不相同。
表1结果显示，上述方法获得的重组酯酶中，按照GeneID 9126831基因序列设计引物所表达的重组酯酶，即实施例5所表达的重组酯酶EnEst01，对苯基缩水甘油酸甲酯具有很高的对映选择性催化活性。
实施例7～11不同有机溶剂对两相体系中EnEst01重组酯酶催化的酶促拆分反应的影响
按照实施例1所述方法得到肠杆菌CGMCC 5981的湿菌体，用浓度0.85%(w/v)的生理盐水洗涤3次，以0.25g/ml的湿菌体量加入到pH为6.0的磷酸盐缓冲液中，加入同等体积的含10mmol/L苯基缩水甘油酸甲酯的有机溶剂，在30℃，180rpm下反应8小时。所述有机溶剂分别为异丙醚、甲苯、环己烷、正己烷和异辛烷。收集有机相，经无水硫酸镁干燥处理后，通过实施例6所述的液相色谱仪检测方法，检测反应的转化率和剩余底物的光学纯度，其结果如表2所示。
表2不同有机溶剂对两相体系中酶促拆分反应的影响
  有机溶剂   转化率(%)   ees(%)
  实施例7   异丙醚   27.8   13.6
  实施例8   甲苯   3.1   n.d.*
  实施例9   环己烷   44.5   53.2
  实施例10   正己烷   47.3   62.4
  实施例11   异辛烷   44.7   75.6
*n.d.：没有检测到
表2结果显示，使用甲苯为两相体系中的有机相时，反应几乎不能进行。异辛烷是较好的有机溶剂选择。
实施例12～16不同相比例对两相体系中EnEst01重组酯酶催化的酶促拆分反应的影响
按照实施例1所述方法得到肠杆菌CGMCC 5981的湿菌体，用浓度0.85%(w/v)的生理盐水洗涤3次，取500mg湿菌体悬浮于一定体积的pH为6.0的磷酸盐缓冲液中，加入一定体积的含0.02mmol苯基缩水甘油酸甲酯的异辛烷，反应体系总体积为4ml，在30℃，180rpm下反应8小时。收集有机相，经无水硫酸镁干燥处理后，通过实施例6所述的液相色谱仪检测方法，检测反应的转化率和剩余底物的光学纯度，其结果如表3所示。
表3不同相比例对两相体系中酶促拆分反应的影响
  水相：有机相(v/v)   转化率(%)   ees(%)
  实施例12   1:9   29.2   21.7
  实施例13   1:4   53.6   >99
  实施例14   1:2   54.2   >99
  实施例15   1:1   53.5   >99
  实施例16   2:1   57.6   >99
表3结果显示，当水相和有机相比例在1:4～2:1之间时，都有较好的反应效果，在水相和有机相比例为1:9时，反应速率显著减慢，而当水相和有机相比例超过2:1时，湿菌体的量会严重影响有机相的分离，继续增加水相比例不适宜反应的进行。
实施例17～20不同底物浓度对EnEst01重组酯酶催化的酶促拆分反应的影响
按照实施例1所述方法得到的肠杆菌CGMCC 5981湿菌体用浓度0.85%(w/v)的生理盐水洗涤3次，以0.25g/ml的湿菌体量加入到pH为6.0的磷酸盐缓冲液中，加入同等体积的底物苯基缩水甘油酸甲酯浓度分别为10、50、100、250mmol/L的异辛烷中，在30℃，180rpm下反应一定的时间。收集有机相，经无水硫酸镁干燥处理后，通过实施例6所述的液相色谱仪检测方法，检测反应的转化率和剩余底物的光学纯度，其结果如表4所示。
表4不同的底物浓度对酶促拆分反应的影响
  底物浓度(mmol/L)  反应时间(h)   ees(%)   转化率(%)
  实施例17   10  10   >99   55.6
  实施例18   50   16   >99   56.2
  实施例19   100   16   >99   56
  实施例20   250   20   83.2   55.9
表4结果显示，在10～100mmol/L范围内的底物浓度下，肠杆菌CGMCC5981整细胞能够达到良好的反应速率和产物光学纯度。当底物浓度达到250mmol/L时，肠杆菌整细胞由于受到不断生成的酸性产物的影响，菌体活力有所下降，反应速率有所减慢，该问题可以通过滴加碱液，控制pH恒定在6.0来解决。
实施例21～23温度对EnEst01重组酯酶催化的酶促拆分反应的影响
按照实施例1所述方法得到的肠杆菌CGMCC 5981湿菌体用浓度0.85%(w/v)的生理盐水洗涤3次，以0.25g/ml的湿菌体量加入到pH为6.0的磷酸盐缓冲液中，加入同等体积的底物苯基缩水甘油酸甲酯浓度为250mmol/L的异辛烷中，分别在30、40、50℃水浴，180rpm下反应一段时间，反应过程中滴加2.0N的Na2CO3，保持反应pH恒定在6.0。收集有机相，经无水硫酸镁干燥处理后，通过实施例6所述的液相色谱仪检测方法，检测反应的转化率和剩余底物的光学纯度，其结果如表5所示。
表5不同温度对肠杆菌CGMCC 5981反应特性的影响
  反应温度(℃)  反应时间(h)   ees(%)   转化率(%)
  实施例21   30  8   99.5   50.1
  实施例22   40  3   99.1   53.5
  实施例23   50  2   99.6   52.9
表5结果显示，在温度较低的30℃时反应速率较慢，在40～50℃下可以达到较好的反应效果，但是在50℃时该酯酶的半衰期仅为2.9小时，较高的温度下细胞活性下降迅速，不利于更高浓度的反应和整细胞的重复利用。
实施例24重组酯酶EnEst01催化的酶促拆分反应
按照实施例5所述方法得到的粗酶液以2kU/L的量加入到pH为6.0的磷酸盐缓冲液中，加入同等体积的底物苯基缩水甘油酸甲酯浓度为100mmol/L的异辛烷中，30℃水浴，180rpm，滴加1.0N的Na2CO3溶液控制pH在6.0±0.1范围下反应2h。收集有机相，经无水硫酸镁干燥处理后，通过实施例6所述的液相色谱仪检测方法，检测到反应的转化率为51.3%，剩余底物的光学纯度ees>99%。
实施例25利用肠杆菌CGMCC 5981整细胞制备光学纯(2S,3R)-苯基缩水甘油酸甲酯
在带有机械搅拌的三口烧瓶中，加入125g按照实施例2所述方法得到的湿菌体和250ml pH 6.0的磷酸盐缓冲液，搅拌均匀。然后加入相同体积含有75mmol底物(±)-苯基缩水甘油酸甲酯的异辛烷，水浴恒温，将水浴温度调至40℃，开动机械搅拌(200rpm)，同时插入pH电极，用自动电位滴定仪滴加1.0N的Na2CO3溶液，控制pH在6.0±0.1范围。反应2小时后补加75mmol底物(±)-苯基缩水甘油酸甲酯，使得底物(±)-苯基缩水甘油酸甲酯在异辛烷内的终浓度达到600mM。一共反应5.5小时后停止反应，离心取得有机相，水相用乙酸乙酯萃取，合并有机相，用饱和食盐水洗涤，再加无水硫酸钠干燥后，旋转蒸发去除有机溶剂，再经过硅胶柱层析分离纯化得到淡黄色液体11.6g，收率为43.5%。产物(2S,3R)-苯基缩水甘油酸甲酯的光学纯度>99%ee，比旋光度
Figure BDA00002135354500171
应理解，在阅读了本发明的上述内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。
Figure IDA00002135355500021
Figure IDA00002135355500031

Claims (10)

1.一种肠杆菌（Enterobacter sp.）ECU 1107，其保藏编号为CGMCC No.5981。
2.一种分离的蛋白质，其特征在于：其是如下(a)或(b)的蛋白质：
(a)其氨基酸序列如序列表中SEQ ID No:2所示的蛋白质；
(b)在(a)中的氨基酸序列中经过取代、缺失或添加一个或几个氨基酸残基且具有酯酶活性的由(a)衍生的蛋白质。
3.一种分离的核酸，其特征在于，其是如下(1)或(2)的核酸：
(1)其核苷酸序列如序列表中SEQ ID No:1所示的核酸；
(2)编码如下蛋白质(a)或(b)的基因：
(a)其氨基酸序列如序列表中SEQ ID No:2所示的蛋白质；
(b)在(a)中的氨基酸序列经过取代、缺失或添加一个或几个氨基酸且具有酯酶活性的由(a)衍生的蛋白质。
4.一种包含如权利要求3所述的核酸的重组表达载体。
5.一种包含如权利要求4所述的重组表达载体的重组表达转化体。
6.一种重组酯酶的制备方法，其特征在于，该制备方法包括：培养如权利要求5所述的重组表达转化体，从培养物中获得重组表达的酯酶。
7.一种酯酶的制备方法，其特征在于，其方法包括以下步骤：
(1)培养权利如要求1所述的肠杆菌，将其培养混合物离心后获得肠杆菌整细胞；或
(2)将步骤(1)所得肠杆菌整细胞破碎后制备成酯酶粗酶液；或
(3)将步骤(2)所得酯酶粗酶液冷冻干燥后制备成酯酶粗酶粉。
8.如权利要求1所述的肠杆菌，或如权利要求2所述的蛋白质，或如权利要求5所述的重组表达转化体在制备(2S,3R)-苯基缩水甘油酸甲酯中的用途。
9.一种(2S，3R)-苯基缩水甘油酸甲酯的制备方法，其特征在于，所述的制备方法包括：在不溶于水的有机溶剂和水相缓冲液构成的两相体系中，在权利要求1所述的肠杆菌，或权利要求2所述的蛋白质，或如权利要求5所述的重组表达转化体的催化下，消旋底物(±)-苯基缩水甘油酸甲酯进行水解拆分反应，形成(2S,3R)-苯基缩水甘油酸甲酯。
10.如权利要求9所述的制备方法，其特征在于，所述不溶于水的有机溶剂和水相缓冲液构成的两相体系中，不溶于水的有机溶剂为甲苯、异丙醚、正己烷、环己烷或异辛烷，不溶于水的有机溶剂-水两相的体积比为1︰9～2︰1，所述水解拆分反应在20～50℃进行2～48小时，反应体系pH 5～8。
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