CN110229796A - 酮还原酶突变体及其在制备度洛西汀手性醇中间体及其类似物中的应用 - Google Patents
酮还原酶突变体及其在制备度洛西汀手性醇中间体及其类似物中的应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明提供了一种酮还原酶突变体及其应用；编码此突变体的核苷酸序列、包含此核苷酸序列的重组载体及重组菌株。还提供了所述的酮还原酶突变体作为催化剂在制备S‑构型度洛西汀手性醇中间体及其类似物的应用。本发明的酮还原酶突变体，可作为催化剂，与辅酶再生体系共同用于制备S‑构型的度洛西汀手性醇中间体及其类似物，反应转化率可达90%、95%或99%以上，产物的手性纯度值可达90%、95%或99%以上。反应条件温和，几乎无副产物，辅酶循环体系稳定，具有较大的工业化应用前景。
Description
技术领域
本发明涉及一种酮还原酶突变体及其在制备度洛西汀手性醇中间体及其类似物中的应用，属于生物酶工程和微生物应用领域。
背景技术
盐酸度洛西汀【Duloxetine hydrochloride，(S)-N-甲基-3-(1-萘氧基)-3-(2-噻吩基)-1-丙胺盐酸盐】是由美国礼来公司研发的新型抗抑郁药，能有效地抑制5-羟色氨和去甲肾上腺素的再摄取，高效、安全、副作用小，对其他症状如全身疼痛和胃肠道紊乱也有疗效，该药还被批准用于糖尿病引起的神经疼痛以及女性尿失禁的治疗。2012年全球20个最畅销的处方药榜单中度洛西汀以49.94亿美元的年销售额排名第9。
研究发现(S)-构型的盐酸度洛西汀药效是(R)型两倍，并且相对于(R)-盐酸度洛西汀来说，(S)型对映体是更强的5-羟色胺再摄取抑制剂，因而(S)-构型手性醇中间体的制备是盐酸度洛西汀合成的关键步骤。
目前S-手性醇中间体的合成主要有化学合成和酶法合成两种途径。化学合成采用化学拆分和化学不对称合成来制备手性中间体，这两种方法均存在诸多问题，如化学拆分需要使用大量的拆分剂，反应步骤长，能耗高以及废物排放量大等；基于过渡金属手性配体催化氢化体系，存在着产品光学纯度不高以及重金属残留等问题，导致收率过低，成本居高不下。随着盐酸度洛西汀的专利在2013年12月到期后，原料药价格一再下探，传统化学合成途径因环保和成本问题受到极大冲击。
酶法合成S-手性醇中间体的研究从十几年前即已开始并有报道。起初是利用脂肪酶代替过渡金属催化剂来进行手性拆分，虽然污染大为减少，但也存在拆分效率低、另一对映体无法利用等问题。后续研究利用酮还原酶来进行手性还原制备S-手性醇中间体。WadaM,et al于2004年克隆一个来源于Exiguobacterium sp.F42的短链醇脱氢酶，用于还原3-氧-3-(2-噻吩基)-丙酸乙酯制备手性醇中间体S-3-羟基-3-(2-噻吩基)-丙酸乙酯，手性纯度值大于98％(Wada M,et al.Biosci Biotechnol Biochem,2004,68:1481-1488)。汤传根等(Tang CG,et al.Biotechnol Lett,2011,33:1435-1440)和吴中柳等(CN103740738A)分别报道了利用粘红酵母菌(Rhodotorula sp.CY12)和来源于金黄杆菌(Chryseobacteriumsp.CA49)的羰基还原酶ChKRED15催化N-甲基-3-羰基-3-(2-噻吩基)丙酰胺生成S-手性中间体，手性纯度值均大于99％。然而上述利用酮还原酶来进行手性醇制备的研究中，底物浓度低(<30g/L),且所制备的手性醇还需经过几步化学反应才能制得度洛西汀手性中间体(S)-N-甲基-3-羟基-3-(2-噻吩基)-1-丙胺，限制了其工业化应用。
美国Codexis公司以Lactobacillus kefir来源的醇脱氢酶出发，采用DNA重排等定向进化技术，得到一系列突变体酶，其催化底物浓度可达80g/L，手性纯度值大于99％(US20080206824A)，有望用于工业化生产。不过成本较高，还有进一步下降的空间。
然而国内目前还未有可用于工业化生产的酶及其突变体的研究报道。
发明内容
本发明要解决的技术问题是提供一种来源于赤红球菌菌属Rhodococcus ruber的酮还原酶Rr Kred基因，并提供该酶体外异源表达体系的构建方法，以及该酶作为生物催化剂用于制备度洛西汀手性中间体及其类似物的方法。
本发明的技术方案如下：
酮还原酶突变体，所述的酮还原酶突变体的氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示。
编码所述的酮还原酶突变体的基因，所述的基因的核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示。
酮还原酶Rr Kred的基因序列通过南京金斯瑞生物科技有限公司全基因合成所得，在编码区两端分别添加Nde I和Hind III限制性内切酶位点。目的基因片段通过限制性内切酶Nde I和Hind III酶切后，与经过同样双酶切的pET21a(+)载体进行连接、转化和筛选，筛选得到的阳性质粒Rr Kred-pET21a(+)转入BL21(DE3)宿主菌中，从而构建该酮还原酶的体外异源表达体系。
根据现有公共知识，任何基因经操作或者改造后连入各类表达载体，转化至合适宿主细胞，经适当条件诱导均能过量表达目的蛋白。因此，酮还原酶Rr Kred其表达的载体可以为pET或者pCW或者pUC或者pPIC9k等，表达宿主可以为大肠杆菌，毕赤酵母，链霉菌等。
本发明提供了包含所述基因的重组载体。
本发明提供了包含所述基因的重组菌株。
所述的酮还原酶突变体作为催化剂在制备度洛西汀手性醇中间体及其类似物中的应用，所述的制备方法如下：
在辅酶再生体系的存在下，酮还原酶突变体催化剂催化度洛西汀手性酮基中间体及其类似物与度洛西汀手性醇基中间体及其类似物之间发生立体特异性平衡反应，反应式如下：
其中的R＝H，代表N取代单甲基；R＝CH3，代表N取代双甲基；R＝Ph，代表N取代甲基、苄基。
所述的制备度洛西汀手性醇中间体及其他类似物的方法，包括下列方法的任意一种：
(a)采用异丙醇和新型的功能性酮还原酶突变体Rr Kred进行反应，反应路线如下：
(b)采用异丙醇结合其他脱氢酶O Adh或其他酮还原酶O Kred进行，反应路线如下：
(c)采用葡萄糖结合葡萄糖脱氢酶Gdh进行的应，反应路线如下：
所述的转化反应体系中，包括酮还原酶Rr Kred，磷酸缓冲液，辅酶NADP，底物，辅酶再生底物异丙醇或葡萄糖。
其中，酮还原酶Rr Kred的用量在1-10g/L(优选2-4g/L)，缓冲液浓度在50-200mM(优选50mM)，缓冲液pH值在6.0-8.5之间(pH值优选7.0)，辅酶浓度为0.1-0.5g/L(辅酶浓度优选0.1g/L)，底物浓度在5-20g/L之间，辅酶再生底物浓度根据底物浓度进行调整。
所述的反应的温度范围在35-40℃。
所述的反应的pH范围在7-11。
本发明还提供了酮还原酶Rr Kred作为生物催化剂在转化底物N,N-双甲基-3-氧-3-(2-噻吩基)-1-丙胺(II)及其类似物N-甲基-3-氧-3-(2-噻吩基)-1-丙胺(I)和N-甲基-N’-苄基-3-氧-3-(2-噻吩基)-1-丙胺(III)生成对应手性醇中间体(V、IV、VI)中的应用。
以上为转化底物及其对应的S-手性醇中间体的结构式。
反应后产物通过乙腈萃取后经高效液相色谱(HPLC)验证，反应转化率可达90％，或95％，或99％以上，产物的手性纯度值可达90％，或95％，或99％以上。从而可证明该酶突变体可用于原料I、II、III的生物不对称还原。
可进行上述生物催化反应的酶包括纯酶、相应的重组菌休止细胞、粗酶液或者粗酶粉等其他存在形态。
本发明所用的辅酶再生体系为葡萄糖-葡萄糖脱氢酶体系或异丙醇-醇脱氢酶体系。其中葡萄糖脱氢酶体系采用的酶来源于枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)、巨大芽孢杆菌(Bacillus megaterium)等的体外重组酶，优选为来源于枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)的葡萄糖脱氢酶(BsGDH)的基因重组酶。异丙醇-醇脱氢酶体系所用的酶主要来源于酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)、嗜热菌(Thermoanaerobacter brockii)等的醇脱氢酶，优选为来源于嗜热菌(Thermoanaerobacter brockii)的体外重组醇脱氢酶(TbADH)。具体的为，本发明下面如无特殊说明，采用的辅酶再生体系为异丙醇-酮还原酶RrKred的辅酶再生体系。
本发明具有如下技术效果：
本发明的酮还原酶突变体，可作为催化剂，与辅酶再生体系共同用于制备S-构型的度洛西汀手性醇中间体及其类似物，反应转化率可达90％、95％或99％以上，产物的手性纯度值可达90％、95％或99％以上。反应条件温和，几乎无副产物，辅酶循环体系稳定，具有较大的工业化应用前景。
附图说明
图1为实施例4的HPLC检测结果图。
图2为实施例4的SFC检测结果图。
图3为实施例5的HPLC检测结果图。
图4为实施例5的SFC检测结果图。
图5为实施例6的HPLC检测结果图。
图6为实施例6的SFC检测结果图。
图7为实施例7的HPLC检测结果图。
图8为实施例7的SFC检测结果图。
图9为实施例8的HPLC检测结果图。
图10为实施例8的SFC检测结果图。
图11为实施例9的HPLC检测结果图。
图12为实施例9的SFC检测结果图。
图13为实施例10的HPLC检测结果图。
图14为实施例10的SFC检测结果图。
图15为实施例11的HPLC检测结果图。
图16为实施例11的SFC检测结果图。
图17为实施例12的HPLC检测结果图。
图18为实施例12的SFC检测结果图。
图19为实施例13的HPLC检测结果图。
图20为实施例13的SFC检测结果图。
图21为实施例14的HPLC检测结果图。
图22为实施例14的SFC检测结果图。
图23为实施例15的HPLC检测结果图。
图24为实施例15的SFC检测结果图。
图25为实施例16的HPLC检测结果图。
图26为实施例16的SFC检测结果图。
图27为实施例17的HPLC检测结果图。
图28为实施例17的SFC检测结果图。
图29为实施例18的HPLC检测结果图。
图30为实施例18的SFC检测结果图。
图31为实施例19的HPLC检测结果图。
图32为实施例19的SFC检测结果图。
具体实施方式
以下结合实施例详细地说明本发明。实施方案为便于更好的理解本发明，但并非对本发明的限制。
实施例中，未注明具体条件的实验方法，通常按常规条件，如《分子克隆实验指南》(J.萨姆布鲁克，D.W.拉塞尔著，黄培堂，汪嘉玺，朱厚础等译，第三版，北京：科学出版社，2002)中所述的方法进行
本发明具体实施方式中的底物转化率的检测和产物手性纯度的检测的方法如下：
底物转化率的检测通过HPLC进行，检测的条件如下：仪器为安捷伦HPLC1100、液相柱为安捷伦Agllent 5TC-C18(2)250*4.6mm、流动相Buffer A为甲醇、流动相Buffer B为0.1％磷酸的水溶液(1L超纯水+1mL磷酸)、A相和B相以20％加80％的比例混合，柱温箱温度30℃、流速1mL/min、检测波长245nm、样品浓度2mg/mL、进样量2uL。检测后将产物的峰面积除以产物和底物的峰面积之和，求得转化率。
产物手性纯度的检测通过超临界流体色谱(SFC)检测。检测后将S型产物的峰面积除以S型产物和R型产物的峰面积之和，求得手性纯度。
上述检测样品均采用流动相稀释到合适浓度后，用0.22μm的滤膜过滤进仪器检测。
实施例1原核表达体系的构建
核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示的酮还原酶Rr Kred基因片段由南京金斯瑞生物科技有限公司合成，并重组到pET21a载体上。将阳性重组质粒Rr Kred-pET21a(+)转化表达宿主菌BL21(DE3)(购自天根生化科技(北京)有限公司)，得到原核表达菌株Rr Kred-pET21a(+)/BL21(DE3)，作为后续催化反应原代菌株。
用于辅酶再生的葡萄糖脱氢酶(BsGDH)(LOC111893255)和醇脱氢酶(TbADH)(LOC101068320)基因由南京金斯瑞生物科技有限公司合成，后续重组表达质粒的构建同RrKred-pET21a(+)质粒的构建，转入BL21(DE3)中后分别得到BsGDH-pET21a(+)/BL21(DE3)、TbADH-pET21a(+)/BL21(DE3)表达菌株。
实施例2酶的发酵制备
上述构建的表达菌株Rr Kred-pET21a(+)/BL21(DE3)、BsGDH-pET21a(+)/BL21(DE3)、TbADH-pET21a(+)/BL21(DE3)在加有终浓度为100ug/mL氨苄青霉素的5mL LB液体培养基【10g/L胰蛋白胨(OXIOD)，5g/L酵母粉(OXIOD)，10g/L氯化钠(国药试剂)】中于37℃、200rpm振荡培养过夜后，按1％(V/V)比例接种于含有终浓度为100ug/mL氨苄青霉素的500mL LB液体培养基中，于37℃、200rpm振荡培养。待OD600在0.8-1.0之间时，加入终浓度为0.1mM的诱导剂IPTG(异丙基-β-D-硫代半乳糖苷，IPTG)，并在25℃诱导过夜。菌体在8000rpm条件下离心收集，然后悬浮于50mM pH7.0磷酸钠缓冲液中，超声破碎(200W，3s/5s，10min)，4℃，12000rpm离心20min，取上清备用。
实施例3酶的催化活性检测
将上述得到的酶液用于底物催化反应。
利用葡萄糖脱氢酶BsGDH进行辅酶再生：将1g底物(化合物I)溶解于40mL含有10％异丙醇的50mM pH7.0磷酸钠缓冲液中，随后加入800mg葡萄糖，待搅拌溶解后加入5mg NADP+、250mg酮还原酶LfHSDH冻干粉、100mg BsGDH冻干粉，并用缓冲液将体积补充到50mL。反应液置于37℃恒温水浴锅中，磁力搅拌反应。反应过程中用1M氢氧化钠溶液将体系pH值维持在7.0。反应24h后取样，进行HPLC检测，底物转化率达到62％，产物手性纯度值>99％。
利用醇脱氢酶TbADH进行辅酶再生：将1g底物溶解于40mL含有10％异丙醇的50mMpH7.0磷酸钠缓冲液中，待搅拌溶解后加入5mg NADP+、250mg酮还原酶LfHSDH冻干粉、100mgTbADH冻干粉，并用缓冲液将体积补充到50mL。反应液置于37℃恒温水浴锅中，磁力搅拌反应。反应24h后取样，进行HPLC检测，底物转化率达到55％，产物手性纯度值>99％。
实施例4 Rr Kred的生物催化
将5g底物原料I溶解于800mL含有10％异丙醇的50mM pH7.0磷酸钠缓冲液中，待搅拌溶解后加入0.1g NADP+、2g酮还原酶LfHSDH冻干粉、2g醇脱氢酶TbADH冻干粉，并用缓冲液将体积补充到1L。反应液置于35℃恒温水浴锅中，机械搅拌反应。
反应24h后进行HPLC和SFC检测。
HPLC结果请见图1，SFC结果请见图2。
经过计算，得出底物转化率>99％,手性纯度>99％。
实施例5 Rr Kred的生物催化
将10g底物原料I溶解于800mL含有20％异丙醇的50mM pH7.0磷酸钠缓冲液中，待搅拌溶解后加入0.1g NADP+、4g酮还原酶LfHSDH冻干粉、2g醇脱氢酶TbADH冻干粉，并用缓冲液将体积补充到1L。反应液置于35℃恒温水浴锅中，机械搅拌反应。
反应24h后进行HPLC和SFC检测。
HPLC结果请见图3，SFC结果请见图4。
经过计算，得出底物转化率>95％,手性纯度值>99％。
实施例6 Rr Kred的生物催化
将5g底物原料II溶解于800mL含有20％异丙醇的50mM pH7.0磷酸钠缓冲液中，待搅拌溶解后加入0.1g NADP+、4g酮还原酶LfHSDH冻干粉、2g醇脱氢酶TbADH冻干粉，并用缓冲液将体积补充到1L。反应液置于35℃恒温水浴锅中，机械搅拌反应。反应30h后进行HPLC和SFC检测。
HPLC结果请见图5，SFC结果请见图6。
经过计算，得出底物转化率>98％,手性纯度值>99％。
实施例7 Rr Kred的生物催化
将10g底物原料II溶解于800mL含有20％异丙醇的50mM pH7.0磷酸钠缓冲液中，待搅拌溶解后加入0.1g NADP+、4g酮还原酶LfHSDH冻干粉、2g醇脱氢酶TbADH冻干粉，并用缓冲液将体积补充到1L。反应液置于35℃恒温水浴锅中，机械搅拌反应。反应30h后进行HPLC和SFC检测。
HPLC结果请见图7，SFC结果请见图8。
经过计算，得出底物转化率>92％,手性纯度值>99％。
实施例8 Rr Kred的生物催化
将20g底物原料II溶解于800mL含有20％异丙醇的50mM pH7.0磷酸钠缓冲液中，待搅拌溶解后加入0.1g NADP+、4g酮还原酶LfHSDH冻干粉、2g醇脱氢酶TbADH冻干粉，并用缓冲液将体积补充到1L。反应液置于35℃恒温水浴锅中，机械搅拌反应。反应30h后进行HPLC和SFC检测。
HPLC结果请见图9，SFC结果请见图10。
经过计算，得出底物转化率>90％,手性纯度值>98％。
实施例9 Rr Kred的生物催化
将5g底物原料III溶解于800mL含有20％异丙醇的50mM pH7.0磷酸钠缓冲液中，待搅拌溶解后加入0.1g NADP+、4g酮还原酶LfHSDH冻干粉、2g醇脱氢酶TbADH冻干粉，并用缓冲液将体积补充到1L。反应液置于35℃恒温水浴锅中，机械搅拌反应。反应30h后进行HPLC和SFC检测。
HPLC结果请见图11，SFC结果请见图12。
经过计算，得出底物转化率>85％,手性纯度值>99％。
实施例10 Rr Kred的生物催化
将10g底物原料III溶解于800mL含有20％异丙醇的50mM pH7.0磷酸钠缓冲液中，待搅拌溶解后加入0.1g NADP+、4g酮还原酶LfHSDH冻干粉，并用缓冲液将体积补充到1L。反应液置于35℃恒温水浴锅中，机械搅拌反应。反应30h后进行HPLC和SFC检测。
HPLC结果请见图13，SFC结果请见图14。
经过计算，得出底物转化率>80％,手性纯度值>98％。
实施例11 Rr Kred的生物催化
将10g底物原料II溶解于800mL 50mM pH7.0磷酸钠缓冲液中，待搅拌溶解后加入0.1g NADP+、4g酮还原酶LfHSDH冻干粉、160g葡萄糖、2g GDH冻干粉，并用缓冲液将体积补充到1L。反应液置于40℃恒温水浴锅中，机械搅拌反应。反应30h后进行HPLC和SFC检测。
HPLC结果请见图15，SFC结果请见图16。
经过计算，得出底物转化率>99％,手性纯度值>99％。
实施例12 Rr Kred的生物催化
将10g底物原料II溶解于800mL 50mM pH7.0磷酸钠缓冲液中，待搅拌溶解后加入0.1g NADP+、4g酮还原酶LfHSDH冻干粉、160g葡萄糖、2g Lactobacillus kefiri来源的酮还原酶冻干粉，并用缓冲液将体积补充到1L。反应液置于40℃恒温水浴锅中，机械搅拌反应。反应30h后进行HPLC和SFC检测。
HPLC结果请见图17，SFC结果请见图18。
经过计算，得出底物转化率>98％,手性纯度值>98％。
实施例13 Rr Kred的的生物催化
将5g底物原料I溶解于800mL含有10％异丙醇的50mM pH7.0磷酸钠缓冲液中，待搅拌溶解后加入0.1g NADP+、2g酮还原酶LfHSDH冻干粉、2g醇脱氢酶TbADH冻干粉，并用缓冲液将体积补充到1L。反应液置于40℃恒温水浴锅中，机械搅拌反应。反应24h后进行HPLC和SFC检测。
HPLC结果请见图19，SFC结果请见图20。
经过计算，得出底物转化率>90％,手性纯度值>99％。
实施例14 Rr Kred的的生物催化
将5g底物原料II溶解于800mL含有10％异丙醇的50mM pH7.0磷酸钠缓冲液中，待搅拌溶解后加入0.1g NADP+、2g酮还原酶LfHSDH冻干粉、2g醇脱氢酶TbADH冻干粉，并用缓冲液将体积补充到1L。反应液置于40℃恒温水浴锅中，机械搅拌反应。反应24h后进行HPLC和SFC检测。
HPLC结果请见图21，SFC结果请见图22。
经过计算，得出底物转化率>95％,手性纯度值>99％。
实施例15 Rr Kred的的生物催化
将5g底物原料III溶解于800mL含有10％异丙醇的50mM pH7.0磷酸钠缓冲液中，待搅拌溶解后加入0.1g NADP+、2g酮还原酶LfHSDH冻干粉、2g醇脱氢酶TbADH冻干粉，并用缓冲液将体积补充到1L。反应液置于40℃恒温水浴锅中，机械搅拌反应。反应24h后进行HPLC和SFC检测。
HPLC结果请见图23，SFC结果请见图24。
经过计算，得出底物转化率>80％,手性纯度值>99％。
实施例16 Rr Kred的的生物催化
将5g底物原料II溶解于800mL含有10％异丙醇的50mM pH7.0磷酸钠缓冲液中，待搅拌溶解后加入0.1g NADP+、2g酮还原酶LfHSDH冻干粉、2g醇脱氢酶TbADH冻干粉，并用缓冲液将体积补充到1L。反应液置于40℃恒温水浴锅中，机械搅拌反应。反应24h后进行HPLC和SFC检测。
HPLC结果请见图25，SFC结果请见图26。
经过计算，得出底物转化率>90％,手性纯度值>99％。
实施例17 Rr Kred的的生物催化
将5g底物原料III溶解于800mL含有10％异丙醇的50mM pH7.0磷酸钠缓冲液中，待搅拌溶解后加入0.1g NADP+、2g酮还原酶LfHSDH冻干粉、2g醇脱氢酶TbADH冻干粉，并用缓冲液将体积补充到1L。反应液置于40℃恒温水浴锅中，机械搅拌反应。反应24h后进行HPLC和SFC检测。
HPLC结果请见图27，SFC结果请见图28。
经过计算，得出底物转化率>80％,手性纯度值>99％。
实施例18 Rr Kred的的生物催化
将5g底物原料II溶解于800mL含有10％异丙醇的50mM pH7.0磷酸钠缓冲液中，待搅拌溶解后加入0.1g NADP+、2g酮还原酶LfHSDH冻干粉、2g醇脱氢酶TbADH冻干粉，并用缓冲液将体积补充到1L。反应液置于40℃恒温水浴锅中，机械搅拌反应。反应24h后进行HPLC和SFC检测。
HPLC结果请见图29，SFC结果请见图30。
经过计算，得出底物转化率>90％,手性纯度值>99％。
实施例19 Rr Kred的的生物催化
将5g底物原料II溶解于800mL含有10％异丙醇的50mM pH7.0磷酸钠缓冲液中，待搅拌溶解后加入0.1g NADP+、2g酮还原酶LfHSDH冻干粉、2g醇脱氢酶TbADH冻干粉，并用缓冲液将体积补充到1L。反应液置于40℃恒温水浴锅中，机械搅拌反应。反应24h后进行HPLC和SFC检测。
HPLC结果请见图31，SFC结果请见图32。
经过计算，得出底物转化率>90％,手性纯度值>99％。
序列表
<110> 南京趣酶生物科技有限公司
上海仁酶生物科技有限公司
<120> 酮还原酶突变体及其在制备度洛西汀手性醇中间体及其类似物中的应用
<160> 2
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 345
<212> PRT
<213> 赤红球菌(Rhodococcus ruber)
<400> 1
Met Lys Ala Val Gln Tyr Thr Glu Ile Gly Ser Glu Pro Val Val Val
1 5 10 15
Asp Ile Pro Thr Pro Thr Pro Gly Pro Gly Glu Ile Leu Leu Lys Val
20 25 30
Thr Ala Ala Gly Leu Cys His Ser Asp Ile Phe Val Met Asp Met Pro
35 40 45
Ala Ala Gln Tyr Ala Tyr Gly Leu Pro Leu Thr Leu Gly His Glu Gly
50 55 60
Val Gly Thr Val Ala Glu Leu Gly Glu Gly Val Thr Gly Phe Gly Val
65 70 75 80
Gly Asp Ala Val Ala Val Tyr Gly Pro Trp Gly Cys Gly Ala Cys His
85 90 95
Ala Cys Ala Arg Gly Arg Glu Asn Tyr Cys Thr Arg Ala Ala Asp Leu
100 105 110
Gly Ile Thr Pro Pro Gly Leu Gly Ser Pro Gly Ser Met Ala Glu Tyr
115 120 125
Met Ile Val Asp Ser Ala Arg His Leu Val Pro Ile Gly Asp Leu Asp
130 135 140
Pro Val Ala Ala Ala Pro Leu Thr Asp Ala Gly Leu Thr Pro Tyr His
145 150 155 160
Ala Ile Ser Arg Val Leu Pro Leu Leu Gly Pro Gly Ser Thr Ala Val
165 170 175
Val Ile Gly Val Gly Gly Leu Gly His Val Gly Ile Gln Ile Leu Arg
180 185 190
Ala Val Ser Ala Ala Arg Val Ile Ala Val Asp Leu Asp Asp Asp Arg
195 200 205
Leu Ala Leu Ala Arg Glu Val Gly Ala Asp Ala Ala Val Lys Ser Gly
210 215 220
Ala Gly Ala Ala Asp Ala Ile Arg Glu Leu Thr Gly Gly Gln Gly Ala
225 230 235 240
Thr Ala Val Phe Asp Phe Val Gly Ala Gln Ser Thr Ile Asp Thr Ala
245 250 255
Gln Gln Val Val Ala Val Asp Gly His Ile Ser Val Val Gly Ile His
260 265 270
Ala Gly Ala His Ala Lys Val Gly Phe Phe Met Ile Pro Phe Gly Ala
275 280 285
Ser Val Val Thr Pro Tyr Trp Gly Thr Arg Ser Glu Leu Met Glu Val
290 295 300
Val Ala Leu Ala Arg Ala Gly Arg Leu Asp Ile His Thr Glu Thr Phe
305 310 315 320
Thr Leu Asp Glu Gly Pro Ala Ala Tyr Arg Arg Leu Arg Glu Gly Ser
325 330 335
Ile Arg Gly Arg Gly Val Val Val Pro
340 345
<210> 2
<211> 1038
<212> DNA
<213> 赤红球菌(Rhodococcus ruber)
<400> 2
atgaaagcgg tgcagtatac ggaaattggt tcagaaccgg tggttgtcga tatcccgacc 60
ccgacgccgg gtccgggtga aattctgctg aaagtgaccg cggccggcct gtgtcattcg 120
gacatctttg ttatggatat gccggcagct caatatgcat acggtctgcc gctgacgctg 180
ggtcacgagg gtgtgggtac cgttgcggaa ctgggcgaag gtgtgaccgg cttcggtgtt 240
ggcgatgccg ttgcagtcta tggtccgtgg ggttgcggtg catgtcatgc ttgcgcacgt 300
ggtcgcgaaa actactgcac gcgtgcggcc gatctgggta ttaccccgcc gggtctgggt 360
agcccgggtt ctatggccga atatatgatt gtggacagtg cacgccatct ggttccgatc 420
ggtgacctgg atccggtggc agctgcaccg ctgacggatg ctggtctgac cccgtaccac 480
gcgattagtc gtgttctgcc gctgctgggt ccgggttcca ccgcagtggt tatcggtgtc 540
ggcggtctgg gtcacgtggg cattcagatc ctgcgtgctg tgagtgccgc acgcgtcatt 600
gccgtggatc tggatgacga tcgtctggca ctggcacgtg aagttggtgc agatgctgcg 660
gtcaaatccg gtgctggtgc agcagacgca attcgtgaac tgacgggcgg tcagggtgct 720
accgcggttt ttgacttcgt cggcgcacaa agcacgatcg ataccgccca gcaagtcgtg 780
gcagtggacg gtcatatttc tgttgtcggt atccatgccg gcgcacacgc taaagttggc 840
tttttcatga tcccgtttgg cgcgtcagtg gttacgccgt attggggtac ccgttcggaa 900
ctgatggaag tcgtggcact ggcacgtgca ggtcgtctgg atattcacac cgaaacgttc 960
accctggacg aaggtccggc tgcataccgt cgtctgcgtg aaggttctat ccgtggtcgc 1020
ggcgttgtcg tgccgtaa 1038
Claims (8)
1.酮还原酶突变体，其特征在于，所述的酮还原酶突变体的氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示。
2.编码如权利要求1所述的酮还原酶突变体的基因，其特征在于，所述的基因的核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示。
3.包含如权利要求2所述基因的重组载体。
4.包含如权利要求2所述基因的重组菌株。
5.如权利要求1所述的酮还原酶突变体作为催化剂在制备度洛西汀手性醇中间体及其类似物中的应用，其特征在于，所述的制备方法如下：
在辅酶再生体系的存在下，酮还原酶突变体催化剂催化度洛西汀手性酮基中间体及其类似物与度洛西汀手性醇基中间体及其类似物之间发生立体特异性平衡反应，反应式如下：
6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，其特征在于，所述的制备度洛西汀手性醇中间体及其他类似物的方法，包括下列方法的任意一种：
(a)采用异丙醇和新型的功能性酮还原酶突变体Rr Kred进行反应，反应路线如下：
(b)采用异丙醇结合其他脱氢酶O Adh或其他酮还原酶O Kred进行，反应路线如下：
(c)采用葡萄糖结合葡萄糖脱氢酶Gdh进行的应，反应路线如下：
所述的转化反应体系中，包括酮还原酶Rr Kred，磷酸缓冲液，辅酶NADP，底物，辅酶再生底物异丙醇或葡萄糖；
其中，酮还原酶Rr Kred的用量在1-10g/L，缓冲液浓度在50-200mM，缓冲液pH值在6.0-8.5之间，辅酶浓度为0.1-0.5g/L之间，底物浓度在5-20g/L之间，辅酶再生底物浓度根据底物浓度进行调整。
7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，所述的反应的温度为35-40℃。
8.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，所述的反应的pH为7-11。
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Cited By (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN111411116A (zh) * | 2020-04-01 | 2020-07-14 | 安徽联创生物医药股份有限公司 | 酮还原酶、核酸、重组表达质粒及菌株、合成劳拉替尼中间体中的应用 |
| CN111676201A (zh) * | 2020-06-30 | 2020-09-18 | 宁波酶赛生物工程有限公司 | 具有立体选择性的酮还原酶与(s)-3-羟基丁酸乙酯的不对称合成方法 |
| CN112458142A (zh) * | 2020-12-11 | 2021-03-09 | 上海合全药物研发有限公司 | 生物催化制备(1r,2r)-2-羟基环戊腈的方法 |
Citations (6)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN103740738A (zh) * | 2014-01-12 | 2014-04-23 | 中国科学院成都生物研究所 | 羰基还原酶、其基因及用于度洛西汀手性中间体的制备 |
| CN103789368A (zh) * | 2014-01-23 | 2014-05-14 | 上海工业生物技术研发中心 | 一种n-保护哌啶醇的生产方法 |
| CN104152506A (zh) * | 2014-08-08 | 2014-11-19 | 江南大学 | 醛酮还原酶的重组菌粗酶体系催化合成(s)-n,n-二甲基-3-羟基-3-(2-噻吩)-1-丙胺的方法 |
| CN105861457A (zh) * | 2016-05-26 | 2016-08-17 | 无锡佰翱得生物科学有限公司 | 一种酶活提高的乙醇脱氢酶突变体及其制备方法与应用 |
| CN106574281A (zh) * | 2014-07-03 | 2017-04-19 | 巴斯夫欧洲公司 | 醇类的氧化还原自足性生物催化胺化 |
| CN110004162A (zh) * | 2019-04-10 | 2019-07-12 | 长兴制药股份有限公司 | 一种羰基还原酶、基因及其在盐酸甲氧那明关键中间体上的应用 |
-
2019
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Patent Citations (6)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN103740738A (zh) * | 2014-01-12 | 2014-04-23 | 中国科学院成都生物研究所 | 羰基还原酶、其基因及用于度洛西汀手性中间体的制备 |
| CN103789368A (zh) * | 2014-01-23 | 2014-05-14 | 上海工业生物技术研发中心 | 一种n-保护哌啶醇的生产方法 |
| CN106574281A (zh) * | 2014-07-03 | 2017-04-19 | 巴斯夫欧洲公司 | 醇类的氧化还原自足性生物催化胺化 |
| CN104152506A (zh) * | 2014-08-08 | 2014-11-19 | 江南大学 | 醛酮还原酶的重组菌粗酶体系催化合成(s)-n,n-二甲基-3-羟基-3-(2-噻吩)-1-丙胺的方法 |
| CN105861457A (zh) * | 2016-05-26 | 2016-08-17 | 无锡佰翱得生物科学有限公司 | 一种酶活提高的乙醇脱氢酶突变体及其制备方法与应用 |
| CN110004162A (zh) * | 2019-04-10 | 2019-07-12 | 长兴制药股份有限公司 | 一种羰基还原酶、基因及其在盐酸甲氧那明关键中间体上的应用 |
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| 匿名: ""MULTISPECIES: NAD(P)-dependent alcohol dehydrogenase[Rhodococcus]"", 《GENBANK》 * |
Cited By (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN111411116A (zh) * | 2020-04-01 | 2020-07-14 | 安徽联创生物医药股份有限公司 | 酮还原酶、核酸、重组表达质粒及菌株、合成劳拉替尼中间体中的应用 |
| CN111676201A (zh) * | 2020-06-30 | 2020-09-18 | 宁波酶赛生物工程有限公司 | 具有立体选择性的酮还原酶与(s)-3-羟基丁酸乙酯的不对称合成方法 |
| CN112458142A (zh) * | 2020-12-11 | 2021-03-09 | 上海合全药物研发有限公司 | 生物催化制备(1r,2r)-2-羟基环戊腈的方法 |
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