CN103695480A - 利用含离子液体反应体系制备手性醇的方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种在含离子液体体系中制备(R)-[3,5-双(三氟甲基)苯基]乙醇的方法，所述方法为：以棘孢木霉ZJPH0810培养获得的湿菌丝体作为催化剂，以3,5-双三氟甲基苯乙酮作为底物，在式（Ⅰ）所示氨基酸类离子液体与pH值为5.5～8.0的磷酸缓冲液构成的反应体系中，于25～45℃、100～300r/min条件下反应6～50小时，反应液经分离纯化得到(R)-[3,5-双(三氟甲基)苯基]乙醇产物；本发明提出的氨基酸类离子液体具有促进辅酶再生的功能，毒性较低且绿色环保、可再生、可生物降解，将含该类离子液体反应体系用于生物催化反应，工艺环境友好、符合绿色发展策略，可克服传统离子液体生物可降解性差且不可再生等缺点。

Description

利用含离子液体反应体系制备手性醇的方法

（一）技术领域

本发明涉及一种(R)-3,5-双三氟甲基苯乙醇的生物催化制备方法，特别涉及一种利用含氨基酸类离子液体的反应体系提高微生物细胞催化制备阿瑞吡坦药物关键手性中间体(R)-3,5-双三氟甲基苯乙醇反应效率的方法。

（二）背景技术

(R)-3,5-双三氟甲基苯乙醇是合成用于治疗化疗引起的恶心和呕吐的NK-1受体拮抗剂-阿瑞吡坦药物的关键手性中间体。与化学法相比，采用微生物细胞催化潜手性3,5-双三氟甲基苯乙酮不对称还原制备(R)-3,5-双三氟甲基苯乙醇具有反应条件温和、选择性高等诸多优点。本发明在发明人原有发明“棘孢木霉及在合成(R)-3,5-双三氟甲基苯乙醇中的应用”(CN101724568A)的基础上，研究开发了利用含氨基酸离子液体共溶剂体系中生物催化制备阿瑞吡坦中间体的新方法，以解决原发明专利(CN101724568A)中存在的底物浓度(80mM)和产率(53.4%)偏低等问题，通过构建合适的生物催化反应体系，以实现底物增溶，提高反应效率。

离子液体作为绿色溶剂常用于生物催化、有机合成、化学分离等反应过程中。与有机溶剂相比，离子液体具有不易挥发，物理化学稳定性好和结构可设计性等优点。然而，传统的咪唑类和嘧啶类离子液体存在诸如环境不友好、生物可降解性差且不可再生等缺点(Chem Soc Rev,2011,40:1383)。氨基酸类离子液体作为一种新型绿色溶剂引起了人们的广泛关注。氨基酸是一种可再生资源，具有低毒、可再生、绿色环保等优点，季铵盐化学结构与表面活性剂结构类似，不仅可改善细胞膜的通透性，而且还能降低底物对细胞的毒害作用。采用本发明提出的氨基酸类离子液体用于生物催化反应，有利于底物增溶，可使生物还原反应在保持较高产率和较短反应时间的前提下进一步提高反应的底物浓度。同时，采用的新型离子液体更符合绿色化学发展方向。

生物催化3,5-双三氟甲基苯乙酮制备(R)-3,5-双三氟甲基苯乙醇的反应式如下所示：

（三）发明内容

本发明目的在于构建一种含新型离子液体反应体系，并将其应用于生物不对称还原3,5-双三氟甲基苯乙酮制备(R)-[3,5-双(三氟甲基)苯基]乙醇的反应过程，以解决现行方法中存在的底物难溶性和产率偏低等问题。

本发明采用的技术方案是：

本发明提供一种利用含离子液体的反应体系进行生物催化制备(R)-[3,5-双(三氟甲基)苯基]乙醇的方法，所述方法为：以棘孢木霉ZJPH0810发酵培养获得的湿菌丝体（制备方法参见CN101724568A，具体参见实施例1）作为催化剂，以3,5-双三氟甲基苯乙酮作为底物，在式（Ⅰ）所示氨基酸类离子液体与pH值为5.5～8.0的缓冲液构成的反应体系中，于25～45℃、100～300r/min条件下反应6～50小时，反应液用等体积的正己烷萃取，取萃取液分离纯化得到(R)-[3,5-双(三氟甲基)苯基]乙醇产物；所述反应体系中湿菌丝体的加入量以菌丝体干重计为10～50g/L，优选为20～40g/L，更优选30g/L，所述反应体系中底物初始浓度为20～200mM，优选为50～150mM，更优选70～100mM，所述反应体系中氨基酸类离子液体的质量浓度为0.1～30%，优选为1～20%，更优选1～5%；

[N_R1,R2,R3,R4]⁺L^–

（Ⅰ）

式（Ⅰ）中阳离子为取代季铵盐，阴离子为天然氨基酸，其中取代季铵盐的取代基R1、R2、R3和R4各自独立为C1～C4的烷基，优选直链烷基。

进一步，优选所述天然氨基酸为下列之一：丙氨酸(Ala)、丝氨酸(Ser)、苏氨酸(Thr)、色氨酸(Trp)、缬氨酸(Val)、亮氨酸(Leu)、异亮氨酸(Ile)、甲硫氨酸(Met)、苯丙氨酸(Phe)、脯氨酸(Pro)、天冬氨酸(Asp)、酪氨酸(Tyr)、天冬酰胺(Asn)、赖氨酸(Lys)、半胱氨酸(Cys)、谷氨酸(Glu)、谷氨酰胺(Gln)、精氨酸(Arg)、组氨酸(His)或甘氨酸(Gly)，更优选所述天然氨基酸为下列之一：Met、Glu、Cys、Gly、Tyr或Arg。

进一步，优选所述氨基酸类离子液体为下列之一：[N_1,1,1,1]⁺[Glu]^–（四甲基铵谷氨酸）、[N_3,3,3,3]⁺[Glu]^–（四丙基铵谷氨酸）、[N_1,1,2,2]⁺[Tyr]^–（二甲基二乙基铵酪氨酸）、[N_1,1,1,1]⁺[Met]^–（四甲基铵甲硫氨酸）、[N_1,2,1,1]⁺[Arg]^–（三甲基乙基铵精氨酸）或[N_4,4,4,4]⁺[Glu]^–（四丁基铵谷氨酸），其中取代季铵盐中1为甲基，2为乙基，3为丙基，4为丁基，更优选具有辅酶再生能力的[N_1,2,1,1]⁺[Arg]^–或[N_4,4,4,4]⁺[Glu]^–。

进一步，优选所述反应是在30℃、200r/min条件下反应24小时。

进一步，所述反应体系中还添加有辅助底物，以促进辅酶再生，所述辅助底物可为下列一种或两种及以上任意比例的混合：①甲醇、②乙醇、③异丙醇、④甘油、⑤葡萄糖、⑥果糖、⑦鼠李糖或⑧麦芽糖，所述含氨基酸类离子液体的反应体系中辅助底物的质量浓度为0.1～20%，更优选下列之一：①反应体系中终浓度3～10%(v/v)无水乙醇；②反应体系中终浓度3～10%(v/v)无水乙醇和反应体系中终浓度3～10%(w/w)葡萄糖两者的混合；③反应体系中终浓度3～10%(v/v)无水乙醇、反应体系中终浓度3～10%(v/v)异丙醇和反应体系中终浓度3～10%(w/w)葡萄糖三者的混合，最优选下列之一：①反应体系中终浓度6%(v/v)无水乙醇；②反应体系中终浓度6%(v/v)无水乙醇和反应体系中终浓度6%(w/w)葡萄糖两者的混合；③反应体系中终浓度6%(v/v)无水乙醇、反应体系中终浓度6%(v/v)异丙醇和反应体系中终浓度6%(w/w)葡萄糖三者的混合。

更进一步，优选所述反应体系中湿菌丝体的加入量以菌丝体干重计为20～40g/L，所述反应体系中底物初始浓度为70～100mM，所述反应体系中氨基酸类离子液体质量浓度为1～5%，所述反应体系中辅助底物为体积终浓度6%无水乙醇、体积终浓度6%无水乙醇和质量终浓度6%葡萄糖两者的混合或是体积终浓度6%无水乙醇、体积终浓度6%异丙醇和质量终浓度6%葡萄糖三者的混合。

进一步，所述缓冲液为pH值为7.0的磷酸缓冲液（优选磷酸二氢钾-磷酸氢二钾缓冲液）。

更进一步，本发明所述的利用含离子液体的反应体系制备(R)-3,5-双三氟甲基苯乙醇的方法推荐按如下步骤进行：以棘孢木霉ZJPH0810发酵培养获得的湿菌丝体（制备参见CN101724568A，具体参见实施例1）作为催化剂，以3,5-双三氟甲基苯乙酮作为底物，添加辅助底物，在式（Ⅰ）所示氨基酸类离子液体与pH值7.0的磷酸缓冲液构成的反应体系中，于30℃、150～200r/min条件下反应24～48小时，获得含有目标产物的反应液，将反应液用等体积的正己烷萃取，取萃取液经分离纯化得到(R)-[3,5-双(三氟甲基)苯基]乙醇产物；所述辅助底物为下列之一：①反应体系中终浓度6%(v/v)无水乙醇；②反应体系中，终浓度6%(v/v)无水乙醇和终浓度6%(w/w)葡萄糖两者的混合；③反应体系中，终浓度6%(v/v)无水乙醇、终浓度6%(v/v)异丙醇和终浓度6%(w/w)葡萄糖三者的混合；所述反应体系中湿菌丝体的加入量以菌丝体干重计为30g/L，所述反应体系中底物初始浓度为70～100mM，所述反应体系中氨基酸离子液体质量浓度为1～5%。

生物转化反应结束后，反应液用等体积的正己烷萃取，取正己烷萃取相，经旋转蒸发器蒸馏浓缩5倍体积，然后加入柱体积1～5%的硅胶混匀后，转移至含有硅胶的层析柱中，再添加柱体积1～5%的硅胶，然后以石油醚︰乙酸乙酯=8︰1（v/v）为洗脱剂进行硅胶柱层析分离，收集含有目标产物的洗脱液，将含有目标产物的洗脱液经旋转蒸发器蒸干，即得(R)-[3,5-双(三氟甲基)苯基]乙醇纯品。(R)-[3,5-双(三氟甲基)苯基]乙醇¹HNMR(600MHz,CDCl₃):7.85(s,2H),7.79(s,1H),5.06-5.03(q,1H,J=6.48Hz),1.55(d,3H,J=6.48Hz)。

萃取液中产物和未反应底物的浓度采用气相色谱法分析，用内标法定量，内标物为十二烷。取1ml萃取液加入2μl十二烷进行分析。气相色谱操作条件为：进样器温度250℃，检测器温度250℃，柱温80℃保留2min，以4℃/min升温至180℃，维持10min，载气为氮气，流量为1.5ml/min，分流比为1:20，进样量为1μl。根据气相色谱检测谱图，用相对校正因子法计算出反应液中产物的浓度和ee值。

产率计算方法为：

内标法：以十二烷为内标物，测得产物浓度标准曲线。测定时在样品中加入一定量的十二烷为内标物，根据内标物浓度计算得出产物浓度。

标准曲线制备方法：准确称取一系列不同浓度的底物或产物标准品，溶于正己烷，配制成一系列混合溶液，分别用气相色谱检测。将所得色谱图积分得到峰面积，以底物或产物与正十二烷的峰面积比(S_底物/S_十二烷或S_产物/S_十二烷)为横坐标，浓度比(C_底物/C_十二烷或C_产物/C_十二烷)为纵坐标，作出标准曲线，从而得到3，5-双三氟甲基苯乙酮与内标物的相对校正因子为1.31，3,5-双三氟甲基苯乙醇与内标物的相对校正因子为1.69。

产率计算公式如下：

$Y=(\%)=\frac{C_P}{C_0}\×100\%$     公式（1）

公式（1）中C_p为(R)-3,5-双三氟甲基苯乙醇浓度，C₀为3,5-双三氟甲基苯乙酮初始浓度。

产物的光学纯度由对映体过量值(enantiomeric excess,ee)来表征。计算公式为：

$\mathrm{ee}=\frac{C_R-C_S}{C_R+C_S}\×100\%$     公式（2）

公式（2）中C_R和C_S分别为R型和S型3,5-双三氟甲基苯乙醇的摩尔浓度。

本发明所述氨基酸类离子液体（[N_R1,R2,R3,R4]⁺L^–）具有促进棘孢木霉ZJPH0810源羰基还原酶的辅酶再生能力。所述的棘孢木霉ZJPH0810源羰基还原酶的辅酶依赖型为辅酶Ⅰ，即NADH，因此棘孢木霉ZJPH0810源羰基还原酶的辅酶再生是指NADH的再生能力。棘孢木霉ZJPH0810源羰基还原酶的辅酶再生能力可以通过棘孢木霉ZJPH0810源羰基还原酶的比活力测定。

棘孢木霉ZJPH0810源羰基还原酶的辅酶再生能力测定条件为：总反应体积为2.5mL，0.3mM的氧化型辅酶ⅠNAD⁺，1wt%氨基酸类离子液体，pH7.0的磷酸缓冲液，于30℃水浴保温5min后加入1ml酶液（即棘孢木霉ZJPH0810湿菌丝体经细胞破碎离心后的上清液），30℃条件下，检测上述体系在340nm处5min内NAD(P)H吸光度变化值，从而计算得到棘孢木霉ZJPH0810源羰基还原酶的比活力。蛋白含量采用考马斯亮蓝法测定。

所述酶液的获得方法：称取适量新鲜培养的棘孢木霉ZJPH0810湿菌丝体（制备参见CN101724568A，具体参见实施例1），细胞经液氮研磨，蜗牛酶酶解后，离心去除细胞碎片后的上清液即为酶液。

酶活力单位定义：在上述条件下，每分钟催化还原1umol NAD⁺的酶活力为1个酶活力单位。

酶活力计算公式：酶活(U)=EW×V×1000/(6220×1)

酶比活力计算公式：酶比活(U/mg)=酶活(U)/蛋白量(mg)

EW：每min内340nm处吸光度的变化；V：反应液的体积(mL)；6220：摩尔消光系数(Lmol^-1cm^-1)；l：光程距离(cm)。

本发明所述氨基酸类离子液体的制备方法（以四甲基铵谷氨酸为例）：

（1）树脂预处理

将201×7型阴离子交换树脂置于烧杯中，用饱和食盐水密封浸泡24小时后，用蒸馏水漂洗干净，然后用4倍量树脂体积的5wt％氢氧化钠水溶液浸泡4小时，使之全部转变成OH型，用蒸馏水冲洗树脂至中性。

然后用4倍量树脂体积的5wt％盐酸水溶液浸泡树脂4小时，使其全部转变成Cl型，倾去酸液，用蒸馏水冲洗树脂至中性。

必要时可重复上述操作l～2次(目的是充分除去树脂所含的杂质离子)，最后用6倍量树脂体积的5wt％氢氧化钠水溶液浸泡树脂4小时，使其全部转变成OH型。

（2）四甲基氢氧化铵的制备

将1Kg步骤(1)中预处理过的树脂装入层析柱中，缓慢加入300ml卤盐离子液体[四甲基铵]^＋X^－（X为Cl^-、Br^-等离子），使其通过树脂并交换生成四甲基氢氧化铵。

（3）四甲基铵谷氨酸制备

将10ml0.1M的谷氨酸水溶液慢慢滴加至10ml0.1M的四甲基氢氧化铵水溶液中，滴加完毕，室温搅拌24h，再于60℃旋蒸浓缩至原体积的约1/3～1/4，以除去溶液中的大部分水，然后升温至70℃，继续旋转蒸发48小时，制得离子液体四甲基铵谷氨酸，所述离子液体四甲基铵谷氨酸中谷氨酸与四甲基铵的摩尔比为1:1。其它氨基酸类离子液体均可参照此法制备获得，仅需更换为相应的氨基酸和季铵盐即可。

本发明与现有技术相比，具有如下优点：

本发明采用棘孢木霉细胞催化制备(R)-3,5-双三氟甲基苯乙醇时，在反应体系中加入氨基酸类离子液体，通过其对底物的增溶作用，可使反应的底物浓度由80mM（水相转化，参见CN101724568A，具体参见实施例5）提高到100mM（含离子液体反应体系，具体参见本发明实施例20），产率也相应地从53.4%（水相转化，参见CN101724568A，具体参见实施例5）提高到89.4%（含离子液体反应体系，具体参见本发明实施例20），有效提高了反应效率；氨基酸类离子液体具有促进辅酶再生的功能，毒性较低且绿色环保、可再生、可生物降解，以该类离子液体构建反应体系用于生物催化反应，工艺环境友好、符合绿色发展策略，可克服传统离子液体的生物可降解性差且不可再生等缺点。

(四)附图说明

图1为3,5-双三氟甲基苯乙酮底物和[3,5-双(三氟甲基)苯基]乙醇产物的标准品气相检测图谱。

图2为棘孢木霉生物还原反应萃取液气相色谱图。

(五)具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于此：

本发明所述湿菌丝体的制备参见CN101724568A，具体参见实施例1。

实施例1四甲基铵谷氨酸离子液体的合成

（1）树脂预处理

将1.2Kg201×7型阴离子交换树脂置于烧杯中，加入1L饱和食盐水密封浸泡24小时后，用蒸馏水漂洗干净，然后用4倍量树脂体积的5wt%氢氧化钠水溶液浸泡4小时，使之全部转变成OH型，用蒸馏水冲洗树脂至中性。

然后用4倍量树脂体积的5wt%盐酸水溶液浸泡树脂4小时，使其全部转变成Cl型，倾去酸液，用蒸馏水冲洗树脂至中性。

重复上述操作l～2次(目的是充分除去树脂所含的杂质离子)，最后用6倍量树脂体积的5wt%氢氧化钠水溶液浸泡树脂4小时，使其全部转变成OH型。

（2）四甲基氢氧化铵的制备

将1.0Kg步骤(1)中预处理过的树脂装入层析柱中，缓慢加入300ml卤盐离子液体[四甲基铵]^＋X^－（X为Cl^-、Br^-等离子），使其通过树脂并交换生成四甲基氢氧化铵。

（3）四甲基铵谷氨酸离子液体（[N_1,1,1,1]⁺[Glu]^–）制备

将10ml0.1M的谷氨酸水溶液慢慢滴加至10ml0.1M的的四甲基氢氧化铵水溶液中，滴加完毕，室温搅拌24h，再于60℃旋蒸浓缩至原体积的约1/3～1/4，以除去溶液中的大部分水，然后升温至70℃，继续旋转蒸发48小时，制得离子液体四甲基铵谷氨酸，所述离子液体四甲基铵谷氨酸中谷氨酸与四甲基铵物质的量之比为1:1。制备得到的四甲基铵谷氨酸离子液体：¹H NMR(400MHz,D₂O)δ=3.05(s,12H),2.07(q,4H),1.75(m,1H),1.64(m,2H)。

实施例2-6：

将实施例1中四甲基铵分别用四丙基铵、二甲基二乙基铵、三甲基乙基铵和四丁基铵替换，将实施例1中谷氨酸分别用酪氨酸、甲硫氨酸、精氨酸替换，分别制备得到实施例2-6所述离子液体。

实施例2：四丙基铵谷氨酸离子液体（[N_3,3,3,3]⁺[Glu]^–）、实施例3：二甲基二乙基铵酪氨酸离子液体（[N_1,1,2,2]⁺[Tyr]^–）、实施例4：四甲基铵甲硫氨酸离子液体（[N_1,1,1,1]⁺[Met]^–）、实施例5：三甲基乙基铵精氨酸离子液体（[N_1,2,1,1]⁺[Arg]^–）、实施例6：四丁基铵谷氨酸离子液体（[N_4,4,4,4]⁺[Glu]^–）。

实施例2制备得到的四丙基铵谷氨酸离子液体：¹H NMR(400MHz,D₂O)δ=3.50(q,1H),2.36(q,8H),2.08(q,4H),1.65(m,2H),1.33(q,8H),0.96(t,12H)；

实施例3制备得到的二甲基二乙基铵酪氨酸离子液体：¹H NMR(400MHz,D₂O)δ=6.78(s,4H),3.65(q,1H),2.40(m,10H),0.99(q,12H)；

实施例4制备得到的四甲基铵甲硫氨酸离子液体：¹H NMR(400MHz,D₂O)δ=3.65(q,1H),3.04(s,12H),2.34(q,4H),2.09(s,3H)；

实施例5制备得到的三甲基乙基铵精氨酸离子液体：¹H NMR(400MHz,D₂O)δ=5.54(d,2H),3.59(q,1H),3.32(q,9H),3.21(d,2H),2.47(m,6H),1.33(s,3H)；

实施例6制备得到的四丁基铵谷氨酸离子液体：¹H NMR(400MHz,D₂O)δ=3.48(q,1H)，2.36(q,8H),2.05(q,4H),1.75(m,1H),1.64(m,2H),1.33(q,16H),0.96(t,12H)。

实施例7

将发酵所得湿菌丝体悬浮于20ml Na₂HPO₄-NaH₂PO₄（pH5.5）缓冲液中，湿菌丝体以干重计浓度为30g/L反应体系（反应体系总体积20ml），再加入终浓度5wt%的四丙基铵谷氨酸离子液体(实施例2方法制备，[N_3,3,3,3]⁺[Glu]^–)，终浓度70mM的3,5-双三氟甲基苯乙酮作为底物，1.2ml无水乙醇(终浓度6%，v/v)为辅助底物，置于30℃、200r/min摇床中进行生物还原反应24h。反应结束后，反应液用等体积的正己烷萃取，取正己烷层进行气相色谱分析，所得产物(R)-[3,5-双(三氟甲基)苯基]乙醇的浓度为34.5mM，ee值大于98%，产率为49.3%。

生物转化反应结束后，反应液用等体积的正己烷萃取，萃取液中的产物和未反应底物的浓度采用气相色谱分析，用内标法定量。内标物为十二烷。取1ml萃取液加入2μl十二烷进行分析。气相色谱的操作条件为：进样器温度250℃，检测器温度250℃，柱温80℃保留2min，以4℃/min升温至180℃，维持10min，载气为氮气，流量为1.5ml/min，分流比为1:20，进样量为1μl。根据气相色谱检测谱图，用相对校正因子法计算出反应液中产物的浓度和ee值。

实施例8：

将发酵所得湿菌丝体悬浮于20ml Na₂HPO₄-NaH₂PO₄（pH5.5）缓冲液中，湿菌丝体以干重计浓度为30g/L反应体系（反应体系总体积20ml），加入终浓度5wt%的四甲基铵谷氨酸离子液体(实施例1方法制备，[N_1,1,1,1]⁺[Glu]^–)，终浓度70mM的3,5-双三氟甲基苯乙酮作为底物，1.2ml无水乙醇(终浓度6%，v/v)为辅助底物，置于30℃，200r/min摇床中进行生物还原反应24h。反应结束后，反应液用等体积的正己烷萃取，取正己烷层进行气相色谱分析，分析条件同实施例7，所得产物(R)-[3,5-双(三氟甲基)苯基]乙醇的浓度为34.6mM，ee值大于98%，产率为49.4%。

实施例9：

将发酵所得湿菌丝体悬浮于20ml Na₂HPO₄-NaH₂PO₄（pH5.5）缓冲液中，湿菌丝体以干重计浓度为30g/L反应体系（反应体系总体积20ml），加入终浓度5wt%的四甲基铵甲硫氨酸离子液体(实施例4方法制备，[N_1,1,1,1]⁺[Met]^–)，终浓度70mM的3,5-双三氟甲基苯乙酮作为底物，1.2ml无水乙醇(终浓度6%，v/v)为辅助底物，置于30℃，200r/min摇床中进行生物还原反应24h。反应结束后，反应液用等体积的正己烷萃取，取正己烷层进行气相色谱分析，分析条件同实施例7，所得产物(R)-[3,5-双(三氟甲基)苯基]乙醇的浓度为42.7mM，ee值大于98%，产率为61.0%。

实施例10：

将发酵所得湿菌丝体悬浮于20ml Na₂HPO₄-NaH₂PO₄（pH5.5）缓冲液中，湿菌丝体以干重计浓度为30g/L反应体系（反应体系总体积20ml），加入终浓度5wt%的二甲基二乙基铵酪氨酸离子液体(实施例3方法制备，[N_1,1,2,2]⁺[Tyr]^–)，终浓度70mM的3,5-双三氟甲基苯乙酮作为底物，1.2ml无水乙醇(终浓度6%，v/v)为辅助底物，置于30℃，200r/min摇床中进行生物还原反应24h。反应结束后，反应液用等体积的正己烷萃取，取正己烷层进行气相色谱分析，分析条件同实施例7，所得产物(R)-[3,5-双(三氟甲基)苯基]乙醇的浓度为47.9mM，ee值大于98%，产率为68.4%。

实施例11：

将发酵所得湿菌丝体悬浮于20ml Na₂HPO₄-NaH₂PO₄（pH5.5）缓冲液中，湿菌丝体以干重计浓度为30g/L反应体系（反应体系总体积20ml），加入终浓度5wt%的四丁基铵谷氨酸离子液体(实施例6方法制备，[N_4,4,4,4]⁺[Glu]^–)，终浓度70mM的3,5-双三氟甲基苯乙酮作为底物，1.2ml无水乙醇(终浓度6%，v/v)为辅助底物，置于30℃，200r/min摇床中进行生物还原反应24h。反应结束后，反应液用等体积的正己烷萃取，取正己烷层进行气相色谱分析，分析条件同实施例7，所得产物(R)-[3,5-双(三氟甲基)苯基]乙醇的浓度为53.7mM，ee值大于98%，产率为76.7%。

实施例12：

将发酵所得湿菌丝体悬浮于20ml Na₂HPO₄-KH₂PO₄（pH6.0）缓冲液中，湿菌丝体以干重计浓度为30g/L反应体系（反应体系总体积20ml），加入终浓度5wt%的四丁基铵谷氨酸离子液体(实施例6方法制备，[N_4,4,4,4]⁺[Glu]^–)，终浓度70mM的3,5-双三氟甲基苯乙酮作为底物，1.2ml无水乙醇(终浓度6%，v/v)为辅助底物，置于30℃，200r/min摇床中进行生物还原反应24h。反应结束后，反应液用等体积的正己烷萃取，取正己烷层进行气相色谱分析，分析条件同实施例7，所得产物(R)-[3,5-双(三氟甲基)苯基]乙醇的浓度为58.1mM，ee值大于98%，产率为83.0%。

实施例13：

将发酵所得湿菌丝体悬浮于20ml K₂HPO₄-KH₂PO₄（pH7.0）缓冲液中，湿菌丝体以干重计浓度为30g/L反应体系（反应体系总体积20ml），加入终浓度5wt%的四丁基铵谷氨酸离子液体(实施例6方法制备，[N_4,4,4,4]⁺[Glu]^–)，终浓度70mM的3,5-双三氟甲基苯乙酮作为底物，1.2ml无水乙醇(终浓度6%，v/v)为辅助底物，置于30℃，200r/min摇床中进行生物还原反应24h。反应结束后，反应液用等体积的正己烷萃取，取正己烷层进行气相色谱分析，分析条件同实施例7，所得产物(R)-[3,5-双(三氟甲基)苯基]乙醇的浓度为60.1mM,ee值大于98%，产率为85.9%。

实施例14：

将发酵所得湿菌丝体悬浮于20ml K₂HPO₄-KH₂PO₄（pH8.0）缓冲液中，湿菌丝体以干重计浓度为30g/L反应体系（反应体系总体积20ml），加入终浓度5wt%的四丁基铵谷氨酸离子液体(实施例6方法制备，[N_4,4,4,4]⁺[Glu]^–)，终浓度70mM的3,5-双三氟甲基苯乙酮作为底物，1.2ml无水乙醇(终浓度6%，v/v)为辅助底物，置于30℃，200r/min摇床中进行生物还原反应24h。反应结束后，反应液用等体积的正己烷萃取，取正己烷层进行气相色谱分析，分析条件同实施例7，所得产物(R)-[3,5-双(三氟甲基)苯基]乙醇的浓度为51.2mM,ee值大于98%，产率为73.1%。

实施例15：

将发酵所得湿菌丝体悬浮于20ml K₂HPO₄-KH₂PO₄（pH7.0）缓冲液中，湿菌丝体以干重计浓度为30g/L反应体系（反应体系总体积20ml），加入终浓度5wt%的四丁基铵谷氨酸离子液体(实施例6方法制备，[N_4,4,4,4]⁺[Glu]^–)，终浓度70mM的3,5-双三氟甲基苯乙酮作为底物，1.2ml无水乙醇(终浓度6%，v/v)和1.2g葡萄糖(终浓度6%，w/w)为辅助底物，置于30℃，200r/min摇床中进行生物还原反应24h。反应结束后，反应液用等体积的正己烷萃取，取正己烷层进行气相色谱分析，分析条件同实施例7，所得产物(R)-[3,5-双(三氟甲基)苯基]乙醇的浓度为63.1mM，ee值大于98%，产率为90.1%。

实施例16：

将发酵所得湿菌丝体悬浮于20ml K₂HPO₄-KH₂PO₄（pH7.0）缓冲液中，湿菌丝体以干重计浓度为30g/L反应体系（反应体系总体积20ml），加入终浓度5wt%的四丁基铵谷氨酸离子液体(实施例6方法制备，[N_4,4,4,4]⁺[Glu]^–)，终浓度70mM的3,5-双三氟甲基苯乙酮作为底物，1.2ml无水乙醇(终浓度6%，v/v)、1.2g葡萄糖(终浓度6%，w/w)和1.2ml异丙醇(终浓度6%，v/v)为辅助底物，置于30℃，200r/min摇床中进行生物还原反应24h。反应结束后，反应液用等体积的正己烷萃取，取正己烷层进行气相色谱分析，分析条件同实施例7，所得产物(R)-[3,5-双(三氟甲基)苯基]乙醇的浓度为65.7mM,ee值大于98%，产率为93.9%。

实施例17：

将发酵所得湿菌丝体悬浮于20ml K₂HPO₄-KH₂PO₄（pH7.0）缓冲液中，湿菌丝体以干重计浓度为30g/L反应体系（反应体系总体积20ml），加入终浓度5wt%的四丁基铵谷氨酸离子液体(实施例6方法制备，[N_4,4,4,4]⁺[Glu]^–)，终浓度70mM的3,5-双三氟甲基苯乙酮作为底物，置于30℃，200r/min摇床中进行生物还原反应24h。反应结束后，反应液用等体积的正己烷萃取，取正己烷层进行气相色谱分析，分析条件同实施例7，所得产物(R)-[3,5-双(三氟甲基)苯基]乙醇的浓度为12.5mM,ee值大于98%，产率为17.9%。

实施例18：

将发酵所得湿菌丝体悬浮于20ml K₂HPO₄-KH₂PO₄（pH7.0）缓冲液中，湿菌丝体以干重计浓度为30g/L反应体系（反应体系总体积20ml），加入终浓度1wt%的四丁基铵谷氨酸离子液体(实施例6方法制备，[N_4,4,4,4]⁺[Glu]^–)，终浓度70mM的3,5-双三氟甲基苯乙酮作为底物，1.2ml无水乙醇(终浓度6%，v/v)、1.2g葡萄糖(终浓度6%，w/w)和1.2ml异丙醇(终浓度6%，v/v)为辅助底物，置于30℃，200r/min摇床中进行生物还原反应24h。反应结束后，反应液用等体积的正己烷萃取，取正己烷层进行气相色谱分析，分析条件同实施例7，所得产物(R)-[3,5-双(三氟甲基)苯基]乙醇的浓度为67.6mM,ee值大于98%，产率为96.6%。

实施例19：

将发酵所得湿菌丝体悬浮于20ml K₂HPO₄-KH₂PO₄（pH7.0）缓冲液中，湿菌丝体以干重计浓度为30g/L反应体系（反应体系总体积20ml），加入终浓度1wt%的四丁基铵谷氨酸离子液体(实施例6方法制备，[N_4,4,4,4]⁺[Glu]^–)，终浓度80mM的3,5-双三氟甲基苯乙酮作为底物，1.2ml无水乙醇(终浓度6%，v/v)、1.2g葡萄糖(终浓度6%，w/w)和1.2ml异丙醇(终浓度6%，v/v)为辅助底物，置于30℃，200r/min摇床中进行生物还原反应24h。反应结束后，反应液用等体积的正己烷萃取，取正己烷层进行气相色谱分析，分析条件同实施例7，所得产物(R)-[3,5-双(三氟甲基)苯基]乙醇的浓度为72.3mM,ee值大于98%，产率为90.4%。

实施例20：

将发酵所得湿菌丝体悬浮于20ml K₂HPO₄-KH₂PO₄（pH7.0）缓冲液中，湿菌丝体以干重计浓度为30g/L反应体系（反应体系总体积20ml），加入终浓度1wt%的四丁基铵谷氨酸离子液体(实施例6方法制备，[N_4,4,4,4]⁺[Glu]^–)，终浓度100mM的3,5-双三氟甲基苯乙酮作为底物，1.2ml无水乙醇(终浓度6%，v/v)、1.2g葡萄糖(终浓度6%，w/w)和1.2ml异丙醇(终浓度6%，v/v)为辅助底物，置于30℃，200r/min摇床中进行生物还原反应。反应结束后，反应液用等体积的正己烷萃取，取正己烷层进行气相色谱分析，分析条件同实施例7，所得产物(R)-[3,5-双(三氟甲基)苯基]乙醇的浓度为89.4mM，ee值大于98%，产率为89.4%。

实施例21：

将发酵所得湿菌丝体悬浮于20ml K₂HPO₄-KH₂PO₄（pH7.0）缓冲液中，湿菌丝体以干重计浓度为30g/L反应体系（反应体系总体积20ml），加入终浓度1wt%的三甲基乙基铵精氨酸离子液体(实施例5方法制备，[N_1,2,1,1]⁺[Arg]^–)，终浓度100mM的3,5-双三氟甲基苯乙酮作为底物，1.2ml无水乙醇(终浓度6%，v/v)、1.2g葡萄糖(终浓度6%，w/w)和1.2ml异丙醇(终浓度6%，v/v)为辅助底物，置于30℃，200r/min摇床中进行生物还原反应。反应结束后，反应液用等体积的正己烷萃取，取正己烷层进行气相色谱分析，分析条件同实施例7，所得产物(R)-[3,5-双(三氟甲基)苯基]乙醇的浓度为83.2mM，ee值大于98%，产率为83.2%。

实施例22：

将适量发酵所得湿菌丝体经液氮研磨成粉末状后，加入到5mlK₂HPO₄-KH₂PO₄（pH7.0）缓冲液中，再添加质量浓度为10mg/ml的蜗牛酶（购自上海生工），水浴恒温37℃酶解1小时后，4℃离心去除菌丝体(12000×g，30min)后，制备得到酶液。

在1ml K₂HPO₄-KH₂PO₄(pH7.0)缓冲液中，加入1wt%三甲基乙基铵精氨酸离子液体(实施例5方法制备，[N_1,2,1,1]⁺[Arg]^–)，0.3mM NAD⁺，于30℃水浴保温5min后加入1ml酶液(含2μg蛋白，蛋白含量采用考马斯亮蓝法测定)，根据30℃下测定的340nm处5min内吸光度的变化，计算出棘孢木霉ZJPH0810源羰基还原酶的比酶活为0.44U/mg。

酶活力单位定义为：在上述条件下，每分钟催化还原lμmol NAD⁺的酶活力为1个酶活力单位。

酶活力计算公式为：酶活(U)=EW×V×1000/(6220×1)

酶比活的计算公式：酶比活(U/mg)=酶活(U)/蛋白量(mg)

EW：每min内340nm处吸光度的变化；V：反应液的体积(mL)；6220：摩尔消光系数(Lmol^-1cm-¹)；l：光程距离(cm)。

实施例23：

将适量发酵所得湿菌丝体经液氮研磨成粉末状后，加入到5mlK₂HPO₄-KH₂PO₄（pH7.0）缓冲液中，再添加质量浓度为10mg/ml的蜗牛酶（购自上海生工），水浴恒温37℃酶解1小时后，4℃离心去除菌丝体(12000×g，30min)后，制备得到酶液。

在1ml K₂HPO₄-KH₂PO₄(pH7.0)缓冲液中，加入1wt%四丁基铵谷氨酸离子液体(实施例6方法制备，[N_4,4,4,4]⁺[Glu]^–)，0.3mM NAD⁺，于30℃水浴保温5min后加入1ml酶液(含2μg蛋白，蛋白含量采用考马斯亮蓝法测定)，根据30℃下测定的340nm处5min内吸光度的变化，计算出棘孢木霉ZJPH0810源羰基还原酶的比酶活为1.43U/mg。

Claims (10)

1.一种利用含离子液体的反应体系制备(R)-[3,5-双(三氟甲基)苯基]乙醇的方法，其特征在于所述方法为：以棘孢木霉ZJPH0810发酵培养获得的湿菌丝体作为催化剂，以3,5-双三氟甲基苯乙酮作为底物，在式（Ⅰ）所示氨基酸类离子液体与pH值为5.5～8.0的缓冲液构成的反应体系中，于25～45℃、100～300r/min条件下反应6～50小时，反应液用等体积的正己烷萃取，取萃取液分离纯化得到(R)-[3,5-双(三氟甲基)苯基]乙醇；所述反应体系中湿菌丝体的加入量以菌丝体干重计为10～50g/L，所述反应体系中底物初始浓度为20～200mM，所述反应体系中氨基酸类离子液体质量浓度为0.1～30%；

[N_R1,R2,R3,R4]⁺L^–

（Ⅰ）

式（Ⅰ）中阳离子为取代季铵盐，阴离子为天然氨基酸，其中取代季铵盐的取代基R1、R2、R3和R4各自独立为C1～C4的烷基。

2.如权利要求1所述利用含离子液体的反应体系制备(R)-[3,5-双(三氟甲基)苯基]乙醇的方法，其特征在于所述天然氨基酸为下列之一：丙氨酸、丝氨酸、苏氨酸、色氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、脯氨酸、天冬氨酸、酪氨酸、天冬酰胺、赖氨酸、半胱氨酸、谷氨酸、谷氨酰胺、精氨酸、组氨酸或甘氨酸。

3.如权利要求1所述利用含离子液体的反应体系中制备(R)-[3,5-双(三氟甲基)苯基]乙醇的方法，其特征在于所述氨基酸类离子液体为下列之一：[N_1,1,1,1]⁺[Glu]^–、[N_3,3,3,3]⁺[Glu]^–、[N_1,1,2,2]⁺[Tyr]^–、[N_1,1,1,1]⁺[Met]^–、[N_1,2,1,1]⁺[Arg]^–或[N_4,4,4,4]⁺[Glu]^–，其中取代季铵盐中1为甲基，2为乙基，3为丙基，4为丁基。

4.如权利要求1所述利用含离子液体的反应体系中制备(R)-[3,5-双(三氟甲基)苯基]乙醇的方法，其特征在于所述反应是在30℃、200r/min条件下反应24小时。

5.如权利要求1所述利用含离子液体的反应体系制备(R)-[3,5-双(三氟甲基)苯基]乙醇的方法，其特征在于所述反应体系中湿菌丝体的加入量以菌丝体干重计为20～40g/L，所述反应体系中底物初始浓度为50～150mM，所述反应体系中氨基酸类离子液体质量浓度为1～20%。

6.如权利要求1所述利用含离子液体的反应体系制备(R)-[3,5-双(三氟甲基)苯基]乙醇的方法，其特征在于所述反应体系中还添加有辅助底物，所述辅助底物为下列一种或两种及以上任意比例的混合：①甲醇、②乙醇、③异丙醇、④甘油、⑤葡萄糖、⑥果糖、⑦鼠李糖或⑧麦芽糖，所述反应体系中辅助底物质量浓度为0.1～20%。

7.如权利要求6所述利用含离子液体的反应体系制备(R)-[3,5-双(三氟甲基)苯基]乙醇的方法，其特征在于所述辅助底物为下列之一：①反应体系中体积终浓度3～10%无水乙醇；②反应体系中体积终浓度3～10%无水乙醇和反应体系中质量终浓度3～10%葡萄糖两者的混合；③反应体系中体积终浓度3～10%无水乙醇、反应体系中体积终浓度3～10%异丙醇和反应体系中质量终浓度3～10%葡萄糖三者的混合。

8.如权利要求6所述利用含离子液体的反应体系制备(R)-[3,5-双(三氟甲基)苯基]乙醇的方法，其特征在于所述反应体系中湿菌丝体的加入量以菌丝体干重计为20～40g/L，所述反应体系中底物初始浓度为70～100mM，所述反应体系中氨基酸类离子液体质量浓度为1～5%，所述反应体系中辅助底物为体积终浓度6%无水乙醇、体积终浓度6%无水乙醇和质量终浓度6%葡萄糖两者的混合或是体积终浓度6%无水乙醇、体积终浓度6%异丙醇和质量终浓度6%葡萄糖三者的混合。

9.如权利要求1所述利用含离子液体的反应体系制备(R)-[3,5-双(三氟甲基)苯基]乙醇的方法，其特征在于所述缓冲液为pH值为7.0的磷酸缓冲液。

10.如权利要求1所述利用含离子液体的反应体系制备(R)-[3,5-双(三氟甲基)苯基]乙醇的方法，其特征在于萃取液分离纯化的方法为：取萃取液减压浓缩5倍体积，然后以体积比8:1的石油醚和乙酸乙酯混合液为洗脱剂进行硅胶柱层析，收集含有目标产物的洗脱液，将洗脱液干燥，即得(R)-3,5-双三氟甲基苯乙醇。

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