CN113981013A - 一种手性四氢萘-2-醇化合物的生物催化制备方法 - Google Patents

一种手性四氢萘-2-醇化合物的生物催化制备方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开一种手性四氢萘‑2‑醇化合物的生物催化制备方法，包括步骤：(a)在液态反应体系中，以5,7‑二氟‑2‑四氢萘酮为底物，在辅酶存在下，在羰基还原酶催化下，进行不对称还原反应，形成(R)‑5,7‑二氟‑1,2,3,4‑四氢萘‑2‑醇；(b)任选地从所述步骤(a)的反应后的反应体系中分离出(R)‑5,7‑二氟‑1,2,3,4‑四氢萘‑2‑醇。本发明还公开该方法的羰基还原酶及其编码基因、载体、生物工程菌。本发明的优点在于步骤短，条件温和，收率显著提高，产品光学纯度高。

Description

一种手性四氢萘-2-醇化合物的生物催化制备方法
技术领域
本发明属于医药技术领域，特别是涉及一种手性四氢萘-2-醇化合物的生物催化制备方法。
背景技术
盐酸内匹司他是一种有效的选择性多巴胺β-水解酶抑制剂。现有的技术中，内匹司他盐酸盐的合成难度大，成本高，究其主要原因在于手性中间体的获得难。
WO 2009/021055A1公开了内匹司他的化学合成方法。该方法包括，预先将(-)-1R,2S-N-甲基麻黄碱、氢化铝锂、2-乙胺基吡啶经两步操作依次混合反应，制备得黄绿色悬浮液；再将悬浮液冷却至-65℃，向其中逐滴加入原料5,7-二氟-2-四氢萘酮，待反应完成后经一系列后处理得到手性中间体(R)-5,7-二氟-1,2,3,4-四氢萘-2-醇，收率47％，ee值93.4％。该方法的不足之处在于，预先前处理和后处理操作繁琐且条件严苛，不适合工业化生产，而且收率低，光学纯度偏低。
CN 111018663A公开了一种内匹司他中间体的制备方法，其在前述方法的基础上进行了改进，达到了提高产品的光学纯度的效果。该方法先将原料5,7-二氟-2-四氢萘酮还原生成消旋的5,7-二氟-1.2,3,4-四氢萘-2-醇(实施例收率96.3％)，再通过脂肪酶对消旋醇进行酯化后进行动力学拆分生成(R)-5,7-二氟-1,2,3,4-四氢萘-2-乙酯(实施例收率45％)，随后对其水解生成手性中间体(R)-5,7-二氟-1,2,3,4-四氢萘-2-醇(实施例收率91％，ee值99％)。该方法的不足之处在于，反应步骤多，动力学拆分理论收率仅为50％(实际收率45％)，无效异构体难以消旋，原料浪费严重，导致生产成本较高，不适合工业化生产。
因此，综合已有报道结合实际生产需要，本领域迫切需要开发出一种更具经济性的(R)-5,7-二氟-1,2,3,4-四氢萘-2-醇的制备方法，即能够同时满足以下条件：1)反应步骤短，操作简便；2)反应条件温和，易于工业化生产；3)产品收率能显著提高；4)产品光学纯度高。
发明内容
针对现有技术中，合成手性中间体(R)-5,7-二氟-1,2,3,4-四氢萘-2-醇的反应步骤多、操作繁琐、反应条件较严苛、收率低、和/或光学纯度偏低的不足，本发明提供了一种(R)-5,7-二氟-1,2,3,4-四氢萘-2-醇的生物催化制备方法，在温和的条件下，将原料5,7-二氟-2-四氢萘酮经一步还原反应直接得到(R)-5,7-二氟-1,2,3,4-四氢萘-2-醇，同时收率显著提高，产品光学纯度高，ee值能达99％。
第一方面，本发明提供了一种(R)-5,7-二氟-1,2,3,4-四氢萘-2-醇的生物催化制备方法，其包括以下步骤：
(a)在液态反应体系中，以式II化合物(5,7-二氟-2-四氢萘酮)为底物，在辅酶存在下，在羰基还原酶催化下，进行不对称还原反应，形成式I化合物，即(R)-5,7-二氟-1,2,3,4-四氢萘-2-醇；
Figure BDA0003387580340000021
(b)任选地从所述步骤(a)的反应后的反应体系中分离出式I化合物；
其中，所述羰基还原酶选自下组：
(i)来源于Leifsonia sp.strain S749的羰基还原酶LSADH，其氨基酸序列如SEQID NO:2所示；
(ii)对SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列在保持酶活性范围内，进行一个或多个氨基酸的替换、缺失、改变、插入或增加，所得到的至少约85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、或99％相同的氨基酸序列。
在一种优选的实施方式中，所述反应体系中，式II化合物浓度为1-1000g/L。
在一种优选的实施方式中，所述反应体系中，所述式II化合物的浓度为10g/L以上、30g/L以上、50g/L以上、70g/L以上、90g/L以上、100g/L以上、120g/L以上、140g/L以上、160g/L以上、180g/L以上、200g/L以上、220g/L以上、240g/L以上、260g/L以上、280g/L以上、300g/L以上、320g/L以上、350g/L以上、400g/L以上、或450g/L以上。
在一种优选的实施方式中，所述反应体系中，所述式II化合物的浓度为10-500g/L；优选地，所述式II化合物的浓度为100-500g/L；进一步优选地，所述式II化合物的浓度为200-400g/L；更进一步地，所述式II化合物的浓度为300-400g/L。
在一种优选的实施方式中，所述反应体系中，所述式II化合物的浓度为50-450g/L；优选地，所述式II化合物的浓度为150-550g/L；进一步优选地，为250-450g/L；更进一步地，为250-350g/L。
在一种优选的实施方式中，所述一个或多个氨基酸是指1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、或超过10个氨基酸。优选地，是指1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、或超过8个氨基酸。进一步优选地，是指1个、2个、3个、4个、5个或超过5个氨基酸。
在一种优选的实施方式中，一个或多个氨基酸为1～10个氨基酸；优选地，为1～8个氨基酸；进一步优选地，为1～5个氨基酸。
在一种优选的实施方式中，所述羰基还原酶选自下组：
(i)来源于Leifsonia sp.strain S749的羰基还原酶LSADH，其氨基酸序列如SEQID NO:2所示；
(ii)对SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列在保持酶活性范围内，对其第63、81、98、154、163、203、218位氨基酸中的至少一个氨基酸进行的氨基酸替换、缺失、改变、插入或增加，所得到的氨基酸序列。
在一种优选的实施方式中，所述羰基还原酶选自下组：
(i)来源于Leifsonia sp.strain S749的羰基还原酶LSADH，其氨基酸序列如SEQID NO:2所示；
(ii)对SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列在保持酶活性范围内，对其第63、81、98、154、163、203、218位氨基酸中的至少一个氨基酸进行的相同数量的氨基酸的替换所得到的氨基酸序列。
在一种优选的实施方式中，所述羰基还原酶选自：对SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列在保持酶活性范围内，按以下改变方式中的任意一种或多种进行改变所得到的氨基酸序列；所述改变方式为：
第63位的氨基酸丙氨酸(A)被缬氨酸(V)替换；第81位的氨基酸丙氨酸(A)被苏氨酸(T)替换；第98位的氨基酸丙氨酸(A)被缬氨酸(V)替换；第154位的氨基酸丝氨酸(S)被酪氨酸(Y)替换；第163位的氨基酸丙氨酸(A)被甘氨酸(G)替换；第203位的氨基酸丙氨酸(A)被缬氨酸(V)替换；第218位的氨基酸谷氨酸(E)被赖氨酸(K)替换。
在一种优选的实施方式中，所述羰基还原酶为氨基酸序列选自下组的酶：
对应于SEQ ID NO:2的第63位的氨基酸丙氨酸(A)被缬氨酸(V)替换的氨基酸序列；
对应于SEQ ID NO:2的第81位的氨基酸丙氨酸(A)被苏氨酸(T)替换的氨基酸序列；
对应于SEQ ID NO:2的第98位的氨基酸丙氨酸(A)被缬氨酸(V)替换的氨基酸序列；
对应于SEQ ID NO:2的第154位的氨基酸丝氨酸(S)被酪氨酸(Y)替换的氨基酸序列；
对应于SEQ ID NO:2的第163位的氨基酸丙氨酸(A)被甘氨酸(G)替换的氨基酸序列；
对应于SEQ ID NO:2的第203位的氨基酸丙氨酸(A)被缬氨酸(V)替换的氨基酸序列；
对应于SEQ ID NO:2的第218位的氨基酸谷氨酸(E)被赖氨酸(K)替换的氨基酸序列；
对应于SEQ ID NO:2的第163位的氨基酸丙氨酸(A)被甘氨酸(G)替换和第203位的氨基酸丙氨酸(A)被缬氨酸(V)替换的氨基酸序列；
对应于SEQ ID NO:2的第163位的氨基酸丙氨酸(A)被甘氨酸(G)替换和第218位的氨基酸谷氨酸(E)被赖氨酸(K)替换的氨基酸序列；
对应于SEQ ID NO:2的第63位的氨基酸丙氨酸(A)被缬氨酸(V)替换、第81位的氨基酸丙氨酸(A)被苏氨酸(T)替换和第163位的氨基酸丙氨酸(A)被甘氨酸(G)替换的氨基酸序列；
对应于SEQ ID NO:2的第63位的氨基酸丙氨酸(A)被缬氨酸(V)替换、第98位的氨基酸丙氨酸(A)被缬氨酸(V)替换和第203位的氨基酸丙氨酸(A)被缬氨酸(V)替换的氨基酸序列；
对应于SEQ ID NO:2的第63位的氨基酸丙氨酸(A)被缬氨酸(V)替换、第98位的氨基酸丙氨酸(A)被缬氨酸(V)替换、第163位的氨基酸丙氨酸(A)被甘氨酸(G)替换和第203位的氨基酸丙氨酸(A)被缬氨酸(V)替换的氨基酸序列。
在一种优选的实施方式中，所述羰基还原酶的编码基因序列选自下组：
(a)SEQ ID NO:1所示的序列；
(b)与(a)限定的序列互补的多核苷酸；或
(c)与(a)限定的序列具有至少70％(优选至少75％、80％、85％、90％，更优选至少95％、96％、97％、98％、99％)以上的序列一致性的任一多核苷酸或互补序列。
在一种优选的实施方式中，所述羰基还原酶基因构建在表达载体上。优选地，所述表达载体为重组质粒。
在一种优选的实施方式中，所述反应体系中，还存在共底物。
在一种优选的实施方式中，所述共底物选自：异丙醇、葡萄糖、甲酸铵、或其组合。
在一种优选的实施方式中，所述反应体系中，共底物的质量体积浓度为5％～50％(w/v)。
在一种优选的实施方式中，所述辅酶选自下组：还原性辅酶、氧化性辅酶、或其组合。
在一种优选的实施方式中，所述还原性辅酶选自下组：NADH、NADPH、或其组合。
在一种优选的实施方式中，所述氧化性辅酶选自下组：NAD+、NADP+、或其组合。
在一种优选的实施方式中，所述NAD+用量与底物用量比率为0.01％～1.0％(w/w)；优选地，比率为0.01％～0.5％(w/w)。
在一种优选的实施方式中，所述NADP+的用量与底物用量比率为0.01％～1.0％(w/w)；优选地，比率为0.01％～0.5％(w/w)。
在一种优选的实施方式中，所述的反应体系中，还存在用于辅酶再生的酶。其中，所述用于辅酶再生的酶选自：醇脱氢酶、甲酸脱氢酶、葡萄糖脱氢酶、或其组合。
在一种优选的实施方式中，所述步骤(a)中，反应温度为10℃～50℃；优选地，反应温度为15℃～45℃；进一步优选地，反应温度为20℃～40℃；更优选地，反应温度为25℃～35℃。
在一种优选的实施方式中，所述步骤(a)中，反应时间为0.1～240小时；优选地，反应时间为0.1～120小时；进一步优选地，反应时间为0.5～72小时；更优选地，反应时间为1～48小时。
在一种优选的实施方式中，所述步骤(a)中，反应体系的pH为6.0～9.0；优选地，pH为6.0～8.5；进一步优选地，pH为6.5～8.0；更优选地，pH为6.5～7.5。
在一种优选的实施方式中，所述反应体系中，羰基还原酶的存在形式为：游离形式的酶、固定化酶、或菌体形式的酶。
在一种优选的实施方式中，所述反应体系为水性体系。
在一种优选的实施方式中，所述反应体系为磷酸缓冲盐体系。
在一种优选的实施方式中，所述的反应体系含有选自下组的溶剂：水、醇、或其组合。
在一种优选的实施方式中，所述的反应体系还含有助溶剂。
在一种优选的实施方式中，所述的助溶剂选自下组：二甲基亚砜、甲醇、乙醇、异丙醇、乙腈、甲苯、丙酮、或其组合。
在一种优选的实施方式中，所述助溶剂的体积百分浓度为5-50％(v/v)；优选地，所述助溶剂的体积百分浓度为5-30％(v/v)。
在一种优选的实施方式中，所述步骤(b)中，所述的分离包括：加热使蛋白失活，过滤菌体，用萃取溶剂萃取滤液，浓缩有机层。
在一种优选的实施方式中，所述步骤(b)中，所述加热是指：加热至50-80℃。
在一种优选的实施方式中，所述步骤(b)中，所述过滤菌体是指：经过硅藻土过滤菌体。
在一种优选的实施方式中，所述步骤(b)中，所述萃取溶剂为甲叔醚、二氯甲烷、甲苯、或乙酸乙酯。
在一种优选的实施方式中，所述步骤(b)中，所述的分离包括：加热至50-80℃使蛋白失活，经过硅藻土过滤菌体，向滤液中加入萃取溶剂，所述萃取溶剂为甲叔醚、二氯甲烷、甲苯、或乙酸乙酯等，萃取并合并有机层，经干燥、过滤，浓缩有机层得产品。
在一种优选的实施方式中，所述步骤(b)中，所述反应后的反应体系中，式I化合物的ee值≥95％；优选地，式I化合物的ee值≥98％；进一步优选地，式I化合物的ee值≥99％。
在一种优选的实施方式中，所述步骤(b)中，所述反应后的反应体系中，≥90％式II化合物被转化为式I化合物；优选地，≥95％式II化合物被转化为式I化合物；进一步优选地，≥98％式II化合物被转化为式I化合物；更优选地，≥99％式II化合物被转化为式I化合物。
在一种优选的实施方式中，所述步骤(b)中，所述反应后的反应体系中，式I化合物的浓度1～1000g/L。
第二方面，本发明提供了一种反应体系，所述反应体系包括：
(1)水性溶剂；
(2)底物，所述底物为式II化合物(5,7-二氟-2-四氢萘酮)；
Figure BDA0003387580340000061
(3)辅酶；
(4)羰基还原酶；所述羰基还原酶选自下组：
(i)来源于Leifsonia sp.strain S749的羰基还原酶LSADH，其氨基酸序列如SEQID NO:2所示；
(ii)对SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列在保持酶活性范围内，进行一个或多个氨基酸的替换、缺失、改变、插入或增加，所得到的至少约85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、或99％相同的氨基酸序列；
(5)共底物。
在一种优选的实施方式中，所述反应体系还包括：(6)用于辅酶再生的酶。
在一种优选的实施方式中，所述反应体系中，式II化合物浓度为1-1000g/L。
本发明提供的上述反应体系，能够进行酶促反应，以高产率制得高光学纯度的(R)-5,7-二氟-1,2,3,4-四氢萘-2-醇。优选地，光学纯度为ee值≥95％；进一步优选地，光学纯度为ee值≥98％；更优选地，光学纯度为ee值≥99％
即，第三方面，本发明还提供了一种(R)-5,7-二氟-1,2,3,4-四氢萘-2-醇的生物催化制备方法，其包括：使用如本发明第二方面所述的反应体系，进行酶促反应，从而制得(R)-5,7-二氟-1,2,3,4-四氢萘-2-醇，即式I化合物：
Figure BDA0003387580340000071
在一种优选的实施方式中，所述反应体系中，式II化合物浓度为1-1000g/L。
在一种优选的实施方式中，所述方法中，反应后的反应体系中，式I化合物的ee值≥95％；优选地，式I化合物的ee值≥98％；进一步优选地，式I化合物的ee值≥99％。
在一种优选的实施方式中，所述方法中，反应后的反应体系中，≥90％式II化合物被转化为式I化合物；优选地，≥95％式II化合物被转化为式I化合物；进一步优选地，≥98％式II化合物被转化为式I化合物；更优选地，≥99％式II化合物被转化为式I化合物。
第四方面，本发明还提供了一种羰基还原酶，所述羰基还原酶选自下组：
(i)来源于Leifsonia sp.strain S749的羰基还原酶LSADH，其氨基酸序列如SEQID NO:2所示；
(ii)对SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列在保持酶活性范围内，进行一个或多个氨基酸的替换、缺失、改变、插入或增加，所得到的至少约85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、或99％相同的氨基酸序列。
本发明公开的羰基还原酶是能够催化5,7-二氟-2-四氢萘酮还原制备基本上立体异构体纯的(R)-5,7-二氟-1,2,3,4-四氢萘-2-醇的羰基还原酶。
在一种优选的实施方式中，所述羰基还原酶选自：对SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列在保持酶活性范围内，进行一个或多个氨基酸的替换、缺失、改变、插入或增加，所得到的至少约85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、或99％相同的氨基酸序列。优选地，至少约90％相同；更优选地，至少约95％、96％、97％、98％、或99％相同。这些并异可以是一个或多个氨基酸插入、缺失、取代或这些改变的任何组合。在一些实施方案中，氨基酸序列羌异可以包含非保守的、保守的以及非保守的和保守的氨基酸取代的组合。本文描述了可以进行这些改变的各种氨基酸残基位置。
在一种优选的实施方式中，所述羰基还原酶选自：对SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列在保持酶活性范围内，对其第63、81、98、154、163、203、218位氨基酸中的至少一个氨基酸进行的氨基酸替换、缺失、改变、插入或增加，所得到的氨基酸序列。
在一种优选的实施方式中，所述一个或多个氨基酸是指1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、或超过10个氨基酸。优选地，是指1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、或超过8个氨基酸。进一步优选地，是指1个、2个、3个、4个、5个或超过5个氨基酸。
在一种优选的实施方式中，一个或多个氨基酸为1～10个氨基酸；优选地，为1～8个氨基酸；进一步优选地，为1～5个氨基酸。
在一种优选的实施方式中，所述羰基还原酶选自：对SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列在保持酶活性范围内，对其第63、81、98、154、163、203、218位氨基酸中的至少一个氨基酸进行的相同数量的氨基酸的替换所得到的氨基酸序列。
在一种优选的实施方式中，所述羰基还原酶选自：对SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列在保持酶活性范围内，按以下改变方式中的任意一种或多种进行改变所得到的氨基酸序列；所述改变方式为：
第63位的氨基酸丙氨酸(A)被缬氨酸(V)替换；第81位的氨基酸丙氨酸(A)被苏氨酸(T)替换；第98位的氨基酸丙氨酸(A)被缬氨酸(V)替换；第154位的氨基酸丝氨酸(S)被酪氨酸(Y)替换；第163位的氨基酸丙氨酸(A)被甘氨酸(G)替换；第203位的氨基酸丙氨酸(A)被缬氨酸(V)替换；第218位的氨基酸谷氨酸(E)被赖氨酸(K)替换。
在一种优选的实施方式中，所述羰基还原酶为氨基酸序列选自下列具体实施方案中的酶(突变体)。
在一些具体实施方案中，本公开内容的改良的羰基还原酶包含其中对应于SEQ IDNO:2的第63位的氨基酸丙氨酸(A)被缬氨酸(V)替换的氨基酸序列。
在一些具体实施方案中，本公开内容的改良的羰基还原酶包含其中对应于SEQ IDNO:2的第81位的氨基酸丙氨酸(A)被苏氨酸(T)替换的氨基酸序列。
在一些具体实施方案中，本公开内容的改良的羰基还原酶包含其中对应于SEQ IDNO:2的第98位的氨基酸丙氨酸(A)被缬氨酸(V)替换的氨基酸序列。
在一些具体实施方案中，本公开内容的改良的羰基还原酶包含其中对应于SEQ IDNO:2的第154位的氨基酸丝氨酸(S)被酪氨酸(Y)替换的氨基酸序列。
在一些具体实施方案中，本公开内容的改良的羰基还原酶包含其中对应于SEQ IDNO:2的第163位的氨基酸丙氨酸(A)被甘氨酸(G)替换的氨基酸序列。
在一些具体实施方案中，本公开内容的改良的羰基还原酶包含其中对应于SEQ IDNO:2的第203位的氨基酸丙氨酸(A)被缬氨酸(V)替换的氨基酸序列。
在一些具体实施方案中，本公开内容的改良的羰基还原酶包含其中对应于SEQ IDNO:2的第218位的氨基酸谷氨酸(E)被赖氨酸(K)替换的氨基酸序列。
在一些具体实施方案中，本公开内容的改良的羰基还原酶包含其中对应于SEQ IDNO:2的第163位的氨基酸丙氨酸(A)被甘氨酸(G)替换和第203位的氨基酸丙氨酸(A)被缬氨酸(V)替换的氨基酸序列。
在一些具体实施方案中，本公开内容的改良的羰基还原酶包含其中对应于SEQ IDNO:2的第163位的氨基酸丙氨酸(A)被甘氨酸(G)替换和第218位的氨基酸谷氨酸(E)被赖氨酸(K)替换的氨基酸序列。
在一些具体实施方案中，本公开内容的改良的羰基还原酶包含其中对应于SEQ IDNO:2的第63位的氨基酸丙氨酸(A)被缬氨酸(V)替换、第81位的氨基酸丙氨酸(A)被苏氨酸(T)替换和第163位的氨基酸丙氨酸(A)被甘氨酸(G)替换的氨基酸序列。
在一些具体实施方案中，本公开内容的改良的羰基还原酶包含其中对应于SEQ IDNO:2的第63位的氨基酸丙氨酸(A)被缬氨酸(V)替换、第98位的氨基酸丙氨酸(A)被缬氨酸(V)替换和第203位的氨基酸丙氨酸(A)被缬氨酸(V)替换的氨基酸序列。
在一些具体实施方案中，本公开内容的改良的羰基还原酶包含其中对应于SEQ IDNO:2的第63位的氨基酸丙氨酸(A)被缬氨酸(V)替换、第98位的氨基酸丙氨酸(A)被缬氨酸(V)替换、第163位的氨基酸丙氨酸(A)被甘氨酸(G)替换和第203位的氨基酸丙氨酸(A)被缬氨酸(V)替换的氨基酸序列。
本发明提供的上述羰基还原酶在前述催化5,7-二氟-2-四氢萘酮还原制备(R)-5,7-二氟-1,2,3,4-四氢萘-2-醇的方法中表现出高活性、高产率和高光学纯度的优点。
第五方面，本发明还提供前述第四方面所述的羰基还原酶作为催化剂在以5,7-二氟-2-四氢萘酮为底物经生物催化还原制备(R)-5,7-二氟-1,2,3,4-四氢萘-2-醇中的应用。
第六方面，本发明还提供前述第四方面所述的羰基还原酶的编码基因。
在一种优选的实施方式中，所述羰基还原酶的编码基因的核苷酸序列选自下组：
(a)SEQ ID NO:1所示的序列；
(b)与(a)限定的序列互补的多核苷酸；或
(c)与(a)限定的序列具有至少70％(优选至少75％、80％、85％、90％，更优选至少95％、96％、97％、98％、99％)以上的序列一致性的任一多核苷酸或互补序列。
在一种优选的实施方式中，所述羰基还原酶的编码基因的核苷酸序列选自：与SEQID NO:1所示的序列具有至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、或99％以上的序列一致性的任一多核苷酸或互补序列。
在一种优选的实施方式中，所述羰基还原酶的编码基因的核苷酸序列选自：编码如前所述的突变体的氨基酸序列的编码基因。
第七方面，还提供了一种表达载体，所述表达载体装载有前述第四方面所述的羰基还原酶的编码基因。
在一种优选的实施方式中，所述表达载体为重组质粒。
在一种优选的实施方式中，所述表达载体为pET28a(+)载体。
第八方面，本发明还提供了一种基因工程菌，包括宿主细胞和转入宿主细胞的目的基因，所述目的基因包含前述第四方面所述的羰基还原酶的编码基因。
在一种优选的实施方式中，所述宿主细胞为大肠杆菌。
技术术语
羰基还原酶
在本发明中，“羰基还原酶”是能够立体选择性催化潜手性酮不对称还原得到手性醇的酶。
在本发明中，所述的羰基还原酶包括是野生型的和突变型的。此外，可以分离的，也可以是重组的。可用于本发明的羰基还原酶优选来自Leifsonia sp.strain S749(其Genbank序号为AB213459)的羰基还原酶。此外，与上述羰基还原酶有类似活性或同源性(如≥80％，较佳地≥85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、或99％)的酶也在本发明范围之内。一种典型的羰基还原酶的氨基酸序列如SEQID No:2所示，其编码基因如SEQ ID No:1所示。
由于密码子的简并性，编码SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列的碱基序列不仅仅局限于SEQ ID NO:1。本领域技术人员可以通过适当引入替换、缺失、改变、插入或增加来获得该碱基序列的同系物，本发明涵盖这些同系物，只要其表达的重组酶保持催化5,7-二氟-2-四氢萘酮还原制备(R)-5,7-二氟-1,2,3,4-四氢萘-2-醇的催化还原活性即可。本发明中多聚核苷酸的同系物可以通过对碱基序列SEQ ID NO:1的一个或多个碱基在保持酶活性范围内进行替换、缺失或增加来制得。
本发明的羰基还原酶还包括对SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列在保持酶活性范围内，进行一个或多个氨基酸的替换、缺失、改变、插入或增加，所得到的氨基酸序列。
在本发明中，还提供了对其第63、81、98、154、163、203、218位氨基酸进行改良获得的羰基还原酶突变体，其相对于野生型酶均具有更高的活性，对R构型的立体选择性均可达到99％以上。在一优选的实施方式中，羰基还原酶突变体为突变体3,5,7,9,11,13,15,17所示(见表2)。
反应体系中可以用上述羰基还原酶的湿菌体、粗酶液、粗酶粉或者纯酶等。为获得较高的转化效率，优选使用粗酶液。羰基还原酶的用量与底物用量比率优选为1％～6％(w/w)或者休止细胞菌体的质量与底物的质量比率为10～100％。
辅酶
本发明中，“辅酶”是指能够实现氧化还原反应中电子传递的辅酶。
典型地，本发明的辅酶为还原性辅酶NADH、NADPH或氧化性辅酶NAD+、NADP+。由于还原性辅酶的价格成本较为昂贵，优选选择氧化性辅酶NAD+、NADP+。
当选择氧化性辅酶时，需要选择实现辅酶再生的方法，主要包括三种(1)葡萄糖脱氢酶与共底物葡萄糖；(2)醇脱氢酶与共底物异丙醇，(3)甲酸脱氢酶与共底物甲酸铵。
在一个优选实施方式中，辅酶为NAD+，辅酶再生体系为醇脱氢酶，本发明优选醇脱氢酶与共底物异丙醇。NAD+用量与底物用量比率为0.01％～1.0％(w/w)。缓冲体系为磷酸缓冲盐，浓度为0.1mol/L。缓冲液的pH为6-10。
助溶剂
本发明中，可以在反应体系中添加或不添加助溶剂。
如本文所用，术语“助溶剂”是指难溶性物质与加入的第三种物质在溶剂中形成可溶性分子间的络合物、缔合物或复盐等，以增加难溶性物质在溶剂中的溶解度。这种第三种物质称为助溶剂。
本发明中，底物化合物5,7-二氟-2-四氢萘酮难溶于水，当底物浓度增大时，严重影响反应转化率。因此，需通过加入助溶剂提高底物溶解性，以改善反应转化情况。可选的助溶剂为二甲基亚砜、甲醇、乙醇、异丙醇、乙腈、甲苯、丙酮、或其组合，浓度优选为5-30％(v/v)，优选为二甲基亚砜。
立体异构体
本发明中，立体异构体是指由分子中原子在空间上排列方式不同所产生的异构体，它可分为顺反异构体、对映异构体两种，也可分为对映异构体和非对映异构体两大类。在化学反应或酶促反应中，一种立体异构体相对于另一立体异构体优先形成，称之为立体选择性。立体选择性可以是部分的，这时一种立体异构体的形成比另一种有利，或者立体选择性可以是完全的，这时只形成一种立体异构体。当立体异构体是对映体时，立体选择性是指对映体选择性，即一种对映体在两种对映体总和中的分数(通常报道为百分比)。其(通常为百分比)在本领域中通常可选地报道为根据如下公式由其计算的对映体过量(ee)：[主要对映体-次要对映体]/[主要对映体+次要对映体]。在立体异构体是非对映异构体时，立体选择性是指非对映体选择性，即一种非对映体在两种非对映体混合物中的分数(通常报道为百分比)，通常可选地报道为非对映体过量(d.e.)。对映体过量和非对映体过量是立体异构体过量的类型。本发明中，基本上立体异构体纯，酶能够将底物转化为具有至少约95％、96％、97％、98％、或99％立体异构体过量的相应产物；优选为，至少约98％立体异构体过量；更优选为，至少约99％立体异构体过量。
生物催化制备方法
本发明提供了一种来源于Leifsonia sp.strain S749的羰基还原酶(LSADH)催化还原化合物5,7-二氟-2-四氢萘酮(式II)制备化合物(R)-5,7-二氟-1,2,3,4-四氢萘-2-醇(式I)的方法。反应式如下所示：
Figure BDA0003387580340000121
根据上述优选体系，所述制备方法的实施过程如下：将底物充分溶解在助溶剂，如二甲基亚砜或异丙醇，然后加入到磷酸缓冲液中，搅拌均匀后，加入湿菌体、粗酶液、粗酶粉或纯酶，加入辅酶NAD+，共底物异丙醇，维持在20℃～40℃，TLC或HPLC监控，优选至反应转化率达到98％以上。反应终止后，向反应液中加入异丙醇或甲基叔丁基醚，离心或硅藻土过滤，除去菌体，取上清液，上清液用萃取溶剂萃取，萃取溶剂可选为甲叔醚、二氯甲烷、甲苯或乙酸乙酯。萃取水层2-3次，合并有机相；用饱和食盐水洗涤2-3次，干燥、浓缩后得到产品。
本发明的主要优点包括：
1)利用本申请筛选得到的羰基还原酶可以通过一步反应由5,7-二氟-2-四氢萘酮制备得到(R)-5,7-二氟-1,2,3,4-四氢萘-2-醇，反应步骤短，反应条件温和，后处理仅需萃取分离，成本低廉，绿色环保。
2)利用本申请筛选得到的羰基还原酶及制备方法来制备(R)-5,7-二氟-1,2,3,4-四氢萘-2-醇，相比现有技术水平，收率显著提升，成本降低。
3)本申请筛选得到的羰基还原酶对(R)-5,7-二氟-1,2,3,4-四氢萘-2-醇具有很高的立体选择性，产物光学纯度高，ee值达99％以上。
附图说明
图1为式I化合物的消旋体手性图谱，图中S构型保留时间为6.0min和R构型保留时间为6.5min。
图2为本申请的羰基还原酶催化所得式I化合物的手性图谱，图中显示R构型ee值达99％以上；图中还显示了与消旋体手性图的对比。
具体实施方式
下面将对本发明的技术方案进行清楚、完整的描述，显然，所描述的实施例是本发明的一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动的前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册(New York:Cold Spring Harbor LaboratoryPress,1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则百分比和份数按重量计算。本发明中所涉及的实验材料如无特殊说明均可从市售渠道获得。
实施例1：羰基还原酶的初筛
本实施例中对不少于10种羰基还原酶进行初步筛选，其中，
ADH来源于Corynebacterium sp.ST-10，其Genbank序号为AB190261；
LSADH来源于Leifsonia sp.strain S749，其Genbank序号为AB213459；
ARQR来源于Agrobacterium radiobacter ECU2556，其Genbank序号为WP_015918093.1；
Fusc2来源于fusidioides strain ATCC 14700，其Genbank序号为QBB00668.1；
LK来源于Lactobacillus kefir，其Genbank序号为WP_054768785.1；
BD来源于Brevundimonas diminuta 470-4，其Genbank序号为EKY29933.1；
CK20来源于Chryseobac-terium sp.CA49，其Genbank序号为AHC30858.1；
Fusc1来源于fusidioides strain ATCC 14700，其Genbank序号为QBB00667.1；
DHCR来源于Debaryomyces hansenii CBS767，其Genbank序号为XM_459695；
740酶购自浙江中科鸿安生物工程有限公司。
筛选结果如表1所示，其中具体反应条件见相应的注释。
表1 部分羰基还原酶的筛选结果
编号 羰基还原酶 转化率(％) ee值(％) 构型
1 ADH<sup>b</sup> 69.2 10.6 R
2 LSADH<sup>a</sup> 100 99 R
3 ARQR<sup>b</sup> 11.8 25.3 R
4 Fusc2<sup>b</sup> 7.3 42.5 R
5 LK<sup>b</sup> 95.3 33.1 S
6 BD<sup>b</sup> 27.9 85.6 R
7 CK20<sup>a</sup> 18.4 90.4 R
8 740<sup>a</sup> 100 91.2 S
9 Fusc1<sup>b</sup> 6.7 43.5 R
10 DHCR<sup>b</sup> 86.4 87.8 R
a表示反应条件为：2mL反应体系(1):10g/L底物，20g/L葡萄糖，1mM NAD(P)，10g/LGDH，磷酸缓冲液(0.1M，pH 7.0)，28℃，220rpm，2h。
b表示反应条件为：2mL反应体系(2):10g/L底物，20％异丙醇，1mM NAD(P)，磷酸缓冲液(0.1M，pH 7.0)，28℃，220rpm，2h。
由表1知，来源不同的羰基还原酶对本发明中的底物5,7-二氟-2-四氢萘酮(式II)的还原效果存在显著差异。本申请意外发现，在催化5,7-二氟-2-四氢萘酮(式II)还原制备得到(R)-5,7-二氟-1,2,3,4-四氢萘-2-醇(式I)时，羰基还原酶LSADH相比其他羰基还原酶在转化率和立体选择性两方面同时具有显著的优势。
实施例2：羰基还原酶工程菌的构建
将来源于Leifsonia sp.strain S749的羰基还原酶(LSADH)基因克隆入pET28a(+)载体，转入大肠杆菌DH5α感受态细胞，卡那霉素抗性平板培养。挑取阳性转化子单菌落并提取质粒测序确定后，提取重组质粒，然后导入宿主大肠杆菌BL21(DE3)，平板培养，挑取单菌落，LB培养，获得羰基还原酶(LSADH)的重组基因工程菌。
实施例3：羰基还原酶突变库的构建及筛选
以野生型的羰基还原酶LSADH为模板，利用随机点突变试剂盒(
Figure BDA0003387580340000141
IISite-Directed Mutagenesis Kit)进行易错PCR，或通过定向进化将野生型的羰基还原酶基因LASDH进行突变，获得包含进化的羰基还原酶基因的质粒文库。构建后的质粒文库转入大肠杆菌BL21(DE3)(货号：康为世纪CW0809S)中，于37℃烘箱中，在含50μg/mL卡那霉素的LB固体培养基上培养过夜。将单菌落挑选至含400μL LB液体培养基(含50μg/mL卡那霉素)的96孔板中，37℃，200rpm过夜培养，得种子液。然后将10μL种子液转移至含400μL发酵培养基(含50μg/mL卡那霉素)的96深孔板中，37℃培养至OD600值>0.8。然后加入终浓度为1mM的异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)，降温至28℃诱导突变体表达，继续培养20h。发酵结束后，通过4000g，30min离心收集菌体，然后再用200μL裂解缓冲液(含有1000U溶菌酶的0.1M磷酸缓冲液，pH 7.0)重新悬浮菌体，并在30℃裂解1h。裂解结束后，于4℃，4000g，离心30min，澄清的上清液用于测定突变体活性。将190μL反应液(含0.4mM底物、1mM NADH、40μL二甲基亚砜)加入新的96孔板中，再加入10μL的上清液后，在340nm检测NADH的变化。NADH的消耗量反应突变体酶活的高低，各个突变体的相对活性如表2。
发酵培养基配方如下：酵母提取物(2.4％)，大豆蛋白胨(1.2％)，氯化钠(0.3％)，甘油(0.5)，磷酸氢二钾(0.2％)，七水硫酸镁(0.05％)。
表2 部分突变体及其相对活性
突变体序号 与SEQ ID NO:2的氨基酸残基差异 突变数 相对活性(％)*
3 A203V 1 130
5 S154Y 1 120
7 A98V 1 120
9 A163G、A203V 2 382
11 A163G、E218K 2 213
13 A63V、A81T、A163G 3 320
15 A63V、A98V、A203V 3 380
17 A63V、A98V、A163G、A203V 4 420
*野生型羰基还原酶LSADH(SEQ ID NO:2)的活性设为100％。
由表2知，羰基还原酶突变库中，突变体的活性均优于野生型羰基还原酶基因LSADH。尤其是突变体9、11、13、15、17、具有2～4个氨基酸突变点，其活性优于仅具有1个氨基酸突变位点的突变体3、5、7。
实施例4：(R)-5,7-二氟-1,2,3,4-四氢萘-2-醇(化合物TM)的生物催化制备
取0.1M的磷酸盐缓冲液(7mL)，加入NAD+(0.01g)，加入异丙醇(2mL)，加入上述发酵所得突变体17(1g)，剧烈搅拌分批加式II化合物(0.5g)的DMSO(1mL)溶液，30℃，HPLC监控反应转化率>98％时，终止反应。加入甲叔醚(20mL)萃取，加热至60℃保温1h，蛋白失活，加入10％的硅藻土，过滤菌体，甲叔醚(10mL)萃取水层，合并有机层，水洗(10mL×2)，5％食盐水洗，无水硫酸钠干燥，过滤，浓缩得式I化合物(0.42g，收率84％)，ee值99％。消旋体化合物的两个异构体手性纯度的液相图谱如图1所示，两个异构体物质保留时间分别为6.0min(S构型)和6.5min(R构型)。突变体17酶催化反应制备得到的式I化合物的液相图谱如图2所示，其保留时间为6.5min(R构型)，手性纯度(ee)为99％。
实施例5：(R)-5,7-二氟-1,2,3,4-四氢萘-2-醇(化合物TM)的生物催化制备
取0.1M的磷酸盐缓冲液(7mL)，加入NAD+(0.01g)，加入异丙醇(2mL)，加入上述野生型羰基还原酶基因LSADH(2g)，剧烈搅拌分批加式II化合物(0.2g)的DMSO(1mL)溶液，30℃，HPLC监控反应转化率>98％时，终止反应。加入甲叔醚(20mL)萃取，加热至60℃保温1h，蛋白失活，加入10％的硅藻土，过滤菌体，甲叔醚(10mL)萃取水层，合并有机层，水洗(10mL×2)，5％食盐水洗，无水硫酸钠干燥，过滤，浓缩得式I化合物(0.16g，收率80％)，ee值99％。上述野生型羰基还原酶基因LSADH催化反应制备得到的式I化合物的液相图谱与图2一致，其保留时间为6.5min(R构型)。
实施例6：(R)-5,7-二氟-1,2,3,4-四氢萘-2-醇(化合物TM)的生物催化制备的放大
取0.1M的磷酸盐缓冲液(7L)，加入NAD+(1g)，加入异丙醇(2L)，加入上述发酵所得突变体17(350g)，剧烈搅拌分批加式II化合物(700g)的DMSO(1L)溶液，30℃，HPLC监控反应转化率>98％时，终止反应。加入甲叔醚(20L)萃取，加热至60℃保温1h，蛋白失活，加入10％的硅藻土，过滤菌体，甲叔醚(10L)萃取水层，合并有机层，水洗(10L×2)，5％食盐水洗，无水硫酸钠干燥，过滤，浓缩得式I化合物(622g，收率88％)，其保留时间为6.5min(R构型)，手性纯度(ee)为99.6％。
综上所述，上述各实施例仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限定本发明的保护范围，凡在本发明的精神和原则之内，所做的任何修改、等同替换、改进等，皆应包含在本发明的保护范围内。
序列表
<110> 寰酶生物技术（上海）有限公司
<120> 一种手性四氢萘-2-醇化合物的生物催化制备方法
<130> HM-BT-2021001
<160> 2
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 859
<212> DNA
<213> LSADH
<400> 1
tggagttatc cgacaggtgt cggataactg aagggagatt ttcatggctc agtacgacgt 60
cgccgaccgg tccgcgatcg tgaccggagg cggctcgggc atcgggcgcg ccgtggcgct 120
cactctcgcg gcgagcggcg cagccgtcct cgtcaccgac ctgaacgagg agcacgcgca 180
ggccgtcgtg gccgagatcg aggccgcggg cggtaaggcc gccgcgctcg cgggcgacgt 240
gaccgacccc gcgttcggcg aggcgagcgt cgccggggcg aacgctctcg cgcccctcaa 300
gatcgcggtc aacaacgcgg gcatcggcgg cgaggccgcc acggtcggcg actactcgct 360
cgacagctgg cgcacggtga tcgaggtcaa cctcaacgcc gtgttctacg ggatgcagcc 420
gcagctgaag gccatggccg ccaacggcgg cggtgcgatc gtcaacatgg cgtccatcct 480
gggaagcgtc ggcttcgcca actcgtcggc ctacgtcacg gccaagcacg cgctgctcgg 540
tctcacccag aacgccgcgc tcgagtacgc cgccgacaag gtgcgcgtcg tcgcggtcgg 600
ccccggcttc atccgcaccc cgctcgtgga ggccaacctc tccgccgacg cgctggcgtt 660
cctcgagggc aagcacgccc tcggccgcct gggcgagccg gaagaggtcg cctcgctggt 720
cgcgttcctc gcctccgacg ccgcgagctt catcaccggc agctaccacc tggtggacgg 780
cggctacacc gcccagtgac cgggcgacag cccgtatcgt gcacggtcgc gctcccttag 840
gctgaggagc gtgaccccg 859
<210> 2
<211> 251
<212> PRT
<213> LSADH
<400> 2
Met Ala Gln Tyr Asp Val Ala Asp Arg Ser Ala Ile Val Thr Gly Gly
1 5 10 15
Gly Ser Gly Ile Gly Arg Ala Val Ala Leu Thr Leu Ala Ala Ser Gly
20 25 30
Ala Ala Val Leu Val Thr Asp Leu Asn Glu Glu His Ala Gln Ala Val
35 40 45
Val Ala Glu Ile Glu Ala Ala Gly Gly Lys Ala Ala Ala Leu Ala Gly
50 55 60
Asp Val Thr Asp Pro Ala Phe Gly Glu Ala Ser Val Ala Gly Ala Asn
65 70 75 80
Ala Leu Ala Pro Leu Lys Ile Ala Val Asn Asn Ala Gly Ile Gly Gly
85 90 95
Glu Ala Ala Thr Val Gly Asp Tyr Ser Leu Asp Ser Trp Arg Thr Val
100 105 110
Ile Glu Val Asn Leu Asn Ala Val Phe Tyr Gly Met Gln Pro Gln Leu
115 120 125
Lys Ala Met Ala Ala Asn Gly Gly Gly Ala Ile Val Asn Met Ala Ser
130 135 140
Ile Leu Gly Ser Val Gly Phe Ala Asn Ser Ser Ala Tyr Val Thr Ala
145 150 155 160
Lys His Ala Leu Leu Gly Leu Thr Gln Asn Ala Ala Leu Glu Tyr Ala
165 170 175
Ala Asp Lys Val Arg Val Val Ala Val Gly Pro Gly Phe Ile Arg Thr
180 185 190
Pro Leu Val Glu Ala Asn Leu Ser Ala Asp Ala Leu Ala Phe Leu Glu
195 200 205
Gly Lys His Ala Leu Gly Arg Leu Gly Glu Pro Glu Glu Val Ala Ser
210 215 220
Leu Val Ala Phe Leu Ala Ser Asp Ala Ala Ser Phe Ile Thr Gly Ser
225 230 235 240
Tyr His Leu Val Asp Gly Gly Tyr Thr Ala Gln
245 250

Claims (18)

1.一种(R)-5,7-二氟-1,2,3,4-四氢萘-2-醇的生物催化制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
(a)在液态反应体系中，以5,7-二氟-2-四氢萘酮为底物，在辅酶存在下，在羰基还原酶催化下，进行不对称还原反应，形成(R)-5,7-二氟-1,2,3,4-四氢萘-2-醇；
(b)任选地从所述步骤(a)的反应后的反应体系中分离出(R)-5,7-二氟-1,2,3,4-四氢萘-2-醇；
其中，所述羰基还原酶选自下组：
(i)来源于Leifsonia sp.strain S749的羰基还原酶LSADH，其氨基酸序列如SEQ IDNO:2所示；
(ii)对SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列在保持酶活性范围内，进行一个或多个氨基酸的替换、缺失、改变、插入或增加，所得到的至少约85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、或99％相同的氨基酸序列。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述反应体系中，所述反应体系中，5,7-二氟-2-四氢萘酮的浓度为1-1000g/L；优选地，所述式II化合物的浓度为10-500g/L；优选地，所述式II化合物的浓度为100-500g/L；进一步优选地，所述式II化合物的浓度为200-400g/L；更进一步地，所述式II化合物的浓度为300-400g/L。
3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述羰基还原酶选自下组：
(i)来源于Leifsonia sp.strain S749的羰基还原酶LSADH，其氨基酸序列如SEQ IDNO:2所示；
(ii)对SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列在保持酶活性范围内，对其第63、81、98、154、163、203、218位氨基酸中的至少一个氨基酸进行的氨基酸替换、缺失、改变、插入或增加，所得到的氨基酸序列；
优选地，所述羰基还原酶选自下组：
(i)来源于Leifsonia sp.strain S749的羰基还原酶LSADH，其氨基酸序列如SEQ IDNO:2所示；
(ii)对SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列在保持酶活性范围内，对其第63、81、98、154、163、203、218位氨基酸中的至少一个氨基酸进行的相同数量的氨基酸的替换所得到的氨基酸序列；
进一步优选地，所述羰基还原酶选自：对SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列在保持酶活性范围内，按以下改变方式中的任意一种或多种进行改变所得到的氨基酸序列；所述改变方式为：
第63位的氨基酸丙氨酸(A)被缬氨酸(V)替换；第81位的氨基酸丙氨酸(A)被苏氨酸(T)替换；第98位的氨基酸丙氨酸(A)被缬氨酸(V)替换；第154位的氨基酸丝氨酸(S)被酪氨酸(Y)替换；第163位的氨基酸丙氨酸(A)被甘氨酸(G)替换；第203位的氨基酸丙氨酸(A)被缬氨酸(V)替换；第218位的氨基酸谷氨酸(E)被赖氨酸(K)替换；
更优选地，所述羰基还原酶为氨基酸序列选自下组的酶：
对应于SEQ ID NO:2的第63位的氨基酸丙氨酸(A)被缬氨酸(V)替换的氨基酸序列；
对应于SEQ ID NO:2的第81位的氨基酸丙氨酸(A)被苏氨酸(T)替换的氨基酸序列；
对应于SEQ ID NO:2的第98位的氨基酸丙氨酸(A)被缬氨酸(V)替换的氨基酸序列；
对应于SEQ ID NO:2的第154位的氨基酸丝氨酸(S)被酪氨酸(Y)替换的氨基酸序列；
对应于SEQ ID NO:2的第163位的氨基酸丙氨酸(A)被甘氨酸(G)替换的氨基酸序列；
对应于SEQ ID NO:2的第203位的氨基酸丙氨酸(A)被缬氨酸(V)替换的氨基酸序列；
对应于SEQ ID NO:2的第218位的氨基酸谷氨酸(E)被赖氨酸(K)替换的氨基酸序列；
对应于SEQ ID NO:2的第163位的氨基酸丙氨酸(A)被甘氨酸(G)替换和第203位的氨基酸丙氨酸(A)被缬氨酸(V)替换的氨基酸序列；
对应于SEQ ID NO:2的第163位的氨基酸丙氨酸(A)被甘氨酸(G)替换和第218位的氨基酸谷氨酸(E)被赖氨酸(K)替换的氨基酸序列；
对应于SEQ ID NO:2的第63位的氨基酸丙氨酸(A)被缬氨酸(V)替换、第81位的氨基酸丙氨酸(A)被苏氨酸(T)替换和第163位的氨基酸丙氨酸(A)被甘氨酸(G)替换的氨基酸序列；
对应于SEQ ID NO:2的第63位的氨基酸丙氨酸(A)被缬氨酸(V)替换、第98位的氨基酸丙氨酸(A)被缬氨酸(V)替换和第203位的氨基酸丙氨酸(A)被缬氨酸(V)替换的氨基酸序列；
对应于SEQ ID NO:2的第63位的氨基酸丙氨酸(A)被缬氨酸(V)替换、第98位的氨基酸丙氨酸(A)被缬氨酸(V)替换、第163位的氨基酸丙氨酸(A)被甘氨酸(G)替换和第203位的氨基酸丙氨酸(A)被缬氨酸(V)替换的氨基酸序列。
4.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述反应体系中，还存在共底物；优选地，所述共底物选自：异丙醇、葡萄糖、甲酸铵、或其组合；优选地，所述反应体系中，共底物的质量体积浓度为5％～50％(w/v)。
5.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述辅酶选自下组：还原性辅酶、氧化性辅酶、或其组合；优选地，所述还原性辅酶选自下组：NADH、NADPH、或其组合；优选地，所述氧化性辅酶选自下组：NAD+、NADP+、或其组合；优选地，所述NAD+用量与底物用量比率为0.01％～1.0％(w/w)；优选地，比率为0.01％～0.5％(w/w)；优选地，所述NADP+的用量与底物用量比率为0.01％～1.0％(w/w)；优选地，比率为0.01％～0.5％(w/w)。
6.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的反应体系中，还存在用于辅酶再生的酶；优选地，所述用于辅酶再生的酶选自：醇脱氢酶、甲酸脱氢酶、葡萄糖脱氢酶、或其组合。
7.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤(a)中，反应温度为10℃～50℃；优选地，反应温度为15℃～45℃；进一步优选地，反应温度为20℃～40℃；更优选地，反应温度为25℃～35℃。
8.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤(a)中，反应时间为0.1～240小时；优选地，反应时间为0.1～120小时；进一步优选地，反应时间为0.5～72小时；更优选地，反应时间为1～48小时。
9.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤(a)中，反应体系的pH为6.0～9.0；优选地，pH为6.0～8.5；进一步优选地，pH为6.5～8.0；更优选地，pH为6.5～7.5。
10.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的反应体系还含有助溶剂；优选地，所述的助溶剂选自下组：二甲基亚砜、甲醇、乙醇、异丙醇、乙腈、甲苯、丙酮、或其组合；优选地，所述助溶剂的体积百分浓度为5-50％(v/v)；优选地，所述助溶剂的体积百分浓度为5-30％(v/v)。
11.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤(b)中，所述的分离包括：加热使蛋白失活，过滤菌体，用萃取溶剂萃取滤液，浓缩有机层；优选地，所述加热是指：加热至50-80℃；优选地，所述过滤菌体是指：经过硅藻土过滤菌体；优选地，所述萃取溶剂为甲叔醚、二氯甲烷、甲苯、或乙酸乙酯；优选地，所述步骤(b)中，所述的分离包括：加热至50-80℃使蛋白失活，经过硅藻土过滤菌体，向滤液中加入萃取溶剂，所述萃取溶剂为甲叔醚、二氯甲烷、甲苯、或乙酸乙酯等，萃取并合并有机层，经干燥、过滤，浓缩有机层得产品；优选地，所述步骤(b)中，所述反应后的反应体系中，式I化合物的ee值≥95％；优选地，式I化合物的ee值≥98％；进一步优选地，式I化合物的ee值≥99％；优选地，所述步骤(b)中，所述反应后的反应体系中，≥90％式II化合物被转化为式I化合物；优选地，≥95％式II化合物被转化为式I化合物；进一步优选地，≥98％式II化合物被转化为式I化合物；更优选地，≥99％式II化合物被转化为式I化合物；优选地，所述步骤(b)中，所述反应后的反应体系中，式I化合物的浓度1～1000g/L。
12.一种反应体系，其特征在于，所述反应体系包括：
(1)水性溶剂；
(2)底物，所述底物为5,7-二氟-2-四氢萘酮；
(3)辅酶；
(4)羰基还原酶；所述羰基还原酶选自下组：
(i)来源于Leifsonia sp.strain S749的羰基还原酶LSADH，其氨基酸序列如SEQ IDNO:2所示；
(ii)对SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列在保持酶活性范围内，进行一个或多个氨基酸的替换、缺失、改变、插入或增加，所得到的至少约85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、或99％相同的氨基酸序列；
(5)共底物。
13.一种(R)-5,7-二氟-1,2,3,4-四氢萘-2-醇的生物催化制备方法，其包括：使用如权利要求12所述的反应体系，进行酶促反应，从而制得(R)-5,7-二氟-1,2,3,4-四氢萘-2-醇。
14.一种羰基还原酶，所述羰基还原酶选自下组：
(i)来源于Leifsonia sp.strain S749的羰基还原酶LSADH，其氨基酸序列如SEQ IDNO:2所示；
(ii)对SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列在保持酶活性范围内，进行一个或多个氨基酸的替换、缺失、改变、插入或增加，所得到的至少约85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、或99％相同的氨基酸序列；
优选地，所述羰基还原酶选自：对SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列在保持酶活性范围内，进行一个或多个氨基酸的替换、缺失、改变、插入或增加，所得到的至少约85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、或99％相同的氨基酸序列；
优选地，所述羰基还原酶选自：对SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列在保持酶活性范围内，对其第63、81、98、154、163、203、218位氨基酸中的至少一个氨基酸进行的氨基酸替换、缺失、改变、插入或增加，所得到的氨基酸序列；
优选地，所述羰基还原酶选自：对SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列在保持酶活性范围内，对其第63、81、98、154、163、203、218位氨基酸中的至少一个氨基酸进行的相同数量的氨基酸的替换所得到的氨基酸序列；
优选地，所述羰基还原酶选自：对SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列在保持酶活性范围内，按以下改变方式中的任意一种或多种进行改变所得到的氨基酸序列；所述改变方式为：
第63位的氨基酸丙氨酸(A)被缬氨酸(V)替换；第81位的氨基酸丙氨酸(A)被苏氨酸(T)替换；第98位的氨基酸丙氨酸(A)被缬氨酸(V)替换；第154位的氨基酸丝氨酸(S)被酪氨酸(Y)替换；第163位的氨基酸丙氨酸(A)被甘氨酸(G)替换；第203位的氨基酸丙氨酸(A)被缬氨酸(V)替换；第218位的氨基酸谷氨酸(E)被赖氨酸(K)替换；
优选地，所述羰基还原酶为氨基酸序列选自下组的酶：
对应于SEQ ID NO:2的第63位的氨基酸丙氨酸(A)被缬氨酸(V)替换的氨基酸序列；
对应于SEQ ID NO:2的第81位的氨基酸丙氨酸(A)被苏氨酸(T)替换的氨基酸序列；
对应于SEQ ID NO:2的第98位的氨基酸丙氨酸(A)被缬氨酸(V)替换的氨基酸序列；
对应于SEQ ID NO:2的第154位的氨基酸丝氨酸(S)被酪氨酸(Y)替换的氨基酸序列；
对应于SEQ ID NO:2的第163位的氨基酸丙氨酸(A)被甘氨酸(G)替换的氨基酸序列；
对应于SEQ ID NO:2的第203位的氨基酸丙氨酸(A)被缬氨酸(V)替换的氨基酸序列；
对应于SEQ ID NO:2的第218位的氨基酸谷氨酸(E)被赖氨酸(K)替换的氨基酸序列；
对应于SEQ ID NO:2的第163位的氨基酸丙氨酸(A)被甘氨酸(G)替换和第203位的氨基酸丙氨酸(A)被缬氨酸(V)替换的氨基酸序列；
对应于SEQ ID NO:2的第163位的氨基酸丙氨酸(A)被甘氨酸(G)替换和第218位的氨基酸谷氨酸(E)被赖氨酸(K)替换的氨基酸序列；
对应于SEQ ID NO:2的第63位的氨基酸丙氨酸(A)被缬氨酸(V)替换、第81位的氨基酸丙氨酸(A)被苏氨酸(T)替换和第163位的氨基酸丙氨酸(A)被甘氨酸(G)替换的氨基酸序列；
对应于SEQ ID NO:2的第63位的氨基酸丙氨酸(A)被缬氨酸(V)替换、第98位的氨基酸丙氨酸(A)被缬氨酸(V)替换和第203位的氨基酸丙氨酸(A)被缬氨酸(V)替换的氨基酸序列；
对应于SEQ ID NO:2的第63位的氨基酸丙氨酸(A)被缬氨酸(V)替换、第98位的氨基酸丙氨酸(A)被缬氨酸(V)替换、第163位的氨基酸丙氨酸(A)被甘氨酸(G)替换和第203位的氨基酸丙氨酸(A)被缬氨酸(V)替换的氨基酸序列。
15.如权利要求11所述的羰基还原酶作为催化剂在以5,7-二氟-2-四氢萘酮为底物经生物催化还原制备(R)-5,7-二氟-1,2,3,4-四氢萘-2-醇中的应用。
16.一组编码如权利要求14所述的羰基还原酶的编码基因。
17.一种表达载体，其特征在于，所述表达载体装载有如权利要求14所述的羰基还原酶的编码基因；优选地，所述表达载体为重组质粒；优选地，所述表达载体为pET28a(+)载体。
18.一种基因工程菌，其特征在于，包括宿主细胞和转入宿主细胞的目的基因，所述目的基因包含如权利要求14所述的羰基还原酶的编码基因；优选地，所述宿主细胞为大肠杆菌。
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